JP7152072B2 - Ｃｔｇｆ発現抑制用組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、ＣＴＧＦの発現を高効率で抑制し、優れた線維増殖性疾患の予防または治療効果を有する組成物に関する。
組織リモデリングとは、生理学的または病理学的なストレスに反応して組織を再構築することを指す。病理生理学での組織リモデリングは、結合組織成長因子（Connective tissue growth factor，ＣＴＧＦ）、筋線維の分化と活性化、細胞外基質（ＥＣＭ）の沈着および線維化の過剰発現によって特徴付けられる。様々な信号分子及び因子の中で、ＣＴＧＦは組織リモデリングにおける中枢的な媒介体として考えられてきた。ＣＴＧＦは、様々な信号伝達経路に関与し、細胞の付着と移動、ＥＣＭリモデリング及び臓器構造の変化を起こす。組織リモデリング及び線維化は、肺線維症、肝線維症、腎線維症、糖尿病性網膜症および皮膚線維症（ケロイド及び肥厚性瘢痕）のような数多くの線維性障害と関連がある。
皮膚の傷治癒過程は非常に複雑であり、炎症、細胞分化及び増殖、組織リモデリング（コラーゲンの生成を含む）の重複した段階で構成される。いくつかのサイトカインと成長因子、特にＴＧＦ－βは創傷治癒の初期と後期の段階で重要な役割を果たす。ＴＧＦ－βはＣＴＧＦの上向き調節により、白血球の移動、血管の新生、線維芽細胞の移動、およびＥＣＭ成分（コラーゲン及びフィブロネクチン）の生産を媒介する。ＣＴＧＦの過剰発現が肥厚性瘢痕とケロイド患者に観察されたので、ＣＴＧＦ発現の抑制は、線維化の過程を阻害又は逆転できる線維化の機序を調節する魅力的な戦略である。
多くの抗体またはアンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＴＧＦの発現を抑制したり、過剰なコラーゲンの生成および線維化を減少させる作用について調べた。ｓｉＲＮＡは、ＣＴＧＦを抑制するための有望な候補物質の一つである。ｓｉＲＮＡに誘導されたＲＮＡ干渉は、標的ｍＲＮＡを配列相補的に認識して切断する、非常に特異で効率的な遺伝子サイレンシング機構によって媒介される。新しい治療薬としての高い潜在能力にもかかわらず、１）生物学的システムでの核酸分解酵素による急速な分解、２）効果的なｓｉＲＮＡ投与量の維持の困難性、３）生物学的障壁を横切る効率的な送達の困難性などのいくつかの限界と障壁が存在する。
現在までｓｉＲＮＡの送達のために、陽イオン性高分子、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ウイルスおよび様々なナノ物質が開発された。陽イオン性高分子とＬＮＰの臨床的適用は、生体内構造の毒性及び／又は不安定性に注意する必要があり、ウイルス性の遺伝子の送達は、低い包装能力のほか突然変異誘発の問題がある。ｓｉＲＮＡバックボーンの化学的変形は、安定性と細胞吸収を増加させることができるが、高コスト、労働集約性、時間のかかる工程、及び標的細胞での満足できる効果を得るための多量のｓｉＲＮＡ投与のような欠点を依然として有している。
本発明は、ＣＴＧＦ発現を高効率で抑制し、優れた線維増殖性疾患の予防または治療効果を持つ組成物を提供することを目的とする。
１．配列番号１の配列と１０ヌクレオチド以上相補的な配列からなる核酸分子；を含む、ＣＴＧＦ遺伝子発現抑制用組成物。
２．前記項目１において、配列番号１の配列と１６ヌクレオチド以上相補的な配列からなる核酸分子；を含む組成物。
３．前記項目１において、配列番号１の配列全体と相補的な配列からなる核酸分子；を含む組成物。
４．前記項目１において、前記核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＰＮＡまたはｍｉＲＮＡの１つの鎖（strand）をなすものである組成物。
５．前記項目４において、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号５４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５５の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５６の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号５７の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５８の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６０の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６５の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６７の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６９の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号７０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号７１の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号７２の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ；からなる群より選択される少なくとも一つのｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む組成物。
６．前記項目５において、前記センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡ配列の３’末端にＵＵまたはｄＴｄＴの配列をさらに含む組成物。
７．前記項目４において、配列番号８７～９９の配列からなる群より選択される一つの配列からなるＰＮＡを少なくとも一つ含む組成物。
８．前記項目７において、前記ＰＮＡの少なくとも一つの末端に配列番号１０１～１１３からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるペプチド；又はｍＰＥＧ５０００がさらに結合されたものである組成物。
９．前記項目１～８のいずれか一つに記載の組成物を含む線維増殖性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
１０．前記項目９において、前記線維増殖性疾患は、肥厚性瘢痕、ケロイド、線維症、肺線維症、特発性肺線維症、肝線維症、腎線維症、嚢胞性線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、皮膚硬化症、糖尿病性網膜症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、放射－誘導線維症、心筋線維症、糖尿病性腎臓病、慢性腎不全症、慢性ウイルス性肝炎、胆道線維症、脂肪肝炎、アルコール性脂肪肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、増殖性硝子体網膜症、筋骨格系の腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、膠芽腫、肺癌、卵巣癌、食道癌、大腸癌、膵臓癌、腎臓硬化症、サルコイドーシス、緑内障、黄斑変性、網膜下線維症、脈絡膜血管新生、硝子体網膜症、増殖性硝子体網膜症、糖尿病網膜症、角膜炎、翼状片、瞼裂斑、皮膚硬化症、子宮筋腫、全身硬化症、糸球体腎炎、ヒト免疫不全ウイルス腎症、急性呼吸困難症候群、慢性閉塞性肺疾患、レイノー病、関節リウマチ、多発性筋炎、血管狭窄症、歯周炎、および歯周齦からなる群より選択される少なくとも一つである組成物。
１１．ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持した多孔性シリカ粒子；を含み、
前記多孔性シリカ粒子は、直径５ｎｍ未満の気孔を有するシリカ粒子を１２０℃～１８０℃で２４時間～９６時間膨張剤と反応させ、前記直径５ｎｍ未満の気孔を膨張させるステップと、前記気孔が膨張されたシリカ粒子を４００℃以上の温度で３時間以上か焼するステップとを含んで製造され、
前記多孔性シリカ粒子の平均直径は１００ｎｍ～１，０００ｎｍであり、そのＢＥＴ表面積は２００ｍ２／ｇ～７００ｍ２／ｇであり、そのｇ当たりの体積は０．７ｍｌ～２．２ｍｌであり、
前記多孔性シリカ粒子は、下記数式１の吸光度の比が１／２となるｔが２４以上である、ＣＴＧＦ遺伝子発現抑制用組成物。
[数式１]
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは７．４であり、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
１２．前記項目１１において、前記多孔性シリカ粒子は、外部表面または気孔内部が中性のｐＨで陽電荷または無電荷を帯びるものである組成物。
１３．前記項目１１において、前記多孔性シリカ粒子は、親水性または疎水性の官能基を有するものである組成物。
１４．前記項目１１において、前記核酸分子は、配列番号１の配列と１０ヌクレオチド以上相補的なものである組成物。
１５．前記項目１１において、前記核酸分子は、配列番号１の配列と１６ヌクレオチド以上相補的なものである組成物。
１６．前記項目１１において、配列番号１の配列全体と相補的な配列からなる核酸分子；を含む組成物。
１７．前記項目１１において、前記核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＰＮＡまたはｍｉＲＮＡの１つの鎖（strand）をなすものである組成物。
１８．前記項目１７において、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号５４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５５の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５６の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号５７の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５８の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６０の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６５の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６７の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６９の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号７０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号７１の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号７２の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ；からなる群より選択される少なくとも一つのｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む組成物。
１９．前記項目１８において、前記センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡ配列の３’末端にＵＵまたはｄＴｄＴの配列をさらに含むものである組成物。
２０．前記項目１７において、配列番号８７～９９の配列からなる群より選択される一つの配列からなるＰＮＡを少なくとも一つ含む組成物。
２１．前記項目２０において、前記ＰＮＡの少なくとも一つの末端に配列番号１０１～１１３からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるペプチド；またはｍＰＥＧ５０００がさらに結合されたものである組成物。
２２．前記項目１１～２１のいずれか一つに記載の組成物を含む線維増殖性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
２３．前記項目２２において、前記線維増殖性疾患は、肥厚性瘢痕、ケロイド、線維症、肺線維症、特発性肺線維症、肝線維症、腎線維症、嚢胞性線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、皮膚硬化症、糖尿病性網膜症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、放射－誘導線維症、心筋線維症、糖尿病性腎臓病、慢性腎不全症、慢性ウイルス性肝炎、胆道線維症、脂肪肝炎、アルコール性脂肪肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、増殖性硝子体網膜症、筋骨格系の腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、膠芽腫、肺癌、卵巣癌、食道癌、大腸癌、膵臓癌、腎臓硬化症、サルコイドーシス、緑内障、黄斑変性、網膜下線維症、脈絡膜血管新生、硝子体網膜症、増殖性硝子体網膜症、糖尿病網膜症、角膜炎、翼状片、瞼裂斑、皮膚硬化症、子宮筋腫、全身硬化症、糸球体腎炎、ヒト免疫不全ウイルス腎症、急性呼吸困難症候群、慢性閉塞性肺疾患、レイノー病、関節リウマチ、多発性筋炎、血管狭窄症、歯周炎、および歯周齦からなる群より選択される少なくとも一つである組成物。
本発明の組成物は、ＣＴＧＦ及びコラーゲンの発現を効果的に抑制できる核酸分子を含んでおり、ＣＴＧＦまたはコラーゲンの過剰発現による様々な線維増殖性疾患の予防または治療が可能である。
図１は、病理学的経路によって誘導されたＣＴＧＦの過剰発現による肥厚性瘢痕及びケロイドの細胞機序、およびＬＥＭ－Ｓ４０１の効果的なＣＴＧＦ発現抑制の原理を模式的に示すものである。 図２、３は、Ａ５４９（図２）及びＨａＣａＴ（図３）細胞のそれぞれを様々な容量のＬＥＭ－Ｓ４０１（１２．５、２５、５０、１００ｎＭ）で６時間処理し、ＣＴＧＦの発現を１２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βによって誘導し、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの発現レベルをＲＴ－ＰＣＲを用いて対照群（無処理、ｓｉＣＴＧＦのみ処理、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬのみ処理、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｓｉＲＮＡ処理）と比較したものである（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５）。 図４、５は、Ａ５４９（図４）及びＨａＣａＴ（図５）細胞のそれぞれをＬＥＭ－Ｓ４０１及びｓｉＣＴＧＦを担持した脂質ナノ粒子（Lipid nanoparticle，ＬＮＰ）で処理して比較したものであり、細胞を７２時間及び９６時間培養し、取得１２時間前にＴＧＦ－βを処理した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５）。 図６は、ＬＥＭ－Ｓ４０１をマウスの皮膚に皮下注入し、ＬＥＭ－Ｓ４０１の注入部位でのｓｉＣＴＧＦ及びＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの皮膚滞留時間を測定するために、切除されたマウスの皮膚の蛍光画像を異なる時点（１日、３日、５日）で撮影したものであり（左、Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：２５ｍｍ）、ＤＡＰＩ染色後、同じ方法で処理された皮膚切片の蛍光画像を撮影したものである（右、Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：１００μｍ）。 図７は、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬに担持されていないＦＩＴＣ－接合されたｓｉＣＴＧＦを皮下注入した切除された皮膚の蛍光画像を異なる時点で撮影したものであり（左）、ＤＡＰＩ染色後、同じ方法で処理された皮膚切片の蛍光画像を撮影したものである（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：１００μｍ）。 図８～１５は、０、４、８、１２日にＬＥＭ－Ｓ４０１（１ｎｍol）を、マウスの皮膚の傷周囲に皮下注入した結果を示すものである。図８～１０は、ＣＴＧＦ及びコラーゲンタイプ１、３のｍＲＮＡ発現レベルをＲＴ－ＰＣＲを用いて１６日目に測定したものである。図１１は、傷ついたマウスの皮膚の画像をＬＥＭ－Ｓ４０１の処理群と対照群（緩衝液、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬのみ、ｓｉＣＴＧＦのみ）とで皮膚の不規則及び柔らかさを処理１０日目に比較したものである。図１２は、ＣＴＧＦとコラーゲンタイプ１、３をそれぞれ認識する抗体で組織を染色した後、ＬＥＭ－Ｓ４０１、自由ｓｉＣＴＧＦ、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬのみ、及び緩衝液で処理した皮膚切片の蛍光画像を撮影したもので、続いて２次抗体を皮膚切片に処理したものである（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：１００μｍ）。図１３～１５は、図１２の画像に基づいて免疫組織化学データを定量分析したものである（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５）。 図１６は、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの濃度増加によるＡ５４９及びＨａＣａＴ細胞での毒性をＣＣＫ－８分析で測定したものである。 図１７は、Ａ５４９及びＨａＣａＴ細胞のそれぞれを２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βで２４時間処理した結果である。細胞は異なる時点で取得され、ＣＴＧＦ発現レベルはＲＴ－ＰＣＲにより分析された。 図１８～２４は、ＬＥＭ－Ｓ４０１を傷の形成から１０、１４、１８、２２日に傷部位に皮下注入した結果である。図１８～２０は、注入部位のＣＴＧＦ及びコラーゲンタイプ１、３のｍＲＮＡの発現レベルをＲＴ－ＰＣＲにより測定したものである。図２１は、取得したマウスの皮膚のＣＴＧＦ及びコラーゲンタイプ１、３の蛍光画像を免疫組織化学法により測定したものである（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：１００μｍ）。図２２～２４は、免疫組織化学データを定量化したものである（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５）。 図２５は、ｓｉＲＮＡをＤＤＶ（多孔性シリカ粒子、ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）に担持してマウスに皮下注入した場合と、担持していないｆｒｅｅ－ｓｉＲＮＡをマウスに皮下注入した場合における体内蛍光画像の検出を比較した結果である。 図２６、２７は、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ（＃１）；配列番号４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ（＃２）；配列番号７の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ（＃３）のＡ５４９及びＨａＣａＴ細胞内のＣＴＧＦ発現レベル抑制能を確認したものでる。図２６は、ｓｉＲＮＡ処理１２時間後にＴＧＦ－βを処理したものであり、図２７は、ＴＧＦ－β処理２４時間後にｓｉＲＮＡを処理したものである。 図２８は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の顕微鏡写真である。 図２９は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の顕微鏡写真である。 図３０は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の製造工程における小気孔粒子の顕微鏡写真である。 図３１は、本発明の一実施形態に係る小気孔粒子の顕微鏡写真である。 図３２は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の気孔直径別の顕微鏡写真である。 ＤＤＶ（Degradable Delivery Vehicle）は、実施例の粒子であり、括弧内の数字は粒子の直径を、下付き文字の数字は気孔の直径を意味する。例えば、ＤＤＶ（２００）１０は、粒子直径が２００ｎｍ、気孔直径が１０ｎｍである実施例の粒子を意味する。 図３３は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の生分解性を確認できる顕微鏡写真である。 図３４は、一つの例示による円筒状の透過膜を備えたチューブである。 図３５は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の時間経過による吸光度の減少の結果である。 図３６は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の時間経過による粒径別の吸光度の減少の結果である。 図３７は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の時間経過による気孔直径別の吸光度の減少の結果である。 図３８は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の時間経過による環境のｐＨ別の吸光度の減少の結果である。 図３９は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の時間経過による吸光度の減少の結果である。 図４０は、一つの例示によるｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの放出を確認するチューブである。 図４１は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子に担持されたｓｉＲＮＡの時間経過による放出程度を示すものである。
本発明の具体的な説明において用語の具体的な意味を定義するが、これは当該分野の通常の技術者に理解される意味として受け入れられるものであるだけで、下記に定義された特定の意味に限定しようとする意図ではない。
「ｓｉＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉または遺伝子サイレンシングを媒介することができる核酸分子を意味する。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制できるので、効率のよい遺伝子のノックダウン方法または遺伝子治療方法として提供される。ｓｉＲＮＡ分子は、センス鎖（標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相応する（corresponding）配列）と、アンチセンス鎖（標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的な配列）とが互いに反対側に位置して二重鎖をなす構造を有することができる。また、ｓｉＲＮＡ分子は、自己相補性（self－complementary）のセンス及びアンチセンス鎖を有する単一鎖の構造を有することができる。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ同士にペアをなす二重鎖ＲＮＡの部分が完全に対をなすものに限定されず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）等によって対を成していない部分が含まれ得る。ｓｉＲＮＡの末端構造は、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉ（RNA interference）効果により抑制できるものであれば、平滑（blunt）末端または粘着（cohesive）末端のいずれも可能である。粘着末端構造としては、３’－末端突出構造と５’－末端突出構造のいずれも可能である。また、ｓｉＲＮＡ分子は、自己相補性のセンスとアンチセンス鎖との間に短いヌクレオチド配列（例えば、約５－１５ｎｔ）が挿入された形態を有することができる。この場合、ヌクレオチド配列の発現によって形成されたｓｉＲＮＡ分子は、分子内混成化によってヘアピン構造を形成することになり、全体としてはステム・アンド・ループ構造を形成することになる。このステム・アンド・ループ構造は、インビトロ（in vitro）またはインビボ（in vivo）でプロセシングされ、ＲＮＡｉを媒介できる活性のｓｉＲＮＡ分子を生成する。
「ｄｓＲＮＡ」とは、ｓｉＲＮＡの前駆体分子であり、標的細胞のＤＩＣＥＲ酵素（Ribonuclease III）を含むＲＩＳＣ複合体と会合してｓｉＲＮＡに切断され、この過程でＲＮＡｉが発生する。ｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡよりも数ヌクレオチドだけ長い配列を有し、センス鎖（標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相応する（corresponding）配列）とアンチセンス鎖（標的遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的な配列）が互いに反対側に位置して二重鎖をなす構造を有することができる。
「ＰＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡと類似の構造を持つが、ＤＮＡ又はＲＮＡとは異なり、電荷を帯びないように設計され、強い結合力を有する合成ポリマーである。ＤＮＡとＲＮＡがデオキシリボース（deoxyribose）又はリボース（ribose）糖バックボーン（backbone）をそれぞれ有するのに対して、ＰＮＡのバックボーンは、反復的なＮ－（２－アミノエチル）－グリシン（（N－（2－aminoethyl）－glycine）単位がペプチド結合で連結された構造を有する。プリン（purine）とピリミジン（pyrimidine）塩基がメチレン（－ＣＨ２－）とカルボニル基（－Ｃ＝Ｏ－）でバックボーンに連結されている構造であり、ペプチドと同様に両末端にそれぞれＮ－末端とＣ－末端を有する。
「核酸」とは、任意のＰＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、組織サンプルに存在する染色体、ミトコンドリア、ウイルス及び／又は細菌核酸を含む意味である。二本鎖核酸分子のいずれか１つ又は２つの鎖を含み、無損傷核酸分子の任意の断片または一部を含む。
「遺伝子」とは、タンパク質のコーディングまたは転写時、または他の遺伝子発現の調節時に機能的な役割を持つ任意の核酸配列またはその一部を意味する。遺伝子は、機能的タンパク質をコードするすべての核酸またはタンパク質をコードまたは発現する核酸の一部のみからなり得る。核酸配列は、エクソン、イントロン、開始または終了領域、プロモーター配列、他の調節配列または遺伝子に隣接する特有の配列内に遺伝子異常を含むことができる。
用語「遺伝子発現」とは、一般的に生物学的活性のあるポリペプチドがＤＮＡ配列から生成され、細胞で生物学的活性を示す細胞プロセスを意味する。その意味で、遺伝子発現は、転写及び解読のプロセスを含むだけでなく、遺伝子または遺伝子産物の生物学的活性に影響を与えることができる転写後および解読後のプロセスを含む。前記プロセスは、ＲＮＡの合成、加工及び輸送だけでなく、ポリペプチドの合成、輸送、およびポリペプチドの解読後の変形を含むが、これらに限定されるものではない。タンパク質産物を暗号化しない遺伝子、例えば、ｓｉＲＮＡ遺伝子の場合に、「遺伝子発現」という用語は、前駆体ｓｉＲＮＡが遺伝子から生成されるプロセスを意味する。通常、前記プロセスは、タンパク質暗号遺伝子に対してＲＮＡポリメラーゼＩＩによって誘導される転写とは異なり、ｓｉＲＮＡ遺伝子の転写産物が解読されてタンパク質を生成しないが、転写と呼ばれる。それにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ遺伝子からの成熟ｓｉＲＮＡの生成は、その用語が本明細書に使用されるように「遺伝子発現」という用語によって含まれる。
用語「標的遺伝子（target gene）」とは、本願に開示される主題の方法および組成物を使用して調整するために標的とする遺伝子を意味する。このため、標的遺伝子は、その発現レベルがｍＲＮＡまたはポリペプチドのレベルにｓｉＲＮＡによって下向き調節される核酸配列を含む。同様に、用語「標的ＲＮＡ」または「標的ｍＲＮＡ」とは、ｓｉＲＮＡが結合して標的遺伝子の発現の調節を誘導する標的遺伝子の転写体を意味する。
用語「転写（transcription）」とは、遺伝子の暗号配列に存在する構造情報のＲＮＡへの発現を誘導する遺伝子とＲＮＡポリメラーゼの相互作用を含む細胞プロセスを意味する。
「下向き調節（down－regulation）」という表現は、正常組織細胞に比べて、活性化された細胞で細胞内転写（gene transcription）または翻訳（gene translation）によって、特定の遺伝子のｍＲＮＡへの発現またはタンパク質への発現量が顕著に減少したことを意味する。
「治療」とは、有益な、または望ましい臨床的結果を得るためのアクセスを意味する。本発明の目的のために、有益な、または望ましい臨床的結果は、非限定的に、症状の緩和、疾患の範囲の減少、疾患状態の安定化（即ち、悪化しない）、疾患の進行の遅延化または緩徐化、疾患状態の改善または一時的緩和および軽減（部分的または完全な）、検出可能かまたは検出不可能かを含む。また、「治療」は、治療を受けていないときに予想される生存率と比較して生存率を伸ばすことを意味し得る。治療は、治療学的治療および予防的または予防措置方法のすべてを指す。前記治療は、予防される障害だけでなく、既に発生した障害において要する治療を含む。
「予防」とは、関連疾患の発症を抑制または遅延させるあらゆる行為を意味する。本願の組成物が、初期症状、または示される前に投与した場合に関連疾患を予防できることは、当業者に自明であろう。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、配列番号１の配列と１０ヌクレオチド以上相補的な配列からなる核酸分子；を含むＣＴＧＦ遺伝子発現抑制用組成物を提供するものである。
配列番号１の配列との相補性は、連続的または非連続的に、１０ヌクレオチド（nucleotide；nt）以上、１１ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１３ヌクレオチド以上、１４ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、１６ヌクレオチド以上、１７ヌクレオチド以上、または１８ヌクレオチド全体であってもよい。
前記核酸分子は、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＰＮＡまたはｍｉＲＮＡの１つの鎖（strand）をなすものであってもよい。この場合、前記ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＰＮＡまたはｍｉＲＮＡは、ＲＮＡi（ＲＮＡ干渉；RNA interference）によって前記ＣＴＧＦ遺伝子の発現を抑制するものであってもよく、より具体的には、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体であるｍＲＮＡ配列のうち、配列番号１の配列からなる部位の少なくとも一部に相補的に結合してＣＴＧＦ遺伝子の発現を抑制するものであってもよい。
前記核酸分子がｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＰＮＡまたはｍｉＲＮＡの１つの鎖（strand）をなす場合、その配列は、当該分野の通常の技術者のレベルで前記ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＰＮＡまたはｍｉＲＮＡの設計時に考慮すべき条件に合致して設計されたものであることは自明である。この場合、回文構造（palindrome）配列を持たないようにして、ヘアピン構造（hairpin shape）、十字型構造（cross shape）によるＲＮＡi効率の低下現象を回避するように設計されたものであってもよい。具体的には、本発明のｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの例としては、配列番号１００（5’－AACUUGAACU－3’）の配列を含まないように設計されたものであってもよく、本発明のＰＮＡの例としては、両末端がＣとＧをそれぞれ有して相補的な関係が形成されることを回避するように設計されたものであってもよく、前記核酸分子全体の配列の長さを適切な長さ以上に維持してＲＮＡiの効率を安定的に有するように設計することができる。
前記核酸分子の全体配列の長さは、１０～３０、１１～２９、１２～２８、１３～２７、１４～２６、１５～２５、１６～２４、１６～２３、１６～２２、１６～２１または１６～２０ヌクレオチド長さであってもよいが、必ずしもこれに限定されるものではない。適切な長さ以上を維持してＲＮＡiの効率を安定的に有するようにする一方、適切な長さ以下を維持して生体内送達効率を維持するために、好ましくは１６～２０ヌクレオチド長さであってもよい。
前記核酸分子は、具体的には、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡと相補的に結合してｓｉＲＮＡをなすアンチセンスＲＮＡ（配列番号２の配列）であってもよく、配列番号３の配列からなる鎖（strand）と相補的に結合してｄｓＲＮＡをなす鎖であってもよく、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡと相補的に結合してｓｉＲＮＡをなすアンチセンスＲＮＡ（配列番号５３の配列）であってもよく、配列番号５４の配列からなる鎖（strand）と相補的に結合してｄｓＲＮＡをなす鎖であってもよく、配列番号５５の配列からなるセンスＲＮＡと相補的に結合してｓｉＲＮＡをなすアンチセンスＲＮＡ（配列番号５６の配列）であってもよく、配列番号５７の配列からなる鎖（strand）と相補的に結合してｄｓＲＮＡをなす鎖であってもよく、配列番号５８の配列からなるセンスＲＮＡと相補的に結合してｓｉＲＮＡをなすアンチセンスＲＮＡ（配列番号５９の配列）であってもよく、配列番号６０の配列からなる鎖（strand）と相補的に結合してｄｓＲＮＡをなす鎖であってもよく、配列番号６１の配列からなるセンスＲＮＡと相補的に結合してｓｉＲＮＡをなすアンチセンスＲＮＡ（配列番号６２の配列）であってもよく、配列番号６３の配列からなる鎖（strand）と相補的に結合してｄｓＲＮＡをなす鎖であってもよく、配列番号６４の配列からなるセンスＲＮＡと相補的に結合してｓｉＲＮＡをなすアンチセンスＲＮＡ（配列番号６５の配列）であってもよく、配列番号６６の配列からなる鎖（strand）と相補的に結合してｄｓＲＮＡをなす鎖であってもよく、配列番号６７の配列からなるセンスＲＮＡと相補的に結合してｓｉＲＮＡをなすアンチセンスＲＮＡ（配列番号６８の配列）であってもよく、配列番号６９の配列からなる鎖（strand）と相補的に結合してｄｓＲＮＡをなす鎖であってもよく、配列番号７０の配列からなるセンスＲＮＡと相補的に結合してｓｉＲＮＡをなすアンチセンスＲＮＡ（配列番号７１の配列）であってもよく、配列番号７２の配列からなる鎖（strand）と相補的に結合してｄｓＲＮＡをなす鎖であってもよい。
前記核酸分子は、具体的には、配列番号８７～９９の配列からなる群より選択される一つの配列からなるＰＮＡであってもよい。
前記記載された配列の具体的な情報は、添付の配列表及び下記表１に具体的に示す。
本発明の核酸分子は、ヒトを含む動物、例えば、サル（monkeys）、ブタ（pigs）、ウマ（horses）、ウシ（cows）、ヒツジ（sheeps）、イヌ（dogs）、ネコ（cats）、マウス（mice）、ウサギ（rabbits）などに由来するものであってもよく、好ましくは、ヒト由来のものであってもよい。
本発明の核酸分子は、それを構成する核酸分子の作用性等価物、例えば、本発明の核酸分子の一部塩基配列が、欠失（deletion）、置換（substitution）または挿入（insertion）によって変形されたが、本発明の核酸分子と機能的に同じ作用をすることができる変異体（variants）を含む概念である。
より具体的には、本発明の核酸分子がｓｉＲＮＡのセンスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡをなす場合には、前記センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡ配列の３’末端にＵＵまたはｄＴｄＴの配列をさらに含むものであってもよい。これは核酸加水分解酵素への抵抗性の増大によるｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡの構造的安定性の向上、安定したＲＩＳＣの誘導によるｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡのＲＮＡｉ効率性の向上などの利点をｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡに付与することができる。
より具体的には、本発明の核酸分子がＰＮＡをなす場合には、少なくとも一つの末端に配列番号１０１～１１３からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるペプチド；またはｍＰＥＧ５０００がさらに結合されたものであってもよい。これはＰＮＡの組成物中の溶解度（solubility）または浸透性（penetration）を上昇させることを目的とすることができ、両末端（Ｎ－末端またはＣ－末端）のうちＣ－末端に結合されることが、別のリンカーを必要としない点でより好ましい。
本発明の核酸分子は、標準分子生物学技術、例えば、化学的合成方法または組換え方法を用いて分離または製造するか、又は市販のものを使用することができる。また、本発明の組成物は、本発明の核酸分子そのものだけでなく、細胞内で本発明の核酸分子の発現率を増加させることができる他の物質、例えば化合物、天然物、新規タンパク質などを含むことができる。
一方、本発明の核酸分子は、細胞内発現のためのベクターに含んで提供することができる。
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ及びＤＥＡＥ－デキストランの複合体、ＤＮＡ及び核タンパク質の複合体、ＤＮＡ及び脂質の複合体などの様々な形質転換技術を用いて細胞内に導入できる。そのために、本発明の核酸分子は、細胞内への効率的な導入を可能にする送達体内に含まれたものであってもよい。前記送達体は、好ましくはベクターであり、ウイルスベクター及び非ウイルスベクターのいずれも使用可能である。ウイルスベクター（viral vector）としては、例えば、レンチウイルス（lentivirus）、レトロウイルス（retrovirus）、アデノウイルス（adenovirus）、ヘルペスウイルス（herpes virus）およびアビポックスウイルス（avipox virus）ベクターなどを使用することができ、好ましくはレンチウイルスベクターであるが、これらに限定されるものではない。レンチウイルスは、レトロウイルスの一種であり、核膜孔（nucleopore）や完全な核膜への能動導入を可能にする事前－統合複合体（ウイルス「シェル（shell）」）の求核性により、分裂細胞だけでなく、未分裂細胞も感染させる特徴がある。
また、本発明の核酸分子を含むベクターは、選別マーカーをさらに含むことが好ましい。前記「選別マーカー（selection marker）」とは、本発明の核酸分子が導入された細胞の選別を容易にするためのものである。前記ベクターで使用できる選別マーカーとしては、ベクターの導入有無を容易に検出または測定できる遺伝子であれば特に限定されないが、代表的には、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能な表現型を付与するマーカー、例えば、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ピューロマイシン（puromycin）、ネオマイシン（Neomycin：Neo）、ハイグロマイシン（hygromycin：Hyg）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（histidinol dehydrogenase gene：hisD）、及びグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（guanine phosphosribosyltransferase：Gpt）などがあり、好ましくは、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）及びピューロマイシンマーカーを使用することができる。
本発明は、前述した組成物を含む線維増殖性疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供するものである。
本発明の薬学的組成物は、線維増殖性疾患の予防または治療効果を有するものであって、この効果は本発明の核酸分子のＣＴＧＦ遺伝子の発現を抑制することにより達成される効果であり得る。
本発明の薬学的組成物の予防または治療の対象疾患である線維増殖性疾患の例としては、肥厚性瘢痕、ケロイド、線維症、肺線維症、特発性肺線維症、肝線維症、腎線維症、嚢胞性線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、皮膚硬化症、糖尿病性網膜症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、放射－誘導線維症、心筋線維症、糖尿病性腎臓病、慢性腎不全症、慢性ウイルス性肝炎、胆道線維症、脂肪肝炎、アルコール性脂肪肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、増殖性硝子体網膜症、筋骨格系の腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、膠芽腫、肺癌、卵巣癌、食道癌、大腸癌、膵臓癌、腎臓硬化症、サルコイドーシス、緑内障、黄斑変性、網膜下線維症、脈絡膜血管新生、硝子体網膜症、増殖性硝子体網膜症、糖尿病網膜症、角膜炎、翼状片、瞼裂斑、皮膚硬化症、子宮筋腫、全身硬化症、糸球体腎炎、ヒト免疫不全ウイルス腎症、急性呼吸困難症候群、慢性閉塞性肺疾患、レイノー病、関節リウマチ、多発性筋炎、血管狭窄症、歯周炎、および歯周齦からなる群より選択される少なくとも一つの疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、ＣＴＧＦまたはコラーゲンなどの過剰発現による疾患に該当するものであれば特に制限されない。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化することができる。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を意味する。液状溶液に製剤化される組成物において薬学的に許容可能な担体は、滅菌および生体に適したものとして、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち１つの成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液及び静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
本発明の薬学的組成物は、本発明の核酸分子を有効成分として含むいずれの剤型にも適用可能であり、経口用または非経口用の剤形に製造することができる。本発明の薬学的剤形は、口腔（oral）、直腸（rectal）、鼻腔（nasal）、局所（topical；頬及び舌下を含む）、皮下、膣（vaginal）または非経口（parenteral；筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与に適したもの、あるいは吸入（inhalation）または注入（insufflation）による投与に適した形態を含む。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量を投与する。有効容量は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野でよく知られている要素によって決定できる。本発明の薬学的組成物は、個々の治療剤として投与しても、他の治療剤と併用して投与してもよい。また、従来の治療剤と順次または同時に投与することができ、単一または多重投与することができる。前記の要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。
本発明の薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食物、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が非常に多様である。適正な投与量は、例えば、患者の体内に蓄積された薬物の量及び／又は使用される本発明の核酸分子の具体的な効能程度によって異なり得る。一般的に、イン・ビボ動物モデル及びイン・ビトロで効果的なものと測定されたＥＣ５０に基づいて計算することができ、例えば、体重１ｋｇ当たりに０．０１μｇ～１ｇであってもよい。日、週、月、または年の単位期間に、単位期間当たりの一回または数回に分けて投与してもよく、若しくはインフュージョンポンプを用いて長期間連続して投与してもよい。反復投与の回数は、薬物の体内滞在時間、体内薬物濃度などを考慮して決定する。疾患の治療経過によっては、治療された後でも再発防止のために組成物を投与することができる。
本発明の薬学的組成物は、線維増殖性疾患の治療に関連して同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上、または有効成分の溶解性及び／又は吸収性を維持／増加させる化合物をさらに含有することができる。また必要に応じて、化学治療剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、及び／又は免疫調節剤などをさらに含むことができる。
また、本発明の薬学的組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように、当該分野で公知の方法を用いて剤形化することができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射液、滅菌粉末の形態であってもよい。
本発明の組成物は、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持体に担持したものであってもよい。また、担持体の種類は、核酸分子を担持できるものであって当該分野で公知のものであれば特に制限されないが、例えば、リポソーム、リポフェクタミン、デンドリマー、ミセル、多孔性シリカ粒子、アミノクレイ、及びヒドロゲルからなる群より選択される少なくとも一つであってもよく、好ましくは、高い核酸分子担持率、徐放性、生分解性などの利点を有する多孔性シリカ粒子であってもよい。
本発明は、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持した多孔性シリカ粒子；を含むＣＴＧＦ遺伝子発現抑制用組成物を提供する。前記多孔性シリカ粒子は、シリカ（ＳｉＯ２）素材の粒子であり、ナノサイズの粒径を有する。
本発明の多孔性シリカナノ粒子は、多孔性粒子であり、ナノサイズの気孔を有し、その表面（外部表面）及び／又は気孔内部にＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持することができる。
本発明の多孔性シリカ粒子は、生分解性粒子であり、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持して体内に投与されたとき、体内で生分解されてＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を放出することができる。つまり、本発明の多孔性シリカ粒子は、体内で徐々に分解され、担持されたＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子が徐放的に放出されるようにすることができる。例えば、下記数式１の吸光度の比が１／２となるｔは、２４以上である。
[数式１]
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは、７．４であり、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
前記数式１は、多孔性シリカ粒子が体内と同様の環境でどの程度の速度で分解されるかを意味するものである。
前記数式１における吸光度Ａ０、Ａｔは、例えば図３４に示されているように、円筒状の透過膜に多孔性シリカ粒子および懸濁液を入れ、透過膜の外部にも同じ懸濁液を入れて測定したものであり得る。
本発明の多孔性シリカ粒子は、生分解性であり、懸濁液中で徐々に分解され得る。直径５０ｋＤａは約５ｎｍに相当するものであり、生分解された多孔性シリカ粒子は、直径５０ｋＤａの透過膜を通過することができる。円筒状の透過膜は、６０ｒｐｍの水平攪拌下にあるので、懸濁液を均一に混合することができ、分解された多孔性シリカ粒子は、透過膜の外部に放出され得る。
前記数式１での吸光度は、例えば、透過膜の外部の懸濁液が新しい懸濁液に入れ替わる環境下で測定したものであり得る。懸濁液は、持続的に入れ替わるものであってもよく、一定期間ごとに入れ替わるものであってもよい。前記一定期間は、定期的または不定期的な期間であってもよい。例えば、１時間～１週間の範囲内で、１時間おき、２時間おき、３時間おき、６時間おき、１２時間おき、２４時間おき、２日おき、３日おき、４日おき、７日おき等に入れ替えることができるが、これらに限定されるものではない。
前記「吸光度の比が１／２となる」ということは、ｔ時間後の吸光度が初期吸光度の半分になるということであり、これは多孔性シリカ粒子の約半分が分解されたことを意味する。
前記懸濁液は緩衝溶液であってもよく、具体例としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）およびＳＢＦ（疑似体液）からなる群より選択される１種以上であってもよく、より具体的にはＰＢＳであってもよい。
本発明の前記数式１の吸光度の比が１／２となるｔは２４以上であり、例えばｔは２４～１２０であってもよく、例えば、前記範囲内で２４～９６、２４～７２、３０～７０、４０～７０、５０～６５などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の多孔性シリカ粒子は、前記数式１の吸光度の比が１／５となるｔが、例えば７０～１４０であってもよく、例えば、前記範囲内で８０～１４０、８０～１２０、８０～１１０、７０～１４０、７０～１２０、７０～１１０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の多孔性シリカ粒子は、前記数式１の吸光度の比が１／２０となるｔが、例えば１３０～２２０であってもよく、例えば、前記範囲内で１３０～２００、１４０～２００、１４０～１８０、１５０～１８０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の多孔性シリカ粒子は、測定される吸光度が０．０１以下となるｔが、例えば、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、５００以上、１，０００以上などであってもよく、その上限は２，０００であってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の多孔性シリカ粒子における前記数式１の吸光度の比とｔは、高い量の相関関係を有するものであり、例えば、ピアソン相関係数が０．８以上であってもよく、例えば０．９以上、０．９５以上であってもよい。
前記数式１のｔは、多孔性シリカ粒子が体内と同様の環境でどの程度の速度で分解されるかを意味するものである。これは、例えば多孔性シリカ粒子の表面積、粒径、気孔直径、表面及び／又は気孔内部の置換基、表面の緻密さの程度などを調節することによって調節できる。
例えば、粒子の表面積を増加させてｔを減少させるか、表面積を減少させてｔを増加させることができる。表面積は、粒子の直径、気孔の直径を調節することによって調節できる。また、表面及び／又は気孔内部に置換基を位置させ、多孔性シリカ粒子が環境（溶媒など）に直接露出することを減らしてｔを増加させることができる。また、多孔性シリカ粒子にＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持させ、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子と多孔性シリカ粒子間の親和度を増加させ、多孔性シリカ粒子が環境に直接露出することを減らしてｔを増加させることができる。また、粒子の製造時に表面をより緻密に製造してｔを増加させることもできる。前記に数式１のｔを調節できる様々な例を示したが、それらに限定されるものではない。
本発明の多孔性シリカ粒子は、例えば球状粒子であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の多孔性シリカ粒子は、平均粒径が例えば１５０ｎｍ～１，０００ｎｍであってもよく、例えば、前記範囲内で１５０ｎｍ～８００ｎｍ、１５０ｎｍ～５００ｎｍ、１５０ｎｍ～４００ｎｍ、１５０ｎｍ～３００ｎｍ、１５０ｎｍ～２００ｎｍであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の多孔性シリカ粒子は、平均気孔直径が例えば１ｎｍ～１００ｎｍであってもよく、例えば、前記範囲内で５ｎｍ～１００ｎｍ、７ｎｍ～１００ｎｍ、７ｎｍ～５０ｎｍ、１０ｎｍ～５０ｎｍ、１０ｎｍ～３０ｎｍ、７ｎｍ～３０ｎｍであってもよいが、これらに限定されるものではない。前記のような大きな直径を持って多量のＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持することができ、サイズの大きいＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の担持も可能である。
本発明の多孔性シリカ粒子は、ＢＥＴ表面積が、例えば２００ｍ２／ｇ～７００ｍ２／ｇであってもよい。例えば、前記範囲内で２００ｍ２／ｇ～７００ｍ２／ｇ、２００ｍ２／ｇ～６５０ｍ２／ｇ、２５０ｍ２／ｇ～６５０ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～７００ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～６５０ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～６００ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～５５０ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～５００ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ～４５０ｍ２／ｇなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の多孔性シリカナノ粒子は、ｇ当たりの体積が例えば０．７ｍｌ～２．２ｍｌであってもよい。例えば、前記範囲内で０．７ｍｌ～２．０ｍｌ、０．８ｍｌ～２．２ｍｌ、０．８ｍｌ～２．０ｍｌ、０．９ｍｌ～２．０ｍｌ、１．０ｍｌ～２．０ｍｌなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。ｇ当たりの体積が小さすぎると、分解速度が速くなりすぎることがあり、大きすぎると、製造が困難であるか、完全な形状を有しないことがある。
本発明の多孔性シリカ粒子は、外部表面及び／又は気孔内部に親水性置換基及び／又は疎水性置換基が存在し得る。例えば、表面及び気孔内部の両方に親水性置換基のみが存在するか、疎水性置換基のみが存在してもよく、表面または気孔内部の一方のみに親水性置換基が存在するか、疎水性置換基が存在してもよい。また、表面に親水性置換基が、気孔内部に疎水性置換基が存在してもよく、その逆の場合も可能である。
本発明の多孔性シリカ粒子に担持されたＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出は、主に、ナノ粒子の分解によって行われるものである。このため、前記置換基の調節によりＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出環境に対する多孔性シリカ粒子の相互作用を調節し、ナノ粒子自体の分解速度を調節して、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出速度を調節することができる。また、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、ナノ粒子から拡散して放出させることもできるが、前記置換基の調節によりＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子のナノ粒子への結合力を調節し、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出を調節することができる。
また、難溶性（疎水性）のＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力を強化するために、気孔内部に疎水性置換基が存在し、使用、製剤化のし易さなどの側面で粒子の表面に親水性置換基が存在するようにするなどの処理も可能である。
親水性置換基としては、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、カルボニル基、スルフヒドリル基、ホスフェート基、チオール基、アンモニウム基、エステル基、イミド基、チオイミド基、ケト基、エーテル基、インデン基、スルホニル基、ポリエチレングリコール基などが挙げられる。疎水性置換基としては、例えば、置換または非置換のＣ１～Ｃ３０のアルキル基、置換または非置換のＣ３～Ｃ３０のシクロアルキル基、置換または非置換のＣ６～Ｃ３０のアリール基、置換または非置換のＣ２～Ｃ３０のヘテロアリール基、ハロゲン基、Ｃ１～Ｃ３０のエステル基、及びハロゲン含有基などが挙げられる。
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、外部表面及び／又は気孔内部が陽電荷、陰電荷、及び／又は無電荷に帯電されたものであってもよい。例えば、表面及び気孔内部の両方が陽電荷に帯電されるか、陰電荷に帯電されてもよく、表面または気孔内部の一方のみが陽電荷に帯電されるか、陰電荷に帯電されてもよい。また、表面が陽電荷、気孔内部が陰電荷に帯電されてもよく、その逆の場合も可能であり、無電荷の場合も同様である。
前記帯電は、例えば、非イオン性置換基、陽イオン性置換基または陰イオン性置換基が存在することによって行われたものであり得る。
前記陽イオン性置換基は、例えば、塩基性基としてアミノ基、その他の窒素含有基などであってもよく、具体的には、アミノ基、アミノアルキル基、アルキルアミノ基、窒素原子を含むヘテロ環芳香族化合物基、シアン基及びグアニジン基からなる群より選択される少なくとも一つの官能基であってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記陰イオン性置換基は、例えば、酸性基としてカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、スルホン酸基（－ＳＯ３Ｈ）、チオール基（－ＳＨ）などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
同様に、前記帯電によって前記置換基の調節によりＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出環境に対する多孔性シリカ粒子の相互作用を調節し、ナノ粒子自体の分解速度を調節して、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出速度を調節することができる。また、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、ナノ粒子から拡散されて放出させることもできるが、前記置換基の調節によりＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子のナノ粒子への結合力を調節し、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出を調節することができる。
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、その表面及び／又は気孔内部に前記の他にＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の担持、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の標的細胞への移動、その他の目的のための物質の担持、又はその他の追加置換基の結合などのための置換基が存在してもよく、それに結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーなどをさらに含んでいてもよい。
前述した表面及び／又は気孔内部の置換基、電荷、結合物質などは、例えば、表面改質によって付加することができる。
表面改質は、例えば、導入しようとする置換基を有する化合物を粒子と反応させて行うことができ、前記化合物は、例えば、Ｃ１～Ｃ１０のアルコキシ基を有するアルコキシシランであってもよいが、これに限定されるものではない。前記アルコキシシランは、前記アルコキシ基を１つ以上有するものであり、例えば１～３つを有することができ、アルコキシ基の結合していない部位に導入しようとする置換基があるか、又はそれで置換された置換基があってもよい。
本発明の多孔性シリカ粒子は、例えば、小気孔の粒子の製造および気孔拡張工程を経て製造したものであってもよく、必要に応じて、か焼（calcination）工程、表面改質工程などをさらに経て製造したものであってもよい。か焼及び表面改質工程をすべて経た場合は、か焼後に表面改質されたものであってもよい。
前記小気孔の粒子は、例えば、平均気孔直径が１ｎｍ～５ｎｍの粒子であってもよい。
前記小気孔の粒子は、溶媒に界面活性剤とシリカ前駆物質を入れて攪拌及び均質化して得ることができる。
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはメタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記溶媒において、水と有機溶媒の混合溶媒の使用時の割合は、例えば、水と有機溶媒を１：０．７～１．５の体積比、例えば１：０．８～１．３の体積比で使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記界面活性剤は、例えば、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ＴＭＡＢｒ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）、ＴＭＰｒＣｌ（塩化ヘキサデシルトリメチルピリジニウム）、ＴＭＡＣｌ（塩化テトラメチルアンモニウム）などであってもよく、具体的にはＣＴＡＢを使用することができる。
前記界面活性剤は、例えば、溶媒１リットル当たりに１ｇ～１０ｇ、例えば、前記範囲内で１ｇ～８ｇ、２ｇ～８ｇ、３ｇ～８ｇなどの量で添加できるが、これらに限定されるものではない。
前記シリカ前駆物質は、溶媒に界面活性剤を添加して攪拌した後に添加することができる。シリカ前駆物質は、例えば、ＴＭＯＳ（テトラメチルオルソシリケート）であってもよいが、これに限定されるものではない。
前記攪拌は、例えば１０分～３０分間行うことができるが、これに限定されるものではない。
前記シリカ前駆物質は、例えば溶媒１リットル当たりに０．５ｍｌ～５ｍｌ、例えば、前記範囲内で０．５ｍｌ～４ｍｌ、０．５ｍｌ～３ｍｌ、０．５ｍｌ～２ｍｌ、１ｍｌ～２ｍｌなどの量で添加できるが、これらに限定されるものではない。
必要に応じて、触媒として水酸化ナトリウムをさらに使用することができるが、これは溶媒に界面活性剤を添加した後、シリカ前駆物質の添加前に撹拌しながら添加することができる。
前記水酸化ナトリウムは、例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を基準で溶媒１リットル当たりに０．５ｍｌ～８ｍｌ、例えば、前記範囲内で０．５ｍｌ～５ｍｌ、０．５ｍｌ～４ｍｌ、１ｍｌ～４ｍｌ、１ｍｌ～３ｍｌ、２ｍｌ～３ｍｌなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記シリカ前駆物質の添加後に溶液を攪拌して反応させることができる。攪拌は、例えば２時間～１５時間行うことができ、例えば、前記範囲内で３時間～１５時間、４時間～１５時間、４時間～１３時間、５時間～１２時間、６時間～１２時間、６時間～１０時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。攪拌時間（反応時間）が短すぎると、結晶核生成（nucleation）が不足することがある。
前記攪拌の後には、溶液を熟成（aging）させることができる。熟成は、例えば、８時間～２４時間行うことができ、例えば、前記範囲内で８時間～２０時間、８時間～１８時間、８時間～１６時間、８時間～１４時間、１０時間～１６時間、１０時間～１４時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
その後、反応産物を洗浄及び乾燥して多孔性シリカ粒子を得ることができる。必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。
前記未反応物質の分離は、例えば、遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。遠心分離は、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができ、具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
前記有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は、遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液を、そのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば、２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
前記乾燥は、例えば２０℃～１００℃で行うことができるが、これらに限定されず、真空状態で行うこともできる。
その後、前記で得られた多孔性シリカ粒子の気孔を拡張する。気孔の拡張は、気孔膨張剤を用いて行うことができる。
前記気孔膨張剤としては、例えば、トリメチルベンゼン、トリエチルベンゼン、トリプロピルベンゼン、トリブチルベンゼン、トリペンチルベンゼン、トリヘキシルベンゼン、トルエン、ベンゼンなどを使用でき、具体的にはトリメチルベンゼンを使用できるが、これらに限定されるものではない。
また、前記気孔膨張剤としては、例えばＮ，Ｎ－ジメチルヘキサデシルアミン（N，N－dimethylhexadecylamine、DMHA）を使用できるが、これに限定されるものではない。
前記気孔の拡張は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子を気孔膨張剤と混合し、加熱して反応させて行うことができる。
前記溶媒は、例えば、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記多孔性シリカ粒子は、例えば、溶媒１リットル当たりに１０ｇ～２００ｇ、例えば、前記範囲内で１０ｇ～１５０ｇ、１０ｇ～１００ｇ、３０ｇ～１００ｇ、４０ｇ～１００ｇ、５０ｇ～１００ｇ、５０ｇ～８０ｇ、６０ｇ～８０ｇなどの割合で添加できるが、これらに限定されるものではない。
前記多孔性シリカ粒子は、溶媒中に均一に分散されているものであってもよく、例えば、溶媒に多孔性シリカ粒子を添加して超音波分散したものであってもよい。混合溶媒を使用する場合には、第１の溶媒に多孔性シリカ粒子を分散した後、第２の溶媒を添加したものであってもよい。
前記気孔膨張剤は、例えば、溶媒１００体積部に対して１０～２００体積部、前記範囲内で１０～１５０体積部、１０～１００体積部、１０～８０体積部、３０～８０体積部、３０～７０体積部などの割合で添加できるが、これらに限定されるものではない。
前記反応は、例えば１２０℃～１９０℃で行うことができる。例えば、前記範囲内で１２０℃～１９０℃、１２０℃～１８０℃、１２０℃～１７０℃、１３０℃～１７０℃、１３０℃～１６０℃、１３０℃～１５０℃、１３０℃～１４０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
前記反応は、例えば６時間～９６時間行うことができる。例えば、前記範囲内で３０時間～９６時間、３０時間～９６時間、３０時間～８０時間、３０時間～７２時間、２４時間～８０時間、２４時間～７２時間、３６時間～９６時間、３６時間～８０時間、３６時間～７２時間、３６時間～６６時間、３６時間～６０時間、４８時間～９６時間、４８時間～８８時間、４８時間～８０時間、４８時間～７２時間、６時間～９６時間、７時間～９６時間、８時間～８０時間、９時間～７２時間、９時間～８０時間、６時間～７２時間、９時間～９６時間、１０時間～８０時間、１０時間～７２時間、１２時間～６６時間、１３時間～６０時間、１４時間～９６時間、１５時間～８８時間、１６時間～８０時間、１７時間～７２時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記例示した範囲内で時間および温度を調節して、反応が過剰せずに十分に行われるようにすることができる。例えば、反応温度が低くなると反応時間を増やしたり、反応温度が高くなると反応時間を短くしたりすることができる。反応が十分でないと、気孔の拡張が十分でないことがあり、反応が進行しすぎると、気孔の過剰拡張により粒子が崩壊することがある。
前記反応は、例えば、段階的に昇温して行うことができる。具体的には、常温から前記温度まで０．５℃／分～１５℃／分の速度で段階的に昇温して行うことができ、例えば、前記範囲内で１℃／分～１５℃／分、３℃／分～１５℃／分、３℃／分～１２℃／分、３℃／分～１０℃／分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記反応は、攪拌下で行うことができる。例えば１００ｒｐｍ以上の速度で攪拌することができ、具体的には１００ｒｐｍ～１，０００ｒｐｍの速度で行うことができるが、これらに限定されるものではない。
前記反応後は、反応液を徐々に冷却することができ、例えば、段階的に減温して冷却することができる。具体的には、前記温度から常温まで０．５℃／分～２０℃／分の速度で段階的に減温して行うことができ、例えば、前記範囲内で１℃／分～２０℃／分、３℃／分～２０℃／分、３℃／分～１２℃／分、３℃／分～１０℃／分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記冷却後に反応産物を洗浄および乾燥し、気孔が拡張された多孔性シリカ粒子を得ることができる。必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。
前記未反応物質の分離は、例えば、遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。遠心分離は、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上、１０回以下、例えば、３回、４回、５回、６回、７回、８回などであってもよい。
前記有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができ、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、例えば、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液を、そのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
前記乾燥は、例えば２０℃～１００℃で行うことができるが、これに限定されるものではなく、真空状態で行うこともできる。
その後、得られた粒子は、か焼することができる。か焼は、粒子を加熱してその表面および内部のシラノール基を除去して粒子の反応性を下げ、より緻密な構造にし、気孔を満たす有機物を除去する工程であり、例えば４００℃以上の温度に加熱して行うことができる。その上限は特に限定されず、例えば、１，０００℃、９００℃、８００℃、７００℃等であってもよい。加熱は、例えば３時間以上行うことができる。その上限は特に限定されず、例えば、２４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間などであってもよい。より具体的には、４００℃～７００℃で３時間～８時間、具体的には５００℃～６００℃で４時間～５時間行うことができるが、これらに限定されるものではない。
気孔を満たす有機物を除去することにより、残存有機物によって示される細胞毒性、泡の発生などの問題を防止することができる。
その後、得られた多孔性シリカ粒子は、表面改質することができる。表面改質は、表面及び／又は気孔内部に行うことができる。粒子表面と気孔内部は、同じように表面改質してもよく、異なるように表面改質してもよい。
前記表面改質により粒子が帯電されるようにするか、または親水性及び／又は疎水性の性質を持つようにすることができる。
より具体的には、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の効果的な担持のために、アミノ基、アミノアルキル基、アルキルアミノ基、窒素原子を含むヘテロ環芳香族化合物基、シアン基及びグアニジン基からなる群より選択される少なくとも一つの置換基を有するようにして、前記多孔性シリカ粒子の表面改質を行うことができる。
表面改質は、例えば、導入しようとする親水性、疎水性、陽イオン性、陰イオン性などの置換基を有する化合物を粒子と反応させて行うことができる。前記化合物は、例えばＣ１～Ｃ１０のアルコキシ基を有するアルコキシシランであってもよいが、これに限定されるものではない。
前記アルコキシシランは、前記アルコキシ基を１個以上有するものであり、例えば１～３個有することができ、アルコキシ基が結合していない部位に導入しようとする置換基があるか、又はそれで置換された置換基があってもよい。
前記アルコキシシランを多孔性シリカ粒子と反応させると、シリコン原子と酸素原子との共有結合が形成され、アルコキシシランが多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部と結合することができる。前記アルコキシシランは、導入しようとする置換基を有しているので、当該置換基を多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部に導入することができる。
前記反応は、溶媒に分散した多孔性シリカ粒子をアルコキシシランと反応させて行うことができる。
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ－ブチロラクトン、１，３－ジメチル－イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４－ヒドロキシ－４－メチル－２－ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ－エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ－ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ－メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ－ジオキサン、Ｐ－ジオキサン、１，２－ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはトルエンを使用できるが、これらに制限されるものではない。
前記陽電荷での帯電は、例えばアミノ基、アミノアルキル基などの窒素含有基などの塩基性基を有するアルコキシシランと反応させて行うことができる。具体的には、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（N－［3－（Trimethoxysilyl）propyl］ethylenediamine）、Ｎ１－（３－トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（N1－（3－Trimethoxysilylpropyl）diethylenetriamine）、（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（（3－Aminopropyl）trimethoxysilane）、Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］アニリン（N－［3－（Trimethoxysilyl）propyl］aniline）、トリメトキシ［３－（メチルアミノ）プロピル］シラン（Trimethoxy［3－（methylamino）propyl］silane）、３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン（3－（2－Aminoethylamino）propyldimethoxymethylsilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記陰電荷での帯電は、例えばカルボキシ基、スルホン酸基、チオール基などの酸性基を有するアルコキシシランと反応させて行うことができる。具体的には、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（（3－Mercaptopropyl）trimethoxysilane）などを使用できるが、これに限定されるものではない。
前記無電荷（陽電荷または陰電荷でなない、電荷がない状態）での帯電は、電荷を持たない通常の官能基を有するアルコキシシランと反応させて行うことができ、前記陽電荷での帯電と陰電荷での帯電を適宜組み合わせて、陽電荷と陰電荷の相殺による無電荷に帯電させることができるが、これに限定されるものではない。
前記親水性の性質は、親水性基、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、カルボニル基、スルフヒドリル基、ホスフェート基、チオール基、アンモニウム基、エステル基、イミド基、チオイミド基、ケト基、エーテル基、インデン基、スルホニル基、ポリエチレングリコール基などを有するアルコキシシランと反応させて持たせることができる。具体的には、 Ｎ－［３－（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（N－［3－（Trimethoxysilyl）propyl］ethylenediamine）、Ｎ１－（３－トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（N1－（3－Trimethoxysilylpropyl）diethylenetriamine）、（３－アミノプロピル）トリメトキシシラン（（3－Aminopropyl）trimethoxysilane）、（３－メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（（3－Mercaptopropyl）trimethoxysilane）、トリメトキシ［３－（メチルアミノ）プロピル］シラン（Trimethoxy［3－（methylamino）propyl］silane）、 ３－（２－アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン（3－（2－Aminoethylamino）propyldimethoxymethylsilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
前記疎水性の性質は、疎水性置換基、例えば、置換または非置換のＣ１～Ｃ３０のアルキル基、置換または非置換のＣ３～Ｃ３０のシクロアルキル基、置換または非置換のＣ６～Ｃ３０のアリール基、置換または非置換のＣ２～Ｃ３０のヘテロアリール基、ハロゲン基、Ｃ１～Ｃ３０のエステル基、ハロゲン含有基などを有するアルコキシシランと反応させて持たせることができる。具体的には、トリメトキシ（オクタデシル）シラン（Trimethoxy（octadecyl）silane）、トリメトキシ－ｎ－オクチルシラン（Trimethoxy－n－octylsilane）、トリメトキシ（プロピル）シラン（Trimethoxy（propyl）silane）、イソブチル（トリメトキシ）シラン（Isobutyl（trimethoxy）silane）、トリメトキシ（７－オクテン－１－イル）シラン（Trimethoxy（7－octen－1－yl）silane）、トリメトキシ（３，３，３－トリフルオロプロピル）シラン（Trimethoxy（3，3，3－trifluoropropyl）silane）、トリメトキシ（２－フェニルエチル）シラン（Trimethoxy（2－phenylethyl）silane）、ビニルトリメトキシシラン（Vinyltrimethoxysilane）、シアノメチル（Cyanomethyl）、［３－（トリメトキシシリル）プロピル］トリチオカーボネート（［3－（trimethoxysilyl）propyl］trithiocarbonate）、（３－ブロモプロピル）トリメトキシシラン（（3－Bromopropyl）trimethoxysilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
そのほか、前記表面改質により難溶性（疎水性）のＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力を強化するために、気孔内部に疎水性置換基が存在し、使用、製剤化のし易さなどの側面で粒子の表面に親水性置換基が存在するようにするなどの処理も可能であり、表面に他のＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質を結合するための置換基が存在してもよい。
また、前記表面改質は、複合的に行うこともできる。例えば、外部表面または気孔内部に２回以上の表面改質を行うこともできる。具体例として、アミノ基が導入されたシリカ粒子にカルボキシル基を含む化合物をアミド結合で結合して陽電荷に帯電した粒子を、他の表面特性を持つように変化させることができるが、これに限定されるものではない。
前記多孔性シリカ粒子のアルコキシシランとの反応は、例えば、加熱下で行うことができる。加熱は、例えば８０℃～１８０℃、例えば、前記範囲内で８０℃～１６０℃、８０℃～１５０℃、１００℃～１６０℃、１００℃～１５０℃、１１０℃～１５０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
前記多孔性シリカ粒子のアルコキシシランとの反応は、例えば４時間～２０時間、例えば、前記範囲内で４時間～１８時間、４時間～１６時間、６時間～１８時間、６時間～１６時間、８時間～１８時間、８時間～１６時間、８時間～１４時間、１０時間～１４時間などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
前記反応温度、時間、そして表面改質に使用される化合物の量などは、表面改質しようとする程度によって選択できる。本発明の核酸分子または物質の親水性、疎水性、電荷の程度によって反応条件を変えて多孔性シリカ粒子の親水性、疎水性、電荷の程度を調節することにより、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質の放出速度を調節することができる。例えば、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質が中性のｐＨで強い陰電荷を帯びる場合には、多孔性シリカ粒子が強い陽電荷を帯びるようにするために、反応温度を高くしたり、反応時間を長くしたり、化合物の処理量を増やすことができるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、例えば、小気孔の粒子の製造、気孔の拡張、表面改質、気孔内部の改質工程を経て製造されたものであってもよい。
前記小気孔の粒子の製造および気孔拡張工程は前述通りの工程によって行うことができ、小気孔の粒子の製造後、そして気孔拡張工程の後に洗浄及び乾燥工程を行うことができる。
必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。未反応物質の分離は、例えば遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。
前記遠心分離は、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、具体的には、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記小気孔の粒子の製造後の洗浄は、先に例示した範囲内の方法／条件で行うことができるが、これらに限定されるものではない。
前記気孔拡張後の洗浄は、先の例示よりは緩和された条件で行うことができる。例えば、洗浄を３回以内行うことができるが、これに限定されるものではない。
前記表面改質と気孔内部改質のそれぞれは、前述通りの工程によって行うことができる。表面改質と気孔内部改質の順に工程を行うことができ、前記両工程の間に粒子の洗浄工程をさらに行うことができる。
前記小気孔の粒子の製造および気孔拡張の後に洗浄をより緩和された条件で行う場合、気孔内部には粒子製造、気孔拡張に使用された界面活性剤などの反応液が満たされているため、表面改質時に気孔内部が改質されずに、表面だけが改質され得る。その後、粒子を洗浄すると、気孔内部の反応液が除去され得る。
前記表面改質工程と気孔内部改質工程との間の粒子の洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、具体的には、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００～１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分～６０分、具体的には、前記範囲内で３分～３０分、３分～３０分、５分～３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
前記洗浄は遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液をそのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、具体的には、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
前記乾燥は、例えば２０℃～１００℃で行うことができるが、これに限定されるものではなく、真空状態で行うこともできる。
ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部に担持することができる。担持は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子とＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子とを混合して行うことができる。
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４－ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２－ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２－ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができる。
また、前記溶媒として、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ＳＢＦ（疑似体液）、Borate－buffered saline、Tris－buffered salineなどを使用することもできる。
前記多孔性シリカ粒子と本発明の核酸分子の割合は、特に限定されず、例えば、重量比が１：０．０５～０．８、例えば、前記範囲内で１：０．０５～０．７、１：０．０５～０．６、１：０．１～０．８、１：０．１～０．６、１：０．２～０．８、１：０．２～０．６等であってもよい。
前記多孔性シリカ粒子に担持されたＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、延長された時間をかけて段階的に放出され得る。このような遅い放出は、連続または非連続性、線形または非線形であってもよく、多孔性シリカ粒子の特徴及び／又はそれとＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子との相互作用に起因して異なり得る。
前記多孔性シリカ粒子に担持されたＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、多孔性シリカ粒子が生分解されながら放出されるが、本発明に係る多孔性シリカ粒子は徐々に分解され、担持されたＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子が徐放的に放出されるようにすることができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子の表面積、粒径、気孔直径、表面及び／又は気孔内部の置換基、表面の緻密さの程度などを調節することで調節できるが、これらに限定されるものではない。
また、前記多孔性シリカ粒子に担持されたＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、多孔性シリカ粒子から離脱して拡散しながらも放出できる。これは多孔性シリカ粒子とＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出環境との関係に影響を受けるものであるところ、これを調整して、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子の放出を調節することができる。例えば、表面改質によって多孔性シリカ粒子のＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子との結合力を強化または弱化させることによって調節することができる。
より具体的な例として、担持されるＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質が難溶性（疎水性）である場合には、粒子の表面及び／又は気孔内部が疎水性置換基を有することにより、多孔性シリカ粒子とＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力が増加し得る。これにより、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子が疎水性置換基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
本明細書で「難溶性」とは、（水に対して）不溶性（insoluble）、実質的に不溶性（practically insoluble）、またはごくわずかの可溶性（only slightly soluble）を含む意味である。これは「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（USP、Remington、Mack Publishing Company発行）に定義されている用語である。
前記難溶性の物質は、例えば１気圧、２５℃での水溶解度が１０ｇ／Ｌ未満、具体的には５ｇ／Ｌ未満、より具体的には１ｇ／Ｌ未満であってもよいが、これらに限定されるものではない。
担持されるＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質が水溶性（親水性）である場合には、粒子の表面及び／又は気孔内部が親水性置換基を有することにより、多孔性シリカ粒子とＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力が増加し得る。これにより、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子が親水性置換基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
水溶性物質は、例えば１気圧、２５℃での水溶解度が１０ｇ／Ｌ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
担持されるＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質が電荷を帯びる場合には、粒子の表面及び／又は気孔内部がその逆の電荷に帯電することにより、多孔性シリカ粒子とＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力が増加し得る。これにより、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子が酸性基または塩基性基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
具体的には、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質が中性のｐＨで陽電荷を帯びるものであれば、粒子の表面及び／又は気孔内部が中性のｐＨで陰電荷に帯電するものであってよい。これにより、多孔性シリカ粒子とＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力が増加して、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子がカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、スルホン酸基（－ＳＯ３Ｈ）などの酸性基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
また、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質が中性のｐＨで陰電荷を帯びるものであれば、粒子の表面及び／又は気孔内部が陽電荷に帯電するものであってもよい。これにより、多孔性シリカ粒子とＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質との結合力が増加して、ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子がアミノ基、その他窒素含有基などの塩基性基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質は、必要な治療の種類、放出環境、使用される多孔性シリカ粒子に依存して、例えば７日～１年またはそれ以上の期間にわたって放出され得る。
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、生分解性で１００％分解され得るので、これに担持されたＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子または物質は、１００％放出され得る。
前記ＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子は、前述の通り、配列番号１の配列との相補性が１０ヌクレオチド（nucleotide；nt）以上、１１ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１３ヌクレオチド以上、１４ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、１６ヌクレオチド以上、１７ヌクレオチド以上、または１８ヌクレオチド全体であってもよい。これに関する具体的な説明は前述の通りである。
本発明は、前述したＣＴＧＦ遺伝子の転写体の少なくとも一部に相補的に結合する核酸分子を担持した多孔性シリカ粒子；を含むＣＴＧＦ遺伝子発現抑制用組成物；を含む線維増殖性疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供するものである。
前記核酸分子、多孔性シリカ粒子、ＣＴＧＦ遺伝子発現の抑制、線維増殖性疾患、薬学的組成物の様々な剤形などの具体的な内容は、前述の通りである。
以下、本発明を具体的に説明するために実施例を挙げて詳細に説明することにする。
以下、本発明で使用されるｓｉＲＮＡは「ｓｉＣＴＧＦ」、本発明の多孔性シリカ粒子は「ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬまたはＤＤＶ」、ｓｉＣＴＧＦが担持されたＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬは「ＬＥＭ－Ｓ４０１」と略称することがある。
実験方法
１．実験材料
ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬとＴＡＭＲＡが結合したＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬは、Ｌｅｍｏｎｅｘ，Ｉｎｃ．（ソウル、大韓民国）から提供された。細胞計数キット－８（Cell counting kit－8）は、Dojindo molecular technologies、Inc．（Maryland、USA）から購入した。ＴＧＦ－βは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ（New Jersey、USA）から購入した。１０％リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、ロズウェルパーク記念研究所１６４０（ＲＰＭＩ １６４０）、ペニシリン－ストレプトマイシン及び０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡは、ＷｅｌＧｅｎｅ（大韓民国）から購入した。核酸分子は、いずれもＬｅｍｏｎｅｘ（ソウル、大韓民国）により合成された。その配列及び本明細書で使用される核酸分子の配列を下記表１に示す。ＰＣＲプライマーは、いずれもＣｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ（ソウル、大韓民国）から購入した。抗マウスＣＴＧＦ抗体は、Ａｂｃａｍ（Cambridge、UK）から購入し、抗マウスコラーゲン１、３抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Carlsbad、CA、USA）から購入した。Ｔｒｉｚｏｌ細胞溶解液は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Carlsbad、CA、USA）から購入した。ＰＣＲ試薬は、いずれもＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．（Shiga、Japan）から購入した。すべての化学物質は、受領してそのまま使用した。なお、以下に示す表１において、「Target sequence」は「標的配列」を、「Position in gene sequence」は「遺伝子配列の位置」を、「GC content」は「GC含有量」を、「Sense strand」は「センス鎖」を、「Antisense strand」は「アンチセンス鎖」を、それぞれ意味する。
Figure 0007152072000001
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２．動物モデル
すべての動物実験は、大韓民国のソウル大学のＩＡＣＵＣ（Institutional Animal Care and Use Coｍｍittees）に準拠して行った。Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（５週）は、ＯＲＩＥＮＴ ＢＩＯ社（城南市、大韓民国）から購入した。
３．細胞生存の測定
Ａ５４９及びＨａＣａＴ細胞を１００μｌの成長培地（５０～７０％コンフルエント）を有する９６ウェル培養プレートにウェル当たり１０，０００細胞の密度で接種した。細胞を血清含有培地で適切な濃度のＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬで処理し、３７℃で２４時間培養した。培養後、細胞を１ｘＰＢＳで２回洗浄した後、１０μｌのＣＣＫ－８を含有した１００μｌの無血清培地を添加し、さらに１時間培養した。培養プレート内の各ウェルの光学密度を４５０ｎｍの波長で測定した。三重項（deviation of triplicates）の平均及び標準偏差が計算され、プロットされた。
４．細胞ベースのＣＴＧＦノックダウン（knockdown）の分析
イン・ビトロでのＬＥＭ－Ｓ４０１のＣＴＧＦ遺伝子サイレンシング効率を証明するために、無血清培地のＬＥＭ－Ｓ４０１（１２．５、２５、５０及び１００ｎＭ）の５００μｌを、ウェル当たり２５，０００細胞のコンフルエントで接種したプレート内のＡ５４９及びＨａＣａＴ細胞に処理した。３７℃の加湿された５％ＣＯ２培養器で６時間培養した後、無血清培養液を除去した。１ｘＰＢＳで２回洗浄した後、血清含有細胞培地を入れ替えた。さらに６時間後、血清含有培養培地を除去し、１ｘＰＢＳで洗浄した。血清を含有した培地でＴＧＦ－β（２ｎｇ／ｍＬ）５００μｌを細胞で処理し、ＣＴＧＦ誘導のために培養１２時間後、Ｔｒｉｚｏｌを用いてｓ総ＲＮＡを抽出した。
ＬＥＭ－Ｓ４０１によるＣＴＧＦノックダウン（knockdown）の持続期間を測定するために、Ａ５４９及びＨａＣａＴ細胞を無血清培地でＬＮＰを含有したＬＥＭ－Ｓ４０１（５０ｎＭ ｓｉＣＴＧＦ）及びｓｉＣＴＧＦ（５０ｎＭ）５００μｌで処理した。加湿された５％ＣＯ２培養器中で３７℃で６時間培養した後、無血清培養液を除去した。１ｘＰＢＳで２回洗浄した後、血清含有細胞培地を入れ替えた。指示された時間培養を行った後、細胞を血清含有培養培地でＴＧＦ－β（２ｎｇ／ｍＬ）５００μｌで処理し、ＣＴＧＦ誘導のために、さらに細胞を２４時間培養した。総ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌを用いて抽出した。
５．ＲＴ－ＰＣＲ
すべてのイン・ビトロ及びイン・ビボで抽出したＲＮＡは、以下の反応条件下で熱循環反応に用いられた。ｃＤＮＡの合成：６５℃で５分、４２℃で２分、４２℃で５０分、７０℃で１５分間不活性化１サイクル、増幅過程：９５℃で３０秒、５５℃で６０秒、７２℃で３０秒の３０サイクル。
６．ｓｉＣＴＧＦ及び多孔性シリカ粒子のインビボ・イメージング
ＬＥＭ－Ｓ４０１（３３ｍＭ）（ＦＩＴＣ－接合ｓｉＣＴＧＦ及びＴＡＭＲＡ－結合ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）の３０μｌを７つの他の部位でマウスの皮膚に注射した。犠牲にした後、ＦＯＢＩ生体内イメージング機器（NeoScience Co.，Ltd.、ソウル市、大韓民国）を用いて、切除されたマウスの皮膚の蛍光画像を撮影した。得られた皮膚サンプルを４％ＰＦＡ溶液に入れた。サンプルをパラフィンに包埋し、１０μｍの厚さに切断した。脱水過程の後、切片されたサンプルをＤＡＰＩで染色した。サンプルは２０ｘ対物レンズ（Olympus、Tokyo、Japan）が装着されたＢＸ７１顕微鏡により観察した。
７．マウス皮膚傷モデルを用いたインビボ実験
マウスの皮膚に生検パンチ（４ｍｍ）を用いて傷を作成すようにパンチングした。時間が経過し、傷を明確に観察するために、黒いシルク糸を用いて、シリコン副木（外側１５ｍｍ、内側８ｍｍ）を傷の周りに縫合した。１ｘＰＢＳでＬＥＭ－Ｓ４０１（３ｍＭ）３０μＬを４日ごとに（４日、８日、１２日）、傷の周りの４つの異なる部位に皮下注入した。傷はテガダーム（Tegaderm）と包帯を２日に一回ずつ交換して管理した。１６日後、マウスを犠牲にした。
ＬＥＭ－Ｓ４０１が組織リモデリングの過程でＣＴＧＦの発現を抑制することを証明するために、マウスの皮膚に穴を開けて、生検パンチ（４ｍｍ）を用いて傷を作成してバンドで包んだ。傷が完全に閉じた後、１ｘＰＢＳでＬＥＭ－Ｓ４０１（３３ｍＭ）３０μlを４日ごとに（１０日、１４日、１８日、２２日）４つの異なる部位の傷部位に皮下注入した。マウスを２６日目に犠牲にした。
８．免疫組織化学
マウスの皮膚サンプルを２４時間４℃で４％ＰＦＡ溶液で培養した。その後、サンプルをパラフィンに包埋し、１０μｍの厚さで切片を作成した。切片化したサンプルを脱水させ、透過溶液（１ｘＰＢＳ中０．２％ｔｗｅｅｎ ２０）でそれぞれ１０分ずつ２回培養した。その後、サンプルを加湿された大気下でブロッキング溶液（５％正常ヤギ血清、１ｘＰＢＳ中０．２％ｔｗｅｅｎ ２０）で４５分間インキュベートした。サンプルを室温で３時間、加湿チャンバーで２％正常ヤギ血清およびＰＢＳ中の抗体の１：１００希釈液を有する０．２％ｔｗｅｅｎ ２０を含有する１次抗体溶液と共にインキュベートした。サンプルを透過溶液でそれぞれ１０分間３回洗い、室温で２時間１ｘＰＢＳで、２％正常ヤギ血清及び０．２％ｔｗｅｅｎ ２０を含有する２次抗体希釈溶液と共に培養した。サンプルを透過溶液で洗浄し、ＤＡＰＩで染色した。サンプルは２０ｘ対物レンズ（Olympus、Tokyo、Japan）が装着されたＢＸ７１顕微鏡により観察した。
９．多孔性シリカ粒子（ＤＤＶまたはＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）
９－１．多孔性シリカ粒子の製造
（１）多孔性シリカ粒子の製造
１）小気孔粒子の製造
２Ｌ丸底フラスコに蒸留水（ＤＷ）の９６０ｍｌとＭｅＯＨの８１０ｍｌを入れた。前記フラスコにＣＴＡＢを７．８８ｇ入れた後、攪拌しながら１Ｍ ＮａＯＨの４．５２ｍｌを素早く入れた。１０分間攪拌して均一な混合液を得た後、ＴＭＯＳの２．６ｍｌを入れた。６時間攪拌して均一に混合した後、２４時間熟成し、反応液を得た。
その後、前記反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノール及び蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブンで乾燥し、１．５ｇの粉末状の小気孔多孔性シリカ粒子（気孔平均直径２ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
２）気孔の拡張
１．５ｇの小気孔多孔性シリカ粒子の粉末をエタノール１０ｍｌに添加して超音波分散し、水１０ｍｌ、ＴＭＢ（trimethyl benzene）１０ｍｌを添加して超音波分散し、分散液を得た。
その後、前記分散液をオートクレーブに入れて１６０℃、４８時間反応させた。
反応は２５℃で開始し、１０℃／分の速度で昇温して行った。その後、オートクレーブ内で１～１０℃／分の速度で徐々に冷却した。
冷却した反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後７０℃のオーブンで乾燥し、粉末状の多孔性シリカ粒子（気孔直径１０～１５ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
３）か焼
前記２）で製造された多孔性シリカ粒子をガラスバイアル（vial）に入れて５５０℃で５時間加熱し、反応終了後、常温まで徐々に冷却して粒子を製造した。
（２）多孔性シリカ粒子の製造
気孔拡張時の反応条件を１４０℃、７２時間に変更した以外は、前記９－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（３）多孔性シリカ粒子の製造（１０Ｌスケール）
５倍大きな容器を使用し、各物質をいずれも５倍の容量で使用した以外は、実施例９－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（４）多孔性シリカ粒子の製造（粒径３００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水９２０ｍｌ、メタノール８５０ｍｌを使用した以外は、９－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（５）多孔性シリカ粒子の製造（粒径５００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水８００ｍｌ、メタノール１，０１０ｍｌ、ＣＴＡＢ １０．６ｇを使用した以外は、９－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（６）多孔性シリカ粒子の製造（粒径１，０００ｎｍ）
小気孔粒子の製造時に蒸留水６２０ｍｌ、メタノール１，３８０ｍｌ、ＣＴＡＢ ７．８８ｇを使用した以外は、９－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（７）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径４ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを２．５ｍｌ使用した以外は、９－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（８）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径７ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを４．５ｍｌ使用した以外は、９－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（９）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径１７ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを１１ｍｌ使用した以外は、９－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（１０）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径２３ｎｍ）
気孔拡張時にＴＭＢを１２．５ｍｌ使用した以外は、９－１－（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
（１１）多孔性シリカ粒子の製造（二重改質）
１）小気孔粒子の製造
実施例９－１－（１）－１）の方法と同様にして小気孔粒子を製造した。
２）気孔の拡張
実施例９－１－（１）－２）の方法と同様にして小気孔粒子をＴＭＢと反応させ、冷却し、遠心分離して上澄み液を除去した。その後、実施例９－１－（１）－２）と同じ条件で遠心分離し、エタノール及び蒸留水で交互に３回洗浄した。その後、実施例９－１－（１）－２）と同じ条件で乾燥し、粉末状の多孔性シリカ粒子（気孔直径１０～１５ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
３）表面改質
気孔が拡張された多孔性シリカ粒子０．８ｇ～１ｇを５０ｍｌのトルエンに分散した後、（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－aminopropyl）triethoxysilane）を５ｍｌ入れて１２０℃で還流したまま１２時間加熱した。この過程では、前述の洗浄過程および乾燥過程を経た後、１ｍｌのトリエチレングリコール（PEG3，2－[2－（2－methoxyethoxy）ethoxy] acetic acid）と、１００ｍｇのＥＤＣ（1－Ethyl－3－（3－dimethylaminopropyl）carbodiimide）と、２００ｍｇのＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（N－Hydroxysuccinimide，ＮＨＳ）を３０ｍｌのＰＢＳに分散して常温で攪拌したまま１２時間反応する。その後、生成物は、前記の洗浄及び乾燥過程を経る。
気孔内部に、前のステップの反応液が残っているため、気孔内部は改質されない。
４）気孔内部の洗浄
表面改質された粒子粉末８００ｍｇを２Ｍ ＨＣｌ／エタノール４０ｍｌに溶かし、１２時間強く撹拌下で還流した。
その後、冷却された反応液を１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブン中で乾燥して粉末状の多孔性シリカ粒子を得た。
５）気孔内部の改質
ｉ）後述する実施例９－２－（２）－１）の方法と同様にして気孔内部にプロピル基を導入した。
ｉｉ）後述する実施例９－２－（２）－２）の方法と同様にして気孔内部にオクチル基を導入した。
９－２．多孔性シリカ粒子の表面改質
（１）陽電荷での帯電
１）粒径３００ｎｍの粒子
実施例９－１－（４）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて、陽電荷に帯電させた。
具体的には、１００ｍＬ丸底フラスコにおいて、１００ｍｇの多孔性シリカ粒子を１０ｍＬのトルエンに洗浄器（bath sonicator）で分散させた。その後、１ｍＬのＡＰＴＥＳを添加し、４００ｒｐｍで攪拌し、１３０℃で攪拌して１２時間反応させた。
反応後、常温まで徐々に冷却し、１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
その後、７０℃のオーブン中で乾燥し、表面および気孔内部にアミノ基を有する粉末状の多孔性シリカ粒子を得た。
２）粒径２００ｎｍの粒子
ｉ）実施例９－１－（１）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて陽電荷に帯電させ、ＡＰＴＥＳを０．４ｍｌ添加し、反応時間を３時間とした以外は、前記実施例９－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
ｉｉ）実施例９－１－（９）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて陽電荷に帯電させ、それ以外は、前記実施例９－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
ｉｉｉ）実施例９－１－（１０）の多孔性シリカ粒子を（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3－Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて陽電荷に帯電させ、それ以外は、前記実施例９－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
（２）疎水性基の導入
１）プロピル基
前記実施例９－１－（１）の多孔性シリカ粒子をトリメトキシ（プロピル）シラン（Trimethoxy（propyl）silane）と反応させて、表面および気孔内部にプロピル基を導入し、ＡＰＴＥＳの代わりにトリメトキシ（プロピル）シラン（Trimethoxy（propyl）silane）を０．３５ｍｌ添加し、１２時間反応させた以外は、前記実施例９－２－（１）の方法と同様にして改質した。
２）オクチル基
前記実施例９－１－（１）の多孔性シリカ粒子をトリメトキシ－ｎ－オクチルシラン（Trimethoxy－n－octylsilane）と反応させて、表面および気孔内部にプロピル基を導入し、ＡＰＴＥＳの代わりにトリメトキシ－ｎ－オクチルシラン（Trimethoxy－n－octylsilane）を０．５ｍｌ添加し、１２時間反応させた以外は、前記実施例９－２－（１）の方法と同様にして改質した。
（３）陰電荷での帯電
１）カルボキシル基
前記実施例９－１－（１）の多孔性シリカ粒子を無水コハク酸（succinic anhydride）と反応させて陰電荷に帯電させ、トルエンの代わりにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を使用し、ＡＰＴＥＳの代わりに８０ｍｇの無水コハク酸（succinic anhydride）を添加して２４時間常温で攪拌し反応させ、洗浄時に蒸留水の代わりにＤＭＳＯを使用した以外は、前記実施例９－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
２）チオール基
ＡＰＴＥＳの代わりにＭＰＴＥＳの１．１ｍＬを使用した以外は、前記実施例９－２－（１）－１）の方法と同様にして改質した。
３）スルホン酸基
前記実施例９－２－（３）－２）の多孔性シリカナノ粒子１００ｍｇを、１Ｍ硫酸水溶液１ｍＬと３０％過酸化水素水２０ｍＬに分散して常温で攪拌し、酸化反応を誘導してチオール基をスルホン酸基に酸化した。その後、前記実施例９－２－（１）－１）の方法と同様にして洗浄および乾燥した。
９－３．核酸分子の担持
実施例９－２－（１）－２）－ｉｉ）の多孔性シリカ粒子１０μｇと５０ｐｍｏｌの核酸分子を１ｘＰＢＳ条件下で混合した後、常温で３０分間置いて積載した。
実験結果
１．本発明の核酸分子のＣＴＧＦ発現抑制の分析
前記実施例に基づいて製造された核酸分子（ＰＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ；前記表１を参照）のＣＴＧＦの発現抑制率を下記表２、３に示す。
下記の表１、２を参照すると、配列番号１の配列と相補性が１０ヌクレオチド以上相補性を有する鎖を含む核酸分子（配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号５４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５５の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５６の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号５７の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５８の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６０の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６５の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６７の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６９の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号７０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号７１の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号７２の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号８７～９９の配列からなる群より選択される一つの配列からなるアンチセンスＰＮＡ）の場合には、９０％を上回る抑制率を示すのに対し、それを満たしていない他の核酸分子の場合には、７５％未満の低い抑制率を示すことが確認できた。
特に、７ヌクレオチドのみの相補性を有する鎖を含む核酸分子（配列番号４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；配列番号６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ）の場合には、６０％前後の顕著に低い発現抑制率を示した。このことから、配列番号１の配列との相補性が１０ヌクレオチド以上であることに技術的意義が存在すると判断される。
このうち、発現抑制率が最も高く、配列番号１の配列と１８ヌクレオチド全体が相補的な鎖を含む、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または配列番号３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡを選択して以下の実験を行った。
Figure 0007152072000009
Figure 0007152072000010
２．多孔性シリカ粒子（ＤＤＶまたはＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）
２－１．粒子の形成及び気孔拡張の確認
実験方法の実施例９－１－（１）～（３）の粒子の小気孔粒子、製造された多孔性シリカ粒子を顕微鏡で観察し、小気孔粒子が均一に生成されているか、気孔が十分に拡張されて多孔性シリカ粒子が均一に形成されているかを確認した（図２８～３１）。
図２８は、実施例９－１－（１）の多孔性シリカ粒子の写真、図２９は、実施例９－１－（２）の多孔性シリカ粒子の写真であり、気孔が十分に拡張された球状の多孔性シリカ粒子が均一に生成されたことを確認することができる。
図３０は、実施例９－１－（１）の小気孔粒子の写真、図３１は、実施例９－１－（１）と９－１－（３）の小気孔粒子の比較写真であり、球状の小気孔粒子が均一に生成されたことを確認することができる。
２－２．ＢＥＴ表面積および気孔体積の計算
実験方法の実施例９－１－（１）の小気孔粒子、実施例９－１－（１）、（７）、（８）、（１０）の多孔性シリカ粒子の表面積と気孔体積を計算した。表面積は、ブルナウアー－エメット－テラー（Brunauer－Emmett－Teller）（ＢＥＴ）方法により計算し、気孔サイズの分布は、バーレット－ジョイナー－ハレンダ（Barrett－Joyner－Halenda）（ＢＪＨ）方法により計算した。
前記各粒子の顕微鏡写真は図３２に、計算の結果は下記表４に示す。
Figure 0007152072000011
２－３．生分解性の確認
実験方法の実施例９－１－（１）の多孔性シリカ粒子の生分解性を確認するために、３７℃、ＳＢＦ（ｐＨ７．４）における生分解の程度を０時間、１２０時間、３６０時間に顕微鏡で観察し、それを図３３に示す。
これを参照すると、多孔性シリカ粒子が生分解され、３６０時間経過後はほぼすべてが分解されたことを確認することができる。
２－４．吸光度比の測定
時間別に下記数式１による吸光度比を測定した。
[数式１]
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
具体的には、多孔性シリカ粒子粉末５ｍｇをＳＢＦ（ｐＨ７．４）５ｍｌに溶かした。その後、５ｍｌの多孔性シリカ粒子溶液を、図３４に示す直径５０ｋＤａの気孔を有する透過膜に入れた。外部膜に１５ｍｌのＳＢＦを添加し、外部膜のＳＢＦは１２時間ごとに入れ替えた。多孔性シリカ粒子の分解は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌して行った。
その後、紫外・可視分光法（UV－vis spectroscopy）によって吸光度を測定し、λ＝６４０ｎｍで分析した。
（１）吸光度比の測定
実験方法の実施例９－１－（１）の多孔性シリカ粒子の吸光度比を前記方法に従って測定し、その結果を図３５に示す。
これを参照すると、吸光度比が１／２となるｔは約５８時間であり、非常にゆっくりと分解されることが確認できた。
（２）粒径別
実験方法の実施例９－１－（１）、（５）、（６）の多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定し、その結果を図３６に示す（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用した。）。
これを参照すると、粒径の増加によってｔが減少することが分かる。
（３）気孔の平均直径別
実験方法の実施例９－１－（１）、（９）の多孔性シリカ粒子、そしてコントロールとして実験方法の実施例９－１－（１）の小気孔多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定した。その結果を図３７に示す（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用した。）。
これを参照すると、実施例の多孔性シリカ粒子は、コントロールに比べてｔが非常に大きいことが確認できる。
（４）ｐＨ別
実験方法の実施例９－１－（４）の多孔性シリカ粒子のｐＨ別吸光度を測定した。吸光度は、ＳＢＦで、そしてｐＨ２、５及び７．４のＴｒｉｓで測定し、その結果を図３８に示す。
これを参照すると、ｐＨ別にｔの差はあるが、いずれも吸光度の比が１／２となるｔは２４以上であった。
（５）帯電
実験方法の実施例９－２－（１）－１）の多孔性シリカ粒子の吸光度を測定し、その結果を図３９に示す（懸濁液と溶媒としては、トリス（Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４）を使用した。）。
これを参照すると、陽電荷に帯電した粒子も吸光度の比が１／２となるｔは２４以上であった。
２－５．担持した核酸分子の放出
Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡをロードした多孔性シリカ粒子１０μｌをＳＢＦ（ｐＨ７．４、３７℃）に再浮遊させ、気孔直径２０ｋＤａの透過膜（図４０のチューブ）に入れた。
その後、透過チューブを１．５ｍｌのＳＢＦに浸漬した。
ｓｉＲＮＡの放出は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌して行われた。
２４時間の前には、０．５、１、２、４、８、１２、２４時間経過した時間に放出溶媒を回収した。その後は２４時間間隔で０．５ｍｌの放出溶媒を蛍光測定のために回収し、等量のＳＢＦを添加した。
Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡの蛍光強度は、６７０ｎｍの波長（λｅｘ＝６４７ｎｍ）で測定し、ｓｉＲＮＡの放出程度を測定した。その結果は図４１に示す。
これを参照すると、ｓｉＲＮＡが５０％放出された時間は約４８時間であることを確認することができる。
３．イン・ビトロ上のＬＥＭ－Ｓ４０１のＣＴＧＦ ｍＲＮＡノックダウンの効果的誘導の確認
ＬＥＭ－Ｓ４０１のターゲット遺伝子ノックダウン効率を測定するために、Ａ５４９（ヒト肺癌非小細胞）細胞とＨａＣａＴ（ヒトケラチノサイト細胞）細胞を、ｓｉＣＴＧＦを担持したＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ（ＬＥＭ－Ｓ４０１）で処理した。両細胞株は、いずれも機能的に活性なＣＴＧＦ転写経路を持っているため、Ａ５４９及びＨａＣａＴ細胞は線維症の研究でイン・ビトロモデル細胞として広く用いられている。まず、Ａ５４９細胞を様々な濃度のＬＥＭ－Ｓ４０１（１２．５、２５、５０及び１００ｎＭ）で処理した後、ＣＴＧＦの発現を誘導するために２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－βと共に培養した（図１）。以前の研究では、ＴＧＦ－βがイン・ビトロでＣＴＧＦの発現を誘導することを示したことがあり、ＴＧＦ－βをＡ５４９及びＨａＣａＴ細胞に処理することにより、ＣＴＧＦの発現レベルが顕著に増加することを確認した（図１７）。細胞株に対するＬＥＭ－Ｓ４０１の処理は、濃度依存的にＣＴＧＦのｍＲＮＡ発現レベルを減少させた。一方、対照群（ｓｉＣＴＧＦ ｏｎｌｙ、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｓｉＲＮＡ及びｖｅｈｉｃｌｅ（ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）ｏｎｌｙ）は、Ａ５４９及びＨａＣａＴ細胞の両方において、ＣＴＧＦのｍＲＮＡレベルに有意な差を示さなかった（図２、３）。この結果は、ＬＥＭ－Ｓ４０１が細胞内へｓｉＣＴＧＦを効率的にトランスフェクション（transfection）させ、ＣＴＧＦ遺伝子のノックダウンを誘導することを示す。
４．イン・ビトロ上のＬＥＭ－Ｓ４０１の徐放的なｓｉＣＴＧＦの放出
本実験では、ＬＥＭ－Ｓ４０１は、Ａ５４９及びＨａＣａＴ細胞においてＬＮＰよりもＣＴＧＦノックダウン効果をより長く維持した。Ａ５４９及びＨａＣａＴ細胞をＬＥＭ－Ｓ４０１（５０ｎＭ）及びＬＮＰ（５０ｎＭ）に担持されたｓｉＣＴＧＦで処理した後、ＴＧＦ－β処理によってＣＴＧＦの発現を誘導した。Ａ５４９細胞において、ＣＴＧＦの下向き調節は、ＬＥＭ－Ｓ４０１の処理後９６時間まで持続された（ＣＴＧＦ発現レベル、７２時間：２６．３％、９６時間：２６．９％）。これに対して、ＬＮＰに担持されたｓｉＣＴＧＦのノックダウン効率は７２時間、９６時間の両方で高くなかった（ＣＴＧＦ発現レベル、７２時間：４６．４％、９６時間：５８．６％）。また、ＨａＣａＴ細胞において、ＬＥＭ－Ｓ４０１のノックダウン効率（ＣＴＧＦ発現レベル、７２時間：３４．３％、９６時間：３５．８％）は、ＬＮＰに担持されたｓｉＣＴＧＦ（ＣＴＧＦ発現レベル、７２時間：６２．５％、９６時間：７８．８％）と比べて持続的で、優れていた（図４、５）。これをまとめると、ＬＥＭ－Ｓ４０１は、細胞でＬＮＰに担持されたｓｉＣＴＧＦに比べて、より長期間、ターゲットｍＲＮＡの発現レベルを抑制することが分かった。
５．マウス皮膚傷モデルにおけるＬＥＭ－Ｓ４０１のＣＴＧＦ発現及び肥厚性瘢痕の形成抑制能の確認
次に、ＬＥＭ－Ｓ４０１が生体内でＣＴＧＦの発現を下向き調節できるかを決定するための実験を行った。生体内での遺伝子ノックダウン効果を測定する前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＴＡＭＲＡ－接合されたＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬに担持されたＦＩＴＣ－接合されたｓｉＣＴＧＦで構成された蛍光標識ＬＥＭ－Ｓ４０１を注入し、担持されていない（自由）ＦＩＴＣ－接合されたｓｉＣＴＧＦのみを皮下注入経路から注入して、ＬＥＭ－Ｓ４０１と自由ｓｉＣＴＧＦの注入部位での持続時間を比較した。そして、切除されたマウスの皮膚と切片化された皮膚の蛍光画像解析は、注入後１，３，５日目に行った。ＦＩＴＣ－ｓｉＣＴＧＦを担持したＴＡＭＲＡ－ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬの蛍光は、１日目に注入部位で強い発光を示した。そして、蛍光は時間の経過によって徐々に減少したが、注入後５日目まで注入部位での蛍光は維持された（図６）。このように時間の経過によって注入部位での蛍光が減少する傾向は、皮膚切片スライドの傾向による（図６）。一方、担持されていない自由ＦＩＴＣ－ｓｉＣＴＧＦのみを注入したマウスから切除した皮膚や切片化した皮膚のスライドでは蛍光シグナルが観察されなかったが、これは自由ｓｉＣＴＧＦが体内で急速に分散してしまったり、非常に迅速な拡散を誘導する小さな断片に分解されることを暗示する（図７）。前記データは、自由ｓｉＣＴＧＦと比べて、ＬＥＭ－Ｓ４０１の方が皮膚内で顕著に高い濃度レベルのｓｉＣＴＧＦを、少なくとも注入後３日目まで維持できることを示す。
次に、ＬＥＭ－Ｓ４０１がＣＴＧＦ遺伝子ノックダウンを誘導でき、コラーゲンの過剰生産を減少させることをマウス皮膚傷モデルによって証明した。マウスの背中の皮膚に生検パンチで傷を作成した後（０日）、管理及び観察のためにシリコン副木を傷の周りに縫合した。ＬＥＭ－Ｓ４０１は、傷の周りに０，４，８，１２日目に皮下注入した。マウスは１６日目に犠牲にした。皮膚でのＣＴＧＦの発現レベルはＲＴ－ＰＣＲにより分析した。ＣＴＧＦの発現レベルは、ＬＥＭ－Ｓ４０１の処理群で顕著に減少したのに対し、ｓｉＣＴＧＦまたはＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬのみを処理した群では、無処理群と比べて変化が観察されなかった。さらに、コラーゲンタイプ１、３の発現レベルもまた、ＬＥＭ－Ｓ４０１の処理群で顕著に下向き調節された（図８～１０）。ＣＴＧＦにより誘導されることが知られているコラーゲンタイプ１、３は、肥厚性瘢痕及びケロイドの主な構成要素である。このことから、ＬＥＭ－Ｓ４０１によって発現が抑制されたＣＴＧＦがコラーゲンタイプ１、３の発現レベルに影響を与えたことを確認することができる。
傷部位の結合組織の過剰成長によって引き起こされた、不均一で凸凹になった不規則な皮膚表面は、肥厚性瘢痕とケロイドの主な特徴である。１０日目の傷ついた皮膚の写真では、対照群は不規則であったが、ＬＥＭ－Ｓ４０１処理群は、規則的で柔らかった（図１１）。これはＬＥＭ－Ｓ４０１が制御できない不均一な皮膚の形成を抑制し、肥厚性瘢痕の形成を防止することを証明する。免疫組織化学分析は、また、対照群よりもＬＥＭ－Ｓ４０１処理群でＣＴＧＦ及びコラーゲンタイプ１、３の発現が有意に低いことを示した（図１２～１５）。皮膚の傷回復過程中、組織リモデリング過程は、表皮が回復した後に真皮で起こる。この過程で、コラーゲン線維の発現が増加するが、コラーゲン形成を制御できない場合には肥厚性瘢痕やケロイドが誘発されることがある。そこで、組織リモデリングの過程でＬＥＭ－Ｓ４０１がＣＴＧＦとコラーゲンの発現を抑制できるかどうかを確認するために、表皮が回復した後にＬＥＭ－Ｓ４０１を注入した。具体的には、生検パンチを用いてマウスの皮膚に穴を開け（０日）、表皮が完全に回復した後、１０，１４，１８，２２日にＬＥＭ－Ｓ４０１を傷部位に注入した。通常、マウス傷モデルでは、傷の形成後、表皮の完全な回復は１０日で十分であった。２６日目にマウスを犠牲にした後、ＣＴＧＦ及びコラーゲンタイプ１、３の発現レベルをＲＴ－ＰＣＲで分析した。ＬＥＭ－Ｓ４０１処理群のＣＴＧＦとコラーゲンの発現レベルは、対照群に比べて有意に低かった（図１８～２０）。免疫組織化学分析は、ＣＴＧＦとコラーゲンタイプ１、３タンパク質の発現レベルがＬＥＭ－Ｓ４０１処理群で顕著に減少することを示した（図２１～２４）。

Claims (11)

  1. 配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５２の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５３の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号５４の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５５の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５６の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号５７の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号５８の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号５９の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６０の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６４の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６５の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６６の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号６７の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号６８の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号６９の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ、配列番号７０の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号７１の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、配列番号７２の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡ及び配列番号８７～９４の配列からなる群より選択される一つの配列からなるＰＮＡからなる群より選択される少なくとも一つを含む、核酸分子。
  2. 配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ、又は配列番号３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡを含む、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記各センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡは、その配列の３’末端にＵＵまたはｄＴｄＴの配列をさらに含むものである、請求項１に記載の核酸分子。
  4. 前記ＰＮＡの少なくとも一つの末端に配列番号１０１～１１３からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるペプチド；またはｍＰＥＧ５０００がさらに結合されたものである、請求項１に記載の核酸分子。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸分子を含む線維増殖性疾患の予防または治療用の薬学的組成物であって、
    前記線維増殖性疾患は、肥厚性瘢痕、ケロイド、肺線維症、肝線維症、腎線維症、嚢胞性線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、皮膚硬化症、全身硬化症、放射－誘導線維症、心筋線維症、胆道線維症、腎臓硬化症、網膜下線維症、糖尿病性網膜症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、糖尿病性腎臓病、慢性腎不全症、脂肪肝炎、増殖性硝子体網膜症、筋骨格系の腫瘍、骨肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、サルコイドーシス、黄斑変性、硝子体網膜症、角膜炎、翼状片、瞼裂斑、子宮筋腫、糸球体腎炎、ヒト免疫不全ウイルス腎症、急性呼吸困難症候群、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、多発性筋炎、および血管狭窄症からなる群より選択される疾患である、薬学的組成物。
  6. 前記核酸分子は、多孔性シリカ粒子の表面または気孔内部に担持されたものであり、
    前記多孔性シリカ粒子は、平均気孔直径が５ｎｍ～１００ｎｍであり、下記数式１の吸光度の比が１／２となるｔが２４以上である、請求項５に記載の線維増殖性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
    [数式１]
    Ａｔ／Ａ０
    （式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
    前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
    前記懸濁液のｐＨは７．４であり、
    Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
  7. 前記多孔性シリカ粒子は、外部表面または気孔内部が中性のｐＨで陽電荷または無電荷を帯びるものである、請求項６に記載の線維増殖性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
  8. 前記多孔性シリカ粒子は、親水性または疎水性の官能基を有するものである、請求項６に記載の線維増殖性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
  9. 前記核酸分子は、配列番号１の配列からなるセンスＲＮＡ及び配列番号２の配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｓｉＲＮＡ；または配列番号３の配列からなる鎖及びそれに相補的な鎖からなるｄｓＲＮＡである、請求項５に記載の線維増殖性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
  10. 前記核酸分子の各センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡは、その配列の３’末端にＵＵまたはｄＴｄＴの配列をさらに含むものである、請求項５に記載の線維増殖性疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
  11. 前記核酸分子のＰＮＡの少なくとも一つの末端に配列番号１０１～１１３からなる群より選択される少なくとも一つの配列からなるペプチド；またはｍＰＥＧ５０００がさらに結合されたものである、請求項５に記載の組成物。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012508560A (ja) 2008-08-25 2012-04-12 エクスカリアード・ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 結合組織成長因子を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用
JP2013532952A (ja) 2010-03-24 2013-08-22 アールエックスアイ ファーマシューティカルズ コーポレーション 皮膚および線維症適用におけるｒｎａ干渉
JP2017529384A (ja) 2014-07-22 2017-10-05 レモネックス インコーポレイテッドLemonex Inc. 生理活性物質又はタンパク質伝達用組成物及びその用途
WO2017178883A3 (en) 2016-04-11 2018-08-23 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using rna complexes that target connective tissue growth factor

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6965025B2 (en) * 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
CN101884789A (zh) * 2004-02-11 2010-11-17 法布罗根股份有限公司 Ctgf作为糖尿病肾病的治疗靶点
TWI386225B (zh) * 2004-12-23 2013-02-21 Alcon Inc 用於治療眼睛病症的結締組織生長因子（ＣＴＧＦ）ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制技術
US7825099B2 (en) * 2006-01-20 2010-11-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes
JP2012520683A (ja) * 2009-03-19 2012-09-10 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いた結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）遺伝子発現のＲＮＡ干渉媒介性阻害
MX365647B (es) * 2011-02-02 2019-06-10 Excaliard Pharmaceuticals Inc El uso de compuestos antisentido dirigidos al factor de crecimiento del tejido conectivo (ctgf) para tratar queloides o cicatrices hipertroficas.
KR101388958B1 (ko) * 2012-07-16 2014-04-24 서울대학교산학협력단 약물전달용 조성물 및 이를 이용한 약물전달방법
JP2017501968A (ja) 2013-06-28 2017-01-19 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー 第ｘｉｉ因子インヒビターおよびｃ１−インヒビターを使用する組合せ療法
US20160122764A1 (en) * 2013-07-05 2016-05-05 Bioneer Corporation Respiratory disease-related gene specific sirna, double-helical oligo rna structure containing sirna, compositon containing same for preventing or treating respiratory disease
CN105462975B (zh) * 2015-12-18 2018-03-23 中国科学院北京基因组研究所 一种特异性抑制ctgf基因表达的小干扰rna及其应用
CN108251420A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 苏州瑞博生物技术有限公司 抑制人和动物中CTGF基因表达的siRNA、包含其的组合物及其应用
KR102152348B1 (ko) * 2017-09-05 2020-09-08 주식회사 레모넥스 세포 운명 조절용 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012508560A (ja) 2008-08-25 2012-04-12 エクスカリアード・ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 結合組織成長因子を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその使用
JP2013532952A (ja) 2010-03-24 2013-08-22 アールエックスアイ ファーマシューティカルズ コーポレーション 皮膚および線維症適用におけるｒｎａ干渉
JP2017529384A (ja) 2014-07-22 2017-10-05 レモネックス インコーポレイテッドLemonex Inc. 生理活性物質又はタンパク質伝達用組成物及びその用途
WO2017178883A3 (en) 2016-04-11 2018-08-23 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using rna complexes that target connective tissue growth factor

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochemical and Biophysical Research Communications，2000年，Vol. 278，pp. 119-124
Gene Therapy，2007年，Vol. 14，pp. 790-803
THE JOURNAL OF GENE MEDICINE，2006年，Vol. 8，pp. 889-900

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