CN108743563B

CN108743563B - 一种药物载体、兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球、其制备方法和应用

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Publication number: CN108743563B
Application number: CN201810965789.2A
Authority: CN
Inventors: 陈渝萍; 张辉; 曾国栋; 赵昌波
Original assignee: Nanhua University
Current assignee: Nanhua University
Priority date: 2018-08-23
Filing date: 2018-08-23
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2038-08-23
Also published as: CN108743563A

Abstract

本发明涉及纳米药物技术领域，本发明提供了一种药物载体、兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球、其制备方法和应用，该载药纳米球包括：药物基体，所述药物基体为负载喜树碱的介孔中空二氧化硅纳米颗粒；复合在所述药物基体上的偶联物，所述偶联物为视黄醇偶联的壳聚糖。本发明提供的载药纳米球粒径分布均匀、比表面积大，生物相容好；能有效解决喜树碱溶解性差、生物利用度低的问题；对喜树碱的释放具有缓释作用，且在低的pH环境下释放明显高于在偏碱性的生理条件下的释放；并对视黄醇和视黄醇结合蛋白复合高摄取的肝星状细胞具有特异的靶向性，可进一步提高喜树碱抗肝纤维化的效果，利于应用。

Description

一种药物载体、兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及纳米药物技术领域，具体涉及一种药物载体、兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球、其制备方法和应用，尤其是一种pH响应性的视黄醇介导并负载喜树碱特异性靶向肝星状细胞的介孔中空二氧化硅纳米球的制备方法和应用。

背景技术

喜树碱(英文名：Camptothecin，简称CPT)，是从我国特有的珙桐科植物喜树中提取的一种五环生物碱，是继紫杉醇后第二种天然抗肿瘤药物。1966年，美国Monroe E.Wall博士首次从我国引种的喜树干中分离并最早报道其抗癌活性。1985年，Hsiang等揭示了CPT抑制拓扑异构酶I的作用新机制，该药逐渐引起国内外医药界的极大重视。

有研究报道，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活和活化表型的维持需要旺盛的糖酵解代谢活动，抑制糖酵解代谢活动可以促使活化态HSCs从肌成纤维母细胞(Myofibroblastic，MF)表型向静息态表型转变。而CPT能够抑制缺氧因子HIF-1-α(hypoxia-inducible-factor 1-α)蛋白水平和活性，且HIF-1-α蛋白是很多糖酵解酶及转运蛋白转录的关键调控因子。因此，喜树碱有抑制HIF-1-α和糖酵解代谢活动、进而逆转细胞活化态表型和治疗肝纤维化的可能性。但是，目前喜树碱在临床中的开发利用却非常有限。其原因主要在于：1)喜树碱难溶于水、生物利用度小，且毒性大；2)若制成盐则活性降低，进入体内又易被体循环系统清除，从而限制了其在临床中的开发利用。

纳米载药系统具有可提高药物利用度、可控释放速率等特点，已成为药剂学及生物纳米领域研究的热点。根据制备等不同，纳米载药系统包括纳米球、纳米胶束和纳米脂质体等类型。但是，目前报道的载送CPT的载药体系在药物控释、降低毒性等方面仍有待改善。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种药物载体、兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球、其制备方法和应用，本发明提供的载药纳米球具有较高的生物利用度，能使药物喜树碱更好地pH响应性的控释，降低药物的毒副作用，更好地抑制活化HSCs。

本发明提供了一种药物载体，包括：

介孔中空二氧化硅纳米球基体；

复合在所述介孔中空二氧化硅纳米球基体上的偶联物，所述偶联物为视黄醇偶联的壳聚糖。

本发明提供的药物载体中，以介孔中空二氧化硅纳米球为基体，即所述药物载体包括介孔中空二氧化硅纳米球基体。所述的介孔中空二氧化硅纳米球也称介孔中空二氧化硅纳米粒、纳米颗粒，简称HMSNs。介孔中空二氧化硅纳米颗粒作为一种新型的药物运输系统，具有粒子形状、可控的粒径，巨大的比表面积和孔容、药物的装载率高，以及对药物的缓释作用、易于修饰的内外表面，生物相容性好等特点。其中，HMSNs具有的空腔与介孔结构增大了载药容积，可提升药物装载量。

在本发明中，所述药物载体基体上复合有壳聚糖成分。壳聚糖(chitosan，CS)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。壳聚糖是一种生物相容性好、可生物降解的天然高分子，在生物医学方面有着巨大的应用潜能。

并且，壳聚糖分子中含有大量的活性氨基，可以发生共价交联、接枝、醋化、酞化、醚化等衍生化反应。本发明将壳聚糖的偶联物修饰到介孔中空二氧化硅纳米球的表面，可实现负载物的pH响应性释放。

本发明所述药物载体基体上复合有视黄醇成分；视黄醇又称维生素A(vitaminA)，是一个具有脂环的不饱和一元醇，分子量：286.4516。在本发明中，所述介孔中空二氧化硅纳米球基体上复合视黄醇偶联的壳聚糖。具体地，视黄醇与壳聚糖通过羰基二咪唑连接得到偶联物；该偶联物再修饰于介孔中空二氧化硅纳米球表面。其中，视黄醇与结合蛋白RBP形成复合物、为HSCs表面受体特异性识别和相互作用，介导HSCs对视黄醇的大量储存。HSCs可通过类似的受体识别作用，与视黄醇修饰的壳聚糖涂层的纳米颗粒相结合。

本发明所提供的药物载体为纳米颗粒，其粒径分布均匀、比表面积大，生物相容好，细胞毒性小。在本发明的实施例中，所述药物载体的氮气吸附-脱附等温线呈现IV型。具体地，所述药物载体的BET比表面积为120～125m²/g，平均孔径为1.5～2.0nm。

本发明提供的药物载体可负载喜树碱等药物，不仅能解决喜树碱溶解性差、生物利用度低的问题，而且利用视黄醇与视黄醇结合蛋白(RBP)复合物同肝星状细胞表面特异受体的作用选择性聚集于肝星状细胞处，肝星状细胞内吞摄取该纳米药物，最后通过细胞内涵体和溶酶体的微酸环境缓慢释放药物，降低药物的毒副作用。此外，本发明提供的药物载体还可负载尼罗红等染料药物，以进行药物检测等。

本发明提供了一种兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球，包括：

药物基体，所述药物基体为负载喜树碱的介孔中空二氧化硅纳米颗粒；

复合在所述药物基体上的偶联物，所述偶联物为视黄醇偶联的壳聚糖。

本发明提供的载药纳米球能有效解决喜树碱溶解性差、生物利用度低的问题，能使药物喜树碱更好地pH响应性的控释，降低药物的毒副作用，更好地抑制活化HSCs。

本发明提供的载药纳米球负载有喜树碱，其负载在介孔中空二氧化硅纳米颗粒上，构成药物基体；即本发明所述药物基体为负载喜树碱的介孔中空二氧化硅纳米颗粒。

本发明所述载药纳米球中，以介孔中空二氧化硅作为药物载体，它与低毒性、生物相容性极好的壳聚糖及特异性识别肝星状细胞的视黄醇分子偶联，并负载治疗肝纤维化的抗癌药物喜树碱。具体地，所述药物基体上复合有偶联物，其可为视黄醇与壳聚糖通过羰基二咪唑连接得到的物质。其中，所述的复合包括静电吸附等作用形式。

本发明提供的载药纳米球为纳米颗粒，属于纳米药物。本发明该纳米药物可以有效解决喜树碱水溶性差、生物利用度低的问题，并且显著增加了纳米材料对肝星状细胞的靶向性。本发明所提供的纳米颗粒粒径分布均匀、比表面积大，生物相容好，细胞毒性小。在本发明的实施例中，所述载药纳米球的氮气吸附-脱附等温线呈现IV型。

本发明所述载药纳米球是一种兼具pH响应性的视黄醇介导特异性靶向肝星状细胞的介孔中空二氧化硅纳米球(hollow silica mesoporous nanoparticles,HSMNs)，其载药量大、生物相容性好；本发明一些实施例中，所述HSMN体系对CPT的包封率为80％，载药量为44％，远远超过了一些载药体系的载药能力。并且，本发明所述载药纳米球外表面修饰的壳聚糖兼具pH敏感性和视黄醇受体靶向性，使得负载的药物喜树碱定位释放，解决了喜树碱在体内输送效率不高的问题，且避免了对其他正常组织的损伤。

本发明提供的载药纳米球为HMSNs体系，兼具pH响应性和HSC靶向性；其中，pH敏感性是通过壳聚糖和HMSNs之间静电相互吸引的物理作用实现。本发明所述的纳米颗粒对喜树碱的释放具有缓释作用，且在低的pH环境下的释放明显高于中性条件下的释放，实现了正常生理条件下对CPT的封堵和酸性条件下的良好的响应性释放。同其它通过复杂的分子化学接枝的门控体系相比，本发明HMSNs体系的pH响应式的控释简便而有效，作为药物载体在药物控释领域具有广泛的应用前景和价值。

并且，本发明中视黄醇的修饰，是针对HSC的靶向设计、一般HMSNs不具备的。本发明所述的载药纳米球具有视黄醇介导的主动靶向性，对视黄醇受体高表达的肝星状细胞具有特异的靶向性，可进一步提高喜树碱抗肝纤维化的效果。

本发明实施例提供了一种兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球的制备方法，包括以下步骤：

S1、提供介孔中空二氧化硅纳米球；

S2、将所述介孔中空二氧化硅纳米球与喜树碱进行负载，得到负载喜树碱的介孔中空二氧化硅纳米颗粒；

S3、采用偶联视黄醇的壳聚糖，与所述负载喜树碱的介孔中空二氧化硅纳米颗粒在溶液中进行复合，得到兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球。

本发明所制备的纳米颗粒粒径分布均匀、比表面积大，生物相容好；能有效解决喜树碱溶解性差、生物利用度低的问题；对喜树碱的释放具有缓释作用，可以更好地保证CPT在循环过程中不被释放和在纤维化肝脏部位以及活化HSC中的充分释放；且可进一步提高喜树碱抗肝纤维化的效果。

本发明实施例首先提供介孔中空二氧化硅纳米球；具体可采用模板法合成介孔中空二氧化硅纳米球。本发明实施例所述模板法中，以碳酸钙纳米颗粒(CaCO₃NPs)为模板球。在本发明的具体实施例中，采用气相法制备模板球碳酸钙，再通过碱性条件下硅源的缩合，在碳酸钙颗粒(CaCO₃NPs)上进行包硅，最后索氏提取的方法去除模板球和表面活性剂，得到介孔中空二氧化硅纳米颗粒(SiO₂HMSN颗粒)。

其中，所述模板球碳酸钙颗粒分布分散，粒径大小较均匀；其平均粒径可为100nm～110nm。所述介孔中空二氧化硅纳米球的平均粒径可为120nm～130nm，单层硅厚度为10～15nm，如为12nm。本发明对模板法合成条件没有特殊限制，所用的硅源、表面活性剂以及碱性条件等均采用本领域技术人员熟知的即可。本发明的优选实施例中，将模板球与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)混合，加入氨水后，以正硅酸乙酯为硅源进行缩合反应，得到中间产物；分离后，利用索氏提取器，酸性条件下除去模板球及表面活性剂，即得所述的介孔中空二氧化硅纳米球(SiO₂HMSN颗粒)。

本发明实施例以所述介孔中空二氧化硅纳米球为药物载体，将抗纤维化药物喜树碱负载到用模板法合成的该介孔中空二氧化硅纳米球中。本发明所述的HMSN载体载药量高，生物安全性好。本发明对喜树碱的负载方式没有特殊限制；主要通过吸附的方法，将喜树碱负载到介孔中空二氧化硅纳米颗粒的孔道。本发明实施例中负载CPT的过程具体可为：将一定质量的SiO₂HMSN颗粒分散在含CPT的二甲基亚砜(DMSO)溶液中，室温下避光搅拌一定时间，随后分离，得到负载喜树碱的介孔中空二氧化硅纳米颗粒(CPT@SiO₂HMSN颗粒)。

得到负载喜树碱的介孔中空二氧化硅纳米颗粒后，本发明实施例将其与偶联视黄醇的壳聚糖在溶液中进行复合，得到偶联物涂层的纳米颗粒，其为兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球。

其中，所述偶联视黄醇的壳聚糖可由视黄醇与壳聚糖通过羰基二咪唑连接制备；具体按照以下步骤得到：将羰基二咪唑和视黄醇溶于N-N二甲基甲酰胺，在通氮气、避光条件下，与壳聚糖混合反应，经固液分离，得到视黄醇偶联的壳聚糖(CS-VA)。

在本发明的一些实施例中，将16.2mg羰基二咪唑和28.6mg视黄醇溶解在N-N二甲基甲酰胺的溶液中，通入氮气10min，避光条件下搅拌24h。随后向上述溶液中加入50mg的壳聚糖，继续通入氮气10min，避光搅拌24h。随后将所得产物离心，水洗，冷冻干燥，得到视黄醇偶联的壳聚糖。

得到视黄醇偶联的壳聚糖后，本发明实施例将其配制成酸性的偶联物溶液，然后与所述负载喜树碱的介孔中空二氧化硅纳米颗粒混合搅拌，使偶联物与负载喜树碱的介孔中空二氧化硅纳米球在溶液中通过静电吸附，得到复合有偶联物的载药纳米球(CPT@SiO₂-CS-VA HMSN颗粒)。

其中，所述偶联物溶液为酸性，优选为弱酸性，如pH值为6。本发明实施例中壳聚糖涂层是通过静电相互作用涂敷在SiO₂颗粒表面的，颗粒表面的负电性和壳聚糖涂层的正电性是关键。另外，壳聚糖分子需要在酸溶液中溶解。所述偶联物溶液具体配制如下：将10mg视黄醇偶联的壳聚糖溶于质量分数为3％的乙酸溶液中，磁力搅拌，配制质量分数为50％的视黄醇壳聚糖偶联物溶液，随后调节pH至6。

本发明实施例将除去模板球及表面活性剂并负载喜树碱的介孔中空二氧化硅纳米颗粒(CPT@SiO₂HMSN颗粒)，以5-10mg/mL慢慢加到以上偶联物溶液中；于室温搅拌，离心，水洗，冷冻干燥，得到偶联物涂层的纳米颗粒(CPT@SiO₂-CS-VA HMSN颗粒)。本发明实施例中以偶联物涂层有效封闭药物的释放；一般而言，涂层厚度加大封闭效果也相应增强；但粒径也会加大，在酸性条件下消除涂层的时间延长。

本发明实施例涉及一种pH响应性的视黄醇介导并负载喜树碱特异性靶向肝星状细胞的介孔中空二氧化硅纳米球(CPT@SiO₂-CS-VA HMSN颗粒)的制备，具体包括：将抗纤维化药物喜树碱负载到模板法合成的介孔中空二氧化硅纳米球中，得到负载喜树碱的介孔二氧化硅纳米球；将靶向肝星状细胞分子视黄醇与壳聚糖通过中间活化体羰基二咪唑连接制备偶联物；将该偶联物与负载喜树碱的介孔中空二氧化硅纳米球在溶液中，如在pH＝6弱酸溶液中通过搅拌静电吸附将偶联物涂覆到纳米颗粒上，得到所述的pH响应性的视黄醇介导并负载喜树碱特异性靶向肝星状细胞的介孔中空二氧化硅纳米球(CPT@SiO₂-CS-VA HMSN颗粒)。

另外，前文所述的药物载体的制备方法与此内容类似，采用模板法合成的介孔中空二氧化硅纳米球不进行药物负载，直接进行后续步骤即可。

本发明所制备的纳米颗粒粒径分布均匀、比表面积大，生物相容好；能有效解决喜树碱溶解性差、生物利用度低的问题；对喜树碱的释放具有缓释作用，且在低的pH环境下释放明显高于在偏碱性的生理条件下的释放。本发明利用视黄醇与视黄醇结合蛋白(RBP)复合物同肝星状细胞表面特异受体的作用选择性聚集于肝星状细胞处，肝星状细胞内吞摄取该纳米药物，最后通过细胞内涵体和溶酶体的微酸环境缓慢释放药物，降低药物的毒副作用，且本发明显著增加了纳米材料对肝星状细胞的靶向性，可进一步提高喜树碱抗肝纤维化的效果。

本发明提供了如上文所述的兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。

本发明实施例制备了pH响应性控释的、靶向HSC的载送CPT的HMSN体系；并且，本发明应用该体系取得了更好的抑制活化HSC的效果,具有广泛的应用前景和价值。

附图说明

图1是实施例1/2/4所制备的CaCO₃、SiO₂、SiO₂-CS-VA三种HMSN颗粒的粒径图；

图2是实施例1所制备的CaCO₃纳米颗粒的SEM图；

图3是实施例4中所制备的SiO₂-CS HMSN颗粒的SEM图；

图4是实施例4中所制备的SiO₂-CS-VA HMSN颗粒的SEM图；

图5是实施例2所制备的SiO₂HMSN颗粒和实施例4所制备的SiO₂-CS-VA HMSN颗粒的氮气吸附-脱附等温图谱；

图6是实施例2所制备的SiO₂HMSN颗粒和实施例4所制备的SiO₂-CS-VA HMSN颗粒的孔隙分析图；

图7是实施例2、3、4所得产物的红外图谱；

图8是实施例1、2、4所得产物的Zeta电位图；

图9是实施例6所得药物NR@SiO₂-CS-VA HMSN颗粒累积释放百分比与时间关系；

图10是实施例4中所得药物CPT@SiO₂-CS-VA HMSN颗粒在不同pH条件下的累积释放图；

图11是实施例8中载体SiO₂-CS-VA和SiO₂-CS两种HMSN颗粒对T6细胞的毒性分析；

图12是实施例9中两种纳米载体负载尼罗红对T6细胞的靶向作用的荧光关系图；

图13是实施例10中两种纳米载体负载尼罗红对T6细胞的靶向作用流式关系图；

图14是实施例10中两种纳米载体负载尼罗红对Hela细胞的靶向作用流式关系图；

图15是实施例11中两种纳米载体负载喜树碱对T6细胞存活率曲线图；

图16是实施例12中纳米载体负载喜树碱对T6细胞三种基因α-Sma、Collagen1a1和Pkm的mRNA表达变化分析图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的药物载体、兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球、其制备方法和应用进行具体地描述。

实施例1模板球碳酸钙纳米颗粒(CaCO₃NPs)的制备：

用电子天平精准称取0.2g的无水氯化钙固体颗粒，溶于100mL的无水乙醇中，充分搅拌使之完全溶解，再转移到150mL的广口瓶中，保鲜膜封住瓶口，扎孔若干，最后置于干燥器中。同样取一30mL的小广口瓶，瓶内放置足量的碳酸氢铵，保鲜膜密封，扎孔若干，放置于干燥器中上述150mL广口瓶附近。最后用盖子将该干燥器盖严密封，于恒温培养箱25℃放置48h，上述150mL广口瓶中得到乳白色溶液。随后将该乳白色溶液多次离心、洗涤，得到模板球碳酸钙，并于无水乙醇中保存，待用。

实施例2介孔中空二氧化硅纳米球(SiO₂HMSNs)的制备：

将实施例1所得模板球碳酸钙50mg分散于内有200mL无水乙醇的烧杯中，再加入50±5mg的CTAB，保鲜膜密封磁力搅拌4小时，使得模板球碳酸钙表面充分吸附CTAB，随后加入氨水2mL，继续搅拌30min，然后逐滴滴加正硅酸乙酯400μL，充分反应24小时，得到中间产物。将所述中间产物多次离心、水洗，再将水洗后的产物置于透析袋中，利用索氏提取器，于盐酸的乙醇溶液中80℃回流，除去模板球及CTAB，隔天换酸醇溶液，回流两天，得到目标产物。最后，将该目标产物水洗，得到介孔中空二氧化硅纳米颗粒(SiO₂HMSN颗粒)，并于乙醇溶液保存，待用。

实施例3视黄醇偶联壳聚糖偶联物(CS-VA)的制备：

将中间活化体羰基二咪唑16.2mg和靶向配体视黄醇28.6mg，按照反应物摩尔比1:1溶解在50mL的N-N二甲基甲酰胺的溶液中，通入氮气10min，避光条件下搅拌24h。随后向上述溶液中加入50mg的壳聚糖(阿拉丁，低粘度壳聚糖，<200mPa.s，货号C105801)，继续通入氮气10min，避光搅拌24h。随后将所得产物离心，水洗，冷冻干燥，得到视黄醇偶联的壳聚糖。

实施例4介孔中空二氧化硅表面涂层偶联物(SiO₂-CS-VA HMSNs)的制备：

(1)称取实施例2所得SiO₂HMSN颗粒各25mg，其中一份分散在20mL浓度为0.5mg/mL的含CPT的DMSO溶液中，室温下避光搅伴24h。随后高速离心，收集产物CPT@SiO₂颗粒，并用水进行洗涤，然后再次离心、收集CPT@SiO₂HMSN颗粒。

将10mg视黄醇偶联的壳聚糖(实施例3制得)溶于20mL质量分数为3％的乙酸溶液中，磁力搅拌，配制质量分数为50％的视黄醇壳聚糖偶联物溶液，随后用氢氧化钠溶液调节pH至6。取以上制备的CPT@SiO₂HMSN颗粒乙醇溶液(浓度5-10mg/mL)慢慢滴加到pH为6的上述偶联物溶液中。室温快速搅拌24h，将所得反应液离心，水洗，冷冻干燥，得到偶联物涂层的纳米颗粒CPT@SiO₂-CS-VA。CPT：80％(包封率)&44％(载药量)。

(2)取另外一份SiO₂HMSN颗粒的乙醇溶液，进行同样的涂层操作，得到空白的药物载体纳米颗粒SiO₂-CS-VA HMSN颗粒。

(3)作为对比，再取一份SiO₂HMSN颗粒，仅用壳聚糖溶液进行涂覆，得到对比药物载体纳米颗粒SiO₂-CS HMSN颗粒。

(4)作为对比，将(1)中的CPT@SiO₂颗粒，仅用壳聚糖溶液进行涂覆，得到对比药物纳米颗粒CPT@SiO₂-CS HMSN颗粒。

实施例5各产物的表征测试：

将实施例1得到的模板球CaCO₃，实施例2得到的介孔中空二氧化硅纳米球(SiO₂HMSNs)，以及实施例4中的药物载体纳米颗粒(SiO₂-CS-VA HMSN颗粒)，进行多项表征测试。

图1为本发明实施例的DLS分析结果，根据图1，模板球碳酸钙和介孔中空二氧化硅纳米球的平均粒径分别为105nm和128nm，由此可推测，单层硅厚度约为12nm。纳米硅球表面涂敷VA修饰的壳聚糖后，总体上平均粒径略有增大，颗粒发生部分团聚。

采用场发射扫描电镜，对模板球、合成的纳米载体进行表面形貌的观察，结果参见图2～4，其中a、b、c分别代表是模板球碳酸钙纳米颗粒、壳聚糖涂覆的二氧化硅中空介孔纳米球颗粒、偶联物涂覆的二氧化硅中空介孔纳米球颗粒。可以看到，模板球碳酸钙颗粒分布分散，粒径大小较均匀，粒径大约105nm。而壳聚糖涂层的二氧化硅和偶联物涂层修饰的二氧化硅，颗粒间较易团聚，表面粗糙，其中部分颗粒有暴露的孔洞，显示其中空结构。

图5是以上实施例中SiO₂和SiO₂-CS-VA两种HMSN颗粒的比表面积的测定及分析结果，图6是SiO₂和SiO₂-CS-VA两种HMSN颗粒的孔隙的测定及分析结果。从曲线的形状特征来看，所合成的SiO₂-CS-VA材料的氮气吸附-脱附等温线呈现IV型。经BET公式计算得到，SiO₂颗粒的比表面积为789.21m²/g，SiO₂颗粒表面经过偶联物涂覆后表面积减小到121.64m²/g。相对于SiO₂颗粒，SiO₂-CS-VA材料比表面积减少了667.57m²/g，由此表明，硅球表面绝大部分被偶联物涂敷住，致使大部分孔道被堵塞。

通过BJH方法，对氮气吸附-脱附实验结果进行分析计算两种纳米颗粒的平均孔径。同SiO₂硅球4.2nm的平均孔径相比，涂敷VA修饰的壳聚糖纳米颗粒的孔径减小为1.7nm，减小了2.5nm，结果表明，硅球表面的偶联物涂覆是成功的。

图7分别是CS和CS-VA涂敷物以及SiO₂和SiO₂-CS-VA HMSN颗粒的红外图谱，在壳聚糖CS的图谱中，3432cm^-1左右分布较宽的吸收峰为由氢氧键遆合的-OH伸缩振动与-NH的伸缩振动构成的吸收峰，2927cm^-1处为不对称的-CH₂的振动伸缩峰。对于偶联物CS-VA，1640cm^-1和1560cm^-1分别为酰胺I和酰胺II带的伸缩振动峰，1258cm^-1为C-C的伸缩振动峰，在2962cm^-1处出现了新峰为-CH₃的对称峰，此峰源自于修饰的配体VA，在1590cm^-1处，酰胺II峰的强度明显变弱，其原因是由于部分N-H水解并和VA发生酰胺反应，在1258cm^-1处的峰是配体VA的C-C伸缩振动峰，相对于CS此位置处的峰变强，795cm^-1处的峰对于CS是新峰，来源于VA环上的甲基峰，698cm^-1是双键的C-H振动峰。这些谱图变化说明，偶联物的合成是成功的。

对于SiO₂-CS-VA颗粒，1080cm^-1处为Si-O-Si的不对称伸缩振动峰，在2962cm^-1处出现-CH₃峰，在795cm^-1左右的峰的强度明显高于SiO₂处的峰，这些说明硅球表面有靶向配体VA的存在。

图8显示了以上实施例所制备的相关纳米载体的Zeta电位结果，图中Zeta电位显示，模板球碳酸钙颗粒由于其含有大量碳酸根离子，故其电位为负值(-16.9mV)，二氧化硅纳米颗粒表面含有大量的-OH，所以电位为负值(-26.7mV)，涂层VA修饰的壳聚糖后，因为壳聚糖所含氨基基团覆盖硅球表面-OH负电荷，使得颗粒电位值有负值变化到正值，达到13.1mV。这一电位改变也间接证明，壳聚糖成功涂敷并覆盖到硅球表面。

实施例6药物NR@SiO₂-CS-VA在不同pH条件下的累积释放分析：

将实施例2得到的介孔中空二氧化硅纳米颗粒称取25mg，分散到30mL含尼罗红(Nile red，NR)浓度为1mg/mL的甲醇溶液中，避光搅拌24h，高速离心，水洗，收集产物NR@SiO₂HMSN颗粒。随后进行实施例4中的涂层操作，得到药物NR@SiO₂-CS-VA。尼罗红:76％(包封率)&40％(载药量)。

另外，作为对比，将所收集的NR@SiO₂HMSN颗粒仅进行壳聚糖溶液的涂层操作，得到药物NR@SiO₂-CS颗粒。

将所得药物NR@SiO₂-CS-VA置于透析袋中，相同条件下测试不同pH条件下的累计释放，结果见图9。图9显示了荷载尼罗红的SiO₂-CS-VA体系，在中性条件下72h累积释放率低于为30％，与其在酸性条件下80％的累计释放率形成鲜明对比。由此说明，壳聚糖偶联物涂层不仅能很好地封闭HMSN孔道的开口，防止药物过早释放，而且可在酸性环境去除药物封堵，控制药物释放。

实施例7药物CPT@SiO₂-CS-VA在不同pH条件下的累积释放分析：

将实施例4得到的荷载CPT的HMSN颗粒，按照实施例6进行药物累积释放，结果见图10。

根据图10，72小时后CPT@SiO₂-CS-VA在pH为7.4的体系中的药物累积释放仅仅30％左右，壳聚糖涂层有效遏制了药物在生理pH条件下的释放。但在pH为5的条件下，药物的释放达到80％，表明壳聚糖涂层赋予载药颗粒pH响应性的释放行为。

实施例8两种纳米载体对T6细胞的毒性分析：

将T6细胞以每孔5×10³接种于96孔板中，于37℃、5％的细胞浮箱贴壁生长24h，随后分别加入浓度范围25μg/mL至500μg/mL的SiO₂-CS-VA和SiO₂-CS HMSNs(实施例4制得)，继续培养24h，再加入CCK-8试剂，用酶标仪检测吸光度值，测试结果见图11。

图11为两种空白载体对细胞的毒性结果，当用浓度为0-500mg/mL的空白纳米载体处理大鼠活化肝星状T6细胞后，细胞存活率随着空白纳米载体的浓度增加而呈现一定的下降趋势，但基本维持在90％以上。说明空白载体的细胞相容性良好。

实施例9 T6细胞摄取两种负载尼罗红的纳米药物的荧光显微观察：

将T6细胞以每孔5×10⁵接种于24孔板中，于37℃、5％的细胞浮箱贴壁生长24h，随后分别加入两种等量负载尼罗红的纳米荧光药物(实施例6中制得)，继续培养2h，PBS洗涤2次，每次5min，加入2.5wt％的戊二醛，避光，于37℃的恒温培养箱静置0.5h，PBS洗涤3次，每次5min。每孔再加入100μL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(1:500，v/v)，汽浴恒温振荡器摇晃5min，吸走DAPI，清洗三次后加入适量PBS避光保存。荧光显微镜观察NR@SiO₂-CS-VA与NR@SiO₂-CS的荧光分布，结果见图12。

图12显示了T6细胞选择性吞噬包载等量尼罗红的壳聚糖涂敷HMSN颗粒的情形，可以看见，NR@SiO₂-CS-VA颗粒所产生的红色荧光强度要显著强于无靶向配体修饰的NR@SiO₂-CS，说明HSC-T6摄取了更多VA偶联的颗粒。

实施例10 T6和Hela细胞摄取两种包覆尼罗红纳米载体的定量分析：

将T6和Hela细胞以每孔5×10⁵接种于6孔板中，于37℃、5％的细胞浮箱贴壁生长24h，随后分别加入两种等量负载尼罗红的纳米荧光药物(实施例6中制得)，继续培养2h，PBS洗涤3次，每次5min。加入300μL的胰酶消化贴壁细胞，再加入一定量化的培养基终止消化，将细胞收集于流式管中，利用细胞流式仪，检测T6和Hela细胞摄取NR@SiO₂-CS-VA和NR@SiO₂-CS的荧光强度，流式数据见图13、图14。

图13、图14分别显示了T6和Hela细胞吞噬包载等量尼罗红的壳聚糖涂敷HMSN颗粒的细胞流式仪的定量分析结果，同样显示了HSC-T6细胞对VA修饰后的HMSN纳米颗粒的吞噬明显增强，细胞的荧光强度表现出数量级的差异。而Hela细胞对两种颗粒的吞噬没有选择性，说明VA修饰有效介导了HMSN颗粒对肝星状细胞的主动靶向性。

实施例11负载CPT的HMSNs的细胞毒性分析

将T6细胞以每孔5×10³接种于96孔板中，于37℃、5％的细胞浮箱贴壁生长24h，随后分别加入浓度范围25μg/mL至500μg/mL的CPT@SiO₂-CS-VA和CPT@SiO₂-CS(实施例4制得)，继续培养24h，再加入CCK-8试剂，用酶标仪检测吸光度值，测试结果见图15。

图15为三种CPT配方对HSC-T6细胞毒性分析；随着药物浓度的增加，三种CPT配方毒性增强。裸药CPT的毒性最强，经HMSN载送的其它两种CPT的细胞毒性虽低于裸药，但也非常明显。其中，VA修饰的荷药体系的毒性明显高于无修饰的对应体系。

实施例12 T6细胞摄取两种包覆CPT的药物培养后，由静息态到活化态α-Sma、Collagen1a1、Pkm的mRNA表达量变化分析：

将T6细胞以每孔5×10⁵接种于12孔板中，于37℃、5％的细胞浮箱贴壁生长24h，随后分别加入三种浓度一致的药物，即：CPT和两种负载CPT的HMSNs药物继续培养48h，PBS洗涤两次并吸弃PBS，每孔加入等量TRIzon Reagent，-80℃冷冻2h后提取T6细胞的RNA。采用逆转录试剂盒和QPCR仪将RNA逆转录为cDNA并稀释，其后进行定量PCR，分析α-Sma、Col1a1、Pkm的mRNA表达量变化，结果如图16。

图16显示了三种CPT配方是如何影响活化HSCs代表性代谢酶基因Pkm和两个MF表型分子标记物基因(α-Sma和Col 1a1)的表达。同对HSC-T6细胞的毒性结果，三种CPT配方均显著降低这些基因RNA表达水平；其中，裸药CPT的抑制作用最显著，而VA接枝的体系比相应的无VA修饰的体系表现出更多抑制效果，说明VA配体通过介导HSC-T6细胞对其修饰的纳米体系的选择性摄取、加强了药效。

由以上实施例可知，本发明所制备的纳米颗粒粒径分布均匀、比表面积大，生物相容好；能有效解决喜树碱溶解性差、生物利用度低的问题；对喜树碱的释放具有缓释作用，且在低的pH环境下释放明显高于在偏碱性的生理条件下的释放。本发明利用视黄醇与视黄醇结合蛋白(RBP)复合物同肝星状细胞表面特异受体的作用选择性聚集于肝星状细胞处，肝星状细胞内吞摄取该纳米药物，最后通过细胞内涵体和溶酶体的微酸环境缓慢释放药物，降低药物的毒副作用，且本发明显著增加了纳米材料对肝星状细胞的靶向性，可进一步提高喜树碱抗肝纤维化的效果，利于应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于使本技术领域的专业技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，是能够实现对这些实施例的多种修改的，而这些修改也应视为本发明应该保护的范围。

Claims

1.一种药物载体，包括：

介孔中空二氧化硅纳米球基体；

2.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于，所述偶联物为视黄醇与壳聚糖通过羰基二咪唑连接得到的物质。

3.根据权利要求1或2所述的药物载体，其特征在于，所述药物载体的氮气吸附-脱附等温线呈现IV型。

4.根据权利要求3所述的药物载体，其特征在于，所述药物载体的BET比表面积为120～125m²/g，平均孔径为1.5～2.0nm。

5.一种兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球，包括：

6.一种兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球的制备方法，包括以下步骤：

S1、提供介孔中空二氧化硅纳米球；

7.根据权利要求6所述的兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球的制备方法，其特征在于，所述偶联视黄醇的壳聚糖按照以下步骤得到：将羰基二咪唑和视黄醇溶于N-N二甲基甲酰胺，在通氮气、避光条件下，与壳聚糖混合反应，经固液分离，得到视黄醇偶联的壳聚糖。

8.根据权利要求6所述的兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球的制备方法，其特征在于，步骤S3为：将偶联视黄醇的壳聚糖配制成酸性的偶联物溶液，然后与所述负载喜树碱的介孔中空二氧化硅纳米颗粒混合搅拌，得到复合有偶联物的载药纳米球。

9.如权利要求5所述的兼具pH响应性和HSC靶向性的载药纳米球，或权利要求6～8中任一项所述的制备方法得到的载药纳米球在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。