CN103221040A - 双硫仑制剂及用途 - Google Patents

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Abstract

由双硫仑或其衍生物和一种能够提高双硫仑或其衍生物体内半衰期的组分组成的制剂及其用途。尤其是联合使用或不联合使用铜制剂用于癌症的治疗中。

Description

双硫仑制剂及用途
本发明涉及一种新型的双硫仑或其衍生物的制剂和用途，特别用于癌症的治疗。
双硫仑用于戒酒的治疗超过50年。双硫仑对乙醇敏感，病人在治疗期间即使摄取很少量的乙醇，也会产生不适的反应。双硫仑阻断了乙醇在乙醛阶段的氧化。摄入双硫仑后，人体血液中乙醛的浓度比饮用等量乙醇但未服用双硫仑的受试者乙醛的浓度高5至10倍。乙醛在血液中的蓄积会产生极度不适症状，称为双硫仑-乙醇样反应，其程度与摄入的双硫仑和乙醇的量均成正比，这种反应会一直持续到乙醇被完全代谢。双硫仑即使与很少量的乙醇同服，也会产生面部潮红、头颈部血管剧烈搏动、搏动性头痛、呼吸困难、恶心、呕吐、出汗、口干、胸痛、心悸、过度换气、心动过速、低血压、晕厥、躁动不安、乏力、眩晕、视力模糊和恍惚等症状。
体外实验证明，双硫仑对多种癌症细胞都具有高度的细胞毒性(WangW et al(2003)Int J Cancer104(4)：504-11；Cen De et al(2004)J Med Chem47(27)：6914-2)。双硫仑对肿瘤细胞的细胞毒性作用有效浓度处于纳摩尔水平，比许多临床使用的抗癌药物更加显著有效。尽管体外实验结果很令人振奋，但是鲜有研究报道了双硫仑在动物实验中的抗癌活性(Iljin K et alClin Cancer Res2009；15(19)：6070-8；Brar S Setal Mol Cancer Ther2004；3(9)：1049-60；Chen D et al Cancer Res2006；66(21)：10425-33)。此外，此类研究表明在给予小鼠极高剂量双硫仑后方能有效，这种剂量对癌症患者是不可耐受的。目前有几项已经完成或正在进行的使用双硫仑治疗癌症的临床试验(Verma S et al.Am J Clin Oncol1990；13(2)：119-24)，但尚未取得有积极成果的报道。由体外、体内和临床数据之间的差异得出结论：双硫仑不适合用于人类癌症的治疗。
因此，截至目前，双硫仑未作为抗癌药物用于人体，这是因为双硫仑在癌症治疗方面的潜在临床应用受到现有双硫仑口服制剂的制约。口服给药后，双硫仑在胃酸中极不稳定，并且大部分口服的双硫仑快速降解成二硫化碳(CS2)和二乙胺(DEA)(Johansson B.AActa Psychiatr Scand Suppl1992；369：15-26)。吸收的双硫仑在肝脏富集并被血液中红细胞中谷胱甘肽还原酶系统迅速降解(半衰期：4分钟)。因此，口服剂量为500mg的双硫仑，其血药浓度低于检测限。这并不影响其抗酒精滥用的作用，因为口服的双硫仑迅速聚集于肝脏，抑制ALDH。双硫仑在血液中迅速降解对双硫仑的临床应用提出了严峻的挑战，同时解释了临床试验未得到理想结果的原因(http://www.clinicaltrials.gov/)。体外细胞毒性实验和患者抗癌疗效的差异表明双硫仑经由胃肠道系统、肝首过效应和血液途径快速降解，阻止了治疗量的药物到达癌症部位，因此成为临床使用双硫仑进行癌症治疗的主要限制因素。
根据本发明的第一个方面，提供了由双硫仑或其衍生物以及能够延长双硫仑或其衍生物体内半衰期的组分组成的双硫仑制剂。
双硫仑化学结构式：
Figure BDA00003193239600021
双硫仑的其中一个衍生物可能是二乙基二硫代氨基甲酸或二乙基二硫代氨基甲酸酯(DDC)或其代谢物，或是双硫仑的代谢物。更恰当地说，衍生物不包括铜。
在给药间隔大于两个小时情况下，下次给药前，双硫仑或其衍生物的活性最好至少维持在50％以上。
优选的双硫仑或相关衍生物的体内半衰期是增加到至少30分钟，最好至少1小时，2小时以上更好，甚至是2.5小时以上。优选的体内半衰期是指给予的双硫仑或其衍生物降解一半所用的时间。
更恰当地说，双硫仑或其衍生物的降解产物，不具有显著的抗肿瘤活性。体内半衰期可以通过测定不同时间点血浆中活性物质的浓度来计算。
可通过将双硫仑及其衍生物包封，实现延长双硫仑及其衍生物的半衰期的目的。
这种能够延长双硫仑或相关衍生物的半衰期的组成可以是脂质体，或者说用脂质体将双硫仑及其衍生物包封。更具体地说，本发明涉及一种双硫仑制剂，将双硫仑及其衍生物包裹在脂质体中。优选制剂是制备双硫仑脂质体。
脂质体是人工制备的囊泡，外层为磷脂双分子层，可以将双硫仑或其衍生物包裹其中。
本发明制备的脂质体直径范围是100～300nm，优选粒径是175nm±60nm左右。
脂质体具有两亲性，而实现延长双硫仑半衰期的是亲水外壳。
脂质体中的脂质含量范围是10～100mg/ml，最好是50mg/ml左右。
脂质体中的脂质指磷脂，磷脂可以是天然磷脂和(或)合成磷脂。通常意义的磷脂包括中性磷脂和(或)荷负电荷磷脂与甾醇类物质合用，比如胆固醇。目前所用磷脂可以是不带任何电荷的磷脂酰胆碱，和其他荷负电的磷脂，例如磷脂酰甘油。根据最终所要形成脂质体的粒径、被载的药物和脂质体稳定性等方面选择合适的脂质材料。
如果其中含有胆固醇，胆固醇含量占全部脂质材料总量的比例可以在0～50％之间，最好处于35～50％之间。胆固醇降低脂质双分子层对离子和极性小分子的透过性和(或)降低蛋白质穿透双分子层造成双分子层无序而致不稳定的能力，从而提高脂质体的稳定性。
本发明涉及至少载有双硫仑或其衍生物的脂质体为稳定且可重现的。脂质体以混悬液形式存在时应更为稳定。脂质体适用于静脉注射，亦可用于口服给药，用于癌症治疗。
采用Bangham等人发明的方法制备(J.Mol.Biol.(1964)8，660-668)得到了不同粒径大小的多层脂质体(MLVs)。此方法中磷脂溶解于适宜的有机溶剂中，然后通过真空条件下旋转蒸发除去有机溶剂。形成的脂质膜注入合适的含有药物的水化介质，通过人工或机械搅拌实现水化过程。MLVs的非均相混悬液可以采用任何已知的技术来使其粒径减小和匀化。例如，将MLVs溶液经过钛探头超声或聚碳酸酯滤膜过滤是得到挤出多室脂质体的两种常用方法。
能够延长双硫仑或其衍生物的半衰期的制剂也可以是纳米粒(Malamet al(2009)Trends in Pharmacological Sciences Vol，30No.11)。纳米粒是粒径范围为1～1000nm的粒子。纳米粒可以是白蛋白纳米粒，也可以是固体脂质纳米粒子，粒径范围在50～1000nm。这些脂质材料在人体生理温度(37℃)下为固体，包括一系列脂类材料，例如单甘油酯、甘油二酯和甘油三酯、脂肪酸、蜡以及它们的组合。固体脂质纳米粒形成一个强亲脂性基质，药物可以包载其中随后释放。
另外，纳米粒也可选择聚合物为材料。这些聚合物通常是一些可生物降解的有机高分子。常用的聚合物有聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物和聚乙二醇。脂质体可以进行表面修饰，可以向脂质体表面插入蛋白质，通过氨基酸基团连接蛋白质和多肽，通过巯基基团结合蛋白质和多肽，连接糖类和其他小分子，结合抗体或其他癌症靶向的分子等。
在进一步可选的实施例中，纳米粒也可以是金属金纳米粒，并通过含有巯基的分子对金属金表面进行功能化修饰。
这种提高双硫仑及其衍生物半衰期的组成可能是介孔二氧化硅纳米粒(Coti et al(2009)Nanoscale Vol.1，No.1，Pages1-172)。
本制剂最好与含铜制剂联合使用，两制剂可以是单独、同时或循序给药，这里首选循序给药。
很多癌症细胞中的铜的水平高于健康组织，因此本制剂在不额外给铜的情况下也是有疗效的。
双硫仑或其衍生物的给药剂量约为250或500毫克/天，最好采用静脉给药。酗酒患者的双硫仑耐受剂量为250至500毫克/天。患者最好同时服用2mg铜，如葡萄糖酸铜。葡萄糖酸铜最好通过口服使用。
双硫仑或其衍生物给药剂量范围可以是1mg/kg～50mg/kg，范围是1mg/kg～20mg/kg更佳，最优剂量为10mg/kg。
本发明涉及了一种双硫仑或其衍生物的脂质体，根据本发明得到的包含双硫仑及其衍生物的脂质体比单独应用双硫仑或其衍生物具有更长的体内半衰期。
首选的实施例中，本发明提供一种脂质体，其中仅包含一种活性成分，即双硫仑。优选方法中，脂质体中不含铜。
双硫仑或其衍生物的脂质体的最优处方室温保存一年以上稳定。
另一方面，本发明提供了一种双硫仑制剂用于癌症的治疗。
本发明的制剂可以用于阻止和(或)抑制肿瘤细胞和(或)肿瘤干细胞的增殖。
双硫仑脂质体能够有效地阻止或降低肿瘤干细胞的增殖。癌症治疗方法对肿瘤干细胞无效被认为是导致很多癌症治疗失败的原因。
癌症可以为任何适合的癌症，例如，肾脏癌，膀胱癌，卵巢癌，乳腺癌，子宫内膜癌，胰腺癌，淋巴癌，甲状腺癌，骨癌，中枢神经系统癌症，白血病，肝癌，前列腺癌，肺癌，结肠癌，直肠癌，脑癌，黑色素瘤。
进一步来看，依据癌症治疗药物方面的发明，本发明提供了双硫仑制剂的应用。
然而更进一步本发明提供了一种治疗癌症的方法，它包括根据本发明给予患者有效治疗剂量双硫仑制剂。
另一方面，本发明提供了一种药物组成。它包含根据本发明而来的双硫仑制剂以及药物制剂上可用的载体或辅料。
制剂应用
本发明提供了一种治疗和预防癌症的方法，这种方法通过给予病人需要的有效治疗剂量的制剂。同样，使用本发明中的制剂用于癌症治疗药物的生产也在本发明范围中。类似地，以此类推，本发明同样提供了一个用于癌症治疗的制剂。
术语“治疗”用于此，意在为抵御病人的疾病或紊乱状态而进行的管理以及照料。本术语囊括了针对特定患者的广谱的治疗，例如给予活性化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病的进程、紊乱或不良状态，缓和或减轻症状或并发症，和/或治疗或消除疾病，紊乱或不良状态，也包括预防不良状态。在这里，预防应被理解为管理照料病人以同疾病、不良状态或紊乱抗争，包括给予活性化合物来预防一些症状和并发症的发生。被治疗的病人最好为哺乳动物类，尤其是人类，但也包括动物，如狗，猫，马，牛，羊和猪。
联合治疗
许多疾病使用多于一种药物联合治疗，或同时使用，或循序使用。因此，在癌症治疗方法中，使用本发明的制剂作为一种辅助方法或联合方法同其他常规的癌症治疗方法合用，也包括在本发明的范围中。并且，同样地，本发明的范围也包括利用本发明的制剂与其他常规用于癌症治疗的活性物质联合使用用于癌症治疗药物生产以及应用。
在一个实施例中，本发明的制剂可与手术治疗和放射性治疗联合使用，和/或与一种或多种药物联合治疗，例如
Figure BDA00003193239600061
Wafer(卡氮芥晶片)，5-氟尿嘧啶，阿霉素，紫杉醇和吉西他滨。这种联合使用更好地用于治疗一种或者多种癌症，包括结肠癌，乳腺癌和恶性胶质瘤癌(脑癌)。所有上述提到的实例显示出了强烈的协同作用。
专业技术人员可采用必要或方便的方法进行联合给药，就本专利说明书的目的而言，联合给药中并无有关于化合物使用顺序，使用量，重复性或相对使用量上的限制。
药物组成
另一方面，本发明提供了一种药物制剂，它包括双硫仑或其衍生物，或其在药物制剂方面可接受的盐，溶剂化物或者水合物，和一种能够增加双硫仑或其衍生物的体内半衰期的组分。
一个实施例提供了一种药物制剂用于癌症治疗，包括双硫仑或其衍生物，或者药物制剂方面可接受的盐，溶剂化物或者水合物，和一种能增加双硫仑或其衍生物的体内半衰期的组分。
在上下文中，术语“药物制剂方面可接受的盐”意指对病人无害的盐类。这些盐类中包括药物制剂方面可接受的酸或碱的加成盐，金属盐，铵盐和烷基化铵盐，加成盐包括无机酸盐和有机酸盐。可接受的无机酸盐的代表包括盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，磷酸盐，磺酸盐，硝酸盐等类似无机酸盐类。可接受的有机酸典型例子包括甲酸，乙酸，三氯乙酸，三氟乙酸，丙酸，苯甲酸，肉桂酸，柠檬酸，富马酸，甘露酸，乳酸，马来酸，苹果酸，丙二酸，扁桃酸，草酸，苦味酸，丙酮酸，水杨酸，琥珀酸，甲基磺酸，乙基磺酸，酒石酸，抗坏血酸，双羟萘酸，亚甲基双水杨酸，乙基二磺酸，葡萄糖酸，甲基顺丁烯二酸，天冬氨酸，硬脂酸，棕榈酸，乙二胺四乙酸，甘醇酸，对氨基苯甲酸，谷氨酸，苯磺酸，甲苯磺酸等等。药物制剂方面可接受的无机酸和有机酸加成盐包括药物制剂方面可接受的盐的更多例子在J.Pharm.Sci.1977，volume66，issue2中列举出来。金属盐的例子包括锂、钠、钾、镁盐等等。铵盐和烷基化铵盐的例子包括，铵，甲胺盐，二甲胺盐，三甲胺盐，乙胺盐，乙醇胺，二乙胺，丁基胺盐，四甲基胺盐等等。
本发明的药物组成可利用药物制剂方面可接受的载体或者填充剂以及其他已知的并且与传统的技术相一致的辅助物和辅料制成，例如那些在Remington公开的：The Science and Practice of Pharmacy，19thEdition，Gennaro，Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1995.
药物制剂方面可接受的载体包括惰性固体稀释剂或者填充剂，无菌水溶液和各种有机溶剂。固体载体包括乳糖，石膏粉，蔗糖，环糊精，滑石粉，明胶，琼脂，果胶，阿拉伯胶，硬脂酸镁，硬脂酸和纤维素的低级烷基醚。液体载体包括糖浆，花生油，橄榄油，磷脂，脂肪酸，脂肪酸胺，聚氧乙烯和水。此外，本发明的化合物可以与水或普通的有机溶剂形成溶剂化物。这样的溶剂化物也包含在本发明的范围之内。
该药物组成可进一步包括缓冲系统，防腐剂，等渗剂，螯合剂，稳定剂和表面活性剂，这是本领域技术人员众所周知的。为方便起见，参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th edition，2000。该组合物还可进一步包括一种或多种治疗制剂，积极应对相同的疾病状态。
生产含本发明各药物组成的控释系统的方法，包括结晶法，浓缩法，共结晶法，沉淀法，共沉淀法，乳化法，分散法，高压均质法，微囊化法，喷雾干燥法，微囊化法，凝聚法，相分离法，溶剂蒸发法来形成微球，挤出物和超临界流体的过程，但并不仅限于这些方法。一般参考Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise，D.L.，ed.Marcel Dekker，New York，2000)and Drug and the PharmaceuticalSciences vol.99：Protein Composition and Delivery(MacNally，E.J.，ed.Marcel Dekker，New York，2000).
服用根据本发明而来的药物组成可通过以下几种途径，例如，口服，直肠，鼻腔，肺，局部(包括颊和舌下)，经皮，脑池内，腹膜内，阴道和非口服(包括皮下，肌内，鞘内，静脉内和皮内)的途径。最优的途径将依赖于受试者的总体状况和年龄，病情的性质以及所选择的活性成分。
本发明化合物可制备成喷雾剂，乳膏，软膏，凝胶剂，吸入剂，贴片，植入剂，混悬液等，用于局部使用。为此应用目的，局部使用也应包括漱口水，漱口剂。本发明的化合物可以用于圆晶技术，如可生物降解的卡氮芥糯米纸胶囊(Gliadel)聚合物晶片，对于脑癌化疗非常有用。
用于口服给药的药物组成包括固体剂型，如硬或软胶囊，片剂，锭剂，糖衣丸，丸剂，糖锭剂，粉剂和颗粒剂，用于口服给药的液体剂型包括溶液剂，乳剂，水性或油性悬浮液，糖浆剂和酏剂，这些剂型都含有一定剂量的活性成分和适宜的辅料。
可根据任何已知的方法制备用于口服使用的组成，这类组成可选择一个或多个增甜剂，调味剂，着色剂和防腐剂等各类的添加剂，以提供舒适和可口的药物制剂。
片剂可包含活性成分与适合用于制造片剂的无毒的药物制剂上可接受的辅料的混合物。这些辅料可以是，惰性稀释剂，如碳酸钙，碳酸钠，乳糖，磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如，淀粉，明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁，硬脂酸或滑石粉。
片剂可以不包衣，或用已知的技术包衣来延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在较长的时间内持续作用。例如，一种延时材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯可以被采用。它们也可以由专利报道的方法(inU.S.Patent Nos.4,356,108；4,166,452；and4,265,874)来制备渗透片来控制释放。
用于口服的制剂也可以制备为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，例如，碳酸钙，磷酸钙或高岭土，或制备成软明胶胶囊，其中活性成分混合于水或油介质中，例如花生油，液体石蜡，或橄榄油。
水溶性混悬剂可含有活性化合物与适于制造混悬剂的辅料。这类辅料可以是助悬剂，例如羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，海藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，西黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，如卵磷脂，或环氧乙烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如，十七乙基烯氧鲸蜡醇，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚山梨糖醇酐单油酸酯。水溶性混悬剂还可以含有一种或多种着色剂，矫味剂，或甜味剂，如蔗糖或糖精。
油性混悬剂可以把活性成分混悬在植物油中，例如花生油，橄榄油，芝麻油，椰子油，或者是矿物油，例如液体石蜡中。油性混悬剂可能包括增稠剂，例如蜂蜡，硬质石蜡或者十六醇。甜味剂包括上面提到的所有甜味剂，添加矫味剂能够提供口感好的口服制剂。在处方中增加抗氧剂，例如抗坏血酸，以保存这些组分。
可分散的粉末和颗粒通过加水制备水溶性混悬剂，包括活性化合物与分散剂或润湿剂，助悬剂和一或多种防腐剂的混合物。适宜的分散剂或者润湿剂以及助悬剂已经在前面的例子中提到。添加的辅料例如，甜味剂，矫味剂，着色剂也可能存在。
该发明物的制剂组成可能也以水包油型乳剂的形式存在。油相可能是植物油，例如橄榄油，花生油，矿物油(例如液体石蜡)或者它们的混合物。适宜的乳化剂可以是天然橡胶，例如阿拉伯胶，西黄蓍胶；天然磷脂，例如大豆磷脂、卵磷脂、和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如山梨坦单油酸酯和上述偏酯和环氧乙烷的缩合物，例如聚氧乙烯山梨坦单油酸酯。乳剂可以也包含甜味剂和矫味剂。
糖浆剂和酏剂可以也在处方中加入甜味剂，例如山梨糖醇或蔗糖。这样的制剂也可以含有润湿剂，防腐剂，矫味剂和着色剂。制剂组成可以是无菌水性或油性注射用混悬液的形式。该混悬液可根据已知的方法，使用上述适宜的分散剂或润湿剂和混悬剂。无菌注射制剂也可以是无菌注射溶液或在无毒的非口服给药的稀释剂或溶剂中的混悬液，例如1，3-丁二醇的溶液。可用的溶媒和溶剂有水，林格氏液，等渗氯化钠溶液。此外，无菌的非挥发油用作溶剂或混悬介质非常方便。为此，可以利用任何无刺激性固定组成的油合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸，如油酸，也可以用于注射剂中。
肠胃外给药可以以笔状注射器的方式进行皮下，肌内，腹膜内或静脉内注射。或者，输液泵也可用作肠胃外给药。另外，也可以像催乳素受体拮抗剂的溶液或混悬液制成鼻或肺喷雾制剂那样给药。作为更进一步的选择，包含本发明化合物的药物组成应该也可以采用透皮给药，例如无针注射或来自贴片，比如离子电渗疗法贴剂，或者经粘膜给药(的)如颊粘膜给药。非胃肠道给药的药物剂型包括无菌水溶液和可注射的非水溶液、分散体系、混悬液、乳剂，也包括使用前在无菌注射用溶剂或分散体系中复溶的无菌粉末。
“合剂”指含有至少50％(w/w)水的合剂。同样，“水溶液”指包含至少50％(w/w)水的溶液，而“水混悬液”指包含至少50％(w/w)水的悬浮液。如果需要的话，这些水溶液应加适当的缓冲液，并且液体稀释剂应先用足够的生理盐水或葡萄糖调至等渗。水溶液特别适用于静脉内，肌内，皮下和腹腔内给药。无菌用水介质可以通过已知的标准技术很容易得到。可注射的贮库制剂也在本发明的范围内。
当本发明与其他活性治疗药物结合使用来治疗相同疾病时，它们可以方便地单独或合并给药，单个或多个剂量给药，循序或同时给药，以相同或不同途径给药。
一般情况下，根据预计给药方式，制剂包含的活性成分质量分数约0.005％至95％，最好约0.5％至50％。制剂中的活性化合物的百分比取决于制剂的具体性质，也取决于化合物的活性和患者的需求。溶液中活性成分的比例通常采用是0.01％至90％，同时如果该制剂是经固体稀释得到的，其含量可以更高。在一些实施例中，该液体制剂中含有1％到50％活性化合物。
有效剂量
根据本发明，制剂通常采用实现预期结果的有效用量，例如以有效用量来治疗或预防具体疾病。制剂可以通过给予治疗剂量药物实现治疗效果。治疗效果是指根除或改善的潜在病症和/或消除和/或改善与潜在病症相关联的一个或多个的系统。治疗效果还包括不管是否改善该疾病，能够停止或减缓该疾病的进展。
准确的剂量将取决于给药的频率和方式，性别，年龄，体重和受试者的总体情况，病情的性质和严重程度以及任何的并发症和其他对于技术人员显而易见的因素。有效剂量的确定在本领域的技术人员的能力范围内。
当本发明制剂和第二种制剂联合使用治疗相同疾病时，各化合物的剂量可能与单独给药时不同。本领域的技术人员能很容易地选用合适剂量。
在一个优选的实施例中，该制剂将采取单位剂量形式。例如，该制剂可放置在小瓶或其它容器中。小瓶或其它容器可以含有液体，将被稀释成混悬液的固体，干燥粉末，冻干物，或任何其它合适形式的制剂。
本发明应用于一个方面或实施例的任意特征可以以任何组合和任何数量使用。此外，它们也可以任意数量地与本发明中其他任何方面特征或实例联合使用。这包括但不限于对本应用中权利要求的从属要求进行进一步限定的权利要求的从属要求。
本发明将被进一步描述，只通过非限制性的例子，参照下面的附图和实施例。
图1A-1C表明双硫仑脂质体以铜-依赖的方式诱导乳腺癌细胞凋亡。
图1A显示了MTT细胞毒性检测的结果。X轴是药物浓度，Y轴是存活率％。乳腺癌细胞系暴露于不同的处理条件下72小时，结果表明双硫仑脂质体/铜和双硫仑/铜的细胞毒性是相当的。无铜添加时，双硫仑脂质体不能消除癌细胞和两个细胞系有双相作用(第二生存峰)。
图1B显示用流式细胞仪分析双硫仑脂质体治疗作用下细胞的DNA含量。隔夜培养的乳腺癌细胞72小时暴露于双硫仑脂质体(0.5μM)或铜(10μM)+双硫仑脂质体(0.5μM)。对处理过的细胞(10,000例)的DNA含量进行了测定。sub-G1期细胞的代表凋亡细胞(**P＜0.01，N＝3)。
图1C显示药物暴露72小时后乳腺癌细胞系的形态(×100倍)。
图2表明了MTT分析的结果，结果显示双硫仑脂质体对紫杉醇(PAC)，吉西他滨(GEM)和阿霉素(DOX)的增强作用。DOX∶双硫仑脂质体＝1∶5，吉西他滨∶双硫仑脂质体＝1∶10，紫杉醇∶双硫仑脂质体＝1∶62.5。进行MTT测定之前将细胞72小时暴露在常规抗癌药物或抗癌药物+双硫仑脂质体+10μM铜。
图3A表明，活性氧(ROS)影响乳腺癌细胞的细胞毒性和双硫仑脂质体+铜对其的选择性。结果证明双硫仑脂质体+铜在乳腺癌细胞中诱导ROS生成，而在正常的细胞中则不会。在乳腺癌和正常细胞系中加入ROS检测溶液，并暴露于双硫仑脂质体(1μM)和铜(10μM)中处理1小时。通过流式细胞仪检测ROS阳性的数量。此图显示三个实验的相对ROS活性[(处理/未处理)×100％]平均值和标准差。
图3B显示了双硫仑脂质体+铜对乳腺癌细胞的靶向作用。乳腺癌(T47D，MCF7和MDA-MB-231)和正常(MCF10A及HeCV)的细胞暴露于双硫仑脂质体+铜中。72小时后采用MTT法测定经处理后细胞的生存能力。
图3C表明，ROS抑制剂(NAC)逆转双硫仑脂质体+铜对乳腺癌细胞毒作用。MTT法检测暴露到双硫仑脂质体+铜与或无NAC(10mM)72小时后乳腺癌细胞的细胞活性。
图3D表明，通过EMSA实验检测双硫仑脂质体+铜抑制NFκB对DNA结合能力。乳腺癌细胞株经过双硫仑脂质体(1μM)+铜(10μM)处理24小时。
图4A和4B显示双硫仑+铜对乳腺癌细胞株(MCF7，MDA-MB-231，T47D和ZR75)和正常细胞株(MCF10A及HeCV)细胞克隆的作用。将细胞暴露到双硫仑脂质体(1μM)+铜(10μM)1小时后，药物处理的癌症细胞(2.5×103)和正常细胞(5×103)重新悬浮于无药介质中，并接种于6孔板中。经过10天的培养，计细胞克隆数(＞50个细胞)。图4A显示典型的细胞克隆形成图像。图4B显示从三个实验克隆数的平均值和SD值。
图5A-5E显示双硫仑脂质体+铜对肿瘤干细胞的作用效果。
图5A和5B显示出了常规抗癌药物和双硫仑脂质体+铜在肿瘤干细胞(CSCs)和正常的癌细胞的细胞毒性。肿瘤干细胞对常规抗癌药物高度耐药，但对双硫仑脂质体+铜不然。肿瘤干细胞培养在含有干细胞介质的超低粘附平板中富集。肿瘤干细胞和正常的癌细胞暴露于双硫仑脂质体+铜72小时后，MTT法测定其细胞活力。
图5C和5D显示双硫仑脂质体+铜大大降低肿瘤干细胞(ALDH1和CD24-/CD44+)的数量。肿瘤干细胞暴露在双硫仑脂质体(1μM)+铜(10μM)1小时，并在无药培养基中恢复16小时。用流式细胞仪测定肿瘤干细胞株的ALDH1和CD24-/CD44+。
图5E显示双硫仑脂质体+铜抑制微球体的形成。用双硫仑1μM，铜10μM或双硫仑脂质体+铜处理乳腺癌细胞1小时，然后加入无药干细胞培养基，在超低粘附96孔板(30个干细胞/孔)培养10天。微球体(＞50个细胞/球)数量从30孔中计数，并且在×40倍放大下观察。
图6A至6F表明双硫仑脂质体+铜抑制小鼠肿瘤的生长。将S180小鼠肉瘤(图6A-6C)和MDA-MB-231乳腺癌细胞(1×106)(图6D-6F)分别皮下注入BALB/c和CD1Nu/Nu小鼠背部腹胁处(S180：N＝5；MDA-MB-231：N＝6)。当移植的肿瘤直径达2毫米，应对荷瘤小鼠进行以下的处理：
1)对照组：无治疗。(对照组)
2)双硫仑脂质体：30mg/kg静注。(双硫仑脂质体)
3)双硫仑脂质体静脉注射+氯化铜口服：先口服氯化铜3mg/kg，然后静注双硫仑脂质体30mg/kg。(双硫仑脂质体+铜)
4)双硫仑(30mg/kg)口服(仅用S180进行实验)。(双硫仑)
5)双硫仑(30mg/kg)口服+氯化铜(3mg/kg)口服(仅用S180进行实验)。(双硫仑+铜)
分别在周一，周三和周五给药，连续给药2周。给药结束后观察乳腺癌小鼠1周，观察S180肉瘤小鼠2周。
实施例1
双硫仑脂质体的制备
双硫仑脂质体通过在圆底烧瓶中制得一个包含有适当脂类的氯仿溶液制备，如下表1中所示。然后通过旋转蒸发仪去除有机溶剂，此外痕量溶剂通过通氮气或冷冻干燥除去。得到的脂质薄膜加入含有双硫仑的0.9％NaCl溶液3ml，于振动混合器中每隔30s进行搅拌至水化，随后放置在60℃水浴中相同的的时间，再有效搅拌10min，这样会得到最优的多室脂质体。脂质体溶液然后经钛探头超声至浑浊度发生变化，在N2保护下于冰水浴中每超声2min停止1min。为除去超声过程中产生的钛颗粒，得到的溶液在3000rpm下离心20min。由此得到的脂质悬浮物较好地包含有小单室脂质体。
或者，将用上述方法得到的多室脂质体经0.4和0.2μm的聚碳酸酯滤膜挤出，得到挤出多室脂质体。
双硫仑的包封率的测定方法为，用葡聚糖凝胶G-50M色谱分离脂质体混悬液，以0.9％的NaCl为洗脱液。
表I
Figure BDA00003193239600141
在表格I中使用了以下缩写：MLV-多室脂质体；SUV-小单室脂质体；VET-挤出多室脂质体；PC-磷脂酰胆碱；PG-磷脂酰甘油；CHOL-胆固醇；DSF-双硫仑。
在另一个实施例中双硫仑乳剂用如下成分制备。
Figure BDA00003193239600151
在70℃下将豆磷脂分散到中链甘油三酯(MCT)中，加入双硫仑直至溶于油相。水相中包括F68，油酸钠和甘油，于65℃水浴中加热直至完全溶解。然后用0.1mol/L的NaOH和H3PO4将水相的PH值调至6.0。迅速将水相加到油相中以8000rpm高速剪切混合制备初乳。高速剪切混合过程进行2分钟，重复2次。初乳用注射用水定容至100mL。用高压均质机于7000bar循环8次得到终乳。整个均质过程用冰浴控制温度在40℃以下。最后将乳剂装入小瓶中，通入氮气，于121℃下高压蒸汽灭菌10分钟。
用上述方法得到的双硫仑乳剂在血浆中可至少稳定25小时，25小时后剩余75％，而单纯双硫仑在血浆中被迅速分解，25小时后只剩大约15％。
同样，双硫仑乳剂在全血中可至少稳定5小时，而单纯双硫仑在全血中被迅速降解，5小时后只剩大约10％。
考虑到制备乳剂的常用油的影响，尤其是单独使用长链甘油三酯(LCT)或中链甘油三酯(MCT)或是两者合用的情况。对单独使用长链甘油三酯(LCT)、单独使用中链甘油三酯(MCT)和使用中链甘油三酯(MCT)与长链甘油三酯(LCT)混合物(1∶1)制备的双硫仑乳剂的稳定性进行了考察。将双硫仑溶解在油中，60℃条件下测定其含量的变化。结果在表1A中。
表1A10天中于60℃不同油箱中双硫仑的残留量(％)
Figure BDA00003193239600152
Figure BDA00003193239600161
结果显示在中链甘油三酯中的双硫仑的含量减少大大低于在长链甘油三酯中及两者的混合物中。中链甘油三酯曾被报道是比长链甘油三酯更好的溶剂并且表现出更强的抗氧稳定性。而且，经研究中链甘油三酯是比长链甘油三酯更好的双硫仑溶剂。
实施例2
双硫仑脂质体通过一个铜依赖的机制诱导乳腺癌细胞(BC)凋亡
进行了双硫仑和双硫仑脂质体对乳腺癌细胞的毒性比较，在含有氯化铜(10μM)的培养基中，双硫仑脂质体和双硫仑对乳腺癌细胞相当的毒性(图1A)。无铜添加的情况下双硫仑脂质体不能根除癌细胞，并且经细胞毒性分析证明双硫仑脂质体对两个乳腺癌细胞有两相作用。流式细胞DNA含量分析证明了接触双硫仑脂质体+铜达72小时后细胞凋亡(sub-G1数量)明显增加。药物诱导的形态学改变见图1C。
实施例3
双硫仑脂质体+铜协同增强紫杉醇、阿霉素和吉西他滨的对乳腺癌细胞的细胞毒性
考察了双硫仑脂质体对三种一线抗乳腺癌药物的增强作用。与双硫仑脂质体+10μM铜合用时，紫杉醇、阿霉素和吉西他滨对这三种乳腺癌细胞的细胞毒性明显增强(图2和表2)。
表2.单个抗癌药以及与双硫仑脂质体/铜合用作用于MCF-7，MDA-MB-231和T47D细胞系的细胞毒性
Figure BDA00003193239600171
*表示抗癌药：双硫仑脂质体比例。铜的浓度固定为10μM。表中的数组代表IC50的平均值，IC50通过3次重复值(括号内为标准差)计算得来。**p＜0.01
使用合用指数等效线图解法对双硫仑脂质体+10μM铜与这三种抗癌药物合用时的影响进行了考察，证明了双硫仑脂质体+10μM铜与常规的抗癌药物在很宽的浓度范围内有很强的协同效应。
表3.在人乳腺癌细胞中抗癌药和双硫仑脂质体/铜相互作用的联合指数值
Figure BDA00003193239600181
*表示抗癌药物与双硫仑脂质体的比例恒定(nM级)。列出的合用指数(CI)值来自重复了3次具有相似结果的代表性实验，并且根据Chou和Talalay(1984)导出的多重效应方程计算得出。CI＜1表示两种药物的具有协同作用。
实施例4
双硫仑脂质体+铜专属性的诱导乳腺癌细胞中活性氧(ROS)的产生并且双硫仑脂质体+铜的细胞毒性与ROS有关。
乳腺癌细胞暴露在双硫仑脂质体(1μM)+铜(10μM)中1小时后，ROS的活性被显著地诱导。与之相反，接触药物后正常细胞(MCF10A和HeCV)中ROS的活性没有受到影响或甚至降低了(图3A)。与ROS活性结果一致的是，乳腺癌细胞暴露于双硫仑脂质体(1μM)+铜(10μM)1小时后，产生了很强的细胞毒性，但对正常细胞无影响(图3B)。为了验证ROS和双硫仑脂质体+铜诱导的细胞毒性之间的关系，使用了NAC，一种ROS抑制剂来阻断双硫仑脂质体+铜诱导的ROS活性。图3C显示，培养基中加入NAC后双硫仑脂质体+铜导的乳腺癌细胞毒性被显著降低了。
实施例5
双硫仑脂质体+铜抑制乳腺癌细胞中NFκB的活性
NFκB是ROS诱导产生的核转录因子，具有很强的抗凋亡活性，这就反过来抑制了ROS的促细胞凋亡作用。(Nakano et al2006Cell Death andDifferentiation13(5)730-7)。阻断NFκB的活性能增强ROS诱导的细胞毒性作用，图3D表明双硫仑脂质体+铜显著性抑制了乳腺癌细胞中的NFκB转录活性。
实施例6
双硫仑脂质体+铜抑制乳腺癌细胞株的细胞克隆
用细胞克隆形成法来检验双硫仑脂质体+铜诱导的乳腺癌细胞“生殖性死亡”的能力。图4A和B证明，乳腺癌细胞暴露双硫仑脂质体(1μM)+铜(10μM)1小时后，癌细胞中的细胞克隆形成能力被彻底消除。相反，与单独双硫仑接触后没有影响两个正常细胞株的细胞克隆形成能力。
实施例7
双硫仑脂质体+铜的乳腺癌干细胞靶向性
肿瘤干细胞(CSCs)对化疗具有耐药性常导致化疗失败以及肿瘤复发。图5A证明从三个乳腺癌细胞株中分化而来的肿瘤干细胞对传统的抗癌药具有高耐药性。相反，双硫仑脂质体+铜对肿瘤干细胞和其祖细胞显示出相当的细胞毒性(图5B)。这个结果表明尽管肿瘤干细胞对很多常规抗癌药有耐药性，但双硫仑脂质体+铜可以有效地杀死肿瘤干细胞。当在乳腺癌细胞在干细胞培养基中培养时，可以形成微球体。微球体含有大量的乳腺癌干细胞，这可通过干细胞标志物(ALDH+和CD24-/CD44+)检测。图5C和表4证明，MCF7和T47D细胞暴露于双硫仑脂质体(1μM)+铜(10μM)1小时后，微球体的能力被完全阻断，而双硫仑脂质体和铜单独使用时对这些细胞株中微球体的形成能力没有影响。为了证明双硫仑+铜对肿瘤干细胞的靶向作用，对给药后的乳腺癌微球体中的干细胞标记物进行了分析。图5D和5E表明，经双硫仑脂质体+铜处理后乳腺癌微球体中表达ALDH+和CD24-/CD44+的肿瘤干细胞被完全清除，而双硫仑、铜单独使用或传统抗癌药时都没有这种效果。
表4.在乳腺癌细胞系中双硫仑脂质体对微球体形成能力的效果
Figure BDA00003193239600201
双硫仑脂质体1μM，铜：氯化铜1μM。细胞经不同的方法处理1小时后，在无药培养基上培养10天。表中数据代表三次实验的平均值，括号内为标准差。
实施例8
双硫仑脂质体在荷瘤小鼠体内的抑瘤作用
我们选取荷S180肉瘤小鼠进行双硫仑脂质体的抑瘤实验。图6A和B表明，双硫仑脂质体和铜联合给药能够显著抑制小鼠体内S180肉瘤的生长，且抑瘤率可达到83％。尽管双硫仑脂质体单独给药也有明显的抑瘤作用，抑瘤率可达52％，但低于其和铜联合给药。相反，将双硫仑(原料药)单独或与铜联合给药，都没有观察到抑瘤效果。此外，我们进行了人源性乳腺癌细胞的抑瘤实验。图6D和E表明，同对照组相比，双硫仑脂质体和铜联合给药能抑制54％的肿瘤的生长。通过对小鼠体重的影响考察双硫仑脂质体的系统毒性，如图6C和F所示，在不同的治疗组间体重并无显著性差异。这些结果表明，双硫仑脂质体不会在小鼠体内产生系统毒性。
实施例9
双硫仑脂质体以及双硫仑脂质体+铜对小鼠的毒性作用
表5双硫仑脂质体与葡萄糖酸铜联合对小鼠的急性毒性作用。
Figure BDA00003193239600202
Figure BDA00003193239600211
葡萄糖酸铜通过口服给药形式连续给药三天。在最后一次给铜之后，通过尾静脉注射不同剂量的双硫仑脂质体0.2ml。经计算，LD50值为173.15mg/kg。
表6双硫仑脂质体小鼠的急性毒性作用。
Figure BDA00003193239600212
在无铜添加的情况下，通过尾静脉注射不同剂量的双硫仑脂质体0.2ml。经计算，LD50值为168.77mg/kg。
材料和方法
细胞株和试剂。人乳腺癌细胞株MCF7、MDA-MB-231、T47D、ZR75以及鼠源性的S180肉瘤细胞株均从ATCC购置。双硫仑、氯化铜、N-乙酰-半胱氨酸(NAC)、紫杉醇(PAC)、阿霉素(Dox)、吉西他滨(dFdC)均从Sigma公司购置。双硫仑脂质体注射液为自制。
细胞培养及细胞毒性分析。所有的细胞株均培养在DMEM(Lonza，Wokingham，UK)培养液中，其中含有10％FCS，50units/ml青霉素，50ug/ml链霉素。在体内细胞毒性实验中，细胞[5000/孔(MDA-MB-231PAC10为10,000/孔)]在96孔平底微量滴定板中培养过夜之后给药72小时，然后用MTT比色法进行检测(Plumb JA，et al Cancer Res1989；49(16)：4435-40)。
利用合用指数等效线图解法分析常规抗癌药物同双硫仑+铜的联合作用。过夜培养的细胞分别置于不同浓度的常规抗癌药物(PAC、Dox、dFdC)，双硫仑脂质体+10μM铜，或常规抗癌药和双硫仑脂质体+铜的恒定比例混合物中(紫杉醇：双硫仑脂质体/铜＝1∶62.5、吉西他滨：双硫仑脂质体/铜＝1∶10、阿霉素：双硫仑脂质体/铜＝1∶5)72小时，然后用MTT比色法对上述细胞进行检测。通过CalcuSyn软件，利用CI-isobolagram法分析紫杉醇、阿霉素、吉西他滨同双硫仑脂质体+10μM铜的联合作用。合用指数(CI)由互斥公式求得。
流式细胞术分析DNA含量。细胞(1×106)在含药环境中培养，并通过胰蛋白酶作用得到单个的游离细胞。所得细胞在70％乙醇中固定后，在RNase A(100μg/ml)和碘化丙啶(50μg/ml)中孵育30min。通过FACS Scan收集来自每个样品的10,000个细胞的数据，DNA含量则使用CellQuest软件分析得到。
氧自由基活性的测定。细胞内的氧自由基含量可由2’，7’-二氯双氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)探针测定。细胞(1×106)培养于24孔板中，其培养液成分为1ml的血清以及无酚红的含有20μm2’，7’-二氯双氢荧光素二乙酸酯的DMEM培养液。在激发波长490nm和发射波长520nm条件下，利用荧光检测仪(Thermo Scientific，Northumberland，UK)进行荧光测定。
荧光素酶报告基因的测定。所有的转染均利用Lipofectamine2000(Invirtrogen)转染试剂盒进行，操作步骤均依照厂家的说明书进行。将报告基因质粒pNFκB-Tal-Luc和pGL3-basic分别同作为内对照的海肾荧光素酶报告基因质粒pSV40-Renilla共转染细胞。荧光素酶的活性可通过双荧光素酶化验试剂盒检测，检测步骤均依照厂家说明书进行。利用公式Ln＝L/R(Ln：归一化后的荧光素酶活性，L：所测得的萤火虫荧光素酶活性；R：所测得的海肾荧光素酶活性)，将每个孔中所测得的萤火虫荧光素酶的活性同内对照海肾荧光素酶的活性作归一化。而Ln值可利用pGL3-basic的转录活性被进一步标准化，即RLU＝LnNFκB/LnBasic(RLU：相对荧光素酶活性)。
细胞克隆分析。取6孔板，每孔加入约5×104个细胞，在给药条件下(双硫仑脂质体/铜10uM)培养一个小时。收集细胞，在无药培养液中进一步培养十天，使每孔中的细胞密度达2.5×103。测定50个细胞以上的集落数，即细胞克隆数。
ALDH总活性的测定。依照ALDEFLUOR kit(Stem CellTech.，Durham，NC，USA)说明书中方法测定给药后的乳腺癌细胞ALDH总活性。细胞(2.5×105)于37℃条件下在加入检测缓冲液的乙醛脱氢酶底物中染色30分钟，然后进行检测。而阴性对照则是加入一种专属的乙醛脱氢酶抑制剂，十二烷基三乙基溴化碘(DEAB)。
体外的微球体培养。将乳腺癌细胞培养在超低粘附的6孔板(Corning，MA，USA)中，其中含有2ml的干细胞培养液[SCM，补充有B27且无血清的细胞培养液DMEM-F12，20ng/ml的表皮生长因子，10ng/ml的成纤维细胞生长因子，10ug/ml的胰岛素]，使细胞密度达10，000个/ml。培养7～10天之后，对所得的微球体拍照并将其用于进一步的处理。
利用流式细胞术分析CD24和CD44的表达。将贴壁的细胞或成微球体的细胞用胰蛋白酶处理，所得细胞液过25G针头。将细胞(2.5×105)同CD24和CD44的抗体(BD Pharmingen，Oxford，UK)一起于4℃孵育20分钟。用2％的FCS HBSS(Sigma)洗去未吸附的抗体，将细胞(10，000例)于染色后的一小时内用BD流式细胞仪进行检测。
不同药物的联合应用对鼠源性肉瘤小鼠和人源性乳腺癌小鼠的抑瘤作用。本实验所用到的小鼠(五周大的无胸腺的雌性裸鼠CDl)均饲养在无病原体的环境中。人源MDA-MB-231癌细胞或鼠源S180肉瘤细胞(1×106)均皮下注射在小鼠的一侧胁腹。癌细胞的体积(V)可通过下式计算：V＝(L×W2)×0.5。其中，L为肿瘤的长度，W为其宽度。当鼠体内移植瘤的体积达约200mm3时，将小鼠随机分组进行以下实验。给药的第一天计为第一天。
荷S180肉瘤小鼠分为五组(每组五只)：1.对照组，不给药；2.双硫仑脂质体组，30mg/kg，静脉注射；3.双硫仑脂质体+铜组，双硫仑脂质体30mg/kg，静脉注射，氯化铜3mg/kg，口服；4.双硫仑组，分散于植物油中的双硫仑30mg/kg，口服；5.双硫仑+铜组：双硫仑30mg/kg，口服，氯化铜3mg/kg，口服。
荷人乳腺癌MDA-MB-231小鼠分为两组(每组六只)：1.对照组，不给药；2.给双硫仑脂质体+铜组，双硫仑脂质体30mg/kg，静脉注射，氯化铜3mg/kg，口服。
当小鼠体内瘤直径达2mm时，分组进行不同的实验。在每周的周一、周三、周五给药，连给两周。双硫仑或双硫仑脂质体在中午给药。对于联合给药组，早晨给氯化铜。连续观察荷S180肉瘤的小鼠21天，而连续观察荷人乳腺癌MDA-MB-231的小鼠28天。
统计学分析。实验数据利用T检验和单侧方差进行处理。

Claims (16)

1.一种含有双硫仑或其衍生物以及延长双硫仑或其衍生物体内半衰期的组分的双硫仑制剂。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述双硫仑的衍生物为二乙基二硫代氨基甲酸(DDC)。
3.根据任一前述权利要求所述的制剂，其中双硫仑或其衍生物的体内半衰期被延长到为至少30分钟。
4.根据任一前述权利要求所述的制剂，其中所述增加双硫仑或其衍生物半衰期的组分为脂质体。
5.根据权利要求5所述的制剂，其中双硫仑或其衍生物是被包裹在脂质体中。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的制剂，其中所述增加双硫仑或其衍生物半衰期的组分为纳米粒。
7.根据任一前述权利要求所述的制剂，其中所述制剂不含铜。
8.脂质体或纳米粒，所述脂质体或纳米粒包裹双硫仑或其衍生物。
9.根据权利要求8所述的脂质体或纳米粒，其中双硫仑是被包裹的唯一活性成分。
10.根据前述权利要求中任一项所述的制剂、脂质体或纳米粒在治疗癌症中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述制剂、脂质体或纳米粒需与单独的含铜制剂同时或循序使用。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的双硫仑制剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述药物同单独的含铜制剂同时或循序使用。
14.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者给予治疗有效量的根据权利要求1至7中任一项所述的双硫仑制剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述方法还包括同时或循序给予单独的含铜制剂。
16.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至7中任一项所述的双硫仑制剂和药用载体或赋形剂。
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