CN104069103B - 一种协同增效治疗脑胶质瘤的组合药物 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药制备技术领域，涉及一种能够协同增强抑制脑胶质瘤生长的新型组合药物；其有效药物成分为海兔素和替莫唑胺，将两者按一定质量配比混合后采用浸取、萃取和分离纯化等常规加工工艺配制成片剂、粉剂或采用胶囊包装结构；其制备工艺简单，组合成份单纯，使用安全可靠，疗效明显，医用环境友好，原料加工制备工艺成熟，无副作用。

Description

一种协同增效治疗脑胶质瘤的组合药物

技术领域：

本发明属于医药制备技术领域，涉及一种能够协同增强抑制脑胶质瘤生长的新型组合药物。

背景技术：

脑胶质瘤是颅内发病率最高的恶性肿瘤，手术难以切除干净，复发率、死亡率高，其中胶质母细胞瘤平均生存期只有10-12个月，术后辅以放疗化疗，效果亦不理想，因此寻找好的治疗胶质瘤的药物成为近年来研究的热点和难点；替莫唑胺是目前治疗脑胶质瘤效果较好的化疗药，临床上广泛应用，具有较宽的抗肿瘤谱，易于透过血脑屏障，酸性环境下稳定，现已作为一线化疗药物在临床推广应用，但部分胶质瘤对其反应不敏感，治疗效果差，能否有新的药物与替莫唑胺联合用药，增强其抗瘤作用成为一个新的关注焦点；海兔素是一种天然的海洋药物，它是一种海藻溴代倍半萜，从海洋三列凹顶藻中提取的脂溶性化合物，分子式为C₁₅H₁₉BrO，分子量仅为295；海兔素已经被证实对乳腺癌、胃癌有很好的治疗作用。[天然产物研究与开发，2012；24:1201-1205，中国药理学通报，2010；26(3)：333-337]；替莫唑胺与其他药物联合应用治疗脑胶质瘤是目前提高胶质瘤化疗效果的重要方法，但是目前还没有关于海兔素联合替莫唑胺治疗胶质瘤的研究报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求提供一种治疗脑胶质瘤的抗肿瘤组合药物，具体的说是一种含有海兔素和替莫唑胺的治疗脑胶质瘤的抗肿瘤组合药物。

为实现上述目的，本发明所述的治疗脑胶质瘤的组合药物，其有效药物成分为海兔素和替莫唑胺，其质量配比为(10-20)：1；混合后采用常规加工工艺配制成片剂、粉剂或采用胶囊包装结构；其使用的海兔素为常规工艺制取的白色化合物，分子式为C₁₅H₁₉BrO，分子量为295；使用的替莫唑胺为市售产品药物。

本发明涉及的组合药物与现有技术相比，其制备工艺简单，组合成份单纯，使用安全可靠，疗效明显，医用环境友好，原料加工制备工艺成熟，无副作用。

附图说明：

图1为本发明涉及的海兔素的化学结构式。

图2为本发明涉及的海兔素对胶质瘤的抑制作用的MTT结果显示。

图3为海兔素诱导U-87MG细胞及星形细胞的凋亡结果。

图4为海兔素能明显减少U87及U251细胞克隆数量。

图5为细胞侵袭实验，海兔素能明显抑制胶质瘤的侵袭。

图6(a)为海兔素和替莫唑胺及组合物对胶质瘤细胞活性影响

图6(b)为海兔素和替莫唑胺及组合物对胶质瘤细胞凋亡的影响

图6(c)为海兔素和替莫唑胺及组合物对胶质瘤细胞克隆数影响

图6(d)为海兔素和替莫唑胺及组合物对胶质瘤细胞侵袭的影响

图7为海兔素和替莫唑胺及组合物对大鼠生存时间的影响

具体实施方式：

下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1：

本实施例所述的治疗脑胶质瘤的组合药物，其有效药物成分为海兔素和替莫唑胺，其质量配比为(10-20)：1；采用常规加工工艺混合配制成片剂、粉剂或采用胶囊包装结构；其使用的海兔素为常规工艺加工制取的白色化合物，分子式为C₁₅H₁₉BrO，分子量为295；使用的替莫唑胺为市售产品的粉状药物。

本实施例所述海兔素的制备工艺包括浸取、萃取和分离纯化三个步骤：

(1)浸取：先将三列凹顶藻样品在常温下风干后，称取5kg，按1：2～5的重量比例用体积分数为0.95的乙醇室温下浸泡3天，并反复浸泡提取3次，合并提取液后经减压浓缩并控制温度低于40℃，得到乙醇提取物325g；

(2)萃取：再将乙醇提取物悬浮于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取，有机相回收溶剂得到乙酸乙酯萃取物105g；

(3)分离纯化：取上述乙酸乙酯萃取物，干法上样，进行正相硅胶柱色谱分离，用石油醚丙酮梯度洗脱，薄层色谱检查，合并相同部分，洗脱液经过反复正相硅胶、生物胶Bio-beads、凝胶SephadexLH-20柱色谱和反相HPLC分离纯化，得到白色化合物，为溴代倍半萜海兔素单体(Aplysin)，测其分子式为C₁₅H₁₉BrO，分子量为295。

本发明提取的海兔素(C₁₅H₁₉BrO)的特征如下：无色针晶(石油醚)，mp96～98℃；IR vKBrmax cm-1：2952，2864，1577，1487，l460，1375，l308，l267，1234，1192，1007，904，881862；EI-MS m/z(％)：296[M(81Br)]+(100)，294[M(79Br)]+(100)，281[M(81Br)-CH3]+(95)，279[M(79Br)-CH3]+(95)，239(45)，237(45)，200[M—Br]+(35)，160(16)，115(12)，109(10)，69(5)；1H-NMR(CD3COCD3，500MHz)δ：1.06(3H，d，J＝6.5Hz，H-9)，1.04～1.08(1H，m，H-2a)，1.27(3H，s，H-10)，1.33(3H，s，H-12)，1.60～1.68(2H，m，H-2b，1a)，1.81～1.86(2H，m，H-1b，3)，2.26(3H，s，H-11)，6.60(1H，s，H-5)，7.2(1H，s，H-8)；13C-NMR(CD3COCD3，125MHz)δ：43.0(C-1)，31.9(C-2)，46.6(C-3)，lOO.4(C-3a)，159.4(C-4a)，110.5(C-5)，137.5(C-6)，114.3(C-7)，127.3(C-8)，137.4(C-8a)，55.1(C-8b)，13.3(C-9)，23.1(C-10)，23.4(C-11)，20.1(C-12)；上述数据与现有文献报道的海兔素一致，因此确定所提取到的化合物为海兔素，见图1。

实施例2：

本实施例所制得的海兔素应用效果检测，其涉及的材料来源是:

人胶质瘤细胞系:U87MG,U251MG,U373MG and M059J购买于美国模式培养物集存库；

U87MG-TR细胞：每两周将U87MG细胞用含替莫唑胺培养基培养，共4个月，获得对替莫唑胺耐药的U87MG细胞；

星形胶质细胞：采用原代培养方法，将脑组织剪成碎块，去除脑膜组织，胰酶消化，金属滤网过滤后培养在含15％胎牛血清的DMEM培养基中，用GFAP免疫荧光染色进行鉴定；

海兔素作用胶质瘤细胞活性测定：将U87MG、U251MG、U373MG、M059J和星形胶质细胞分别植入96孔板中，每孔植入5×103个细胞，不同浓度的海兔素(0、20、40μg/ml)分别加入96孔板中，作用48小时，MTT法测定细胞活性，海兔素对胶质瘤的抑制作用随剂量的增高而增强,成剂量依赖性，海兔素对正常星形胶质细胞无抑制作用，说明海兔素能选择性抑制胶质瘤细胞的增值，见图2；

海兔素诱导胶质瘤细胞凋亡的测定：取对数生长期的胶质瘤细胞，以1×10⁶/ml密度接种，用不同浓度海兔素(0、5、10、20、40μg/ml)共同培养48h，收集各组细胞数，磷酸缓冲液洗2次，弃上清，加1ml碘化丙啶(PI)避光30min，细网过滤，流式细胞仪上进行荧光检测，分析细胞凋亡情况，海兔素诱导U-87MG细胞凋亡，随浓度的增加凋亡增多，呈剂量依赖性，对正常星形胶质细胞无作用，说明海兔素能选择性诱导胶质瘤的凋亡，见图3；

海兔素抑制胶质瘤细胞侵袭测定：Matrigel25μl加入transwell板上室,使Matrigel聚合成胶。用无血清培养基制备单细胞悬液，5×10⁴个细胞/ml；胎盘兰拒染实验,细胞活力需大于95％；Transwell培养板上室加入100μl细胞悬液并加入无血清培养基200ul；Transwell培养板下室加入500μl趋化因子,37℃,5％CO₂培养48h；甲醇固定30min，苏木素染色1min，梯度乙醇脱水,二甲苯透明，将聚碳酯膜自上室基底切取下来,中性树脂封片，细胞在高倍镜下(×200)随机取10个视野计数,取平均数，海兔素能明显减少U87及U251细胞克隆数量，明显抑制胶质瘤的生长，抑制作用随剂量的增高而增强,成剂量依赖性，见图4；细胞侵袭实验说明，海兔素能明显抑制胶质瘤的侵袭，抑制作用随剂量的增高而增强,成剂量依赖性，如图5；

海兔素和替莫唑胺对细胞增殖影响：

收集对数生长期的U87细胞，以1×10⁶/ml的密度加入96孔板内，5％CO₂、37℃恒温条件培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液；设4组，分别加入相应反应物，A组对照组；B组为替莫唑胺(4μg/ml)；C组为海兔素(40μg/ml)；D组为海兔素(40μg/ml)和替莫唑胺(4μg/ml)组合物，对照组加入等体积含10％胎牛血清的DMEM培养液，每组均设6个重复孔，培养48h；每孔加入20μl MTT，4h后弃上清，每孔加入150μl DMSO，充分震荡后用酶联免疫检测仪测定490nm处的吸光度值，绘制细胞增殖曲线，计算细胞增殖抑制率(InhibitoryRate,IR)，细胞增殖抑制率IR％＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。海兔素和替莫唑胺组合物对胶质瘤细胞增殖抑制作用明显高于单用海兔素或替莫唑胺,差异有显著统计学意义(P<0.05),见表1；

表1海兔素和替莫唑胺对U87胶质瘤细胞增殖的影响(OD值，)

D与B、C相比p<0.05

A:对照组；B:替莫唑胺；C:海兔素；D:海兔素和替莫唑胺组合物

海兔素和替莫唑胺作用胶质瘤细胞活性测定：将U87植入96孔板中，每孔植入5×10³个细胞，设4组，分别加入相应反应物，A组对照组；B组为替莫唑胺(4μg/ml)；C组为海兔素(40μg/ml)；D组为海兔素(40μg/ml)和替莫唑胺(4μg/ml)组合物，作用48小时，MTT法测定细胞活性，海兔素和替莫唑胺组合物对胶质瘤细胞活性的抑制作用明显高于单用海兔素或替莫唑胺,差异有显著统计学意义(P<0.05)见图6(a)；

海兔素和替莫唑胺诱导胶质瘤细胞凋亡的测定：取对数生长期的U87细胞，以1×10⁶/ml密度接种，设4组，分别加入相应反应物，A组对照组；B组为替莫唑胺(4μg/ml)；C组为海兔素(40μg/ml)；D组为海兔素(40μg/ml)和替莫唑胺(4μg/ml)组合物，共同培养48h，收集各组细胞数，磷酸缓冲液洗2次，弃上清，加1ml碘化丙啶(PI)避光30min，细网过滤，流式细胞仪上进行荧光检测，分析细胞凋亡情况，海兔素和替莫唑胺组合物诱导胶质瘤细胞凋亡的作用明显高于单用海兔素或替莫唑胺,差异有显著统计学意义(P<0.05)见图6(b)；

海兔素和替莫唑胺抑制胶质瘤细胞侵袭测定：Matrigel25μl加入transwell板上室,使Matrigel聚合成胶，用无血清培养基制备U87单细胞悬液，5×10⁴个细胞/ml；胎盘兰拒染实验,细胞活力需大于95％；设4组，分别加入相应反应物，A组对照组；B组为替莫唑胺(4μg/ml)；C组为海兔素(40μg/ml)；D组为海兔素(40μg/ml)和替莫唑胺(4μg/ml)组合物，Transwell培养板上室加入100μl细胞悬液并加入无血清培养基200ul；Transwell培养板下室加入500μl趋化因子,37℃,5％CO₂培养48h；甲醇固定30min，苏木素染色1min，梯度乙醇脱水,二甲苯透明，将聚碳酯膜自上室基底切取下来,中性树脂封片，细胞在高倍镜下(×200)随机取10个视野计数,取平均数，海兔素和替莫唑胺组合物能明显减少U87细胞克隆数量，明显抑制胶质瘤的生长，抑制作用明显强于单用海兔素或替莫唑胺,差异有显著统计学意义(P<0.05)，见图6(c)；细胞侵袭实验说明，海兔素和替莫唑胺组合物抑制细胞侵袭的作用明显高于单用海兔素或替莫唑胺,差异有显著统计学意义(P<0.05)，如图6(d)；

实施例3：

动物实验：制备大鼠脑胶质瘤模型，水合氯醛麻醉大鼠，切开头皮，暴露前囟，于右侧冠状缝前1mm，中线右开3mm，深度5mm；用微量注射器吸取10μl含5×10⁵个C6细胞的悬液，缓慢注射，种植部位约为右侧尾状核区域，注射时间不少于5分钟，于术后第7天磁共振筛选成功模型；选取40只鼠随机分成4组，每组10只，经口喂养海兔素和替莫唑胺，A组灌胃生理盐水，B组灌胃给予替莫唑胺(4mg/kg)，C组灌胃给予海兔素(40mg/kg)，D组灌胃给予海兔素(40mg/kg)和替莫唑胺(4mg/kg)组合物，60天时处死存活鼠，记录鼠的生存曲线，应用海兔素和替莫唑胺组合物的胶质瘤大鼠生存时间明显延长，高于单用海兔素或替莫唑胺组,差异有显著统计学意义(P<0.05)，见图7；大鼠处死后取肿瘤，称重，计算抑瘤率，抑瘤率％＝(对照组平均瘤重—实验组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％，应用海兔素和替莫唑胺组合物治疗的大鼠瘤重明显小于单用海兔素或替莫唑胺组,差异

有显著统计学意义(P<0.05)，见表2；

表2海兔素和替莫唑胺对颅内胶质瘤的抑瘤率

D与B、C相比p<0.05

A:对照组；B:替莫唑胺；C:海兔素；D:海兔素和替莫唑胺组合物。

Claims (1)

1.一种协同增效治疗脑胶质瘤的组合药物，有效药物成分为海兔素和替莫唑胺，混合后制成片剂、粉剂或胶囊；其海兔素为常规工艺制取的白色化合物，分子式为C₁₅H₁₉BrO，分子量为295；替莫唑胺为市售产品药物；其特征在于海兔素与替莫唑胺的质量配比为10:1。