CN104388389B - 耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立，具体方法为：分别用PTX干预OVCAR‑3细胞和SK‑OV‑3细胞，然后换无PTX培养基，至细胞生长恢复正常即细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30％的情况下3至5天可长至90％后再开始正常传代并提高PTX的浓度，每次干预时间为24小时，最终获得保藏号为CCTCC C2014203和CCTCC C2014204的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型。本发明的方法是通过密切观测细胞生长状态选择干预时机，建立的细胞模型耐药系数均处于较高水平且耐药稳定性好，因此可用于卵巢癌耐药机制、卵巢癌耐药逆转、预防化疗耐药和提高化疗敏感性方面的研究。
Description
【技术领域】
本发明涉及细胞模型的建立，具体地说，涉及耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立。
【背景技术】
卵巢癌是致女性死亡的首位生殖道恶性肿瘤，其治疗主要在肿瘤细胞减灭术的基础上紫杉醇联合铂类化疗，此方案初治治疗效果好，但易发生耐药，而耐药后再化疗效果很差。普通卵巢癌细胞株在研究卵巢癌耐药机制中存在局限性，而卵巢癌耐药细胞株更能从分子生物学角度来研究其耐药机制，有助于进一步寻找卵巢癌耐药后的治疗方法。
中国期刊《肿瘤》2006年第8期，刊出的论文“卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/TAX300建立及基因表达谱分析”，采用反复大剂量紫杉醇冲击法，由亲本细胞OC3建立卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/TAX300，耐药株历时10个月建成，耐药性稳定，耐药指数为6.70。
中国期刊《山东医药》2008年第48卷第6期，刊出的论文“卵巢癌紫杉醇耐药细胞株的建立及其耐药机制研究”，选用卵巢癌细胞株SKOV3，以浓度为300μg/ml的TAX反复大剂量冲击用药，培养8个月后建立了TAX耐药细胞株，命名为SKOV3/TAX，该细胞已反复传代3个月以上，结果SKOV3/TAX细胞耐药性稳定，耐药指数(RI)为10.57。
中国期刊《中国药师》2008年第10期，刊出的论文“不同方法建立卵巢癌紫杉醇耐药细胞株对临床用药方案的启发”，用不同的诱导耐药方法培养紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol，A2780/(DDP+Taxol)，A2780/Taxol-1，具体方法是：采用逐步增加药物浓度和大剂量冲击两种方法处理细胞，直至细胞能在2.5μg·ml-1紫杉醇中稳定生长，MTT法检测A2780，A2780/DDP细胞对紫杉醇的药物半数抑制浓度(IC50)分别为(0.23±0.04)μg·ml-1和(0.26±0.02)μg·ml-1，采用逐步增加药物浓度诱导法历经九个月时间建立A2780的紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol-1，对紫杉醇的IC50为(6.63±0.31)μg·ml-1，耐药倍数为28.83。
以上均通过逐步诱导的方法建立了耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，然而其耐药指数仍然较低，如果细胞模型要能用于耐药机制等研究，则要求具备良好的耐药稳定性。另外，目前尚无耐紫杉醇的OVCAR-3卵巢癌细胞株。
综上所述，建立耐药指数更高、耐药稳定性更好的细胞模型仍然是十分必要的。
【发明内容】
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立方法。
本发明的第二个目的是，提供一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型。
本发明的第三个目的是，提供所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的建立方法，它包括以下步骤：
a)培养OVCAR-3细胞和SK-OV-3细胞；
b)OVCAR-3细胞和SK-OV-3细胞分别用PTX开始干预，然后换无PTX培养基，至细胞生长恢复正常即细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30％的情况下3至5天可长至90％后再开始正常传代并提高PTX的浓度，每次PTX的干预时间均为24小时；
c)对干预后的OVCAR-3细胞和SK-OV-3细胞进行检测，获得耐紫杉醇卵巢癌细胞模型。
所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的保藏号分别为CCTCC C2014203和CCTCCC2014204。
实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
作为本发明的一种技术方案，所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的保藏号为CCTCCC2014203，细胞株命名为OV3R-PTX。
所述的保藏号为CCTCC C2014203耐紫杉醇卵巢癌细胞模型可用于研究卵巢癌耐药机制、寻找卵巢癌耐药逆转的靶点、筛选治疗卵巢癌的药物。
作为本发明的另一种技术方案，所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的保藏号为CCTCC C2014204，细胞株命名为SK3R-PTX。
所述的保藏号为CCTCC C2014204耐紫杉醇卵巢癌细胞模型可用于研究卵巢癌耐药机制、寻找卵巢癌耐药逆转的靶点、筛选治疗卵巢癌的药物。
本发明优点在于：
本发明通过科学的方法建立了两株耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，建立细胞模型的过程不是机械式设置药物浓度梯度和定期传代，最后筛选出存活的细胞系，而是密切观测细胞生长状态，待达到细胞形态饱满，无漂浮死细胞，细胞密度为30％的情况下3至5天可长至90％后再开始正常传代并提高PTX的浓度，通过该方法建立了两株耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，其耐药系数均显著高于现有的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，且耐药稳定性好。所以本发明的第三个目的是此模型可用于卵巢癌耐药机制、卵巢癌耐药逆转、预防化疗耐药和提高化疗敏感性方面的研究。
【具体实施方式】
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、材料
OVCAR-3细胞、SK-OV-3细胞购自美国ATCC公司。
紫杉醇(PTX)购自太极集团四川太极制药有限公司：30mg/5ml/支。
紫杉醇工作液用细胞培养基(RPMI-1640+10％FBS，购自美国Gibco公司)配制。
二、建株步骤
1)OVCAR-3细胞和SK-OV-3细胞用RPMI-1640+10％FBS+100U/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素培养。
2)两株细胞分别用PTX起始浓度为0.01μM开始干预，给予PTX 24小时后换无药培养基(RPMI-1640+10％FBS+100U/ml青霉素+0.1mg/ml链霉素)。
3)待细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞、传代密度为30％的情况下3至5天可长至90％后再开始正常传代(P)并提高PTX的浓度。
母细胞OVCAR-3在第19代起(P19)到P20加0.01μM PTX干预，共3次，每次24小时；在P21，加0.1μM PTX干预1次；在P22-P32，加0.5μM PTX干预，共12次；在P33-34，加1μM PTX干预，共2次；在P34-P38，加5μM PTX干预，共10次。细胞生长良好，-80℃储存。
母细胞SK-OV-3在P18起到P19加0.01μM PTX干预，共3次；在P20-P35，加1μM PTX干预，共13次。细胞生长良好，-80℃储存。
上述细胞每次干预24小时后更换无PTX培养基，至细胞生长恢复正常(即细胞稳定生长、形态饱满、无漂浮死细胞)后再进入下一轮PTX干预。历时5个月，最终在OVCAR-3细胞株中PTX至5μM，标记为OV3R-PTX；在SK-OV-3细胞株中PTX至1μM，标记SK3R-PTX。OVCAR-3细胞共干预PTX 28次，SK-OV-3细胞共干预PTX 16次。耐药株建立过程中OVCAR-3共传19代，SK-OV-3共传17代。耐药株已于2014年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学，430072)，OV3R-PTX保藏编号为CCTCC C2014203，SK3R-PTX保藏编号为CCTCCC2014204。
4)计算半抑制浓度(IC50)和耐药系数(RI)。
采用WST-1法(美国Roche公司)检测细胞存活率。每孔5000个OVCAR-3及OV3R-PTX细胞和每孔3000个SK-OV-3及SK3R-PTX细胞分别接种至96孔培养板，24小时后给予不同浓度的PTX(0，0.0001，0.001，0.01，0.1，0.5，1，5，10μM)干预，48小时后每孔加10μL WST-1试剂，在培养箱中37℃继续培养2小时，然后用酶标仪检测450nm波长的吸光度。通过GraphpadPrism软件计算IC50。耐药系数(RI)＝耐药株IC50/敏感株IC50。耐药细胞建成后放-80℃冰柜冻存，1个月、6个月后复苏，再次检测耐药系数以确定其耐药系数的稳定性。
三、结果
紫杉醇对各细胞株的IC50如表1所示。
表1 紫杉醇对各细胞株的IC50
| 细胞株 | OVCAR-3 | OV3R-PTX | SK-OV-3 | SK3R-PTX |
| IC50(μM) | 0.014 | 1.469 | 0.489 | 8.717 |
表2 两株耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的耐药系数
| 细胞株 | OV3R-PTX | SK3R-PTX |
| 耐药系数(建成时) | 104.93 | 17.83 |
| 耐药系数(1个月后) | 95.25 | 17.55 |
| 耐药系数(6个月后) | 101.87 | 16.92 |
本发明为进一步研究卵巢癌的耐药机制、逆转卵巢癌耐药建立了可靠模型，建立的耐药细胞株的耐药系数远远高于现有的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，且耐药细胞株的耐药稳定性很高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种耐紫杉醇卵巢癌细胞模型，其特征在于，所述的细胞模型的保藏号为CCTCCC2014203。
2.权利要求1所述的耐紫杉醇卵巢癌细胞模型的用途，其特征在于，用于研究卵巢癌耐药机制、寻找卵巢癌耐药逆转的靶点、筛选治疗卵巢癌的药物。
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