CN118581045A - 一株多突变的人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株多突变的人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系及其应用，属于肿瘤生物学领域，所述多突变的人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系命名为S009细胞系，所述S009细胞系携带突变的TP53基因、ROS1基因、EGFR基因、ALK基因、ERBB2基因、CTDP1基因、ITGA2B基因、SBF1基因，可作为研究小细胞肺癌微环境、癌相关成纤维细胞的工具，为小细胞肺癌转移及侵袭性实验提供了载体，可用于神经内分泌肿瘤的临床药物的靶点的筛选和药理机制研究，对开发治疗高度恶性高转移性肺癌的药物具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤生物学领域，特别涉及一株多突变的人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系及其应用。
背景技术
肺癌是造成全球癌症相关死亡率最高的恶性肿瘤。小细胞肺癌（SCLC）约占新诊断肺癌病例的15%，属于神经内分泌肿瘤，起源于支气管周围并浸润支气管黏膜下层，与吸烟密切相关。小细胞肺癌具有高增殖性、早期广泛转移性、易获得化疗耐药性以及广泛的染色体重排和非常高的突变负荷，预后极差，总体5年生存率小于7%。多数SCLC发现时已无手术机会，虽对化疗敏感，但极易耐药，针对这一类型的肺癌患者往往缺乏合适的细胞学模型和有效的治疗手段，近年来有研究者提出针对肺癌微环境作为治疗靶点的方案，但小细胞肺癌原代细胞模型及小细胞肺癌相关肿瘤微环境模型较为缺乏。因此，建立原代小细胞肺癌模型对于研究肺癌发生发展、肿瘤微环境及药物靶点筛选具有重要意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一株多突变的人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系，来源于临床小细胞肺癌转移性淋巴结组织样本，所述人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系命名为S009，保藏编号为CCTCC NO: C202447，保藏日期为2024年2月1日，保藏单位为武汉大学中国典型培养物保藏中心。
进一步地，所述S009细胞系携带突变的TP53基因、ROS1基因、EGFR基因、ALK基因、ERBB2基因、CTDP1基因、ITGA2B基因、SBF1基因。
S009细胞系作为实验材料在研究癌症中的应用。
进一步地，所述S009细胞系在构建小细胞肺癌原代细胞系动物模型中的应用。
进一步地，所述S009细胞系在构建小细胞肺癌微环境模型中的应用。
进一步地，所述S009细胞系在构建3D肿瘤培养体系和类器官模型中的应用。
进一步地，所述S009细胞系在构建小细胞肺癌微环境与小细胞肺癌发生进展关系模型中的应用。
进一步地，所述S009细胞系作为实验材料在小细胞肺癌耐药机制研究中的应用。
本发明通过肺癌细胞原代培养法构建了一株多突变的人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系，该细胞系的来源为临床小细胞肺癌患者，通过全外显子测序证实S009细胞系具有突变的TP53基因、ROS1基因、EGFR基因、ALK基因、ERBB2基因、CTDP1基因、ITGA2B基因、SBF1基因。该株人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009，可在培养基中进行体外培养，体外培养生长快速稳定，能连续传代，可用于构建原代小细胞肺癌模型，对于研究肺癌发生发展、肿瘤微环境及药物靶点筛选具有重要意义。具有较高的科研和生产应用价值，能够产生良好的科研、经济和社会效益。
与现有技术相比，本发明的有益效果是成功建立了一株人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系，经过原代培养、细胞系鉴定、全外显子测序、裸鼠荷瘤等实验，证实该细胞系经多次传代后仍能保持较高增殖活性，并携带多基因突变，能为将来中国患者来源的转移性小细胞肺癌的发生发展及肿瘤微环境的相关研究奠定基础。
附图说明
图1是显微镜下人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009的3个不同代次的细胞形态图（×100）；
其中，a为第一代的细胞形态图；
b为第25代的细胞形态图；
c为第50代的细胞形态图。
图2是人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009生长曲线图。
图3是人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009构建及STR鉴定结果图；其中a~f分别为细胞中基因座02-D13S317、05-VWA、03-D7S820、06-TH01、04-D16S539和08-TOPX检测鉴定。
图4为全外显子测序覆盖图。
图5是人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009全外显子测序拷贝数变异图。
图6为人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009第25代接种于裸鼠右侧上肢皮下2周后拍照。
图7是人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009染色体核型分析结果图；其中，a为制片染色后镜下观，b为核型状况。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细发明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下发明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
本发明肿瘤组织标本取自云南省肿瘤医院1例小细胞肺癌患者左侧颈部淋巴结活检取材（男，56岁，小细胞肺癌，临床分期IIIc期（通过医院伦理审查及患者知情同意）），进行了构建人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系的研究。
发明人对分离的样本进行了连续培养、建系，并通过短串联重复序列测定、全外显子测序和核型分析证明了该细胞系为一株新的多突变细胞系。目前，该细胞系已传代至65代，具有良好的稳定性，且该人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系命名为人小细胞肺癌细胞株S009Homo sapiens，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: C202447，保藏日期为2024年2月1日。
通过实验表明，本发明最终得到一株全新的多突变的人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系，可用于小细胞肺癌及肿瘤微环境的研究。
1、原代培养：
（1）为防止肿瘤组织标本污染及坏死，手术取材后立即将离体组织置于无菌4℃PBS中浸泡。转移至超净台，将其置于10cm2培养皿中，用含100万U/L青霉素和1g/L链霉素的PBS清洗组织样本3次，并去除多余脂肪和坏死组织；
（2）用无菌手术剪剪碎至1-2mm3组织块，再次去除多余脂肪和坏死组织，干贴于12孔板，加入2mL含20%胎牛血清的DMEM-1640培养基（美国Gibco公司），37℃细胞培养箱中培养。
（3）每天观察细胞爬出情况，2-3天换液1次，约7天后开始有细胞从组织块周围爬出，及时记录细胞形态、大小及生长情况（实验结果）。
获得的结果如图1a所示，镜下可见贴壁生长的细胞，细胞形态多样，其中可见梭形的成纤维细胞及多种细胞类型生长。
2、细胞传代
当贴壁细胞长至底面积80%-90%时行细胞传代，具体操作如下：
（1）PBS清洗去除未贴壁的细胞及组织碎块；加入1mL0.25%胰酶，置于37℃培养箱中等待消化；
（2）细胞在胰酶作用下开始皱缩，约5min后吸出胰酶，镜下观察大多数细胞脱落为圆形透亮形态为最佳消化状态；
（3）加入2mL含有20%胎牛血清的DMEM-1640培养基中和胰酶，终止消化；
（4）1000rpm离心5min后，弃上清，2mL含有20%胎牛血清的DMEM-1640培养基重悬细胞后继续培养，约3天后重复上述传代步骤。
目前该细胞系已传至65代。
将培养的细胞置于倒置显微镜下，每隔5代在明视野下进行拍照，结果如图1所示，类上皮细胞及成纤维样细胞生长。
离心收集S009第29代对数生长期的细胞，调整细胞浓度为1×104个/孔，接种于2块24孔板中，置37℃、5%CO2、21%O2培养箱中培养约10天，每天计数3孔细胞，取平均值。以时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线（见图2）。可见细胞株经反复传代，仍然保持较好的增殖稳定性。
短串联重复序列（Short tandem repeat，STR）也称微卫星DNA，一般由一个长2-6bp的核心序列经多次串联重复排列而成，重复次数大多在10-60次之间，个体间核心序列的重复次数呈高度变异性，因而一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是细胞生物学对细胞身份和来源鉴定的主要方法。收集传代中的人小细胞肺癌淋巴结转移原代S009细胞，使用擎科的动物基因组抽提试剂盒（货号TSP201-200）提取细胞的基因组DNA，使用新海生物的 NuHi SU9 dNTP Mix（货号NH9347）特异荧光引物进行扩增。其中STR位点拷贝数及比对细胞库信息如表1及图3所示，上述序列与收录于ATCC, DSMZ, JCRB 和 RIKEN数据库的细胞系STR数据进行比对，EV值低于0.8；STR结果表明S009细胞为原代培养细胞，且在培养过程中未出现和其他细胞的交叉污染。
表1. STR位点拷贝数基因分型结果
实施例4. 人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009的全外显子测序（由北京Novogene公司进行）
外显子组测序（Whole Exome Sequencing，WES）是利用探针杂交富集外显子区域的DNA序列，然后通过高通量测序，主要识别和研究与癌症相关的编码区相关突变的技术手段。相较于全基因组测序，由于外显子只占人类基因组约1%（约30Mb），因此更容易做到高深度测序，检测到更多低频和罕见变异，同时也能降低费用，缩短周期。
建库测序流程：
1. DNA样本检测；
2. 随机打断小片段DNA（180-280bp）；
3. 末端修复，磷酸化，加A尾；
4. 连接接头；
5. 探针杂交，捕获外显子区域；
6. 去除未结合的DNA片段；
7. 文库质量检测；
8. Illumina PE150上机测序。
DNA样品检测：（1）琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 降解程度以及是否存在杂带、RNA 及蛋白污染； （2）Qubit 3.0 对 DNA 浓度进行精确定量。其中 DNA 浓度≥20 ng/µL，总量0.4 µg 以上的 DNA 样品被用来建库。
文库构建：采用 Agilent 公司的液相芯片捕获系统，对人的全外显子区域 DNA进行高效富集，然后在 Illumina 平台上进行高通量、高深度测序。建库和捕获实验采用Agilent SureSelect Human All Exon V6 试剂盒，严格使用说明书推荐的试剂和耗材，并参照最新的实验流程进行操作。 实验基本流程：将基因组 DNA 经 Covaris 破碎仪随机打断成长度为 180-280 bp 的片段，经末端修复和加 A 尾后在片段两端分别连接上接头制备成 DNA 文库。带有特异 index 标签的 DNA 片段与生物素标记的探针进行液相杂交，再使用带链霉素的磁珠将基因上的外显子捕获下来，经 PCR 扩增后进行文库质检，合格即可进行测序。
库检：文库构建完成后，先使用 Qubit 3.0 进行初步定量，随后使用 NGS3K/Caliper 对文库的 Insert size（插入片段大小）进行检测，Insert size 符合预期后，使用 Q-PCR 方法对文库的有效浓度（3 nmol/L）进行准确定量，以保证文库质量。
上机测序：库检合格后，根据文库的有效浓度及数据产出需求进行 Illumina 平台PE150进行测序。PE150 测序即 Pair end 150 bp，意指高通量双端测序，每端各测 150bp。双端测序是将每条插入片段的两端进行测序的方法，由于插入片段的长度分布已知，双端测序时不仅可以知道片段两端的序列，也能知道这两段序列之间的长度，从而便于后续比对。
基本信息分析结果：主要目的是获取肺癌样本基因组的突变信息。首先，对测序原始数据（Raw data）进行质控，得到高质量的Clean data；然后，将Clean data与人参考基因组B37序列进行比对分析，获得Bam文件；最后基于Bam进行GermLine和Somatic Mutation的检出与注释，从而得到癌症机制研究的基本突变信息结果。
人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009的全外显子测序共获得61,376,318个reads，如图4所示本次所有测序样本的平均比对率为99.92%，目标区域的平均测序深度为94.00X，目标区域的平均覆盖度为99.72%，通过不同深度的占比情况可以看出本次样本测序深度的均一性较好。从测序结果可看出本例小细胞肺癌患者基因拷贝数变异增加（如图5所示），单个核酸多态性（Single-nucleotide polymorphisms，SNP）检测如表2所示（仅列出该例中肺癌常见基因突变的部分基因）。
全外显子测序证实S009细胞系具有突变的TP53基因、ROS1基因、EGFR基因、ALK基因、ERBB2基因、CTDP1基因、ITGA2B基因、SBF1基因。
表2. SNP变异位点及氨基酸改变
| 基因名称 | 变异位点及氨基酸改变 |
| TP53 | TP53:NM_001126118:exon3:c.C98G:p.P33R,TP53:NM_000546:exon4:c.C215G:p.P72R,TP53:NM_001126112:exon4:c.C215G:p.P72R,TP53:NM_001126113:exon4:c.C215G:p.P72R,TP53:NM_001126114:exon4:c.C215G:p.P72R,TP53:NM_001276695:exon4:c.C98G:p.P33R,TP53:NM_001276696:exon4:c.C98G:p.P33R,TP53:NM_001276760:exon4:c.C98G:p.P33R,TP53:NM_001276761:exon4:c.C98G:p.P33R |
| ROS1 | ROS1:NM_002944:exon15:c.G2176A:p.V726I,ROS1:NM_001378891:exon16:c.G2161A:p.V721I,ROS1:NM_001378902:exon16:c.G2161A:p.V721I |
| ROS1 | ROS1:NM_002944:exon6:c.G500A:p.R167Q,ROS1:NM_001378891:exon7:c.G527A:p.R176Q,ROS1:NM_001378902:exon7:c.G527A:p.R176Q |
| ROS1 | ROS1:NM_002944:exon5:c.A433C:p.T145P,ROS1:NM_001378891:exon6:c.A460C:p.T154P,ROS1:NM_001378902:exon6:c.A460C:p.T154P |
| EGFR | EGFR:NM_001346941:exon7:c.G761A:p.R254K,EGFR:NM_001346897:exon12:c.G1427A:p.R476K,EGFR:NM_001346899:exon12:c.G1427A:p.R476K,EGFR:NM_001346898:exon13:c.G1562A:p.R521K,EGFR:NM_001346900:exon13:c.G1403A:p.R468K,EGFR:NM_005228:exon13:c.G1562A:p.R521K,EGFR:NM_201282:exon13:c.G1562A:p.R521K,EGFR:NM_201284:exon13:c.G1562A:p.R521K |
| ALK | ALK:NM_001353765:exon10:c.A1177G:p.I393V,ALK:NM_004304:exon29:c.A4381G:p.I1461V |
实施例5、人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009细胞体内模型实验
计数S009细胞，将处于对数生长期的细胞按5×106个/200µl/只，接种于3只雌性Balb/c (nu/nu) 小鼠（5周龄左右，体重15-19g）右上肢裸区皮下；隔日观察接种部位肿瘤生成情况，结果如图6所示，14天后未见有明显瘤块形成，说明细胞系S009短期内成瘤效果不明显或S009可能为以小细胞肺癌相关成纤维细胞为主的细胞系，可为构建小细胞肺癌体内微环境模型及研究肿瘤微环境与小细胞肺癌发生进展关系提供基础。
实施例6、人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009细胞核型分析
（1）细胞正常培养，观察细胞生长状态，接种至 6 孔培养板，培养44-48h。待其生长至对数生长期（融合度 50%～60%）进行实验。
（2）秋水仙素处理：吸去培养基，分别加入含有秋水仙素（终浓度0.3ug/ml）的新鲜培养基，继续于 37℃ 培养 3小时。培养结束后，常规消化细胞，离心去上清液，重悬细胞并轻轻吹散均匀。
（3）低渗处理：逐滴滴加预热（提前进行37度水浴）的 3 mL 低渗液，并将细胞均匀分布于悬液中，再逐滴滴加5ml低渗液，轻轻颠倒离心管至水平 2 次，放至 37 ℃ 水浴作用 15 分钟。
（4）预固定：加入新鲜配制的固定液约 200 μL，预固定 2 分钟；1000 rpm 离心 8分钟。
（5）固定：A．去上清，敲打管底以剩余溶液使细胞充分重悬，确保细胞成单个分散状态；B．沿管壁逐滴滴加 3 mL 固定液，用枪轻轻将细胞吹散，再逐滴加入 5 - 8 mL 固定液，4℃冰箱固定30 min；C．1000 rpm 离心 8 分钟，敲打管底使细胞充分重悬，确保细胞成单个分散状态。如上述加入固定液重复固定细胞 2 次；D．剩余 0.3ml 固定液，用枪轻轻吹散细胞。
（6）制片：吸取细胞悬液，滴至预冷的载玻片上，将载玻片掠过酒精灯几次，室温下干燥。在显微镜下观察，滴加的悬液不能重叠。哺乳动物细胞悬浮液滴加高度为距载玻片20cm。哺乳动物细胞悬浮液滴加时，载玻片与水平面成15°角。优选地， 哺乳动物细胞悬浮液的滴加量为每载玻片10 μ L。
（7）染色：取出玻片，滴加稀释后的 Giemsa 液，完成覆盖即可，染色 25分钟；自来水冲洗终止染色，放入 37 ℃ 烘干。
（8）镜检观察：先用低倍镜做全面检查，再换至高倍镜，以100×油镜观察并拍照。核型分析结果如图7所示。
实验随机选取7个细胞进行G 显带核型分析，结果显示细胞系为 2 倍体核型，染色体数目是为46，性染色体是 XY，男性。未见到异常染色体形态结构。进一步证明该细胞系S009可为以小细胞肺癌间质细胞为主的原代细胞系，并且经历多次传代后细胞染色体核型仍保留正常细胞的基本特征，未出现显著细胞衰老，能够在体外稳定传代，有助于进一步探讨肿瘤微环境与小细胞肺癌的交互作用机制及未来探究不同原代细胞亚群在肿瘤进展和治疗反应中的作用。
实施例7、人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009在肿瘤微环境及小细胞肺癌侵袭中的应用
1、细胞免疫荧光染色鉴定癌症相关成纤维细胞
（1）在24孔板铺50%左右细胞，过夜，弃培养基，加入PBS清洗2-3次。
（2）向24孔板中加入4%多聚甲醛，覆盖住细胞，室温固定10 min，加入PBS清洗2-3次。
（3）加入抗原修复液使其覆盖住细胞，室温孵育5 min。PBS洗涤2-3次。
（4）快速封闭液封闭10 min，PBS洗涤2-3次。
（5）用一抗稀释液按1:1000稀释一抗，一抗分别为 α-SMA、FSP-1以及 PDGFR，室温孵育1 h，PBS洗涤2-3次。
（6）按1:500稀释荧光二抗后，室温避光孵育1 h。PBS洗涤2-3次。
（7）加入少量DAPI染色液，覆盖住细胞即可，室温染色5-10分钟，吸除DAPI染色液，PBS洗涤2-3次，滴加防泮灭剂，用盖玻片封固，4℃过夜后共聚焦荧光显微观察、拍照。
2、ELISA检测分泌IL-6等细胞因子能力
收集S009细胞培养上清液，ELISA法检测培养上清中IL-6的浓度。
（1）将HumanIL-6 ELISA试剂盒置于常温，细胞培养上清样品放置冰盒上融化，稀释样品。
（2）配制1×清洗液:取25×wash buffer30 mL+720 mL ddH2O。
（3）配制1000 pg/mL的标准品:向粉剂瓶中加入1 mL diluent混匀后放15 min。
（4）配制不同梯度标准品:按倍比稀释依次配制1000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.5 pg/mL、15.6 pg/mL、0 pg/mL 的8种浓度的标准品。
（5）配制试剂A工作液（1:100）:10 μL A试剂+90 mL A试剂稀释液。配制试剂B工作液（1:100）:10 μL B试剂+90 mL B试剂稀释液。
（6）向包被好的96孔板中加入100 μL/孔标准或样品或空白，封口膜封口，37℃孵育2 h。
（7）取出96孔板，倒弃溶液，不洗板，加100 μL/孔试剂A工作液，用封口膜封口，37℃孵育1 h。
（8）倒弃溶液，洗板3次，每次用清洗液400 μL/孔，静置1-2 min。
（9）拍干96孔板，加100 μL/孔试剂B工作液，用新封口膜封口，37℃孵育1 h。
（10）倒弃溶液，洗板5次，每次用清洗液400 μL/孔，静置1-2 min。
（11）拍干96孔板，加90 μL/孔底物，用新封口膜封口，37℃孵育15-30 min。
（12）加50 μL/孔终止液，轻轻摇匀。用酶标仪在450 nm观察结果。
3、小细胞肺癌相关成纤维细胞小细胞肺癌体外共培养
（1）划痕实验
在24孔板背面用marker笔平行于长轴画直线。实验组为分离的小细胞肺癌相关成纤维细胞和小细胞肺癌细胞系H446的共培养体系，按成纤维细胞与H446细胞比例设置5个组（4:1、2:1、1:1、1:2、1:4），对照组为H446细胞，每组3个复孔。调整每孔总细胞量为2×104个， 37℃，5%CO2培养箱过夜。用200 μL枪头，垂直于长轴在所铺细胞上画直线，完成后，无菌PBS洗三次，加入无血清培养基。放置于培养箱中，分别于0 h、24 h、48 h、72 h拍照，计算细胞相对迁移率。
（2）Transwell 迁移实验
实验组提前 24 h 将接种于 24 孔板，2×104/孔，对照组不接种。第 2 d，无血清培养基重悬H446，稀释密度为 1×105/ml，接种于Transwell 小室中，上室 200 μL无血清细胞悬液，下室 600 μL培养基（10%血清），放置 37℃培养箱中。24 h 后，PBS 清洗，甲醇固定 30 min，0.5%结晶紫溶液染色10 min，PBS清洗，显微镜观察拍照，200×镜下计数并绘制柱状统计图。
实施例8、人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系S009类器官模型和3D培养体系构建
传统细胞培养方法在模拟细胞体内生存环境方面存在缺陷。细胞3D培养方法可为细胞提供更加接近体内生存条件的微环境，使细胞状态保持在与人体内 生长相似的状态，对药物筛选等研究具有重要意义。
实验分为3D组和2D组两组。S009细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，置于 37℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞悬液，以1×104个/孔的浓度200 μL接种于普通96孔板中，到期后弃旧培养基，PBS洗涤2次，加入0.25%胰酶消化，室温1~2min 后显微镜下观察细胞形态变化，当观察到细胞间隙变大、贴壁细胞突起收缩时，弃去胰蛋白酶，加入含10%胎牛血清的 RPMI 1640完全培养基终止消化作用，吹打重悬细胞传代、回收细胞，为 2D培养组。以200 μL相同浓度加到已铺好基质胶的 96孔板里，到期后用分散酶消化基质胶，回收细胞，每组设置3个复孔为平行对照。
癌症相关成纤维细胞是否是造成小细胞肺癌耐药的原因尚不清楚。基于建立的细胞体外模型，将培养的小细胞肺癌相关成纤维细胞、H446细胞消化、计数，实验组为设置5个浓度梯度（4:1、2:1、1:1、1:2、1:4）的癌相关成纤维细胞+H446，对照组为H446细胞，接种于96 孔板，每孔加入100 μL1×105个/mL的细胞悬液。每组设置5个平行复孔。待细胞过夜贴壁后，选择小细胞肺癌的一线联合用药方案依托泊苷+卡铂，实验组对照组分别加入含不同浓度药物混合液的培养基，药物浓度设置为2～32 μg/mL，置于培养箱培养 72 h 后，按产品说明书加入 MTS 溶液。37 ℃孵育 3 h，用酶标仪测定 490 nm 处的吸光度值。计算细胞抑制率及IC50值。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性发明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。
Claims (8)
1.一株多突变的人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系，其特征在于：所述多突变的人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系命名为S009细胞系，于2024年 2 月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: C202447。
2.根据权利要求1所述的一株多突变的人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系，其特征在于：所述S009细胞系携带突变的TP53基因、ROS1基因、EGFR基因、ALK基因、ERBB2基因、CTDP1基因、ITGA2B基因、SBF1基因。
3.根据权利要求1或2所述的多突变的人小细胞肺癌淋巴结转移原代细胞系作为实验材料在研究癌症中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述S009细胞系在构建小细胞肺癌原代细胞系动物模型中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述S009细胞系在构建小细胞肺癌微环境模型中的应用。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述S009细胞系在构建3D肿瘤培养体系和类器官模型中的应用。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述S009细胞系在构建小细胞肺癌微环境与小细胞肺癌发生进展关系模型中的应用。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述S009细胞系作为实验材料在小细胞肺癌耐药机制研究中的应用。
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