CN111019899A - 人恶性叶状肿瘤细胞系lj-0429及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人恶性叶状肿瘤细胞系LJ‑0429，所述细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为C2018234。本发明还公开了人恶性叶状肿瘤细胞系LJ‑0429作为研究肿瘤发生发展机理的细胞模型以及在筛选抗肿瘤药物中的应用。本发明的人叶状肿瘤细胞系LJ‑0429是从中国人来源建立的，建系时间短，生物遗传性稳定，且目前市面上缺乏人恶性叶状肿瘤细胞系，以该叶状肿瘤细胞系作为研究模型，对于了解中国叶状肿瘤病人的发病机制有很大的帮助。

Description

人恶性叶状肿瘤细胞系LJ-0429及其应用
技术领域
本发明涉及动物细胞系技术领域，尤其是一种人恶性叶状肿瘤细胞系LJ-0429及其应用
背景技术
乳腺叶状肿瘤是一种少见的乳腺肿瘤，约占乳腺肿瘤的1％，这种肿瘤生长很快，常表现为巨大肿物；组织学上将其分为良性、交界性、恶性；即使是良性叶状肿瘤，也会复发，恶性叶状肿瘤还会发生血行转移。化疗和放疗对叶状肿瘤的治疗效果不确切，目前能够降低其复发、转移几率的治疗方法就是扩大的手术切除，但即使是扩大的手术切除，叶状肿瘤的局部复发率仍高达8-36％，恶性叶状肿瘤的血源性转移率高达22％。
目前，促使叶状肿瘤恶性转化的机制目前尚不清楚。现有的分子标记物在预测肿瘤的生物学行为方面的价值也有限。因此，加强对叶状肿瘤细胞恶性进展机制的研究非常必要，对遏制叶状肿瘤的恶性进展，降低局部复发、远处转移以及恶性叶状肿瘤的死亡率具有重要的意义。而建立可靠的叶状肿瘤细胞系则是当务之急。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一株人恶性叶状肿瘤细胞系LJ-0429，以填补目前国内外人群来源的叶状肿瘤细胞系的空缺，本发明的人恶性叶状肿瘤细胞系来源于中国人群组织提取的叶状肿瘤细胞，能用于研究乳腺叶状肿瘤发生发展机理及相关药物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
在第一个方面，本发明提供了一株恶性人叶状肿瘤细胞系LJ-0429，所述细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为C2018233。
在第二个方面，本发明提供了一种用于研究肿瘤发生发展机理的细胞模型，所述细胞模型为上述的细胞系。
优选地，所述肿瘤为恶性肿瘤。
优选地，所述肿瘤为乳腺叶状恶性肿瘤。
在第三个方面，本发明提供了上述的细胞系LJ-0429在筛选抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为乳腺叶状肿瘤。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明的人叶状肿瘤细胞系LJ-0429是从中国人来源建立的，建系时间短，生物遗传性稳定，且目前市面上缺乏人恶性叶状肿瘤细胞系，以该叶状肿瘤细胞系作为研究模型，对于了解中国叶状肿瘤病人的发病机制有很大的帮助。
附图说明
图1为本发明中人恶性叶状肿瘤细胞系LJ-0429在光学显微镜下的照片。
具体实施方式
本发明涉及微生物动物细胞系领域，具体涉及一株人乳腺叶状肿瘤细胞系及其建立方法。本发明中的人叶状肿瘤细胞系LJ-0429，该细胞系来源于患有恶性叶状肿瘤的54岁女病人的左乳肿物，命名为人叶状肿瘤恶性细胞系LJ-0429，已保藏于中国典型培养中心，保藏日期为2018年12月16日；保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2018234。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。如无特别说明，本发明中试剂浓度均为质量浓度。
实施例1
本发明的人叶状肿瘤细胞系LJ-0429通过以下方法获得：
(1)标本采集及保存方法：待完整的乳腺叶状肿瘤被完整手术取下来，用无菌手术刀将肿瘤组织正中切开，取活力旺盛增生活跃的组织于DMEM培养基中。标本的采集均在手术主刀与病理科医师指导下进行，防止对病理报告的诊断产生影响；当标本暂不做后续操作时，将其保存在4℃DMEM培养基中，尽量在24h内使用标本。
(2)原代培养：组织经PBS洗涤3次，机械剪至尽可能碎，Ⅲ型胶原酶消化(1mg/ml，Worthington)加至含有DMEM/F12的50ml离心管中，锡箔纸避光，37度，180转/分，消化1小时，离心250g x 5min，PBS洗涤1次，接种及传代培养和观察培养，细胞培养条件为：37℃，5％(V/V)CO2细胞培养箱，培养所用培养基为：DMEM/F12(Invitrogen)；EGF(Peprotech,20ng/ml)；Hydrocortisone(Sigma,0.5mg/ml)；Insulin(Sigma,10ug/ml)；Pen/Strep(Invitrogen)；培养过程中细胞系LJ-0429的细胞形态如图1所示：长梭形，生长较快，高侵袭性间质细胞，其ER(-)、PR(-)、Her-2(-)；传代时，用Tryple胰酶消化细胞，按1:2的比例传代。
(3)纯化细胞：为了提取较纯的间质成份来源的原代叶状肿瘤细胞，具体为待细胞传代几次后，将细胞按照1:10传代至较大培养皿中培养，镜下观察并标记间质特征的细胞，无菌条件下刮除周围上皮特征的细胞，PBS洗涤3次，加入新鲜培养基继续培养传代。
(4)原代细胞永生化：LJ-0429细胞系通过感染永生化病毒SV40T，使原代细胞感染成功并能传代至30代，即永生化成功(此方法来自于abm公司)。
其中，永生化具体步骤如下：
1.培养包装细胞：转染前，提前将慢病毒包装细胞293T复苏在10cm细胞板进行培养，加入10ml含10％(W/W)热灭活胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，使细胞在进行病毒包装时达到70-80％融合率。细胞培养条件同上步骤(2)原代培养。
2.准备慢病毒混合物：
2.1.用LIP3000的方法转染，在750ul opti-mem中加入10ug pLenti-SV40-TVector质粒(来自于abm公司)和10ug的慢病毒转染包装质粒，混匀，室温孵育5min。同时在750ul opti-mem中加入80ul的LIP3000转染试剂，混匀，室温孵育5min；
2.2.将LIP3000转染试剂混合溶液加入到质粒混合溶液中，混匀，室温孵育15min。
3.将准备好的包装细胞293T换成6ml新鲜培养基，加入慢病毒混合物，摇匀。细胞在5％(V/V)CO2条件下，37℃培养48h。
4.收获慢病毒：转染48小时后收集培养基，以0.45μm的过滤膜过滤该培养基得到纯化的病毒液。以10,000×g离心4小时收集病毒颗粒，获得浓缩的慢病毒，放至-80℃冰箱保存。
5.慢病毒感染：
5.1感染前6h，接种6孔板，保证感染时叶状肿瘤细胞长至约30-40％的融合密度；
5.2将保存于-80℃冰箱中病毒液拿至室温融化，混匀；
5.3依照病毒滴度和预实验测定的最适MOI值，以病毒稀释用培养液(10％FBS完全培养基，含双抗)对病毒原液进行稀释，准备0.8mg/mL的polybrene，在6孔板中感染细胞，每孔加入2ml病毒液(含10ug/ml的Polybrene)，病毒上清液置于冰箱，下午二次感染；
5.4第二天，去除细胞里的病毒液，加入完全培养基于培养箱中孵育，细胞长满后，进行传代，将未感染的细胞和感染后的细胞同步培养，传代30代以上，挑选形态正常的细胞做下游检测。
实施例2检测病毒的表达情况
采用Q-PCR(定量即时聚合酶链锁反应，简称定量PCR)检测LJ-0429细胞系中导入相关永生化基因SV40T的表达量。其中，所用的基因引物如下表1所示。
表1引物碱基序列
Forward(正向引物) Reverse(反向引物)
GAPDH AGAGCCTCGAGGAGAAGTTCC(SEQ ID NO.1) ACTAGGGAGTCAAGGACGGG(SEQ ID NO.2)
SV40T GCCAGTACCGTGCCTTATCC(SEQ ID NO.3) GAACCACTAGGCCCATAACCA(SEQ ID NO.4)
LJ-0429细胞系(保藏编号C2018234)导入的是SV40T病毒，LJ-0429细胞系中SV40T的过表达检测结果如下表2所示。
表2 LJ-0429细胞系中SV40T的表达结果
样品 导入基因 ct值 是否表达
对照组 GAPDH 13 是
对照组 SV40T 35 否
永生化组 GAPDH 14 是
永生化组 SV40T 20.93 是
由上述表格2的结果可知，对照组细胞(野生型叶状肿瘤乳腺细胞)中SV40T基因(导入方法参考实施例1中病毒感染步骤)并没有表达，而永生化组细胞(LJ-0429)中的插入基因SV40T已成功表达，说明本发明的LJ-0429细胞具有永生化能力。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.人恶性叶状肿瘤细胞系LJ-0429，其特征在于，所述细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为C2018234。
2.一种用于研究肿瘤发生发展机理的细胞模型，其特征在于，所述细胞模型为权利要求1所述的细胞系。
3.根据权利要求2所述的细胞模型，其特征在于，所述肿瘤为恶性肿瘤。
4.根据权利要求2或3所述的细胞模型，其特征在于，所述肿瘤为乳腺叶状恶性肿瘤。
5.权利要求1所述的细胞系LJ-0429在筛选抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺叶状肿瘤。
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