CN115747163A

CN115747163A - 一种人乳腺交界性叶状肿瘤荧光标记细胞系及其应用

Info

Publication number: CN115747163A
Application number: CN202211458569.3A
Authority: CN
Inventors: 邵牧民; 江徐; 余学问; 毕嘉欣
Original assignee: Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital
Current assignee: Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital
Priority date: 2022-11-17
Filing date: 2022-11-17
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体提供了一种人乳腺交界性叶状肿瘤荧光标记细胞系HBPT0727，通过以下步骤构建：从人体交界性叶状肿瘤中获得交界性叶状肿瘤细胞；对所述交界性叶状肿瘤细胞进行贴壁培养以得到原代细胞；使用永生化慢病毒感染所述原代细胞；对所述原代细胞继续稳定扩增培养以得到永生化的交界性叶状肿瘤细胞系。本发明提供的细胞系建系时间短，生物遗传性稳定，可多次稳定传代，且带有绿色荧光标记，方便后续实验中肿瘤细胞的追踪与定位。以该细胞系作为研究模型，有助于探讨乳腺叶状肿瘤的发病机制、表型特征、病理改变以及该肿瘤的发生、发展或转移规律，还可以用于抗乳腺叶状肿瘤治疗药物的筛选和评估，具有较高的科研和临床应用价值。

Description

一种人乳腺交界性叶状肿瘤荧光标记细胞系及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727及其应用。

背景技术

乳腺叶状肿瘤是发生于乳腺的纤维上皮性肿瘤，以乳腺间质细胞肿瘤性增生为主要特征，形态学表现为：双层的上皮成分呈裂隙状或腺管状排列，周围绕以丰富的间质细胞成分，形成叶状结构。据WHO第五版肿瘤分类统计，该肿瘤亚裔人群发生率远高于西方人。目前，WHO采用6种组织形态学指标来界定该肿瘤的良恶性，包括：肿瘤边界、间质细胞密度、核分裂象、细胞异型性、间质过度增生以及是否存在异源性成分，分为良性、交界性和恶性叶状肿瘤。大多数叶状肿瘤是良性的，但复发并不少见；恶性叶状肿瘤生长速度快，侵袭性强，少数病例可以发生血行转移。病理学上，提示恶性叶状肿瘤的形态学指标主要是明显的核多形性、浸润性边界、核分裂象增加(≥5个/mm²)、间质细胞过度生长、有异源性恶性肿瘤分化等特点，当肿瘤不具有恶性叶状肿瘤的全部恶性组织学特点时，诊断为交界性叶状肿瘤，病理上认为该肿瘤具有低度恶性生物学行为。

现有的分子标记物在预测叶状肿瘤的生物学进展方面的价值十分有限，而在乳腺叶状肿瘤的临床治疗中，化疗和放疗对叶状肿瘤的治疗效果均不佳，其主要治疗方式仍为手术切除，但术后局部复发率较高，22％左右的恶性叶状肿瘤会发生血源性转移。因此，进一步探究乳腺叶状肿瘤的发生、发展机制，寻找精准的治疗方法，对降低复发与转移率尤为重要。

人乳腺叶状肿瘤的发生、发展机制的研究以及相关临床诊治方案的探索和改进一直都是亟待解决的问题，而建立良好的人乳腺叶状肿瘤细胞实验模型是开展相关研究的基础之一。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中获得叶状肿瘤细胞系主要通过酶消化肿瘤组织这一单一途径问题，同时解决细胞定位与追踪困难的问题。

为此，本发明提供了一种人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727，所述细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO:C2022341；保藏日期为2022年11月03日。

本发明还提供了上述人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727的构建方法，包括以下步骤：

(1)取临床手术切除的交界性叶状肿瘤组织于培养瓶中静置培养，待细胞从组织块边缘游离长出，定期换液，至预定细胞密度后传代；

(2)待步骤(1)中细胞生长稳定后，进行慢病毒转染；

(3)加入puromycin进行筛选，筛选成功后用完全培养基进行传代培养，经稳定传代后，得到人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727。

具体的，上述完全培养基为添加了10-15％ FBS和1％ P/S的Advanced DMEM/F12培养基。

具体的，所述步骤(1)具体为：取临床手术切除的交界性叶状肿瘤组织，冲洗去除杂质和血液，剪碎后均匀分散在培养瓶底部，将培养瓶瓶底朝上放置于37℃，5.0％CO₂培养箱内静置培养，次日，将培养瓶正置，加入完全培养基，使培养液浸没组织块，待细胞从组织块边缘游离长出，定期换液，至预定细胞密度后传代。

本发明还提供了上述人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727的子代细胞。

本发明还提供了上述人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727在建立肿瘤动物或细胞模型中的应用。

本发明还提供了上述人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727在研究肿瘤致病机制、发生、发展或转移中的应用。

本发明还提供了上述人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727在制备、筛选或评估抗肿瘤药物试剂中的应用。

本发明还提供了上述人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727在筛选肿瘤相关标记物中的应用。

具体的，上述应用中，所述肿瘤为交界性肿瘤。

优选的，上述交界性肿瘤为乳腺交界性叶状肿瘤。

优选的，上述乳腺交界性叶状肿瘤为人乳腺交界性叶状肿瘤。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明提供这种人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727为中国女性来源的乳腺交界性叶状肿瘤细胞株，构建方法简单，不需要经过胶原酶消化，节约了时间与经济成本，生物遗传性稳定，而且带有绿色荧光标记，解决了该肿瘤研究实验中细胞定位与追踪的难题，填补了华人人群来源的交界性叶状肿瘤荧光标记细胞系的空白。以该细胞系作为研究模型，有助于探讨乳腺叶状肿瘤的发病机制、表型特征、病理改变以及该肿瘤的的发生、发展或转移规律，还可以用于抗乳腺叶状肿瘤治疗药物的筛选和评估，具有较高的科研和临床应用价值。

以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是本发明人乳腺交界性叶状肿瘤组织常规HE染色图。

图2是本发明提供的人乳腺交界性叶状肿瘤组织块中游离长出原代细胞光镜下形态图，阴影部分为组织块。

图3是本发明提供的人乳腺交界性叶状肿瘤细胞导入永生化病毒后表达GFP荧光图。

图4是本发明提供的人乳腺交界性叶状肿瘤细胞多次传代稳定培养后光镜下形态图。

图5是本发明提供的HBPT0727细胞系的qPCR结果图。

图6是本发明提供的HBPT0727细胞系的免疫组化结果图。

图7是本发明提供的HBPT0727细胞系的STR鉴定结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。

下面通过具体实施例对本发明提供的人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727进行描述。

实施例1：

一、人乳腺交界性叶状肿瘤原代细胞的制备

1、病人信息概述

该患者，女，乳腺纤维上皮性肿瘤，大小约6.5×6×3.5cm，病理诊断符合交界性叶状肿瘤，伴部分导管普通型增生，肿瘤组织切片HE染色结果如图1所示。免疫组化结果：肿瘤性间质细胞CD34(+)，Bcl-2(弱+)，CD117(-)，Desmin(小灶+)，DOG-1(-)，SMA(+)，Ki-67(热点区约20％+)，CD10(+)；肌上皮P63(-)；导管上皮ER(不均质+)。

2、获得原代细胞的具体步骤

(1)获得新鲜的上述病例的临床手术切除的交界性叶状肿瘤标本，在超净工作台内用无菌手术刀切下1×0.5×0.5cm左右的肿瘤组织块，整个过程严格保证无菌。将组织块放置于10cm细胞培养皿中，用含1％P/S的DPBS清洗液冲洗组织块，洗去杂质和血液，重复此步骤3次。

(2)用5mL完全培养基(10％FBS+Advanced DMEM/F12+1％P/S)润湿组织块后，用眼科剪将组织剪切成小块，每块约1mm³大小。

(3)将剪碎的组织块吸入25cm²细胞培养瓶中，使其均匀分散铺在培养瓶的底部，将培养瓶瓶底朝上放置于37℃，5.0％CO₂培养箱内静置培养。

(4)次日，将培养瓶正置，加入5mL完全培养基，使培养液浸润组织块，密切观察细胞生长状况，待细胞从组织块边缘游离长出，如图2所示，每2天换一次液直至细胞密度为80％左右传代。

(5)传代：用0.25％Trypsin-EDTA消化原代细胞，待细胞变圆终止消化，1000rpm离心4min后，弃上清，用5mL完全培养基重悬细胞沉淀后放入培养瓶中，放置于37℃，5.0％CO₂培养箱内静置培养。密切观察细胞生长状况，每2天更换一次培养液，待细胞密度达80％左右传代。

二、人乳腺交界性叶状肿瘤细胞株的建立

原代细胞永生化

(1)感染前准备：待步骤(5)中传代的细胞生长稳定后，接种5×10⁴个细胞于24孔板中，37℃培养过夜，第2天细胞密度约为50％-60％。

(2)目的细胞的感染：吸走原有培养基，每孔细胞加入新的250μL 5％FBS+Advanced DMEM/F12培养基，同时加入终浓度5μg/mL的ADV-HR(1mg/mL)和15μL表达GFP的SV40T慢病毒(MOI＝100)，轻轻摇匀，放入37℃，5.0％CO₂培养箱内静置培养。4h后，向每孔细胞中加入新的250μL5％FBS+Advanced DMEM/F12培养基，和终浓度5μg/mL的ADV-HR(1mg/mL)。

(3)换液：感染24h后，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的500μL完全培养基，继续培养。

(4)细胞筛选：感染72h后，荧光显微镜检测GFP荧光表达效率，如图3所示。同时每孔加入500μL的完全培养基，和终浓度2μg/mL的puromycin进行筛选。筛选成功后用完全培养基进行传代培养。经稳定传代后，得到一株人乳腺交界性叶状肿瘤细胞株，细胞形态如图4所示。命名为人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727，己保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2022年11月03日，保藏编号：CCTCC NO:C2022341。

三、检测人乳腺交界性叶状肿瘤细胞病毒表达情况

采用q-PCR检测HBPT0727细胞系中永生化基因SV40T的表达。其中，所用的基因引物如表1所示，检测结果如表2所示。

表1引物基因序列

表2HBPT0727细胞系中SV40T的表达量

由表2的数据可计算出2^-△△Ct值，得到如图5所示的结果，表明慢病毒组细胞与对照组细胞相比SV40T已成功表达，本发明的HBPT0727细胞系永生化成功。

四、免疫组织化学法分析人乳腺交界性叶状肿瘤细胞中标志物的表达

具体步骤包括：在12孔板中放入无菌细胞爬片，将上述细胞接种于爬片上，每孔接种1×10⁵个细胞。待细胞密度为80％左右时，吸走培养液，PBS洗涤3次后，每孔加入0.5mL4％多聚甲醛固定液，室温固定20min；吸走多聚甲醛，PBS洗涤3次；每孔加入3％H₂O₂水溶液处理10min后，PBS洗涤3次；每孔加入0.5mL封闭液，封闭20min；然后加入一抗4℃孵育过夜；次日，用PBS洗涤3次后，加入二抗孵育20min，PBS洗涤3次；DAB-H₂O₂显色3min，蒸馏水洗终止显色；常规复染脱水透明封片后，光学显微镜观察图像，结果如图6所示。

人乳腺交界性叶状肿瘤细胞株STR鉴定，结果表3和图7所示：

表3STR鉴定结果

以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727，其特征在于：所述细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO:C2022341；保藏日期：2022年11月03日。

2.如权利要求1所述人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)待步骤(1)中细胞生长稳定后，进行慢病毒转染；

3.如权利要求2所述的人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727的构建方法，其特征在于：所述完全培养基为添加了10-15％FBS和1％P/S的Advanced DMEM/F12培养基。

4.如权利要求2所述的人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：取临床手术切除的交界性叶状肿瘤组织(经病理诊断证实)，冲洗去除杂质和血液，剪碎后均匀分散在培养瓶底部，将培养瓶瓶底朝上放置于37℃，5.0％CO₂培养箱内静置培养，次日，将培养瓶正置，加入完全培养基，使培养液浸没组织块，待细胞从组织块边缘游离长出，定期换液，至预定细胞密度后传代。

5.如权利要求1所述的人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727的子代细胞。

6.如权利要求1所述的人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727在建立肿瘤动物或细胞模型中的应用。

7.权利要求1所述的人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727在研究肿瘤致病机制、发生、发展或转移中的应用。

8.权利要求1所述的人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727在制备、筛选或评估抗肿瘤药物试剂中的应用。

9.权利要求1所述的人乳腺交界性叶状肿瘤细胞系HBPT0727在筛选肿瘤相关标记物中的应用。

10.根据权利要求6-9任一项所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为交界性肿瘤。