KR20190028726A - 암 진단 및 모델링에 사용하기 위한 바이오매트릭스 스캐폴드 - Google Patents

암 진단 및 모델링에 사용하기 위한 바이오매트릭스 스캐폴드 Download PDF

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KR20190028726A
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앤드류 장 왕
시 티안
로라 엠. 레이드
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더 유니버시티 오브 노스캐롤라이나 앳 채플 힐
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Abstract

간 및 폐 바이오매트릭스 스캐폴드의 기층 상에, 장기-특이적 매트릭스 추출물이 신규한 탈세포화 전략에 의해 생성된 경우, 인간 결장직장 암세포의 거동에 의해 제시된 바와 같은 장기 특이성의 생물학적 패싯을 재현하는 시험관내 암 전이 모델이 본 명세서에 기재된다. 종양 세포는 조직학, 생물학 및 유전학 및 다른 표현형 형질의 측면에서, 생체내 전이 병소를 모방한 콜로니를 자발적으로 형성하였다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 방사선 또는 화학요법제에 대한 종양의 반응은 사용된 매트릭스 기층에 따라 다르다는 것이 입증되었으며; 따라서, 스캐폴드가 암 연구 및 진단을 위한 유망한 툴을 제공할 것으로 사료된다.

Description

암 진단 및 모델링에 사용하기 위한 바이오매트릭스 스캐폴드
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 7월 12일자로 출원된 미국 제 62/361,306호 및 2017년 2월 16일자로 출원된 미국 제 62/460,056호에 대해 35 U.S.C. 119(e) 하의 우선권을 주장한다.
전이는 암의 이환율과 사망률의 주요 원인이다. 암 연구에서의 주요 도전과제는, 특히, 전이의 주 특징인 장기의 특이성과 관련하여, 암 전이의 생물학을 재현하는 생체외 또는 시험관내 모델이 부재한다는 것이다. 따라서 암 연구와 치료법 개발을 위한 더 나은 툴에는 더 나은 전이 성장 모델이 필요하다.
종양 세포가 특정 장기에 전이되는 경향이 있음을 감안할 때, 장기 특이성은 암 전이의 중요한 특징이다. 추가로, 전이 병소의 치료 반응은, 동일한 환자일지라도, 전이 병소가 생성되는 장기에 따라 다를 수 있다. 그러나, 이들 종양 모델에는 장기 미세환경의 가변성이 부재할 수 있으므로, 기존의 시험관내/생체외 모델 시스템은 이러한 장기 특이성을 반영하지 못한다. 생체내에서 유전자 조작된 마우스 모델이 장기 특이성을 가진다 할지라도, 이는 연구가 어렵고, 매우 고비용이다.
임상적으로, 어떤 종양이 전이 될 것인지, 종양이 어느 조직이나 장기에 전이될 것인지 예측할 수 있는 툴이 부재한다는 문제가 있다. 전이 부위를 예측할 수 있는 분석법은 엄청난 임상적 가치를 가질것이며, 암 관리법을 바꿀 수 있다.
본 발명의 양상은 암 또는 종양의 진단 및/또는 특성화와 관련된 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다. 본원의 암 또는 종양과 관련하여 기재된 임의의 실시형태에서, 암 또는 종양은 악성일 수 있다. 특정 실시형태에서, 암 또는 종양은 특정 조직으로 전이할 수 있는 가능성 및/또는 본원의 하기에 기재된 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제에 반응하는 하나 이상의 이러한 전이의 반응성을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법 실시형태는 종양 또는 암으로부터의 세포를 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드에 시딩 (seeding)하는 단계를 포함한다.
이들 방법 실시형태 중 일부에서, 세포는 (1) 암 또는 종양으로 진단된 환자로부터 채취된 종양 생검 또는 샘플의 세포 또는 (2) 환자와 동일한 암 또는 종양 유형의 세포주로부터의 세포 유래의 것일 수 있다. 이들 방법 실시형태 중 일부에서, 세포를 성장 세포의 콜로니를 형성하는 그의 능력에 대해 분석한다. 일부 실시형태에서, 콜로니는 바이오매트릭스 스캐폴드의 기층에 존재한다. 이들 방법 실시형태 중 일부에서, 세포는 콜로니를 형성한다. 이들 방법 실시형태 중 일부에서, 세포를 3차원 콜로니가 되는 그의 능력에 대해 분석한다. 이들 방법 실시형태 중 일부에서, 세포는 3차원 콜로니를 형성한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 이러한 3차원 콜로니 형성은 각각의 바이오매트릭스 스캐폴드의 기층의 화학적 성질에 의해 영향을 받을 수 있는 것으로 사료된다. 이들 방법 실시형태 중 일부에서, 세포를 유전자를 발현하거나, 단백질 또는 다른 인자를 분비하는 그의 능력에 대해 분석한다. 이들 유전자의 비 제한 예는 전능성 유전자 (예를 들어, OCT4, SOX2, KLF4, KLF5, SALL4, NANOG, BMi-1), 줄기세포 유전자 (예를 들어, EpCAM, LGR5/LGR6, CXCR4, 히알루론산 수용체를 인코딩하는 유전자의 CD44 계열의 다수의 변이체 중 하나 이상의 것, 다약제 내성 유전자 (예를 들어, mdr 유전자 계열, p-당단백질), 세포외 매트릭스 성분을 용해하는 효소 (예를 들어, 히알루로니다제, 콜라게나제, 엘라스타제, 매트릭스-분해 메탈로프로테나제)를 인코딩하는 유전자를 포함하고; 이들 단백질의 비 제한 예는 상기에 언급된 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 (예를 들어, CD44, p-당단백질, 매트릭스 분해 효소)를 포함하고; 이러한 분석에 적절한 다른 인자의 비 제한 예는 엑소좀 생성, 마이크로RNA, 및 중간엽 지지체로부터의 주변분비 신호전달의 정성적 또는 정량적 독립성과 관련된 것을 포함한다. 이들 방법 실시형태 중 일부 실시형태에서, 세포가 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드에 시딩되고, 이에 부착된 경우, 이러한 분석이 이루어질 수 있다. 이들 방법 실시형태 중 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드의 조직 특이적 형태의 기층에 부착될 수 있다.
이들 방법 실시형태 중 일부에서, 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드는 각각 하나 이상의 소정의 인체 장기로부터 유래된다. 추가의 실시형태에서, 소정의 장기는, 예를 들어, 암 또는 종양 유형의 전이와 관련된 것으로 인식되어 있는 장기를 포함하거나, 암 또는 종양이 존재하는 장기를 포함하도록 하기 위해, 환자의 암 또는 종양 유형을 기반으로 선택된다. 모든 방법 실시형태에서, 각각의 바이오매트릭스 스캐폴드는 이것이 유래된 조직의 생물학적 패싯 (biological facet)을 재현한다.
시딩 방법은 암 또는 종양으로 진단된 환자에서 종양이 전이될 가능성을 결정하기 위해, 선택적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양 또는 암세포가 바이오매트릭스 스캐폴드에 성장 세포의 콜로니를 형성한 경우, 장기로의 전이가 예측될 수 있다. 예측된 전이는 상기 스캐폴드가 유래된 장기에 위치한 것으로 추가로 결정될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 생체내에서 세포가 각각 그로부터 유래된 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드에 성장 세포의 콜로니를 형성한 경우, 하나 이상의 소정의 장기로의 전이가 예측된다.
또한, 암 또는 종양으로 진단된 환자에서 적절한 종양 치료를 결정하기 위해, 시딩 방법이 사용될 수 있다. 이는 종양이 전이될 가능성의 결정과 함께 또는 그와 독립적으로 수행될 수 있다.
상기에 개시된 방법 실시형태 중 임의의 것은 그의 조직학, 엑소좀 생성, 마이크로RNA 생성, 중간엽 세포와의 상호작용, 및/또는 유전자 발현 프로파일을 기반으로 하여 콜로니를 특성화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기에 개시된 방법 실시형태 중 임의의 것은 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제에 대한 반응성에 대해 콜로니를 스크리닝하는 단계 또는 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제로 콜로니를 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 암 요법 및/또는 화학요법제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 방사선 요법, 면역요법, 내분비 요법, 분자 요법, 및/또는 하나 이상의 유형의 화학요법, 예컨대 안트라사이클린 (anthracycline), 알킬화제, 백금계 제제, 항-대사물질, 토포이소머라제 억제제, 또는 유사분열 억제제의 1회 이상의 투여를 포함한다. 이러한 암 요법 및/또는 화학요법제는 선택적으로 환자의 암 또는 종양 유형을 기반으로 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 생체내에서 장기에서 하나 이상의 요법 및/또는 제제에 대한 암 또는 종양의 반응성은 장기로부터 제조된 바이오매트릭스 스캐폴드에 시딩된 경우, 하나 이상의 요법 또는 제제에 대한 암 또는 종양 세포의 반응성과 관련될 수 있다.
본 개시내용의 양상은 또한 각각 하나 이상의 소정의 인체 장기로부터 유래된 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드 및 본 명세서의 상기에 개시된 방법 중 하나 이상을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 추가의 실시형태는 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제; 암 또는 종양으로 진단된 환자로부터 채취된 종양 생검 또는 샘플(들)의 세포를 획득하기 위한 툴 또는 설명서; 특정 암 또는 종양 유형으로부터의 세포주로부터의 세포; 및/또는 상기에 개시된 방법을 수행하는데 필요한 임의의 시약, 배지 또는 다른 성분을 추가로 포함하는 키트를 고려한다.
본 개시내용의 추가의 양상은 본 명세서의 상기에 개시된 시딩 방법에 의해 생성된 하나 이상의 소정의 인체 장기에 특이적인 인공 종양 또는 전이 모델을 고려한다.
도 1은 바이오매트릭스 스캐폴드 (BMS)가 생체내에 존재하는 조직-특이적 미세환경을 재현함을 보여준다. (a) 시험관내에서 전이 질병을 연구하기 위해 사용되는 방법론을 도시하는 도식. (b) 폐 및 간 BMS의 주사전자 현미경 사진. 크기 막대, 100 nm. (c) 탈세포화 전 및 후 폐 조직에 존재하는 성장 인자 및 사이토카인의 분석 (n=4). 신호전달 분자의 상대 존재량의 차이를 이원 t-시험을 사용하여 결정하였다. 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 제시되며; * p<0.001; (d) 간 및 폐 BMS에 존재하는 단백질의 조성 및 상대 존재량을 비교하는 열 지도 (n=4). 계층 군집분석을 z-스코어 정규화된 무 표지 정량화 강도를 사용하여 수행하였다.
도 2는 간 및 폐 BMS에서 배양된 경우, 결장직장 암세포가 자발적으로 3D 조작 전이를 형성하는 것을 보여준다. (a) 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 및 폐 BMS에서 성장한 HT-29 (좌측), SW480 (중간), 및 Caco2 (우측) 세포의 주사전자 현미경 사진. 크기 막대, 50 μm. (b) 시딩 효율 및 (c) 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 및 폐 BMS에 시딩된 HT-29 (좌측), SW480 (중간), 및 Caco2 (우측) 세포의 성장 속도 (n=3). 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 제시된다. 시딩 효율 및 성장 속도의 차이를 터키의 다중 비교 후-시험에 의한 일원 ANOVA를 사용하여 결정하였다. 통계적 유의성은 상기 문자로 표시된다 (P　< 0.05). 동일한 문자를 공유하는 그룹은 유의하게 상이하지 않다.
도 3은 조작된 간 전이가 생체내에 존재하는 간 전이와 유사함을 보여준다. (a) 조작된 HT-29 간 전이 (좌측 패널), HT-29 세포의 비장내 주사 후 형성된 간 전이 (중간 패널), 및 후기 인간 결장직장 암 환자로부터 생검한 간 전이 (우측 패널)는 모두 위장관 유래의 간 전이의 대표적인 조직학적 특성을 보여준다. 크기 막대, 20 μm. (b) 플라스틱 ("플라스틱"), 마트리겔 ("마트리겔"), 간 BMS ("조작된 간 전이")에서 성장한 HT-29 세포에 의해 제시되는 평균적인 전체 유전자 발현 패턴 및 HT-29 세포의 비장내 주사로부터 유도된 생체내 간 전이 ("생체내 간 전이") (n=4)의 계층 군집 분석.
도 4는 조작된 전이가 생체내에서 증가된 전이 가능성을 보여줌을 제시한다. (a,c) 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 및 폐 BMS로부터 단리된 HT-29-luc2 세포에 의한 (a) 직접적 간내 주사 또는 (c) 꼬리 정맥 주사 30일 후의 생물발광 이미지. (b,d) HT-29-luc2 세포의 (b) 직접적 간내 주사 또는 (d) 꼬리 정맥 주사 후 간 및 폐 전이가 진행된 동물의 수를 정리한 표.
도 5는 상이한 기층에서 성장한 CRC 세포가 화학요법 및 방사선요법에 대해 상이하게 반응함을 보여준다. (a) 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 및 폐 BMS에서 성장한 CRC 세포의 화학요법에 대한 반응 (n=6). 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 제시된다. 요법 반응의 차이를 터키의 다중 비교 후-시험에 의한 일원 ANOVA를 사용하여 결정하였다. 통계적 유의성은 상기 문자로 표시된다 (P　< 0.05). 동일한 문자를 공유하는 그룹은 유의하게 상이하지 않다. (b) 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 및 폐 BMS에서 성장한 CRC 세포의 방사선요법에 대한 반응 (n=3). 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 제시된다.
도 6은 폐 및 간 조직의 탈세포화가 조직 특이적 신호전달 분자를 함유하는 BMS를 생성함을 보여준다. (a) 탈세포화 전 및 후의 폐 (좌측) 및 간 (우측)의 육안 및 H&E 이미지. 크기 막대, 130 μm. (b) 간 탈세포화 전 및 후에 폐에 존재하는 DNA 함량의 평가 (n=3). 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 제시된다. DNA 함량의 차이를 t-시험을 사용하여 결정하였다. (****P　< 0.0001). (c) 폐 및 간 BMS에 존재하는 성장 인자 및 사이토카인의 분석 (n=4). 간 BMS에 존재하는 신호전달 분자의 평균 픽셀 강도 값을 이전의 연구로부터 획득하였다.
도 7은 세포외 매트릭스 성분의 조성이 간과 폐 BMS 사이에 상이함을 보여준다. 간 및 폐 BMS에서 상이하게 발현된 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌의 상대 존재량을 비교하는 열 지도 (n=4). 계층 군집 분석을 z-스코어 정규화된 무 표지 정량화 강도를 사용하여 수행하였다.
도 8은 (a) 콜로니와 바이오매트릭스 스캐폴드 사이의 계면, (b) 세포 사이의 조밀한 연결 부위, 및 (c) 괴사 영역을 도시하는 조작된 간 전이의 투과 전자 현미경 사진을 도시한다. (a-b) 크기 막대, 2 μm. (c) 크기 막대, 10 μm. 좌측 패널의 바이오매트릭스 스캐폴드는 "B"로 표시된다. 중간 패널의 조질한 연결 부위는 점선으로된 박스로 표시된다. 우측 패널의 괴사 영역은 "N"으로 표시된다.
도 9은 조작된 전이가 감소된 증식 속도로 인해 상대적으로 서서히 성장함을 보여준다. (a) 유동 세포계측을 사용하여, 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 및 폐 BMS에서 성장한 CRC 배양물에서 절단된 카스파제 3 양성인 세포 사멸 중인 세포의 정량화 (n=3). (b) 유동 세포계측에 의해 평가되는 바와 같이, 4시간의 표지 기간 동안, S기로 진입되고, EdU 양성인 상이한 기층에서 배양된 세포의 수의 정량화 (n=3). 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 제시된다. 세포 사멸 및 증식 속도의 차이를 터키 다중 비교 후-시험에 의한 일원 ANOVA를 사용하여 평가하였다. 통계적 유의성은 상기 문자로 표시된다 (P　< 0.05). 동일한 문자를 공유하는 그룹은 유의하게 상이하지 않다.
도 10은 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS 및 폐 BMS에서 성장한 HT-29 (좌측), SW480 (중간), 및 Caco2 (우측) 세포의 대표적 이미지를 도시한다. 크기 막대, 20 μm.
도 11은 조작된 간 전이 및 생체내 전이가 근사한 유전자 특징을 나타냄을 보여준다. (a) 생체내 HT-29 간 전이의 전체적 유전자 발현 프로파일 및 (b) 조작된 간 전이를 마이크로어레이 분석에 의해 평가하였다 (n=4). 간 전이 in (a)에서 간 전이는 백색 화살표로 표시되어 있다. 크기 막대, 100 μm. (c) 벤다이어그램은 플라스틱에서 성장한 세포와 비교하여, 마트리겔 배양시 상향 조절된 유전자의 수, 조작된 전이, 및 생체내 간 전이를 도시한다. 유전자 온톨로지 (ontology) 분석은 통상적으로 상향 조절된 다수의 유전자가 혈관형성, 세포 부착, 및 약제 대사와 관련됨을 보여준다. (d) 실시간 qPCR에 의해 평가되는 바와 같은 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 및 폐 BMS에서 성장한 HT-29, SW480, 및 Caco2 세포에서의 Timp1 유전자 발현 (n=4). 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 제시된다. Timp1 발현의 차이를 터키의 다중 비교 후-시험에 의한 일원 ANOVA를 사용하여 결정하였다. 통계적 유의성은 상기 문자로 표시된다 (P　< 0.05). 동일한 문자를 공유하는 그룹은 유의하게 상이하지 않다.
도 12는 생체외 장기 생물발광 이미지를 도시하며, 조직학적 분석을 사용하여, HT29-luc2 세포의 꼬리 정맥 주사 (a) 또는 직접적 간내 주사 (b) 후의 전체 동물 생물발광 이미지를 기반으로 하여 확인된 전이 병소의 존재를 확인하였다. 조직학에 의해 확인된 대표적 간 및 폐 전이는 화살표로 표시되어 있다. 크기 막대, 20 μm.
도 13은 저산소의 사전 조건화가 플라스틱에서 성장한 HT-29 세포의 전이 가능성을 증가시키지 않음을 보여준다. (a) 정상 및 저산소 조건하에서 배양된 HT-29-luc2 세포의 꼬리 정맥 주사 30일 후의 동물의 생물발광 이미지. (b) 폐 전이가 발생한 동물의 수가 정리된 표.
도 14는 상이한 배양 기층에서 성장한 CRC 세포에 의해 나타난 아노이키스 (anoikis) 및 침윤 가능성에 대한 상대적 민감성의 특성화를 도시한다. (a) 하이드로겔-코팅 플레이트에서의 배양 후, 아노이키스 진행에 대한 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 및 폐 BMS에서 성장한 HT-29, SW480, 및 Caco2 세포의 상대적 내성 (n=3). (b) 트랜스웰 (transwell) 침윤 분석을 사용하여 결정된 바와 같은 상이한 기층에서 성장한 CRC 세포의 침윤 가능성 (n=3). 데이터는 평균 ± S.E.M.으로 제시된다. 생존 및 침윤의 차이를 터키 다중 비교 후-시험에 의한 일원 ANOVA를 사용하여 결정하였다. 통계적 유의성은 상기 문자로 표시된다 (P　< 0.05). 동일한 문자를 공유하는 그룹은 유의하게 상이하지 않다.
이하에서, 본 개시내용에 따른 실시형태가 더욱 상세히 기재될 것이다. 그러나, 본 개시내용의 양상은 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 본 명세서에 설명된 실시형태에 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 이들 실시형태는 본 개시내용이 철저하고 완전하게 이루어질 수 있도록 하고, 당업자에게 본 발명의 범위를 충분히 전달하기 위해, 제공된다. 본 명세서의 기재내용에 사용된 용어는 특정 실시형태를 설명하기 위한 것일뿐이며, 제한하려는 의도가 아니다. 본 명세서 및 출원 전반에 걸쳐 언급된 모든 문헌은 참조로 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어 (기술 및 과학 용어 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에서 정의된 용어와 같은 용어는 본 출원 및 관련 기술의 맥락에서의 그 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명시적으로 그렇게 정의되지 않는 한, 이상적으로 또는 과도하게 형식적인 개념으로 해석되어서는 안됨이 추가로 이해될 것이다. 하기에 명시적으로 정의되지는 않았으나, 이러한 용어는 공통된 의미에 따라 해석되어야 한다.
본 명세서의 기재내용에 사용된 용어는 특정 실시형태를 기재하기 위한 것이며, 단지 본 발명을 제한하고자 하는 의도는 아니다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 기술의 실행에는 달리 지시되지 않는 한, 당 업계의 기술 범위 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술이 사용될 것이다. 예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell 및 Molecular Biology (Academic Press, London); 및 Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology]을 참조한다.
문맥상 달리 지시되지 않는 한, 본원에 기재된 본 발명의 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있음이 구체적으로 의도된다. 추가로, 본 개시내용은 일부 실시형태에서, 본원에 설명된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 배제되거나, 생략될 수 있다는 것을 또한 고려한다. 예시를 위해, 복합체가 성분 A, B 및 C를 포함하는 것으로 명세서내에서 언급된 경우, A, B 또는 C 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 생략하고, 단독으로 또는 임의의 조합으로 배제될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다.
범위를 포함하여, pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량과 같은 모든 수치 표기는 적절한 경우, ( + ) 또는 ( - ) 1.0 또는 0.1의 증량 또는 대안적으로 +/- 15%, 또는 대안적으로 10%, 또는 대안적으로 5%, 또는 대안적으로 2%의 변폭만큼 상이한 근사치이다. 항상 명시적으로 언급되지는 않았으나, 모든 수치 표기 앞에 "약"이라는 용어가 선행 표기된 것임이 이해되어야 한다. 또한, 항상 명시적으로 언급되지는 않았으나, 본원에 기재된 시약은 단지 예시적인 것이며, 이러한 균등물이 당 업계에 공지되어 있음이 이해되어야 한다.
정의
본 발명의 기재내용 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an"및 "the"는 문맥상 달리 명시하지 않는 한, 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약"이 양 또는 농도와 같은 결정 가능한 값 (예를 들어, 바이오매트릭스 스캐폴드의 총 단백질 중 콜라겐의 백분율) 등을 지칭하는 경우, 명시된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 또는 심지어 0.1%의 변폭을 포괄하는 것을 의미한다.
본원에 개시된 임의의 성분, 범위, 투여 형태 등의 선택을 기재하는데 사용되는 경우, "허용 가능한", "유효한" 또는 "충분한"이란 용어는 상기 성분, 범위, 투여 형태 등이 개시된 목적에 적합하다는 것을 의도한다.
또한 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "및/또는"은 양자택일 ("또는")로 해석되는 경우, 조합의 부재뿐만 아니라, 하나 이상의 관련 열거 항목의 가능한 모든 조합 및 임의의 조합을 지칭하고, 포괄한다.
본원에서 용어 "완충액" 및/또는 "세정 배지"는 바이오매트릭스 스캐폴드의 제조에 사용된 시약을 지칭하는데 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포"는 진핵생물 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포는 동물 유래의 것이며, 줄기세포 또는 체세포일 수 있다. 용어 "세포의 집합"은 동일하거나, 상이한 유래의 동일하거나, 상이한 세포 유형의 하나 이상의 세포의 군을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포의 집합은 세포주로부터 유래할 수 있으며; 일부 실시형태에서, 이러한 세포의 집합은 장기 또는 조직의 샘플로부터 유래할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "~를 포함하는"은 조성물 및 방법이 열거된 요소를 포함하나, 다른 요소를 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 접속구 "필수적으로 이루어진" (및 문법적 변형들)은 열거된 물질 또는 단계 "및 열거된 실시형태의 기본 및 신규한 특성 (들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것"을 포괄하는 것으로서 해석되어야 한다. 문헌[In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (원판 내 강조부분)]을 참조하며; 또한 MPEP § 2111.03을 참조한다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "필수적으로 이루어진"은 "포함하는"과 균등한 것으로 해석되어서는 안된다. "이루어진"은 다른 구성성분의 미량 초과의 원소 및 본원에 개시된 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계를 제외하는 것을 의미한다. 이들 접속 용어들 각각에 의해 정의되는 양상은 본 개시내용의 범위 내에 있다.
용어 "배양" 또는 "세포 배양"은 일부 실시형태에서는 부착 세포 (예를 들어, 단층 배양물)로서 또는 회전타원체 또는 유기관의 부유 응집체 배양물로서, 인위적, 시험관내 또는 생체외에서 2차원 (2D, 단층) 또는 3차원 (3D) 환경에서의 세포 (특정 형태의 매트릭스 상 또는 부유 상태인 경우, 세포의 극성 형태)의 유지를 의미한다. 용어 "회전타원체"는 모두 동일한 세포 유형인 세포의 부유 응집체 (예를 들어, 세포주로부터의 응집체)를 나타내며; "유기관"은 여러 세포 유형으로 구성된 세포의 부유 응집체이다. 일부 실시형태에서, 유기관은 상피의 응집체 및 내피 및/또는 기질 또는 성상 세포를 포함하는 하나 이상의 중간엽 세포 유형일 수 있다. "세포 배양 시스템"은 세포 집합이 생존하거나, 성장할 수 있는 배양 조건을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
"배양 배지"는 본원에서 세포의 배양, 성장 또는 증식을 위한 영양 용액을 지칭하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 이는 아미노산, 비타민, 염, 지질, 미네랄, 미량 원소 중 하나 이상을 포함하고, 간질액의 화학적 구성요소를 모방한다. 배양 배지는 기능적 특성, 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, 세포를 성숙시키기 위해 - 일부 경우, 구체적으로는, 특정 계통의 세포로의 줄기/전구 세포의 분화를 촉진하기 위해, 특정 상태 (예를 들어, 전능성 상태, 정지 상태 등)에 세포를 유지시키는 능력을 특징으로 할 수 있다. 줄기/전구 세포에 사용되는 배양 배지의 비 제한적 예는 쿠보타 배지 (Kubota's 배지)이며, 이하에서 추가로 정의된다. 일부 실시형태에서, 배지는 주어진 환경에 세포를 제공하거나 도입시키는데 사용되는 "시딩 배지"일 수 있다.
더욱 구체적으로, "기초 배지"는 세포 주변의 간질액의 화학적 구성요소를 모방하는 조성물 중의 아미노산, 당, 지질, 비타민, 미네랄, 염, 미량 원소 및 다양한 영양소로 구성된 완충액이다. 이러한 배지는 선택적으로, 세포 현탁액의 제조에 통상적으로 사용되는 효소에 대한 억제제의 공급원으로서 또는 생물학적 과정 (예를 들어, 증식, 분화)을 유도하는 데 필요한 필수 신호전달 분자 (호르몬, 성장 인자)를 제공하기 위해, 혈청이 보충될 수 있다. 혈청이 배양에 사용되는 세포 유형에 대해 자가 조직일 수 있으나, 소, 양, 염소, 말 등의 혈청과 같이, 농업용 또는 식용 목적으로 통상적으로 도살된 동물로부터의 가장 통상적인 혈청이다. 혈청이 보충된 배지는 선택적으로 혈청 보충 배지 (SSM)로 지칭될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "분화"는 특정 조건이 성체의 특정 유전자 산물을 생성하는 성체 세포 유형으로의 세포의 성숙을 야기하는 것을 의미한다.
용어 "균등물" 또는 "생물학적 균등물"은 특정 분자, 생물학적, 또는 세포성 물질을 지칭하는 경우, 상호 혼용되어 사용되고, 요망되는 구조 또는 기능성을 유지하는 채로, 최소 상동성을 갖는 것을 의도한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질로 후속하여 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우, 발현은 진핵생물 세포에서 mRNA의 스플라이싱 (splicing)을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 수준은 세포 또는 조직 샘플 내의 mRNA 또는 단백질의 양을 결정함으로써, 결정될 수 있으며; 추가로, 다중 유전자의 발현 수준을 결정하여, 특정 샘플에 대한 발현 프로파일을 획득할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "기능적"은 특정의 구체적 효과를 달성할 의도로 임의의 분자, 생물학적 또는 세포성 물질을 변형시키는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "유전자"는 광범위하게는, RNA가 코딩되는지 (예를 들어, mRNA) 또는 비 코딩되는지 (예를 들어, ncRNA)에 상관없이, RNA 분자로 전사된 임의의 핵산 서열을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "발생시키다" 및 그의 동의어 (예를 들어, 발생시키는, 발생된 등)는 특정 모델 콜로니, 장기, 또는 유기관을 산출시키는 방법 단계를 지칭하는 경우, "생성하다" 및 그의 동의어와 상호 혼용되어 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "단리된"은 다른 물질을 실질적으로 무함유하는 분자 또는 생물학적 또는 세포성 물질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "쿠보타 배지"는 내배엽 줄기세포를 위해 설계되고, (특히 히알루론산 기층 상 또는 3D 히알루론산 하이드로겔 내의 경우) 자가 복제 분열 방식으로 증식에 의해 확장할 수 있도록 하는 완전히 규정된 무혈청 배지를 지칭한다. 쿠보타 배지는 구리, 저 칼슘 (<0.5 mM), 인슐린, 트랜스페린/Fe, 정제된 알부민에 결합된 정제된 유리 지방산의 혼합물 및 선택적으로 또한 고밀도 지단백질을 함유하지 않는 임의의 기초 배지를 지칭할 수 있다. 쿠보타 배지 또는 그의 균등물은 특히 내배엽 줄기세포에 대한 배양 선택시 무혈청으로 사용되며, 정제된 신호물질 (인슐린, 트랜스페린/철), 지질 및 영양소의 규정된 혼합물만을 함유한다. 일부 실시형태에서, 이는 세포 현탁액의 제조에 사용되는 효소를 불활성화시키고, 매트릭스 스캐폴드에 세포를 도입시키는 시딩 과정을 위한 낮은 (통상적으로 5% 이하) 수준의 혈청을 사용한 SSM으로서 일시적으로 사용될 수 있으며; 가능한한 빨리 (예를 들어, 5 내지 6시간 이내) 무혈청 쿠보타 배지로 교체하는 것이 가장 적절하다.
특정 실시형태에서, 배지는 구리, 저 칼슘 (< 0.5 mM)을 함유하지 않고, 인슐린 (5 μg/mL), 트랜스페린/Fe (5 μg/mL), 고밀도 지단백질 (10 μg/mL), 셀레늄 (10-10 M), 아연 (10-12 M), 니코틴아미드 (5 μg/mL), 및 정제된 알부민에 결합된 정제된 유리 지방산의 혼합물이 보충된 무혈청 기초 배지 (예를 들어, RPMI 1640 또는 DME/F12)로 구성된다. 이러한 배지의 제조를 위한 비 제한적인 예시적 방법은 그 개시내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 다른 문헌, 예를 들어 문헌[Kubota H, Reid LM, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 2000; 97:12132-12137, Y. Wang, H.L. Yao, C.B. Cui et al. Hepatology. 2010; 52(4):1443-54, Turner et al; Journal of Biomedical Biomaterials. 2000; 82(1): pp. 156-168; Y. Wang, H.L. Yao, C.B. Cui et al. Hepatology. 2010 Oct 52(4):1443-54]에 공개되어 있다. 무혈청 조건 하에서의 확장을 가능하게 하기 위해, 추가의 인자 및 보충제를 제공함으로써, 쿠보타 배지의 변형물이 특정 세포 유형을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 쿠보타 배지는 무혈청 조건 하에서 생체외에서 생존하고, 확장하도록 하기 위해, 세포 또는 수임 전구세포 (예를 들어, 간모세포) 및 줄기세포 이후의 다른 성숙 계통발생 단계 집합을 수송하여 증폭시킬 수 있도록 변형될 수 있다. 이것의 하나의 예는 수임 전구세포인 간모세포 및 그의 딸세포의 생체외 확장을 위해 변형된 쿠보타 배지이다: 무혈청 쿠보타 배지는 간세포 성장 인자 (HGF), 표피 성장 인자 (EGF), 기본 섬유아세포 성장 인자 (bFGF), 및 때때로 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)로 추가로 보충된다. 생성된 세포 확장은 최소 (존재하는 경우) 자가 복제에 의해 이루어진다. 이러한 배지는, 세포가 IV형 콜라겐 및 라미닌의 기층 상에 존재하거나, 50% 초과의 IV형 콜라겐 및 라미닌을 함유하는 3-D 하이드로겔에 포매된 경우, 특히 효과적이다.
용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드", 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호 혼용되어 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이들의 유사체의 중합 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지되거나, 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 비 제한 예는 하기와 같다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 전령 RNA (mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, RNAi, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머.
폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오타이드의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비 뉴클레오타이드 성분에 의해 차단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합 후, 예를 들어 표지 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이러한 용어는 또한 이중 가닥 및 단일 가닥 분자 둘 모두를 지칭한다. 달리 명시되거나, 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 이러한 기술의 임의의 양상은 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예측되는 두 개의 상보적인 단일 가닥 형태의 각각을 둘 모두 포괄한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "장기"는 개개의 유기체의 특정 부분인 구조를 지칭하며, 개개의 유기체의 특정 기능은 국소적으로 수행되고, 형태학적으로 독립적이다. 장기의 비 제한적 예는 피부, 혈관, 각막, 신장, 심장, 간, 탯줄, 장, 신경, 폐, 태반, 췌장 및 뇌를 포함한다. 장기는 조직 공급원으로 사용될 수 있으며; 예를 들어, 태아, 신생아, 소아 (아동) 또는 성인 장기는 본원에 기술된 용도를 위해, 목적 세포 집합을 추출하는데 사용될 수 있다. 용어 "조직"은 살아있거나 사멸된 유기체의 조직 또는, 살아있거나 사멸된 유기체로부터 유래되거나, 이를 모방하도록 설계된 임의의 조직을 지칭한다. 조직은 건강하고, 질병이 있고/거나, 유전자 변형을 가질 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "천연 조직" 또는 "생물학적 조직" 및 그의 변형은 이것이 유기체로부터 유래 된 때부터 천연 상태 또는 변형되지 않은 상태로 존재하는 생물학적 조직을 지칭한다. "미세 장기"는 "천연 조직"을 모방한 "생체조작 조직"의 절편을 지칭한다.
생물학적 조직은 임의의 단일 조직 (예를 들어, 상호 연결될 수 있는 세포의 집합체) 또는 유기체의 장기 또는 일부분 또는 신체의 부위를 구성하는 조직 군을 포함할 수 있다. 조직은 균질 세포성 물질을 포함할 수 있거나, 예를 들어, 폐 조직, 골격 조직 및/또는 근육 조직을 포함할 수 있는 흉부를 포함하는 신체 부위에서 발견되는 것과 같은 복합 구조일 수 있다. 예시적인 조직은, 이에 제한되는 것은 아니나, 그의 임의의 조합을 포함하여, 간, 폐, 갑상선, 피부, 췌장, 혈관, 방광, 신장, 뇌, 담즙 구조계열, 십이지장, 복부 대동맥, 장골 정맥, 심장 및 장으로부터 유래된 것을 포함한다.
용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 상호 혼용되어 사용되고, 가장 넓은 의미로 2개 이상의 하위 단위 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩타이드 유사체의 화합물을 지칭한다. 하위 단위는 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 양상에서, 하위 단위는 다른 결합, 예를 들어, 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 단백질 또는 펩타이드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 제한이 없다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩티드 유사체를 포함하여, 천연 및/또는 비 천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "시딩"은 바이오매트릭스 스캐폴드와 같은 임의의 물질 상에 세포를 도입하는 방법을 지칭한다. 시딩은, 이에 제한되는 것은 아니나, 플레이트 및/또는 생물반응기를 포함하여, 다양한 용기 내에서 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 동물을 의미하는 것으로 의도된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유류일 수 있으며; 추가의 실시형태에서, 대상체는 인간, 마우스 또는 랫트일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 대상체에서 질병을 "치료하는" 또는 "치료"는 (1) 질병의 소인이 있으나, 그 증상이 아직 발현되지 않은 대상체에서 증상 또는 질병의 발병을 예방하는 것; (2) 질병을 억제하거나, 질병의 진행을 저지시키는 것; 또는 (3) 질병 또는 질병의 증상을 개선하거나, 퇴행을 야기하는 것을 지칭한다. 당 업계에서 이해되는 바와 같이, "치료"는 임상 결과를 포함하여, 유익하거나, 바람직한 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 기법의 목적을 위해, 유익하거나, 요망되는 결과는, 이에 제한되는 것은 아니나, 검출 가능하거나, 검출 불가능하거나 상관없이, 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 질환 (질병 포함)의 정도의 감소, 질환 (질병 포함)의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 질환 (질병 포함)의 지연 또는 지체, 질환 (질병 포함)의 진행, 개선 또는 경감, 상태 및 완화 (부분적이든 전체적이든 상관없음) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
바이오매트릭스 스캐폴드 및 세포외 매트릭스
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포외 매트릭스" 또는 "ECM"은 하나 이상의 세포 표면에 인접하여, 세포에 의해 분비되고, 이를 포함하는 세포 및 조직 또는 장기의 구조적 및/또는 기능적 지지에 관여하는 다양한 생물학적 활성 분자로 이루어진 복합 스캐폴드를 지칭한다. ECM의 화학적 조성은 많은 세포 유형에 의해 공유되는 매트릭스 성분이나, 조직 특이적이다. 특정 매트릭스 성분 및 그 농도는 특정 조직 유형, 조직학적 구조, 장기 및 다른 초 세포 구조와 관련될 수 있다. 본 개시내용과 관련된 세포외 매트릭스의 성분은, 이에 제한되는 것은 아니나, 콜라겐, 콜라겐-결합 매트릭스 성분 (예를 들어, 피브로넥틴, 라미닌, 니도젠 (nidogen), 엘라스틴, 프로테오글리칸, 글리코스아미노글리칸), 및 신호전달 분자 (성장 인자, 사이토카인)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이오매트릭스 스캐폴드의 단리를 위한 전략은 일차적으로 조직의 모든 콜라겐 분자가 불용성으로 유지되도록 설계되므로, 일차적인 고려 사항은 콜라겐 및 이에 결합된 인자이다. 일반적으로, 콜라겐 분자는 공지된 각 콜라겐 유형에 고유한 아미노산의 화학적 성질을 가진다. 현재 29가지 유형의 콜라겐이 공지되어 있다. 공지된 모든 콜라겐 분자는 분자의 중간에 막대 모양의 도메인이 있고, 말단에 구형 도메인이있는 브레이드와 같이 "엮여 있는" 3개의 아미노산 사슬로 구성된다 (따라서, 콜라겐 분자가 "덤벨"과 같은 모양을 갖게 됨). 막대 모양 도메인은 아미노산의 3개조 [글리신-프롤린-X]의 반복을 중요 특징으로 하며, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다. 구형 도메인은 각 콜라겐 유형에 고유한 아미노산 서열로 구성된다.
콜라겐이 세포로부터 분비되고, 분자의 하나 또는 둘 모두의 구형 말단이 특정 펩티다제에 의해 제거된 후, 다수의 콜라겐 분자가 응집되어, 콜라겐 원섬유가 형성된다. 예외적으로, "네트워크 콜라겐" (예를 들어, IV형 또는 VI형)은 구형 도메인이 유지된 후, 말단과 말단이 응집되어, "육각 철망"과 같은 구조를 가진 콜라겐 분자 네트워크가 형성된다.
원섬유 또는 네트워크에 응집된 후, 콜라겐은, 콜라겐 분자 사이 (및 또한 엘라스틴 분자 사이)의 공유 결합을 생성하여, 매우 안정한 콜라겐 분자 응집체를 구성하는 교차 연결된 형태를 생성하는 세포외 구리 의존성 효소인 리실 산화효소의 효과를 통해, 교차 연결된다. 원섬유 콜라겐 내의 원섬유당 콜라겐 분자의 수 또는 네트워크 콜라겐 내의 연결 패턴은 특정 콜라겐 유형의 정확한 아미노산의 화학적 성질에 의해 결정된다.
세포 외 매트릭스를 단리하기 위해 조직을 추출하는 단계는 불용성 형태의 조직 콜라겐의 단리에 집중된 전략으로 달성할 수 있다. 콜라겐은 비 콜라겐 매트릭스 성분이 부착된 스캐폴드로 인식되어 있으며, 신호전달 분자는 다수의 매트릭스-결합 성분에 결합한다. 교차 연결된 콜라겐뿐만 아니라, 교차 연결되지 않은 콜라겐에 의해 세포외 매트릭스 성분의 복합체의 자체 조립이 이루어진다. 따라서, 불용성 형태의 모든 조직 콜라겐을 회수하는 전략은 매트릭스의 대부분의 공지된 성분을 회수하기 위한 이상적인 전략이다.
매트릭스의 단리는 중성 pH 및 1 M 이상의 염 농도를 갖는 완충액을 사용함으로써 달성될 수 있다. 교차 연결된 콜라겐은 증류수로도 단리하여, 보존할 수 있으나, 교차 연결되지 않은 콜라겐을 불용성으로 보존하는데 필요한 염의 정확한 농도는 콜라겐 유형에 따라 다르다. 예를 들어, 피부에 다량 존재하는 I형 및 III형 콜라겐은 불용성으로 유지되기 위해 대략 1 M 염이 필요하다. 이와 달리, 고 수준의 V형 콜라겐은 3.5 내지 4.5 M의 염이 필요하다. 간에서 교차 연결된 콜라겐뿐만 아니라, 교차 연결되지 않은 콜라겐은 불용성으로 유지되기 위해 대략 3.4 내지 3.5 M 염이 필요하다.
세포외 매트릭스가 다량 존재하는 추출물을 제조하는 대부분의 방법은, 전부는 아닐지라도, 대부분의 교차 연결되지 않은 콜라겐 및 결합 성분의 손실을 초래하는 조건을 사용한다. 매트릭스 스캐폴드 단리에서 가장 공통적인 전략은 a) 매트릭스 성분을 분해하는 효소 및/또는 b) 교차 연결되지 않은 콜라겐 및 이에 결합된 임의의 인자의 용해를 유발하는 저염 또는 무염 완충액 (예를 들어, 증류수)을 이용하는 단계를 사용한다. 따라서, 교차 연결된 콜라겐 및 이에 결합된 임의의 인자를 함유하나, 교차 연결되지 않은 콜라겐 및 이에 결합된 성분은 부재하거나, 최소량을 갖는 매트릭스 스캐폴드를 위한 다양한 형태의 탈세포화된 조직 추출물이 존재한다.
용어 "바이오매트릭스 스캐폴드" (BMS)는 모든 조직 콜라겐을 불용성 형태로 유지시키는 전략에 의해 생성된 세포외 매트릭스의 단리된 추출물을 지칭한다. BMS 추출물은 그 화학적 성질 및 그 효과에서 조직 특이적이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, BMS는 생물학적 조직에 천연으로 존재하는 콜라겐 및/또는 콜라겐-결합 인자 중 일부, 선택적으로는 대부분을 보유한다. 일부 실시형태에서, BMS는모두 바이오매트릭스 스캐폴드의 일종인 (예를 들어, 용어 바이오매트릭스 스캐폴드에 포괄됨) 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 니도젠/엔탁틴 (entactin), 엘라스틴, 인테그린, 프로테오글리칸, 글리코스아미노글리칸 (황산화 및 비-황산화 - 히알루론산 포함) 및 이들의 임의의 조합을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진다.
일부 실시형태에서, BMS는 (i) 초기 (새로 형성된) 콜라겐, (ii) 응집되어 있으나, 교차 연결되지 않은 콜라겐 분자 (콜라겐 원섬유), (iii) 교차 연결된 콜라겐, (iv) 콜라겐에 결합된 비 콜라겐 매트릭스 성분 (예를 들어, 라미닌, 피브로넥틴, 니도젠/엔탁틴, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 글리코스아미노글리칸), (v) 이들 상이한 형태의 콜라겐에 결합된 신호전달 분자 및/또는 콜라겐에 결합된 비 콜라겐 인자를 포함하는 조직 콜라겐을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대다수의 교차 연결된 천연 콜라겐 및 교차 연결되지 않은 천연 콜라겐 둘 모두는 조직 내에서 비 콜라겐 매트릭스 분자 및 이들 콜라겐에 결합된 신호전달 분자와 함께 존재한다. 일부 실시형태에서, BMS는 하나 이상의 콜라겐-결합 매트릭스 성분, 예컨대 라미닌, 니도젠, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 히알루론산, 비-황산화 글리코스아미노글리칸, 및 황산화 글리코스아미노글리칸 및 매트릭스 성분에 결합된 성장 인자 및 사이토카인을 포함한다.
일부 실시형태에서, BMS는 생체내에 존재하는 매트릭스-결합 신호전달 분자 중 50% 초과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 매트릭스-결합 신호전달 분자는 표피 성장 인자 (EGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 골 형태형성 인자 (BMF), 형질전환 성장 인자 (TGF), 인터루킨 (IL), 신경 성장 인자 (NGF), 신경영양 인자, 백혈병 억제 인자 (LIF), 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 줄기세포 인자 (SCF), 콜로니 자극 인자 (CSF), GM-CSF, 적혈구생성소, 트롬보포이에틴, 헤파린 결합 성장 인자, IGF 결합 단백질, 태반 성장 인자, 및 Wnt 신호물질일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 BMS는 교차 연결된 콜라겐 및 비-교차 연결된 콜라겐 둘 모두를 보존하기 위해, 저 이온 강도 완충액을 피하여, 제조된다. 일부 실시형태에서, BMS는 검출 가능한 양의 특정 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 니도젠/엔탁틴, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 글리코스아미노글리칸 및/또는 이들의 임의의 조합이 부재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 필수적으로 모든 콜라겐 및 콜라겐-결합 인자가 보유된다. 다른 실시형태에서, BMS는 조직 내에 존재하는 것으로 인식되어 있는 모든 콜라겐을 포함한다.
BMS는 천연 생물학적 조직 내에 존재하는 콜라겐, 콜라겐-결합 매트릭스 성분, and/ 또는 매트릭스 결합된 신호전달 분자 (예를 들어, 성장 인자, 호르몬 및/또는 사이토카인) 중 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99. 5% 또는 100%를 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, BMS는 생물학적 조직의 콜라겐 중 적어도 95% 및 콜라겐-결합 매트릭스 성분 및 매트릭스-결합 신호전달 분자의 대부분을 포함한다. 본원에 기재된 콜라겐은 응집되어 원섬유를 형성하나, 여전히 교차 연결되어 있지 않은 초기 (새로 형성된) 콜라겐일 수 있으며, 일부는 이들의 교차 연결된 형태일 수 있다. 예시적 콜라겐 및 그의 추출 방법이 본 명세서의 하기에서 간략하게 기재된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바이오매트릭스 스캐폴드는 필수적으로, 초기 (새로 형성된) 콜라겐, 자체 조립되어, 교차 연결 전의 원섬유를 형성하는 응집된 콜라겐 분자 + 교차 연결된 콜라겐을 포함하여, 모든 콜라겐을 함유한다. 추가로, 바이오매트릭스 스캐폴드는 선택적으로 다른 매트릭스 성분 + 이들 콜라겐 또는 결합된 매트릭스 성분에 결합된 신호전달 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오매트릭스 스캐폴드 내의 콜라겐의 비율은, 바이오매트릭스 스캐폴드가 유래된 조직 내의 비율과 유사하거나, 동일하다. 본래의 조직을 모방하기 위해, 초기 콜라겐 및 응집된 교차 연결되지 않은 콜라겐의 적절한 백분율의 비 제한 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 적어도 약 또는 약 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 생물학적 조직의 대부분의 콜라겐-결합 매트릭스 성분 및 매트릭스 결합 성장 인자, 호르몬 및/또는 사이토카인은 천연 (예를 들어, 가공되지 않은) 생물학적 조직에 존재하는 콜라겐-결합 매트릭스 성분 및 매트릭스 결합 성장 인자, 호르몬 및/또는 사이토카인 중 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%를 보유하는 바이오매트릭스 스캐폴드를 지칭한다. 용어 "분말형" 또는 "분쇄형"은 본원에서, 분말로 분쇄된 바이오매트릭스 스캐폴드를 기재하기 위해 상호 혼용되어 사용된다. 용어 "3차원 바이오매트릭스 스캐폴드"는 그의 천연 3차원 구조를 유지하는 탈세포화된 스캐폴드를 지칭한다. 이러한 3차원 스캐폴드는 전체 스캐폴드 또는 그의 고정된 단면일 수 있다. 일부 목적을 위해, 스캐폴드는 저온 분쇄로 일컬어지는 과정으로서, 액체 질소 온도에서 분쇄될 수 있다.
예시적 콜라겐은 임의의 유형의 콜라겐 및 전 유형의 콜라겐, 예컨대 현재 I형 내지 XXIX형 콜라겐으로서 확인된 것, 이에 제한되는 것은 아니나, 따라서 또 다른 유형의 콜라겐의 추가 발견을 가능하게 하는 것을 포함한다. 바이오매트릭스 스캐폴드는 천연 생물학적 조직에 존재하는 하나 이상의 콜라겐 중 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 콜라겐은 교차 연결되어 있고/거나, 교차 연결되어 있지 않다. 바이오매트릭스 스캐폴드 내의 콜라겐의 양은 당 업계에 공지된 방법 및 본원에 기재된 바와 같은 방법, 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, 하이드록시프롤린 함량의 결정에 의해 결정할 수 있다. 콜라겐의 교차 연결된 특성이 존재하는지 또는 교차 연결되지 않은 특성이 존재하는지를 결정하는 예시적인 방법에는, 예를 들어 그의 용해 특성의 관찰에 따른 방법이 있다. 예를 들어, 문헌[D. R. Eyre,*　M. Weis, and　J. Wu. Advances in collagen cross-link analysis Methods, 2009; 45 (1): 65-74] (콜라겐의 화학적 성질 분야의 표준 방법에 의한 교차 연결 분석을 기재함)을 참조한다. 예를 들어, 콜라겐이 완충액 중에 1 M 이하의 염 농도로 용해되어 있는지를 기반으로 하여, 교차 연결되어 있는지를 결정할 수 있다.
예시적 콜라겐-결합 매트릭스 성분은, 이에 제한되는 것은 아니나, 부착 분자 (피브로넥틴 및 라미닌 계열); L- 및 P-셀렉틴; 헤파린-결합 성장-관련 분자 (HB-GAM); 트롬보스폰딘 I형 반복 (TSR); 아밀로이드 P (AP); 니도젠/엔탁틴; 엘라스틴; 비멘틴; 프로테오글리칸 (PG); 콘드로이틴 술페이트 PG (CS-PG); 데르마탄 술페이트-PG (DS-PG); 작은 류신을 다량 포함하는 프로테오글리칸 (SLRP) 계열의 구성원, 예컨대 비글리칸 및 데코린; 헤파린-PG (HP-PG); 헤파란 술페이트-PG (HS-PG), 예컨대 글리피칸, 신데칸 및 페르레칸; 및 글리코스아미노글리칸 (GAG), 예컨대 히알루론산, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라탄 술페이트 및 헤파린을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 니도젠/엔탁틴, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 글리코스아미노글리칸 (GAG), 다양한 매트릭스 성분에 결합된 성장 인자, 호르몬, 및 사이토카인 (임의의 조합)을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 이로 필수적으로 이루어진다. 바이오매트릭스 스캐폴드는 천연 생물학적 조직 내에 존재하는 하나 이상의 콜라겐-결합 매트릭스 성분, 호르몬 및/또는 사이토카인 중 적어도 약 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 이상을 포함할 수 있고/거나, 천연 생물학적 조직 내에 존재하는 것의 적어도 약 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100% 이상의 농도로 존재하는 이들 성분 중 하나 이상을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 조직 내에 존재하는 것으로 공지된 모든 또는 대부분의 콜라겐-결합 매트릭스 성분, 호르몬 및/또는 사이토카인을 포함한다. 다른 실시형태에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 천연 생물학적 조직 내에 존재하는 것에 근사한 농도 (예를 들어, 천연 조직 내에 존재하는 농도의 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%)의 하나 이상의 콜라겐-결합 매트릭스 성분, 호르몬 및/또는 사이토카인을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
예시적 매트릭스-결합 신호전달 분자는, 이에 제한되는 것은 아니나, 골 형태형성 단백질 (BMP), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 형질전환 성장 인자 (TGF), 신경 성장 인자 (NGF), 신경영양 인자, 백혈병 억제 인자 (LIF), 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 줄기세포 인자 (SCF), 콜로니 자극 인자 (CSF), GM-CSF, 적혈구생성소, 트롬보포이에틴, 헤파린 결합 성장 인자, IGF 결합 단백질, 태반 성장 인자, Wnt 신호물질을 포함한다.
예시적 사이토카인은, 이에 제한되는 것은 아니나, 인터루킨, 림포카인, 모노카인, 콜로니 자극 인자, 케모카인, 인터페론 및 종양 괴사 인자 (TNF)를 포함한다. 바이오매트릭스 스캐폴드는 천연 생물학적 조직 내에 존재하는 하나 이상의 매트릭스 결합된 성장 인자 및/또는 사이토카인 중 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 100% 이상 (임의의 조합)을 포함할 수 있고/거나, 천연 생물학적 조직 내에 존재하는 것의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 100% 이상의 농도로 존재하는 하나 이상의 이들 성장 인자 및/또는 사이토카인 (임의의 조합)을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 천연 조직 내에 존재하는 것으로 인식되고/거나, 조직에서 검출되는 많은 또는 대부분의 매트릭스 결합 성장 인자, 호르몬 및/또는 사이토카인의 생리학적 수준 또는 생리학적 수준에 근사한 수준을 포함하고, 다른 실시형태에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 천연 생물학적 조직 내에 존재하는 생리학적 농도에 근사한 농도 (예를 들어, 비교시 약 30%, 25%, 20%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 초과만큼의 차이가 존재함)의 하나 이상의 매트릭스 결합된 성장 인자, 호르몬 및/또는 사이토카인을 포함한다. 바이오매트릭스 스캐폴드에 존재하는 성장 인자 또는 사이토카인의 양 또는 농도는 당 업계에 공지되고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 다양한 방법, 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, 다양한 항체 분석 및 성장 인자 분석에 의해 결정할 수 있다.
바이오매트릭스 스캐폴드 및 그의 단리와 관련된 방법 및 조성물은, 예를 들어, 미국 특허 제 8,802.081호, 미국 특허 제 9,102,913호, 미국 특허 제 7,456,017호, 및 미국 가출원 제 62/335,013호에 논의되어 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 바이오매트릭스 스캐폴드는 , 이에 제한되는 것은 아니나, 바이오매트릭스 스캐폴드, 저온분쇄된 바이오매트릭스 스캐폴드, 또는 무손상 바이오매트릭스 스캐폴드의 고정된 단면을 포함하는 다양한 형태로 사용될 수 있다.
암 및 종양
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "암"은 신체의 임의의 일부분 또는 임의의 세포 유형으로부터 유래된 암을 지칭한다. 이는, 이에 제한되는 것은 아니나, 암종, 육종, 혈관종, 림프종, 백혈병, 생식계열 세포 종양, 및 아세포종을 포함한다. 일부 실시형태에서, 암은 체내의 특정 위치 또는 특정 질병과 관련된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "종양"은 양성 또는 악성의 임의의 유형의 종양 조직을 지칭한다. 암 요법 및/또는 화학요법제는 특정 종양의 치료에 사용될 수 있음이 잘 이해될 것이다.
일반적으로, 암은 조직의 질병이며, 조직/장기 내에서 세포 - 세포 관계에 영향을 미치는 유전적 및/또는 후생적 이상을 수반한다. 가장 흔한 것 중에는 후생동물, 조직으로 구성된 유기체, 세포의 조직된 공동체 내에서 기본적인 세포 - 세포 관계를 구성하는 상피 중간엽 세포 관계의 이상이 있다. 모든 정상 조직은 성숙 계통의 중간엽 세포와 연계된 성숙 계통의 상피 세포로 구성되며, 계통은 성숙 과정에서 서로 조율된다. 상피 - 중간엽 관계는 세포외 매트릭스 복합체 및 신호전달 분자의 역학적인 상승작용성 상호작용으로 이루어진 주변분비 신호전달에 의해 매개된다. 유전된 유전적 결함 또는 방사선 또는 환경 독소 (화학물질)에 의해 야기된 하나 이상의 세포 돌연변이는 중간엽 세포로부터의 상피 세포의 질적 또는 양적 독립을 초래할 수 있다. 암종은 상피 악성 종양이고; 육종은 중간엽 세포의 악성 종양이고; 혈관종은 내피세포 중 하나이며; 백혈병 및 림프종은 혈액 세포의 악성 종양을 나타낸다. 악성 세포는 임의의 연령의 기증자의 임의의 조직에서 발생할 수 있으며, 악성 종양이 처음 발생하는 부위인 원발 부위에서 분열을 유발할 수 있다. 악성 종양은 확산될 수 있으며, 즉, 체내의 다른 부위로 전이되어, 원거리 부위에서 분열을 유발할 수 있습니다. 일부 실시형태에서, 암은 체내의 특정 위치 또는 특정 질환과 관련된다.
세포의 악성 형질전환은 세포에서 하나 이상의 유전적 및/또는 후생적 변화를 수반하며, 특정 종양 유형에 특이적이다. 악성 종양 및 특히 전이 가능성의 공지된 유전적 및 후생적 변화에 대한 논의가 최근의 많은 리뷰에서 제공된다. 문헌[Turajlic S, Swanton C. Metastasis as an evolutionary process. Science. 2016 Apr 8; 352(6282):169-75. Review; Suva ML, Riggi N, Bernstein BE. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 2013 Mar 29; 339(6127):1567-70. Review; Vanharanta S, Massague J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 2013 Oct 14; 24(4):410-21. Review; Vogelstein B1, Papadopoulos N, Velculescu VE, Zhou S, Diaz LA Jr, Kinzler KW. Cancer genome landscapes. Science. 2013 Mar 29;339(6127):1546-58. Review; Marquardt JU, Factor VM, Thorgeirsson SS. Epigenetic regulation of cancer stem cells in liver cancer: current concepts 및 clinical implications. Journal of Hepatology. 2010 Sep; 53(3):568-77. Review]을 참조한다.
악성 형질전환을 유발하는 하나 이상의 유전적 또는 후생적 변화의 존재는 악성 세포와 인접 세포와의 상호작용의 변화를 야기할 수 있다. 악성 세포는 정상적으로 조직의 세포 공동체의 활동을 조율하는 주변분비 신호에 대한 의존성이 낮아질 수 있다. 최근 몇 년 동안, 일부 변화는 악성 세포로부터 돌출된 원형질막으로 코팅된 원형물질인 "엑소좀"을 수반하는 것으로 밝혀졌다. 엑소좀은 간질액, 혈액 및/또는 인접 세포의 미세환경으로 방출될 수 있다. 엑소좀은 악성 세포의 세포질 성분, 마이크로RNA 및 효소 활성의 일부를 함유하고, 인접 세포의 원형질막과 융합하여, 엑소좀의 내용물을 인접 세포로 전달할 수 있으며; 이 과정은 인접 세포의 생물학적 활성을 변화시킬 수 있다. 엑소좀은 또한 림프계 또는 혈류를 통해 원발 종양 부위로부터 원거리의 부위로 분배되고, 그 부위의 세포와 융합하여, 이러한 원거리 부위에서 세포의 생물학적 활성을 변화시킬 수 있다. 실제로, 인접 세포 또는 원거리 부위의 세포의 이러한 변형은 침윤 또는 전이에 있어 전편일 수 있다.
대부분의 악성 종양의 치명적인 양상은 그의 전이 능력이다. 종양이 원거리 부위로 확산되는 능력은 오랫동안, 세포가 진행하는 패턴을 나타내는 것으로 인식되어 있었다. 유방암 및 전립선암은 골, 간, 폐 및 뇌로 전이되고; 결장암은 간, 폐 및 복막으로 전이되며; 갑상선암은 간, 폐 및 골로 확산되는 등과 같다. 전이의 초기 단계에는 전이 병소와 조직의 제한된 세트를 수반하나, 암의 후기는 신체 전반으로의 확산을 수반한다.
전이 과정에 영향을 미치는 변수는 종양 세포에 의한 효소의 생성을 포함하고, 세포 외 매트릭스의 성분을 용해시켜, 종양 세포가 원거리 부위로 침윤되고, 분산될 수 있도록 하는 것이다. 효소의 목록은 상이한 범주의 종양에서 구별된다. 예를 들어, 육종은 종양 세포가 혈관으로 빠르게 확산되도록 함으로써, 혈종 (혈관) 경로에 의한 다른 부위로의 종양의 확산을 촉진하는 효소를 생성한다. 이와 달리, 암종은 통상적으로 종양 세포가 림프 채널로 확산될 수 있도록 하고, 후기에서만 혈관 채널로 확산되도록 하는 효소를 생성한다.
확산 또는 전이 경로 (예를 들어, 혈종 대 림프 경로)는 이차적으로 종양 세포가 다양한 조직으로 시딩되도록 한다. 심지어 종양 세포가 조직으로 확산되어, 조직에 부착된 것으로 나타나더라도, 반드시, 성장하여, 그 조직을 콜로니화시키는 것은 아니다. 암의 초기 및 중기에서, 종양은 특정의 원거리 부위에서만 성장하거나, 콜로니화시킬 것이다. 이와 달리, 암의 후기에, 종양 세포는 일반적으로 대부분의 조직에서 발견될 수 있으며, 그 조직에서의 종양 세포의 성장에 "장애"가 무엇이든지, 이를 극복할 수 있다.
전이의 장기 부위 특이성은 "종자 및 토양" 가설로서의 현상을 언급한 스테판 파제트 (Stephen Paget)에 의해 1889년에 기재되었다. 이에 의해, 파제트 박사는 "종자" (종양 세포) 및 "토양" (조직의 미세환경)에 변이가 있음을 의미하였다. 이사야 피들러 (Isaiah Fidler) 박사의 최근 리뷰 (문헌[The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer　2003; 3,　453-458])에 요약된 바와 같이, 백 년 초과의 기간 동안 조사 대상이 되어왔다.
소정의 종양에 의해 생성된 효소의 목록이 확산 경로 및 어느 정도는, 소정의 조직을 콜로니화하는 능력이 가변적인 것으로 인식되어 있으나, 효소의 목록은 전이의 장기-부위 특이성의 현상을 설명하기에 충분하지 않다. 본 출원인들은 또 다른 변수 세트가 세포 외 매트릭스의 조직 특이적 형태의 화학적 성질에 있음을 아래 실험으로 제시한다. 매트릭스의 화학적 성질은 각각의 조직마다 고유하며, 조직의 미세환경에서 생존하고, 성장할 수 있는 종양 세포의 능력을 결정한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 본 출원인들은 파제트가 "토양"과 결부시킨 변수 중 일부가 세포외 매트릭스로부터 기인하는 변수라고 가정한다. 질병의 초기 내지 중기에는, 매트릭스의 화학적 성질의 제어가 가장 중요할 수 있고, 종양 세포가 생존하고 성장할 수 있는지를 결정할 수 있고; 후기에는, 종양 세포가, 매트릭스 및 종양 세포 성장 내의 변수가 약화되거나, 제거되어, 종양 세포가 대부분의 조직에서 성장할 수 있도록 하는 다량의 (및 다수의) 효소를 생성한다.
암 요법 및 화학요법제
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "암 요법"은, 이에 제한되는 것은 아니나, 저온요법, 발열요법, 광역학 요법, 레이저 요법, 방사선 요법, 암-특이적 항체 요법, 화학요법, 적응 세포 이식, 사이토카인 요법, 면역요법, 백신 접종, 칼메트 게렝균 (Bacillus Calmette-Guerin) (BCG), CAR 세포 요법, 내분비 요법 (또한, 호르몬 요법으로 일컬어짐), 줄기세포 요법 (자가, 동종 또는 합성), 및 다른 유형의 표적화 또는 비 표적화 요법을 포함하는 암에 사용되는 임의의 공지된 치료 용법을 의도한다. 미국 국립암연구소의 웹사이트인 www.cancer.gov를 참조하며, 2016년 5월 6일에 최종 접속하였다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "화학요법제"는 암 치료에 유용한 요소, 예컨대 암 치료에 유용한 소분자 화합물을 지칭하고, 암 치료에 유용한 공지된 제제의 모든 투여 형태, 제형 및 연합을 포괄한다. 화학요법제의 비 제한 예는 안트라사이클린, 예컨대 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신 (daunorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 이다루비신 (idarubicin), 발루비신 (valrubicin), 또는 이들의 유도체; 항생제, 예컨대 악티노마이신-D (actinomycin-D), 블레오마이신 (bleomycin), 미토마이신-C (mitomycin-C), 또는 이들의 유도체; 알킬화제, 예컨대 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide), 메콜레타민 (mecholrethamine), 우라무스틴 (uramustine), 멜팔란 (melphalan), 클로람부실 (chlorambucil), 이포스파미드 (ifosfamide), 벤다무스틴 (bendamustine), 카르무스틴 (carmustine), 로무스틴 (lomustine), 스트렙토조신 (streptozocin), 부술판 (busulfan), 다카바진 (dacarbazine), 테모졸로미드 (temozolomide), 티오테파 (thiotepa), 알트레타민 (altretamine), 또는 이들의 유도체; 백금계 제제, 예컨대 시스플라틴 (cisplatin), 카보플라틴 (carboplatin), 네다플라틴 (nedaplatin), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 사트라플라틴 (satraplatin), 트리플라틴 (triplatin), 테트라니트레이트 (tetranitrate), 또는 이들의 유도체; 항-대사물질, 예컨대 5-플루오로우라실, 6-머캅토푸린, 카페시타빈 (capecitabine), 클라드리빈 (cladribine), 클로파라빈 (clofarabine), 시스타빈 (cystarbine), 플록수리딘 (floxuridine), 플루다라빈 (fludarabine), 젬시타빈 (gemcitabine), 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 페메트렉세드 (pemetrexed), 펜토스타틴 (pentostatin), 토구아닌 (thoguanin), 또는 이들의 유도체; 토포이소머라제 억제제, 예컨대 캄토테신 (camptothecin), 토포테칸 (topotecan), 이리노테칸 (irinotecan), 에토포시드 (etoposide), 테니포시드 (teniposide), 미톡산트론 (mitoxantrone), 또는 이들의 유도체; 유사분열 억제제, 예컨대 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel), 이자베필론 (izabepilone), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine), 비노렐빈 (vinorelbine), 에스트라무스틴 (estramustine), 또는 이들의 유도체를 포함한다.
세포 증식을 감소시키는 작용을 하는 제제와 같은 세포감소제는 당 업계에 공지되어 있으며, 광범위하게 사용된다. 암세포가 분열 중인 경우에만 암세포를 사멸시키는 제제는 "세포 주기 특이적"으로 일컬어지며, S기에 작용하는 제제 (예를 들어, 토포이소머라제 억제제 및 항-대사물질)를 포함한다.
토포이소머라제 억제제는 토포이소머라제 효소 (토포이소머라제 I 및 II)의 작용을 간섭하는 약제이다. 화학적 처리 과정 동안, 토포이소머라제 효소는 복제에 필요한 DNA의 구조의 조작을 제어하며, 따라서 세포 주기 특이적이다. 토포이소머라제 I 억제제의 예는 상기에 열거된 캄프토테칸 유사체, 이리노테칸 및 토포테칸을 포함한다. 토포이소머라제 II 억제제의 예는 암사크린 (amsacrine), 에토포사이드 (etoposide), 에토포사이드 포스페이트, 및 테니포사이드 (teniposide)를 포함한다.
항 대사물질은 통상적으로 정상적인 대사 기질의 유사체이며, 종종 염색체 복제와 관련된 과정을 간섭한다. 이들은 주기 내의 매우 특정한 단계에서 세포를 공격한다. 항 대사물질은 엽산 길항제, 예를 들어 메토트렉세이트; 피리미딘 길항제, 예를 들어 5-플루오로우라실, 폭스우리딘, 시타라빈, 카페시타빈 및 겜시타빈; 퓨린 길항제, 예를 들어, 6-머캅토퓨린 및 6-티오구아닌; 아데노신 데아미나제 억제제, 예를 들어 클라드리빈, 플루다라빈, 넬라라빈 및 펜토스타틴; 등을 포함한다.
식물 알칼로이드는 특정 유형의 식물로부터 유래된다. 빈카 알칼로이드 (vinca alkaloid)는 페리윙클 (periwinkle ) 식물 (카타란투스 로세아 (Catharanthus rosea))로부터 제조된다. 탁산 (taxane)은 태평양 주목 (주목과)의 수피로부터 제조된다. 빈카 알칼로이드 및 탁산은 또한 항 미세소관제로 알려져있다. 포도필로톡신은 매이 애플 식물로부터 유래된다. 캄프토테칸 유사체는 아시아의 "행운목" (캄프토테카 아쿠미나타 (Camptotheca acuminata))으로부터 유래된다. 포도필로톡신 및 캄프토테칸 유사체는 또한 토포이소머라제 억제제로 분류된다. 식물의 알칼로이드는 일반적으로 세포 주기 특이적이다.
이들 제제의 예는 빈카 알칼로이드, 예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 비노렐빈; 탁산, 예를 들어 파클리탁셀 및 도세탁셀; 포도필로톡신, 예를 들어 에토포사이드 및 테니소피드; 및 캄프토테칸 유사체, 예를 들어, 이리노테칸 및 토포테칸을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "내분비 요법"은 내분비 요법의 모든 방법, 즉, 호르몬을 첨가하거나, 차단하거나, 제거하는 치료를 지칭한다. 특정 질환 (예를 들어, 당뇨병 또는 갱년기)에서, 낮은 호르몬 수준을 조정하기 위해, 호르몬이 제공된다. 특정 질환에서, 특정 암 (예를 들어, 전립선암 및 유방암)의 성장을 지연시키거나, 중지시키기 위해, 합성 호르몬 또는 다른 약제가 체내의 천연 호르몬을 차단하기 위해 제공될 수 있다. NCI 암 용어 사전을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "면역요법"은 신체가 암, 감염 및 기타 질병과 싸울 수 있도록 면역 체계를 자극하거나, 억제하기 위한 물질을 사용하는 일정한 유형의 생물학적 요법을 지칭한다. 일부 유형의 면역요법은 면역 체계의 특정 세포만을 표적으로 한다. 다른 것들은 일반적인 방식으로 면역 체계에 영향을 미친다. 면역요법의 비 제한적 예는 사이토카인, 백신, 칼메트 게렝균 (BCG) 및 일부 단일클론 항체를 포함한다. NCI 암 용어 사전을 참조한다. 일부 실시형태에서, 면역요법은 수지상 세포 요법, 항체 의존 요법, T-세포 의존 요법, 또는 NK-세포 의존 요법일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "분자 요법"은 암 성장을 유도하는 고유의 분자 이상을 방해하여 암을 치료하도록 설계된 개인별 요법을 지칭한다. 약제 및/또는 분자 제제 -, 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니나, 억제성 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, 임의의 유형의 간섭 RNA, 잠금 핵산 (LNA), 등) - 는 특정 암의 발병, 성장 및 확산에 핵심적인 특정 생화학 경로를 간섭하도록 설계된 표적화된 요법에 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "방사선 요법"은 외부 빔 방사선 요법, 밀폐 공급원 제한 요법 및 전신 방사성 동위 원소 요법을 포함하는 모든 방사선 요법 방법을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 방사선은 종양 부위와 같은 표적 부위에 국소적으로 집중된다. 일부 실시형태에서, 방사선 요법은 전구 약물 접합체의 투여 전에 수행된다. 방사선 요법을 사용하는 임의의 실시형태에서, 방사선 요법은 감마 나이프 방사선, 사이버 나이프 방사선 및/또는 고강도 집속 초음파 방사선을 포함할 수 있다.
어구 "1차" 또는 "2차" 또는 "3차"는 환자가 받은 치료의 순서를 지칭한다. 1차 요법 용법은 첫 번째로 제공된 치료이며, 2차 또는 3차 요법은 각각 1차 요법 후 또는 2차 요법 후 제공된다. 미국 국립암연구소는 1차 요법을 "질병 또는 질환의 첫 번째 치료"로 정의한다. 암 환자의 경우, 최초 치료는 수술, 화학요법, 방사선 요법 또는 이들 요법의 조합이 될 수 있다. 1차 요법은 당업자에게 "최초 요법 및 최초 치료"라고도 지칭된다. 미국 국립암연구소의 웹사이트인 www.cancer.gov를 참조하며, 2016년 5월 6일에 최종 접속하였다. 통상적으로, 환자에게 후속 화학요법 용법이 제공되는 이유는, 환자가 1차 요법에 대해 긍정적인 임상적 또는 비 임상적 반응을 나타내지 않았거나, 1차 요법이 중단되었기 때문이다.
약어
다음의 약어는 본 개시내용 전반에 걸쳐 제시된다.
다음은 본원에서 사용된 약어의 비 제한적인 목록이며, 성장 인자 및 사이토카인에 대해 사용된 약어와는 무관하다: 머리글자가 인자를 나타내고, 이탤릭체로 제공된 경우, 이는 유전자를 지칭하며; 정규 글꼴인 경우, 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 나타낸다. 머리글자가 세포 집합에 대한 것인 경우, 세포가 유래된 종류는 머리글자 앞에 소문자로 표시된다. 예를 들어, m=쥣과동물 (마우스); r=랫트; h=인간.
BMS, 바이오매트릭스 스캐폴드, 세포외 매트릭스에 다량 존재하는 조직-특이적 추출물; Caco-2, 상피 결장직장-선암세포주가 조겐 포그 (Jorgen Fogh) 박사 (슬로안 케터링 암 연구소, NYC, NY)에 의해 수립되었으며 - 이는 개별 조건 하에서 배양 조건에 따라, 소장 유사 세포 대 대장 (결장) 세포로 계통발생이 제한되도록 하는 장내 줄기세포 특성을 가짐; CD, 공통 결정인자; CD34, 조혈 줄기/전구세포 항원; CD45, 대부분의 조혈모세포 하위집합에서 발견되는 공통 백혈구 항원; CRC, 결장직장암; CYP, 시토크롬 P450 모노-옥시게나제, 콜레스테롤, 스테로이드 및 지질의 약제 대사 및/또는 합성과 관련된 다수의 반응을 촉매함; CK, 시토케라틴; CK7, 담즙 세포와 관련된 시토케라틴; CK8 및 CK18, 모든 상피와 관련된 시토케라틴; EpCAM, 상피 세포 부착 분자; FBS, 소 태아 혈청; GAG, 글리코스아미노글리칸, 대부분이 신호 형질도입 과정에서 단백질과 협력하여 다양한 역할을 담당하는 특정 황화 패턴을 가지는 이량체 (우론산 및 아미노당)의 중합체인 탄수화물 사슬임; HDL, 고밀도 지단백질; HDM, 특정 세포 유형의 유지 또는 분화에 사용되는 규정 호르몬의 무혈청 배지; H&E, 헤마톡실린 및 에오신; HT-29, 일부 조건하에서는 미분화 세포로서 거동하나, 분화 조건하에서는, 막 항원의 재분포 및 꼭대기 솔가장자리 막의 발생을 특징으로 하는 극성 형태의 세포를 생성시키는 결장직장 선암세포주; KM, 쿠보타 배지, 또한 줄기세포, 예컨대 간모세포 또는 수임 전구세포의 성숙한 딸 세포에 사용될 수 있는 일부 변형을 가지고, 내피 줄기세포를 위해 설계된 무혈청 배지; LGR5, 류신-풍부 반복-함유 G-단백질 연동된 수용체 5, 장, 간 및 이자에서 중요한 줄기세포 마커; MMP, 매트릭스 메탈로프로테나제 (또는, 펩티다제); MMP2, 매트릭스 메탈로프로테나제-2, 72 kDa 유형 IV 콜라게나제 또는 젤라티나제 A (GELA); MMP9, 매트릭스 메탈로펩티다제 9, 또한 92 kDa IV형 콜라게나제 또는 젤라티나제 B (GELB)로 일컬어지며, 세포외 매트릭스의 분해에 관여하는 아연-메탈로프로테나제 계열의 효소 클래스인 매트릭스인 (matrixin); PAS, 과요오드산-쉬프 (Periodic acid-Schiff); SDC, 소듐 데옥시콜레이트; SEM, 주사전자현미경; SW480, 전이 병소 (질병: 듀크 B형 (Duke's Type B)로부터 유래된 인간 결장직장 선암세포주; TEM, 투과 전자 현미경.
신호물질 (성장 인자, 호르몬, 사이토카인)의 약어
골 형태형성 단백질인 BMP는 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-베타) 상과 계열에 속하는 다기능성 성장 인자; bFGF, 기본 섬유아세포 성장 인자; EGF, 표피 성장 인자; EGFR, 표피 성장 인자 수용체; FGFs, 섬유아세포 성장 인자 (예를 들어, FGF-4, FGF-6, FGF-7) ; FGF-4, 섬유아세포 성장 인자-4; FGF-6, 섬유아세포 성장 인자-6; FGF-7, 섬유아세포 성장 인자-7; GCSF, 과립구-콜로니 자극 인자; GDNF, 아교세포-유래 신경영양 인자; GM-CSF, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자; hGH, 인간 성장 호르몬; HGF, 간세포 성장 인자; HB-EGF, 헤파린-결합 표피 성장 인자; IGFBP-1, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 1; IGFBP-3, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3; IGFBP-4, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 4; IGFBP-6, 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 6; IGF-I, 인슐린-유사 성장 인자-I; IGF-1 SR, 인슐린-유사 성장 인자-I 수용체; IGF-II, 인슐린-유사 성장 인자-II; IL, 인터루킨 (예를 들어, IL-6, IL-11); M-CSF, 대식세포-콜로니 자극 인자; M-CSF R, 대식세포-콜로니 자극 인자 수용체; NT-3, 뉴로트로핀-3; NT-4, 뉴로트로핀-4; PDGF R a, 혈소판-유래 성장 인자 수용체 알파; PDGF R b, 혈소판-유래 성장 인자 수용체 베타; PDGF-AA, 혈소판-유래 성장 인자 AA; PDGF-AB, 혈소판-유래 성장 인자 AB; PDGF-BB, 혈소판-유래 성장 인자 BB; PIGF, 포스파티딜이노시톨 글리칸 앵커 생합성 클래스 F; SCF, 기질 세포-유래 인자-1; SCF R, 기질 세포-유래 인자 수용체; TGF-α, 형질전환 성장 인자 알파; TGF-β, 형질전환 성장 인자 베타; TGF-β2, 형질전환 성장 인자 베타 2; TGF-β3, 형질전환 성장 인자 베타 3; VEGF, 혈관 내피 성장 인자; VEGF R2, 혈관 내피 성장 인자 수용체 2; VEGF R3, 혈관 내피 성장 인자 수용체 3; VEGF-D, 혈관 내피 성장 인자 수용체 D이다.
본 개시내용의 수행 방법
본 발명의 양상은 암 또는 종양의 진단 및/또는 특성화와 관련된 방법, 키트 및 조성물에 관한 것이다. 본원의 암 또는 종양과 관련하여 기재된 임의의 실시형태에서, 암 또는 종양은 악성일 수 있다. 특정 실시형태에서, 암 또는 종양은 특정 조직으로 전이할 수 있는 가능성 및/또는 본원의 하기에 기재된 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제에 반응하는 하나 이상의 이러한 전이의 반응성을 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법 실시형태는 종양 또는 암으로부터의 세포를 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드에 시딩하는 단계를 포함한다.
이들 방법 실시형태 중 일부에서, 세포는 (1) 암 또는 종양으로 진단된 환자로부터 채취된 종양 생검 또는 샘플의 세포 또는 (2) 환자와 동일한 암 또는 종양 유형의 세포주로부터의 세포 유래의 것일 수 있다. 이들 방법 실시형태 중 일부에서, 세포를 성장 세포의 콜로니를 형성하는 그의 능력에 대해 분석한다. 일부 실시형태에서, 콜로니는 바이오매트릭스 스캐폴드의 기층에 존재한다. 이들 방법 실시형태 중 일부에서, 세포는 콜로니를 형성한다. 이들 방법 실시형태 중 일부에서, 세포를 3차원 콜로니가 되는 그의 능력에 대해 분석한다. 이들 방법 실시형태 중 일부에서, 세포는 3차원 콜로니를 형성한다. 이들 방법 실시형태 중 일부에서, 세포를 유전자를 발현하거나, 단백질 또는 다른 인자를 분비하는 그의 능력에 대해 분석한다. 이들 유전자의 비 제한 예는 전능성 유전자 (예를 들어, OCT4, SOX2, KLF4, KLF5, SALL4, NANOG, BMi-1), 줄기세포 유전자 (예를 들어, EpCAM, LGR5/LGR6, CXCR4, 히알루론산 수용체를 인코딩하는 유전자의 CD44 계열의 다수의 변이체 중 하나 이상의 것, 다약제 내성 유전자 (예를 들어, mdr 유전자 계열, p-당단백질), 세포외 매트릭스 성분을 용해하는 효소 (예를 들어, 히알루로니다제, 콜라게나제, 엘라스타제, 매트릭스 분해 메탈로프로테나제)를 인코딩하는 유전자를 포함하고; 이들 단백질의 비 제한 예는 상기에 언급된 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 (예를 들어, CD44, p-당단백질, 매트릭스 분해 효소)을 포함하고; 이러한 분석에 적절한 다른 인자의 비 제한 예는 엑소좀 생성, 마이크로RNA, 중간엽 지지체로부터의 주변분비 신호전달의 정성적 또는 정량적 독립성을 포함한다. 이들 방법 실시형태 중 일부 실시형태에서, 세포가 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드에 시딩되고, 이에 부착된 경우, 이러한 분석이 이루어질 수 있다. 이들 방법 실시형태 중 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드의 조직 특이적 형태의 기층에 부착될 수 있다.
이들 방법 실시형태 중 일부에서, 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드는 각각 하나 이상의 소정의 인체 장기로부터 유래된다. 추가의 실시형태에서, 소정의 장기는, 예를 들어, 암 또는 종양 유형의 전이와 관련된 것으로 인식되어 있는 장기를 포함하거나, 암 또는 종양이 존재하는 장기를 포함하도록 하기 위해, 환자의 암 또는 종양을 기반으로 선택된다. 모든 방법 실시형태에서, 각각의 바이오매트릭스 스캐폴드는 이것이 유래된 조직의 생물학적 패싯을 재현한다.
시딩 방법은 암 또는 종양으로 진단된 환자에서 종양이 전이될 가능성을 결정하기 위해, 선택적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양 또는 암세포가 바이오매트릭스 스캐폴드에 성장 세포의 콜로니를 형성한 경우, 장기로의 전이가 예측될 수 있다. 예측된 전이는 상기 스캐폴드가 유래된 장기에 위치한 것으로 추가로 결정될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 생체내에서 세포가 각각 그로부터 유래된 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드에 성장 세포의 콜로니를 형성한 경우, 하나 이상의 소정의 장기로의 전이가 예측된다.
또한, 암 또는 종양으로 진단된 환자에서 적절한 종양 치료를 결정하기 위해, 시딩 방법이 사용될 수 있다. 이는 종양이 전이될 가능성의 결정과 함께 또는 그와 독립적으로 수행될 수 있다.
상기에 개시된 방법 실시형태 중 임의의 것은 그의 조직학, 엑소좀 생성, 마이크로RNA 생성, 중간엽 세포와의 상호작용, 및/또는 유전자 발현 프로파일을 기반으로 하여 콜로니를 특성화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기에 개시된 방법 실시형태 중 임의의 것은 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제에 대한 반응성에 대해 콜로니를 스크리닝하는 단계 또는 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제로 콜로니를 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 암 요법 및/또는 화학요법제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 방사선 요법, 면역요법, 내분비 요법, 분자 요법, 및/또는 안트라사이클린, 알킬화제, 백금계 제제, 항-대사물질, 토포이소머라제 억제제, 또는 유사분열 억제제의 1회 이상의 투여를 포함한다. 이러한 암 요법 및/또는 화학요법제는 선택적으로 환자의 암 또는 종양 유형을 기반으로 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 생체내에서 장기에서 하나 이상의 요법 및/또는 제제에 대한 암 또는 종양의 반응성은 장기의 바이오매트릭스 스캐폴드에 시딩된 경우, 하나 이상의 요법 또는 제제에 대한 상기 암 또는 종양 세포의 반응성과 관련될 수 있다.
본 개시내용의 양상은 또한 각각 하나 이상의 소정의 인체 장기로부터 유래된 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드 및 본 명세서의 상기에 개시된 방법 중 하나 이상을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 추가의 실시형태는 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제; 암 또는 종양으로 진단된 환자로부터 채취된 종양 생검 또는 샘플의 세포를 획득하기 위한 툴 또는 설명서; 특정 암 또는 종양 유형으로부터의 세포주로부터의 세포; 및/또는 상기에 개시된 방법을 수행하는데 필요한 임의의 시약, 배지 또는 다른 성분을 추가로 포함하는 키트를 고려한다.
본 개시내용의 추가의 양상은 본 명세서의 상기에 개시된 시딩 방법에 의해 생성된 하나 이상의 소정의 인체 장기에 특이적인 인공 종양 또는 전이 모델을 고려한다.
실시예
하기 실시예는 효과를 발휘하도록 본 개시내용을 실시하는 다양한 경우에 사용될 수 있는 비 제한적이고 예시적인 절차이다. 추가로, 본원에 개시된 모든 참조문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
실시예 1 - 바이오매트릭스 스캐폴드의 생성 및 특성화
모든 동물 실험은 노스캐롤라이나 대학의 실험동물 운영위원회에서 제시한 가이드라인을 따랐다.
조직공학 분야의 돌파구는 조직 탈세포화 방법에 의해 제조된 세포외 매트릭스 추출물, 특히 관류 프로토콜에 의해 수행된 것의 사용이었다. 탈세포화 프로토콜은 장기 또는 조직에서 세포를 화학적으로 제거하여, 화학적 조성이 생체내와 유사한 세포외 매트릭스 추출물만 남기는 것이다. 중요한 점은, 탈세포화는 세포외 매트릭스의 복합 조성 및 정상 장기에서 발견되는 그의 해부학적 특징까지 보존하며, 이는 합성 기법을 사용하여 재현하는 것이 거의 불가능하다. 본 출원인들은 탈세포화된 조직으로부터의 매트릭스 추출물이 암 "전이"를 조작하기 위한 조직 특이적인 시험관내 배양 플랫폼을 제조하는데 사용될 수 있다고 가정하였다 (도 1a). 이전의 연구들이 다양한 방법을 성공적으로 사용하여, 조직을 탈세포화하고, 간 및 폐를 포함한 복합 장기를 조작하였으나, 이러한 방법을 사용했을 때 세포 신호전달 분자가 어느 정도까지 보존되는지는 크게 알려지지 않았다7. 한 가지 예외가 있다면, "바이오매트릭스 스캐폴드"를 제조하는 프로토콜은 간 조직 내에 존재하는 모든 공지된 신호전달 분자의 생리적 수준을 유지시키는 것으로 나타났다는 것이다12. 그러나, 이러한 바이오매트릭스 스캐폴드에서 보존된 신호전달 분자들의 세트가 조직 특이적인지는 알려지지 않았다. 본 출원인들은 조직 매트릭스 성분의 98% 초과를 유지하고, 매트릭스 결합 성장 인자 및 사이토카인의 생리학적 수준을 보존하는 바이오매트릭스 스캐폴드 (BMS)의 제조를 위한 프로토콜을 이용하였다. 개념 증명으로서, 본 출원인들은 이러한 배양 플랫폼을 사용하여, 전이성 CRC 세포를 연구하였다. 간 및 폐가 CRC 환자에서 가장 흔한 전이 부위인 점을 감안하여, 본 출원인들은 시험관내에서 간 및 폐 전이를 조작하는 것을 목표로 하였다.
간 및 폐의 관류-기반 탈세포화에 의해 제조된 바이오매트릭스 스캐폴드
이전에 확립된 프로토콜을 사용하여 Prague-Hawley 랫트 (수컷, 250 내지 300g)를 사용하여, 간 및 폐의 바이오매트릭스 스캐폴드를 생성하였다. 탈세포화 시약의 관류를 위해, 간문맥 (간 BMS) 또는 하대 정맥 (폐 BMS)에 캐뉼러를 삽입함으로써, 바이오매트릭스 스캐폴드 (BMS)를 제조하였다. 혈액이 제거될 때까지 혈관계통을 기초 배지(예를 들어, 무혈청 DEEM/F12))로 관류한 후, 36 단위/L 포스폴리파제를 함유하는 1% 소듐 데옥시콜레이트 (SDC) 250 mL로 관류하였다. 그런 다음, 장기를 무혈청 기초 배지로 세정하고, 광학 밀도 (OD 280)에 의해 평가되는 바와 같이, 관류액의 단백질이 음성일 때까지, 3.5 M NaCl (제조된 기초 배지)로 관류하였다. 마지막으로, BMS 샘플을 기초 배지로 세정하고, 즉시 동결시켰다. 동결된 BBMS 샘플을 냉동 제분기(Spex Sample Prep6770, Metuchen, NJ)를 이용하여 고운 분말로 분쇄하였다. 처리된 BMS 분말은 -80°C에 보관하였다.
바이오매트릭스 스캐폴드 분말로 코팅된 조직 배양 플레이트의 제조
BMS 샘플을 4 M 구아니딘 HCL, 50 mM 아세트산나트륨 (pH 5.8) 및 프로테나제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유하는 25 mM EDTA로 구성된 용액에 용해시켰다. 그 후, BCA 분석을 수행하여, 전체 단백질 농도를 결정하였다. BMS 샘플을 함유하는 배지 (DMEM/F12)를 조직 배양 플레이트 또는 Nunc Thermanox 커버슬립 (Thermofisher Scientific, Waltham, MA)에 첨가하고, 밤새 건조하였다. 100 Gy의 외부 빔 조사 (Precision X-Ray, Inc, North Branford, CT)를 사용하여 플레이트를 멸균시켰다.
성장 인자 항체 어레이
조직 (폐, 간) 및 이 조직으로부터의 BMS 샘플을 그 처리 장소인 RayBiotech (Norcross, GA)에 전송하여, 성장 인자 어레이 분석에 배치시켰다. 구체적으로, 성장 인자 및 사이토카인의 상대적인 수준을 RayBio 인간 성장 인자 항체 어레이 G-시리즈 1 (카탈로그 번호 AAH-GF-G1-8)에 의해 정량화하였다. 데이터를 정규화된 신호 강도로 표시하였다.
질량 분광 분석
폐 BMS (n=4) 및 간 BMS (n=4)를 분쇄하고, 전술한 바와 같이, 단백질을 추출하여, 정제하였다22. 각 샘플 (50 μg)을 5 mM DTT로 환원시키고, 15 mM 요오드아세트아미드로 알킬화시키고, 37℃에서 밤새 트립신 (Promega, Madison, WI)으로 분해하였다. C18 회전 칼럼(Pierce)을 사용하여, 펩타이드 샘플을 탈염시켰다. 펩타이드 샘플 (1 μg)을 QExactive HF 질량 분광분석기 (Thermo Scientific, Waltham, MA)에 연동된 Easy nLC 1000을 사용하여 LC/MS/MS로 분석하고, 2시간 동안의 방법을 통해 분리하였다. 분리 구배는 250 nl/분 유속의 5 내지 32% 이동상 B로 구성하였고, 이동상 A는 0.1% 포름산 수용액이었으며, 이동상 B 는 ACN W중 0.1% 포름산으로 구성하였다. QExactive HF를 데이터 의존적 방식을 작동시켜, 최대 강도의 15개의 전구체를 후속 단편화를 위해 선택하였다. 3 Х 106 이온을 표적 값으로 하여, 전구체 스캔 (m/z 400 내지 1600)의 해상도를 120,000으로 설정하였다. 5 Х 104 이온을 표적 값으로 하여, MS/MS 스캔 해상도를 15,000으로 설정하였다. HCD의 정규화된 충돌 에너지를 27%로 설정하였다. 펩타이드 매치를 요망되는 바대로 설정하고, 미지의 전하 또는 1 및 7 이상의 전하 상태를 갖는 전구체를 제외하였다.
원 데이터 파일을 MaxQuant 버전 1.5.3.17을 사용하여 처리하고, MaxQuant 내에서 Andromeda를 사용하여 Uniprot 랫트 데이터베이스 (2016년 12월 다운로드함, 29,795개의 대상물 함유)에서 검색하였다. 효소 특이성을 트립신으로 설정하였고, 최대 2개의 누락 절단 부위까지 허용하였으며, Cys의 카바미도메틸화를 고정 변형으로 설정하였고, Met의 산화를 가변 변형으로 설정하였다. 1% 오 검출율 (FDR)을 사용하여, 모든 데이터를 필터링하였다. 레이저 + 고유 펩타이드를 사용한 무표지 정량화 및 구동 간 매치 (1분 간격)가 이루어지도록 하였다. 정량화에는 단백질당 최소 3개의 고유 펩타이드가 필요하였다. 누락 값이 60%를 초과하는 단백질은 제거하였다. 통계 분석은 ANOVA를 사용하여 Perseus 버전 1.5.6.0에서 수행하였으며, P<0.05를 유의한 것으로 상정하였다. 유의한 단백질의 LFQ 강도로 정규화된 z 스코어를 사용한 계층 군집분석을 수행하였다.
세포 배양
인간 결장/직장 암세포 주 (HT-29, Caco2 및 SW480)는 UNC의 조직 배양 기관으로부터 입수하였다. 루시퍼라제 발현 세포주 HT-29-luc2는 Caliper Life Sciences (Hopkinton, MA)로부터 구입하였다. 짧은 탠덤 반복을 사용하여 세포주를 검증하고, 마이코플라스마 오염을 시험하였다. HT-29, HT-29-luc2, 및 SW480 세포를 10% 소 태아 혈청 (Gibco) 및 페니실린/스트렙토마이신 (Mediatech, Manassas, VA)이 보충된 DMEM/F12 (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양하였다. Caco2 세포를 20% 소 태아 혈청 (Gibco) 및 페니실린/스트렙토마이신 (Mediatech)이 보충된 DMEM/F12 (Gibco)에서 배양하였다. 세포를 정상 조직 배양 플레이트 또는 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 및 폐 BMS 가 코팅된 조직 배양 플레이트 (100 μg/cm2)에서 계대배양하였다.
세포 시딩 효율
CRC 세포를 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 및 폐 BMS가 코팅된 플레이트 (100 ug/cm2)에 시딩하였다. 24시간 후, 배양물을 PBS로 세척하고, 500μL DNA 용해 용액에 용해시켰다. DNA 농도를 Qubit dsDNA BR 분석 키트를 사용하여 평가하였다.
세포 성장 속도
CRC 세포를 6 웰 플레이트 중 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 또는 폐 BMS에서 성장한 CRC 세포를 (100 ug/cm2)에서 성장시켰다. 세포를 시딩 후 다양한 시점에서 수집하고, DNA 용해 용액에 배치하였다. DNA 농도를 Qubit dsDNA BR 분석 키트 사용하여 평가하였다. 시간 경과에 따른 성장 속도를 시딩 효율을 기반으로 정규화하였다.
시험 관내에서의 증식 및 세포 사멸 평가
증식 분석을 위해, 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 또는 폐 BMS에서 성장한 CRC 세포 (100 μg/cm2)를 10μM 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (EdU)과 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 PBS로 세척하고, TrypLE를 사용하여 단일 세포로 가공하고, Click-iT Plus EdU 분석을 사용하여 제조사의 지침에 따라 유동 세포계측 키트(카탈로그 번호 C10646)용 EdU를 염색하였다. 그런 다음, 세포를 10% FBS가 함유 된 PBS로 3회 세척하고 유동 세포계측 분석에 배치하였다.
세포 사멸 분석을 위해, 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 또는 폐 BMS에서 성장한 CRC 세포 (100 μg/cm2)를 수집하여, 단일 세포로 가공하고, 실온에서 10분간 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. 세포 현탁액을 밤새 Dako 블록 (cat)에서 차단시켰다. 이어서, 세포를 1차 접합된 절단 카스파제 3 (1:100)으로 실온에서 2시간 동안 염색하였다. 10% FBS를 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 유동 세포 계측 분석에 배치하였다. 모든 유동 세포 계측 분석은 Beckman Coulter CyAn ADP를 사용하여 수행하였으며, 소프트웨어 Summit 5.2를 사용하여 분석하였다.
아노이키스 분석
플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS 또는 폐 BMS에서 성장한 CRC 세포를 Anchorage Resistance 플레이트 (Cell Biolabs) 또는 대조군 96 웰 세포 배양 플레이트에 1 x 104 /웰로 시딩하였다. 세포를 48시간 동안 배양하였다. 살아있는 세포를 Calcein AM으로 검출하고, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 형광을 판독하였다.
침윤 분석
무혈청 배지 중 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 또는 폐 BMS에서 성장한 CRC 세포를 마트리겔 (Corning)으로 코팅된 삽입물의 상부 챔버에 배치하였다. 하부 챔버에는 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM/F12가 함유되었다. 16시간 배양 후, 비침윤 세포를 면봉으로 제거하고, 막의 하부 표면상의 세포를 100% 메탄올로 고정하고, 1% 톨루이딘 블루로 염색하였다. 역상 현미경을 사용하여 5곳의 세포를 계수하였다.
주사 전자 현미경(SEM)
커버 슬립을 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS 또는 폐 BMS로 코팅하였다. 이들 기층에서 성장한 배양물을 4℃에서 3% 글루타르알데하이드를 함유한 0.15 M 인산나트륨 완충액 (pH 7.4) 용액 중에 밤새 고정시켰다. 샘플을 PBS로 3회 세정한 후, 점진적으로 농축된 에탄올 용액 (30%, 50%, 75% 내지 100%)에 각각 10분씩 연속 인큐베이션을 사용하여 탈수시켰다. 커버 슬립을 Samdri-795 임계점 건조기로 옮기고, 전이 용매로서 CO2를 사용하여 건조하였다 (Tousimis Research Corporation, Rockville, MD). 커버 슬립을 양면 탄소 부착 탭이 있는 13 mm 알루미늄 평판에 장착하고, 10nm의 금 팔라듐 합금( 60Au : 40Pd, Hummer X Sputter Coater, Anatech USA, Union City, CA)으로 스퍼터 (sputter)-코팅하였다. 5 mm의 작동 거리 및 10 um 조리개를 사용하고, 5 kV에서 작동하는 Zeiss Supra 25 FESEM (Carl Zeiss Microscopy, Pleasanton, CA)를 사용하여, 이미지를 획득하였다.
투과 전자 현미경 (TEM)
세포 콜로니를 3% 글루타르알데하이드를 함유하는 0.15 M 인산나트륨 완충액 (pH 7.4) 용액에, 실온에서 1시간 동안 고정시켰다. 그런 다음, 샘플을 PBS로 세정하고, 1% 사산화오스뮴/1.25% 페로시안화칼륨/0.15 M PBS로 1시간 동안 후-고정시켰다. 후-고정 후, 샘플을 탈 이온수로 세정하고, 점진적으로 농축된 에탄올 용액 (30%, 50%, 75% 내지 100%)에 10분씩 연속 인큐베이션을 사용하여 탈수하였다 (30%, 50%, 75% 내지 100%). 이어서, 샘플을 산화프로필렌/Polybed812 에폭시 수지 (Polysciences, Inc., Warrington, PA)의 1:1 혼합물에 밤새 인큐베이션한 후, 24시간 동안 100% 수지에 인큐베이션하였다. 그 후, 샘플을 새로운 Polybed 812 에폭시 수지에 배치하고, 다이아몬드 나이프 및 Leica Ultracut UCT 마이크로톰 (Leica Microsystems)을 사용하여, 70 nm로 횡단 절편화하였다. 절편들을 구리 망 격자판 위에 올려놓고, 4% 수성 아세트산우라닐 및 레이놀즈 시트르산납으로 염색하였다. 격자판을 LEO EM910 투과 전자 현미경 (Carl Zeiss SMT, LLC)을 사용하여, 80 kV에서 관찰하였다. DigitalMicrograph 3.11.0 소프트웨어 (Pleasanton, CA)에 의한 Gatan Orius SC 1000 CCD 카메라를 이용하여 이미지를 획득하였다.
조직학
세포 콜로니를 4% 파라포름알데하이드에서, 실온에서 1시간 동안 고정시키고, 파라핀 포메하고, 4 μm 절편으로 절단하였다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다.
비장 내 주사
무흉선 Nu/Nu 마우스 (수컷, 8 내지 10주령)를 UNC에서 동물 콜로니로부터 얻었다. 마우스를 케타민 (100 mg/kg) 및 덱스도미토르 (dexdomitor) (1 mg/kg)의 복강내 주사로 마취시켰다. 복부 좌측을 절개하여, 비장을 노출시켰다. 그 후, 마우스당 50 ul PBS 현탁액 중 5 x 106 HT-29 또는 HT-29-luc2 세포를 비장내 주사하였다. 모든 동물 실험은 UNC 실험동물 운영 위원회의 승인을 받았다.
유전자 발현 마이크로어레이
제조사의 지침에 따라, RNeasy Mini 키트 (Qiagen)를 사용하여, 플라스틱, 마트리겔, 및 간 BMS에서 성장한 HT-29 세포로부터 모든 RNA를 추출하였다. 또한 , RNA를 HT-29 세포의 비장내 주사 후 생성된 간 전이로부터 단리하였다. 각 조건하에 성장한 세포의 4회 생물학적 복제물을 사용하였다. RNA 특질을 Agilent Bioanalyzer 2100에 의해 평가하였다. RNA 샘플을 노스캐놀라이나 대학 채플힐 캠퍼스의 라인버거 종합 암 센터 게노믹 코어에 전송하였다. Agilent SurePrint G3 Unrestricted Gene Expression 8x60K 마이크로어레이 (인간 G4858A)를 사용하여 샘플을 분석하였다. 혼성화 전에, cDNA는 Cy3-CTP로 표지하였다.
마이크로어레이 데이터 분석을 GeneSpring 12.6 GX 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 원 신호 값을 사분위수로 정규화하였고, 프로브 세트를 신호기 값을 기반으로 하여, 필터링하였다. 정규화된 강도 값에 대해, 유클리드 거리를 활용한 계층 군집분석을 수행하여, 대상물 및 샘플 둘 모두를 분류하였다. 상이하게 발현된 유전자를 통계적 (일원 ANOVA p<0.05) 및 변화 배수 (>=4) 임계값을 기반으로 하여 선택하였다. 그 후, 조작된 간 전이 및 생체내 전이 둘 모두에서 상향조절된 유전자를 유전자 온톨로지를 기반으로 분석하였다. 데이터는 Gene Expression Omnibus 데이터베이스에 데이터를 전송하였다 (수탁 번호 GSE76180).
실시간 PCR
RNeasy 미니 키트 (QIAGEN, Valencia, CA)를 사용하여 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 및 간 BMS에서 성장한 CRC 세포로부터 모든 RNA를 단리하였다. Quantitek cDNA 합성 키트 (QIAGEN)를 사용하여 모든 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. 정규화군으로 β-액틴을 사용한 2-△△Ct 방법에 의해, Timp1 전사체의 정량화를 수행하였다. Timp1 유전자 발현에 사용된 프라이머의 서열은 다음과 같다: 정방향 프라이머 5'-AGACCTACACTGTTGGCTGTGAG-3'; 역방향 프라이머 5'-GACTGGAAGCCCTTTTCAGAG-3'.
약제 반응 분석
CRC 세포를 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS 및 폐 BMS 가 코팅된 96 웰 플레이트 (100 μg/cm2) 중에 2 x 104 세포/웰로 시딩하였다. 시딩 1일 후, 세포를 화학요법으로 24시간 동안 처리하였다. 이어서, 화학요법을 제거하고, 표준 배양 배지에서 세포를 그 다음 24시간 동안 배양 유지하였다. 세포 생존율을 CellTiter 96® Aqueous One Solution 세포 증식 분석 키트 (Promega, Madison, WI)를 사용한 MTS [(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨)] 세포 증식 분석에 의해 결정하였다. 각 배양 조건에 대한 치료 반응을 미처리 배양물에 대해 정규화하였다.
클론형성 분석
각 세포주의 플레이팅 효율 (PE)을 결정하였다. 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 및 폐 BMS에서 성장한 세포를 0, 2, 4, 6 및 8 Gy로 조사하였다. 조사 후, 세포를 25 mL 플라스크에 100 내지 250,000 범위의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 14일 동안 인큐베이션하고, 고정시킨 후, 4% 포름알데하이드, 80% 메탄올 및 0.25% 크리스탈 바이올렛으로 구성된 용액으로 염색하였다. 30개 이상의 세포를 함유하는 콜로니만을 계수하였다. 생존율 (SF)을 식: (형성된 콜로니 수)/(플레이팅된 세포 수) (플레이팅 효율)을 사용하여 계산하였다. SF를 로그 척도의 조사량에 대해 도식화하였다. R 패키지 "CFAssay"를 사용하여 선형 2차 식 SF=e^(-αD-βD2)를 사용하여, 생존 곡선을 생성하였다.
생체내 전의 가능성 평가
플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 또는 폐 BMS에서 성장한 HT-29-luc2 세포를 트립신 처리하고, 수집하여, 단일 세포 현탁액으로 처리하였다. 저산소 세포 배양을 위해, HT-29-luc2 세포를 1% O2 및 5% CO2의 저산소 인큐베이터 챔버에서 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS에 현탁시키고, 꼬리 정맥 주사 (1 x 106/마우스) 또는 직접적 간내 주사 (2 x 103/마우스)를 통해 무흉선 Nu/Nu 마우스 (수컷, 8 내지 10주령)에 투여하였다. 생물발광을 IVIS 촬영 시스템 (Caliper)을 사용하여 매주 결정하였다. 마우스를 무작위로 그룹에 할당하였다. 세포 주사 및 생물 발광 촬영을 연구자에게 블라인드 처리하였다. 통계 분석에서 제외된 동물은 없었다. 각 시점에 대한 루시퍼라제 강도를 각각의 0일째 강도 값으로 정규화하였다. 희생시킨 마우스의 폐 및 간을 분리하여, 생체외 생물발광에 의해 조사하였다.
통계 분석
GraphPad Prism 6 (GraphPad, La Jolla, CA) 또는 R 통계 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 세포 성장 속도, 시딩 효율, MTS, 유동 세포계측, 아노이키스 분석, 침윤 분석 및 실시간 PCR로부터의 결과를 일원 ANOVA 후, 터키 정직 유의차 사후 시험에 의해 분석하였다. 클론형성 분석에서, R 패키지 "CFAssay"를 사용하여, 선형 2차 세포 생존 곡선을 분석하였다. 샘플 크기의 사전 결정에는 통계적 방법을 사용하지 않았다. F-시험을 사용하여, 2개의 변형의 동일성을 시험하였다. 0.05 미만의 P-값을 유의한 것으로 고려하였다.
데이터 유효성
마이크로 어레이 데이터는 Gene Expression Omnibus에서 연구 등록 번호로 이용할 수 있다:
ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=sdmluyaqplgvtuz&acc=GSE76180
논의
전이는 암 환자의 이환율 및 치사율의 주된 원인이며, 전이 생물학이 밝혀진다면, 암 치료법이 현저히 개선될 수 있다. 암 전이의 특징 중 하나는 장기 특이성이다. 암은 장기 근접성이나 혈류에 의해 지목되는 부위에 의해 전적으로 설명될 수 없는 고유의 전이 확산 패턴을 가진다. 정상 조직 미세환경이 전이 성장 및 발달을 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것이 일반적으로 인정되나, 이러한 상호작용을 뒷받침하는 생물학은 밝혀진 바가 거의 없다2. 이는 주로, 사용이 용이하고, 암 전이의 장기 특이성의 생물학을 완전히 재현하는 실험 모델의 부재로 인한 것이다. 기존 시험관내/생체외 모델 시스템은 장기-미세환경 내에 존재하는 성분의 부재로 인해, 장기 특이성을 보유하지 않는다. 콜라겐 및 마트리겔은 부분적으로 3차원(3D) 배양 기층을 제공하는데 사용될 수 있으나, 이들 기층의 조성은 생체내의 전이가 유발된 조직 특이적 미세환경과 매우 다르다. 생체내에서 전이를 유발하는 유전자 조작 동물 모델을 조직 특이적 방식으로 전이되는 암 연구에 사용할 수 있으나, 비용이 많이 들고, 사용이 어렵다. 이전 연구에서 전이의 치료 반응이 전이 부위 간에 상이할 수 있다고 판단되었으므로, 전이와 이들이 속한 조직 미세환경 사이의 상호작용의 기저가 되는 생물학이 밝혀지면, 전이 암 환자에서 더욱 효과적인 암 치료로 이어질 수 있을 것이다.
따라서, 암 전이의 생체내 생물학을 재현할 수 있는 시험관내 모델이 강력하게 요구된다. 이러한 모델은 암 전이에 효과적인 요법의 개발을 촉진할 수 있다. 이것은 전이의 치료 반응이 전이 부위 사이에 상이한 것으로 알려져 있으며, 원발성 종양의 치료 반응과 상이할 수 있다는 점을 고려할 때 특히 중요하다2 -5. 따라서, 본 발명자들은 장기 특이성을 지니는 신규한 시험관내 암 전이 모델을 개발하고자 하였다.
장기의 미세환경은 장기 특이적 전이 모델 개발에 포함되는 중요한 성분이라고 가정하였다. 탈세포화 과정에 의해 제조된 매트릭스 추출물이 복합 장기의 생체 조작에 이용되어 왔다는 것을 고려할 때, 기존의 프로토콜 중 하나 또는 또 다른 것에 의해 생성된 이들 매트릭스 추출물은 암 전이를 조작하는 데 탁월한 기층을 생성할 수 있음이 입증된 것으로 사료된다6-8 (도 1a). 그러나, 화학적 조성이라는 관점뿐만 아니라, 기능적으로도 조직 특이성을 유지하는 유일한 조직 탈세포화 방법은 Rojkind와 Reid가 기재한 방법뿐이며, 매트릭스 추출물은 "바이오매트릭스"로 지칭된다.
장기 특이적 바이오매트릭스 스캐폴드는 생체내 생화학적 환경을 재현한다.
Rojkind-Reid 프로토콜의 고도로 개선된 버전이 Wang 등에 의해 개발되었고, "바이오매트릭스 스캐폴드"로 지칭되고, 조직의 콜라겐 및 콜라겐 결합 매트릭스 성분 (예를 들어, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 등)의 98% 초과를 유지하는 매트릭스 추출물을 생성한 것으로 밝혀졌다. 추가로, 바이오매트릭스 스캐폴드는 생체내에서 발견되는 것과 유사한 수준에서, 임의의 조직 매트릭스 성분에 결합된 모든 공지된 신호전달 분자(성장 인자, 사이토카인)를 함유하는 것으로 나타났다. 매트릭스 성분 및 관련 신호는 조직학적으로 정확한 위치에서 이루어지는 것으로 나타났다. 바이오매트릭스 스캐폴드를 Wang 등의 프로토콜을 사용하여 랫트의 간으로부터 제조하였다. 비슷한 프로토콜을 사용하여, 폐 바이오매트릭스 스캐폴드를 제조하였다.
랫트의 하대 정맥 (IVC)에 탈세포화 시약 주입용 캐뉼라를 삽입하고, 상대정맥 (SVC)을 혈관 클립을 사용하여 고정하였다. 랫트의 경동맥에 유출을 위한 입구를 제조하였다. 랫트 폐의 색 변화 (흰색에서 거의 투명한 색이 됨)는 성공적인 탈세포화의 전조를 징후를 제공하였다 (도 6a). 탈세포화된 간 BMS를 간문맥에 탈세포 시약 주입용 캐뉼라를 삽입함으로써, 제조하였다 (도 6b). 완전히 탈세포화되었는지를 조직학적 방법 및 BMS 물질의 핵산 함량을 평가함으로써 확인하였다 (도 1a, 도 1b에 부연됨). 특히, 이 BMS는 자연적으로 섬유상 단백질 및 탄수화물 망을 형성하여, 조직 배양 접시를 완전히 도포하였다 (도 1b).
폐 BMS가 생체내 폐 미세환경에 존재하는 신호전달 분자를 함유하고 있는지를 평가하기 위해, 본 발명자들은 반 정량적 ELISA를 사용하여 탈세포화 후 본 발명자들의 간 BMS가 가지고 있는 성장 인자 및 사이토카인의 상대적 존재량을 평가하였다. 세포외 매트릭스에 결합된 신호전달 분자가 간 탈세포화 후 유지된 것을 나타내는 이전 데이터와 일치하는 것으로12, 폐 바이오매트릭스 스캐폴드는 분석된 모든 (93%) 성장 인자 및 사이토카인을 거의 생리적 수준으로 유지하였다 (도 1c). 이들 신호전달 분자의 상대적 존재량은 간과 폐 BMS 사이에 달랐으며, 이는 그의 조직 특이적 성질과 일치하는 것임에 유의한다 (도 6c).
간과 폐 BMS 사이에 존재하는 분자 차이를 추가로 평가하기 위해, 질량 분광계 분석을 수행하였다. 세포외 매트릭스-결합 성장 인자 및 사이토카인에서와 같이, 본 발명자들은 세포외 매트릭스 상대적 조성 자체가 또한 간과 폐 BMS 사이에 상이함을 발견하였다 (도 1d; 도 7).
CRC 세포주는 시험관내에서 간 및 폐 "전이"를 형성한다.
조직-특이적 CRC 암 전이를 조작하기 위해, 본 발명자들은 간 및 폐 BMS로 코팅된 조직 배양 접시에 CRC 세포주 (HT-29, SW480, 및 Caco2)를 배양하였다. 흥미롭게도, 세 개의 CRC 세포주 모두 종양 세포가 조밀한 연결부를 통해 함께 연결되어 3차원 (3D) 회전타원체 콜로니를 형성하였다 (도 2a; 도 7a, 도 7b). 이러한 "전이"는 비교적 큰 규모이며, 최대 1 밀리미터의 직경을 갖는다. 직경이 500 마이크로미터를 초과하는 종양 회전타원체는 세포독성 대사물질의 내부 축적뿐 아니라, 산소 및 영양소 이용 가능성의 일반적인 부재로 인해, 괴사 코어를 함유한다. 이러한 관찰과 일치하는 것으로, BMS에서 조작된 전이는 또한, 생체내 전이에서 발견되는 저산소 및 괴사 영역과 유사한 괴사 영역을 함유하였다 (도 7c).
본 발명자들의 조작된 전이의 거동을 특성화하기 위해, 본 발명자들은 간 및 폐 BMS에서 성장한 CRC 세포의 시딩 효율 및 성장 속도를 플라스틱, 콜라겐, 및 마트리겔에서 성장한 세포와 비교하였다. 본 출원인들은 CRC 세포가 플라스틱에서 성장한 세포와 비교하는 경우, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS, 및 폐 BMS 상에서 감소된 시딩 효율을 나타냄을 발견하였다 (도 2b). 추가로, 본 출원인들은 콜라겐, 간 BMS, 및 폐 BMS에서 성장한 세포가 플라스틱 및 마트리겔에서 성장한 세포보다 더 저속으로 성장함을 발견하였다 (도 2c). 조작된 전이에서 관찰된 저속 성장 속도는 생체내 전이 암세포의 거동과 일치한다.
본 출원인들은 그 다음으로 조작된 간 및 폐 전이에서 나타나는 상대적으로 저속의 성장 속도가 증가한 세포 사멸률 때문인지 감소한 증식 속도 때문인지를 결정하고자 하였다. 상이한 기층에서 성장한 암세포에서의 세포 사멸을 특성화하기 위해, 본 출원인들은 유동 세포계측을 사용하여, 세포 사멸 마커인 절단된 카스파제 3의 발현을 평가하였다. 본 출원인들은 모든 배양 조건에서 CRC 세포가 유사한 세포 사멸률을 나타냄을 발견하였다 (도 9a). 상이한 기층에서 성장한 암세포의 상대적 증식 속도를 평가하기 위해, 본 발명자들은 EdU 세포 증식 분석을 수행하였다. 본 출원인들은 세포가 S기에 진입함에 따라, DNA 내로 혼입되는 티미딘 유사체인 EdU와 함께 배양물을 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 본 출원인들은 유동 세포계측을 사용하여 S기로 진입된 (EdU 양성) 세포 수를 정량화하였다. 본 출원인들은 간 및 폐 바이오매트릭스 스캐폴드에서 성장한 종양 세포가 세 가지 세포주 모두에서 시험된 모든 배양 조건 중에서 가장 낮은 증식 속도를 보임을 발견하였다 (도 8b). 종합하면, 이들 데이터는 BMS 상에 시딩된 CRC 세포가 상대적으로 매우 저속으로 성장하는 배양물을 생성하며, 이는 다른 배양 플랫폼에 의해 생성된 배양물보다 생체내 전이와 더 유사함을 보여준다.
조작된 간 전이는 생체내에서 발견되는 전이와 거의 유사하다.
BMS 및 통상적인 기층에서 성장한 암세포가 생체내 전이와 유사성을 공유하는 정도를 추가로 평가하기 위해, 본 출원인들은 조직병리학적 분석을 수행하였다. 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔 및 간 바이오매트릭스에서 성장한 세포의 조직학을 누드 마우스에 존재하는 생체내 간 전이 및 전이성 CRC 암 환자의 간 전이와 비교하였다. 생체내에서 발견되는 위장 유래 간 전이의 통상적인 조직학적 특징은 (1) 인환 세포, (2) 일탈적인 유사분열 특징, (3) 괴사성 잔해 (호산구 및 핵 잔해의 세포외 축적), (4) 다형성 세포 크기 및 모양 및 (5) 다핵 세포를 포함한다. 본 출원인들은 HHT-29, SW480, 및 Caco2 CRC 세포로부터 생성된 조작 간 전이에서 이들 모든 특징을 확인할 수 있었다 (도 3a;도 8). 이와 달리, 콜라겐 및 마트리겔에서 성장한 CRC 세포는 일탈적인 유사 분열 특징만을 나타내었으며, 표준 플라스틱 배양 접시에서 성장한 다핵 세포는 이러한 조직학적 특징을 함유하지 않았다 (도 3a; 도 8). 인환 세포는 생체외 모델 시스템에서 보고되지 않은 생체내 병리 결과이다. 이들 데이터는 조작된 전이가 생체내 간 전이에서 발견된 것과 동일한 병리학적 특징을 함유함을 보여준다.
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본 출원인들은 상이한 기층에서 성장한 암세포 및 생체내 전이가 공유하는 조직학적 특징의 연구에 더하여, 또한 그의 각각의 전사체 간의 유사성 정도를 연구하고자 하였다. 구체적으로, 본 출원인들은 플라스틱, 마트리겔 및 간 BMS에서 배양된 HT-29 세포의 전반적인 유전자 발현 프로파일을 HT-29 세포의 비장 주사에 의해 형성된 생체내 간 전이와 비교하였다 (도 9a, 도 9b). 계층 군집 분석에 의해, 본 발명자들의 조작된 간 전이의 유전자 발현 특징이 플라스틱 또는 마트리겔에서 성장한 HT-29 세포보다 생체내 간 전이에 더 유사한 것으로 밝혀졌다 (도 3b). 조작된 전이 및 생체내 전이에 의해 공유되는 상대적으로 높은 유사성은 조작된 전이 및 마트리겔에서 성장한 CRC 세포의 유전자 발현 프로파일을 플라스틱에서 성장한 세포와 비교함으로써 추가로 평가하였다.
플라스틱에서 성장한 세포와 비교하여, 총 791개의 유전자가 생체 조작 전이 및 생체내 간 전이 둘 모두에서 상향 조절되는 것으로 관찰되었다. 통상적으로 상향조절되는 다수의 이들 유전자는 산화 스트레스 및 저산소증에 대한 생물학적 반응과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다.
플라스틱 및 마트리겔에서 성장한 세포와 비교하여, 총 619개의 유전자가 조작된 전이 및 생체내 간 전이에서 개별적으로 상향조절되는 것으로 관찰되었다 (도 11c). 통상적으로 상향조절된 유전자는 혈관현성, 세포 부착 및 약제 대사 기능과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다 (도 11c).
본 출원인들은 또한 생체내 조작된 간 CRC 전이가 마트리겔 및 플라스틱 배양된 CRC 세포보다 더 높은 수준의 Timp1을 발현한다는 것을 관찰하였다 (도 5d에서 부연됨). 이러한 발견은 CRC 환자의 원발성 종양에서보다 간 전이에서 TIMP1의 더 높은 발현을 입증한 이전의 연구와 일치한다. 종합하면,이들 데이터는 조작된 전이가 생체내 전이를 표현형 및 생물학적으로 밀접하게 모방함을 보여준다.
조작된 전이는 증가된 생체내 전이 가능성을 나타낸다.
본 출원인들은 조작된 전이가 생체내 전이와 공유하는 조직학 및 분자 유사성이 각각의 생체내 조직 내에서 성장하는 능력을 증가시키는지 여부를 판단하고자 하였다. 즉, 본 출원인들은 BMS가 조직 특이적 미세환경을 재현한다면, 그 후, BMS에서 성장한 세포는 그에 상응하는 생체내 미세환경에서 생존하고 성장할 수 있어야 한다고 가정하였다. 예를 들어, 간 BMS에서 성장한 세포는 간 조직에서 성장하기에 더 적응 가능해야 한다. 이 가설을 시험하기 위해, 본 출원인들은 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS 및 폐 BMSs서 성장한 HT-29-luc2 세포를 숙주의 간과 폐에 전달한 후, 생물발광 영상화를 사용하여 생체내 전이를 형성하는 능력을 평가하였다 (도 4a, 도 4c; 도 12). 간 조직에서 성장하는 조작된 간 전이의 상대적인 능력을 결정하기 위해, 본 출원인들은 간장에 상이한 배양 조건에서 성장한 CRC 세포를 전달하기 위해 직접 간내 주사를 사용하여, 조작된 간 전이로부터 단리된 세포가 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 또는 폐 BMS에서 성장한 세포보다 생체내에서 더 많이 간 전이를 형성할 수 있음을 발견하였다 (도 4a, 도 4b, 도 11).
폐 조직에서 성장하는 조작된 폐 전이의 상대적인 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 꼬리 정맥 주사를 사용하여 상이한 기층에서 성장한 CRC 세포를 폐에 전달하였다. 본 출원인들은 폐 BMS에서 성장한 세포가 통상적인 배양 기층에서 성장한 세포보다 폐 전이를 형성하는 능력이 더 높다는 것을 발견하였다 (도 4c, 도 4d; 도 12). 예상외로, 본 출원인들은 간 BMS에서 성장한 세포가 또한 폐 전이를 형성할 수 있음을 발견하였다. 또한, 본 출원인들은 간 BMS로부터의 세포 및 더 낮은 정도이나, 폐 BMS로부터의 세포가 꼬리 정맥 주사 후 간 전이를 형성한다는 것을 발견하였다 (도 4a, 도 4b; 도 12).
저산소 조건에 노출된 암세포는 증대된 생존 및 세포 사멸로의 진행에 대한 내성을 나타낼 수 있다. 조작된 전이에 의해 나타나는 증가된 폐 전이 가능성이 저산소 세포의 존재에 기인하는지를 결정하기 위해, 본 출원인들은 꼬리 정맥 주사를 사용하여 저산소 조건에서 플라스틱에서 성장한 세포를 폐에 전달하였다. 본 출원인들은 플라스틱에서 성장한 CRC 세포의 저산소 전처리가 폐 전이를 형성하는 능력을 증대시키지 않는다는 것을 발견하였다 (도 13). 또한, 꼬리 정맥 주사를 사용하여 전달된 세포는 폐전이를 일으키기 전에 아노이키스를 회피하고, 폐 조직을 콜로니화할 수 있어야 한다. 중요한 점은, 본 출원인들은 간 및 폐 BMS에서 성장한 HT-29 세포에 의해 나타나는 증가된 폐 전이 가능성은 증가 된 아노이키스 내성 또는 증대된 침윤 능력에 기인한 것이 아니라는 것을 발견하였다 (도 14a, 도 14b). 종합하면, 이들 데이터는 조작된 전이가 통상적인 기층에서 성장한 배양물보다 그에 상응하는 생체내 미생환경에서 더 잘 성장할 수 있음을 보여준다.
조작된 전이는 장기 특이적 치료 반응을 나타낸다.
동일한 환자의 상이한 장기에서의 전이가 동일한 치료 요법에 상이하게 반응할 수 있으므로, 조직 특이적인 방식으로 전이를 치료하는데 효과적인 치료 용법을 확인하는 일은 여전히 적극적인 목표 영역으로 남아 있다. CRC 세포가 성장하는 기층이 치료 반응에 영향을 주는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 플라스틱, 콜라겐, 마트리겔, 간 BMS 및 폐 BMS에서 성장한 CRC 세포를 표준 CRC 화학요법 용법과 방사선요법으로 처리하였다. 전이성 CRCs에 대해 통상적으로 사용되는 4가지 화학요법 치료법인 이리노테칸 단독, 이리노테칸 + 5-플루오로우라실 (5-FU), 옥살리플라틴 단독 및 옥살리플라틴 + 5-FU를 조사하였다. 본 출원인들은 화학요법 및 방사선요법에 대한 CRC 세포주의 반응이 시험관내 미세환경에 크게 영향을 받는다는 것을 발견하였다 (도 5a). 예를 들어, 조작된 Caco2 폐 전이는 조작된 Caco2 간 전이보다 화학요법 용법에 대해 일정하게 더 민감하다 (도 5a). 또한, 본 출원인들은 방사선 요법에 대한 CRC 세포 배양물의 반응이 그들의 배양 기층에 따라 다르다는 것을 발견하였다 (도 5b). 중요한 점은, 본 출원인들은 조작된 간 및 폐 전이의 치료 반응이 상이함을 관찰하였다. 이들 결과는 CRC 세포의 치료 반응이 이들이 배양된 세포외 매트릭스의 장기 특이적 조성에 의해 영향을 받는다는 것을 나타낸다.
전이의 거동은 그들이 기속된 조직 특이적 미세환경에 의해 크게 영향을 받는다. 이러한 상호작용의 중요성을 인식한 본 출원인들은 조직 특이적 방식으로 전이성 질병을 연구하기 위해 탈세포화된 장기의 매트릭스 추출물을 사용하여 신규한 3D 시험관내 배양 플랫폼을 개발하였다. 원리 증명으로서, 본 출원인들은 CRC 세포주로부터의 간 및 폐 전이를 조작하였다. 일부 연구는 종양의 미세환경을 재현하기 위해 공동 배양을 사용하나, 본 데이터는 본 출원인들이 무세포의 생화학적 환경을 재현함으로써, 생체내 전이 병소에 존재하는 것과 유사한 조직학적 특징 및 유전자 발현 프로파일을 갖는 전이를 조작할 수 있음을 시사한다. 예를 들어, 본 출원인들은 조작된 간 전이에서 인환 세포를 확인하였으며, 이는 현재까지 어떠한 생체외 암 모델 시스템에서도 보고되지 않은 관찰이다. 중요하게는, 본 출원인들은 조작된 전이가 통상적인 배양 기층에서 성장한 세포와 비교하여, 그의 각각의 생체내 조직 특이적 미세환경에서의 성장에 더 잘 적응한다는 것을 제시한다. 또한, 본 출원인들은 조작된 간 전이가 폐에서 전이를 형성할 수 있음을 관찰하였다. 이러한 관찰에 대한 가능한 설명은 폐가 일반적으로 간보다 더 허용적인 환경이라거나, 간 미세환경에서 성장한 종양 세포가 폐 내에서 성장하는 능력을 촉진하는 특성을 유발한다는 것이다.
이러한 데이터는 표준 치료 용법에 대한 CRC 세포의 치료 반응이 그들이 시험관내에 노출된 조직 특이적 미세 환경에 따라 다음을 나타낸다. 폐 BMS에서 성장한 세포가 일반적으로 간 BMS에서 성장한 세포보다 치료에 더 민감하다는 것은 흥미롭다. 이러한 데이터는, 간 및 폐 전이 둘 모두가 이러한 질병 설정에서 공통적이라 할지라도, 간 전이가 전이성 CRC 환자에서 이환율 및 치사율의 주 원인이라는 임상 관찰결과와 일치한다.
이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 본 출원인들은 시험관내 전이를 조작할 수 있는 이러한 배양 플랫폼이 조직 특이적 방식으로 전이 암 생물학을 연구하기 위한 강력한 툴로 제시됨을 믿는다. 향후 연구는 이러한 평가로 새로운 치료 표적을 밝힐 수 있으므로, 암세포 거동에 영향을 미치는 특이적 ECM 성분을 확인하는 것을 포함할 것이다. 이러한 모델은 또한 전이의 조직 특이적 치료 반응 연구에 유용하다. 특히, 이러한 모델은 전이성 질병에 대한 신규 개발된 치료제를 시험하기 위한 약제 스크리닝 검사에 활용될 수 있다. 중요한 것은, 장기 특이적 방식으로 전이를 치료하기 위해 설계된 치료제를 확인하기 위한 고효율 스크리닝 분석을 가능하게 하는 유일한 시스템이다.
암세포와 장기 특이적 환경 사이의 상호작용은 암세포가 장기를 콜로니화한 후에 전이로 성장하는 능력을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다, "종자 및 토양" 가설2. 미세환경인 "토양"의 중요성을 인식하고, 조직-특이적 바이오매트릭스 스캐폴드를 사용하여, 생체내 전이를 거동 방식, 조직학 및 생물학적으로 밀접하게 모방하였다. 또한, 치료된 치료법에 대한 조작된 전이의 반응은 종양 세포가 성장한 장기-특이적 매트릭스의 화학적 성질에 따라 다르다. 중요한 것은, 바이오매트릭스 스캐폴드 상에서의 세포의 배양이 암세포의 전이 가능성을 증가시키며, 조직 콜로니화에 대한 조직 특이적 편향성을 부여할 수 있다는 것이다. 이러한 발견은 전이 암 환자를 위한 새로운 예후 및 치료 전략을 개발할 가능성을 가지며, 현재, 생체외에서 장기-특이적 미세환경을 재현할 수 있는 유일한 배양 시스템이라는 점에서 유일무이하다.
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Claims (18)

  1. 암 또는 종양으로 진단된 환자 내에서, 암 또는 종양이 전이될 가능성을 결정하는 방법으로서,
    하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드에 암 또는 종양으로 진단된 환자로부터 채취한 종양 생검 또는 샘플의 세포를 시딩 (seeding)하는 단계로, 각각의 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드는 각각 하나 이상의 소정의 인체 조직 또는 장기로부터 유래된 것인 단계,
    성장 세포의 콜로니를 형성하는 능력에 대해 세포를 분석하는 단계로, 각각의 바이오매트릭스 스캐폴드는 이것이 유래된 장기 또는 조직의 생물학적 패싯 (biological facet)을 재현하는 것인 단계를 포함하고,
    세포가 각각 그로부터 유래된 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드 상에 성장 세포의 콜로니를 형성하는 경우, 하나 이상의 소정의 조직 또는 장기로의 생체내 전이가 예측되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세포가 각각 그로부터 유래된 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드의 기층 상에 성장 세포의 콜로니를 형성하는 경우, 하나 이상의 소정의 조직 또는 장기로의 전이가 예측되는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 하나 이상의 소정의 조직 또는 장기로부터 유래된 각각의 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드가 바이오매트릭스 스캐폴드, 저온분쇄된 바이오매트릭스 스캐폴드, 및 무손상 바이오매트릭스 스캐폴드의 고정된 단면으로부터 선택되는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 그의 조직학, 엑소좀 생성, 마이크로RNA 생성, 중간엽 세포와의 상호작용, 및/또는 유전자 발현 프로파일을 기반으로 하여 콜로니를 특성화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제에 대한 반응성에 대해 콜로니를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 암 요법 및/또는 화학요법제는 콜로니의 조직학 엑소좀 생성, 마이크로RNA 생성, 중간엽 세포와의 상호작용, 및/또는 유전자 발현 프로파일을 기반으로 선택되는, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제는 방사선 요법 및/또는 하나 이상의 화학요법, 예컨대 안트라사이클린 (anthracycline), 알킬화제, 백금계 제제, 항-대사물질, 토포이소머라제 억제제, 및 유사분열 억제제의 1회 이상의 투여로부터 선택되는 것인, 방법.
  8. 제5항에 있어서, 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제는 방사선 요법, 면역요법, 내분비 요법, 및 분자 요법으로부터 선택되는 것인, 방법.
  9. 암 또는 종양으로 진단된 환자에서, 암 또는 종양의 적절한 치료를 결정하는 방법으로서,
    (1) 암 또는 종양으로 진단된 환자로부터 채취된 종양 생검 또는 샘플의 세포 또는 (2) 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드에 환자와 동일한 암 또는 종양 유형의 세포주로부터의 세포를 시딩하는 단계로, 각각의 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드는 각각 하나 이상의 소정의 인체 조직 또는 장기로부터 유래되고, 세포가 바이오매트릭스 스캐폴드 상에 성장 세포의 콜로니를 형성하는 단계,
    콜로니를 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제에 처리하는 단계로, 바이오매트릭스 스캐폴드는 이것이 유래된 조직 또는 장기의 생물학적 패싯을 재현하는 것인 단계를 포함하고,
    환자를 위한 적절한 치료는 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제에 의한 처리에 대한 콜로니의 반응성을 기반으로 선택되는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 암 요법 및/또는 화학요법제는 3차원 콜로니의 조직학 또는 유전자 발현 프로파일을 기반으로 선택되는 것인, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제는 방사선 요법 및/또는 하나 이상의 화학요법, 예컨대 안트라사이클린, 알킬화제, 백금계 제제, 항-대사물질, 토포이소머라제 억제제, 및 유사분열 억제제 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제는 방사선 요법, 면역요법, 내분비 요법, 및 분자 요법으로부터 선택되는 것인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 면역요법은 수지상 세포 요법, 항체 의존 요법, T-세포 의존 요법, 또는 NK-세포 의존 요법으로부터 선택되는 것인, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 분자 요법은 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  15. 각각 하나 이상의 소정의 인체 조직 또는 장기로부터 유래된 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드 및 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드 상에 세포를 시딩하기 위한 설명서 및 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
  16. 각각 하나 이상의 소정의 인체 조직 또는 장기로부터 유래된 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드 및 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드 상에 세포를 시딩하기 위한 설명서 및 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 설명서를 포함하는 키트.
  17. 제16항에 있어서, 하나 이상의 암 요법 및/또는 화학요법제를 추가로 포함하는, 키트.
  18. 하나 이상의 소정의 인체 조직 또는 장기에 특이적인 인공 종양 또는 전이 모델로서,
    하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드에 (1) 암 또는 종양으로 진단된 환자로부터 채취된 종양 생검 또는 샘플의 세포 또는 (2) 환자와 동일한 암 또는 종양 유형의 세포주로부터의 세포를 시딩하는 단계로, 각각의 하나 이상의 바이오매트릭스 스캐폴드는 각각 하나 이상의 소정의 인체 조직 또는 장기로부터 유래된 것인 단계에 의해 생성되고,
    세포가 바이오매트릭스 스캐폴드 상에 성장 세포의 콜로니를 형성하고,
    바이오매트릭스 스캐폴드가 이것이 유래된 조직 또는 장기의 생물학적 패싯을 재현한 것인 인공 종양 또는 전이 모델.
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