CN107779436A - 化疗所致周围神经病变细胞模型构建及其检测方法 - Google Patents

化疗所致周围神经病变细胞模型构建及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了化疗所致周围神经病变的细胞模型构建及其检测方法。构建细胞模型的步骤如下：1)提取分离DRG细胞并培养24小时；2)去除培养基，加入新的含有不同浓度化疗药(如OXA、PTX)的培养基继续培养；3)培养时间视不同化疗药物而定，培养结束后即可获得化疗所致周围神经病变细胞模型。用最佳的检测方法对上述3)中制得的细胞模型进行评价分析。结果表明，上述方法所制备的化疗所致周围神经病变细胞模型与公认构建方法制备的细胞模型相比，无明显形态学差异，且较易获得，成本降低。

Description

化疗所致周围神经病变细胞模型构建及其检测方法
技术领域
本发明属于细胞模型构造技术领域，尤其涉及紫杉醇或奥沙利铂诱发的周围神经病变细胞模型的构建方法；本发明同时还涉及该模型活性最佳检测方法。
背景技术
化疗药物所致的周围神经病变(Chemotherapy-induced peripheralneuropathy，CIPN)是常见的化疗相关剂量依赖性毒副反应，临床上很常见，尤其是接受化疗治疗的第一个月发病率最高。CIPN的症状多是对称性，发生在感觉、运动神经和自主神经上，但是尤以感觉神经毒副作用为主，典型的如皮肤感觉异常、麻木、刺痛，燃烧，痛觉过敏，腱反射消失，振动感觉和本体感觉丧失等。CIPN不仅严重影响患者的健康和生活、还会限制化疗方案的实施进而使病情加重。
常见导致CIPN的药物有铂类(如奥沙利铂)、紫杉烷类(如紫杉醇)和长春碱类等，其中前两种临床应用最为广泛。奥沙利铂(oxaliplatin,OXA)是继顺铂、卡铂之后的第3代铂类抗肿瘤药物,单药或联合治疗多种类型肿瘤都显示出良好的应用前景,联合5-氟脲嘧啶/亚叶酸钙已成为进展期结直肠癌的一线化疗方案。紫杉醇(paclitaxel,PTX)是从红豆杉的树皮中提取的一种抗癌药，临床广泛用于乳腺癌、卵巢癌以及非小细胞肺癌的治疗。
CIPN的发病机制主要为影响背根神经节(DRG)的主要感官神经元,DRG的感觉神经元丰富，又无血脑屏障保护，易受损伤。OXA的神经毒性机制可能与其抑制了感觉神经元胞体核仁内rRNA合成相关,使蛋白质合成障碍,致感觉神经元细胞器出现异常形态变化及相应的功能损伤。细胞超微结构形态学研究发现,用药后24～48h,DRG内的神经元变性最显著(Journal of China-Japan Friendship Hospital,2007Apr,Vol.21.No.4)。PTX可能是通过破坏DRG上微观结构，导致轴突内的信息传递和供能障碍，引起DRG神经元细胞坏死，从而发挥毒性作用(中国生化药物杂志，2015，47(35)：185-188)。目前CIPN细胞模型多是从E15的孕鼠中提取DRG培养，虽然也可用于筛选药物但仍有缺点，如动物养殖场提供的大鼠怀孕日期难以确切，而怀孕天数的变化影响神经元的状态。且操作复杂繁琐、难度大耗时久。而新生的SD大鼠操作相对简易也容易获得。近些年来许多国内外文献报道神经营养因子、抗氧化剂、抗抑郁药、抗癫痫药和螯合物等可以对CIPN进行有效的预防与治疗，但在2014年，ASCO发布了CIPN新的防治指南，由于缺乏高质量的、一致性证据，ASCO不推荐使用任何药物用于CIPN的预防(Gansu Medical Journal，2016，Vol.35，No.5)。且目前，尚未有一套有效而简便的药物筛选方法出现。基于上述原因，利用新生SD大鼠的DRG建立化疗所致周围神经病变的细胞模型用于筛选治疗药物非常必要。在此基础上，确立适宜的活性检测方法对评价细胞模型是否成功以及高通量的药物筛选也是尤为重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提出构建化疗所致周围神经病变细胞模型的方法，该方法简便有效，可用于筛选药物。
本发明的另一个目的是提出对化疗所致周围神经病变细胞模型进行检测评价的方法。
本发明提供的化疗所致周围神经病变细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)选取大鼠背根神经节(DRG)为造模细胞，消化后制成单细胞悬液，用培养基进行培养；
(2)培养24h后，弃去培养基，加入含有化疗药物的新鲜培养基继续培养；
(3)化疗药物处理24～48h后，获得化疗所致周围神经病变细胞模型。
进一步地，步骤(1)中所述是指新生一天的SD大鼠。
进一步地，步骤(1)中所述消化是指用3mg/mL I型胶原蛋白酶消化50min，之后离心弃去胶原蛋白酶；所述制成细胞悬液是指用吸管吹打并用70μm细胞筛过滤组织团块制成细胞悬液。
进一步地，步骤(1)中所述培养基为含有终浓度为10ng/mL胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF)和10％胎牛血清(FBS)的Neurobasal-B27完全培养基，37℃、5％CO2条件下培养所述细胞。
进一步地，步骤(2)中所述化疗药物为300nM紫杉醇或3μM奥沙利铂。
进一步地，步骤(2)中所述新鲜培养基为含有2％胎牛血清(FBS)的Neurobasal-B27完全培养基。
进一步地，步骤(3)中所述化疗药物处理时间紫杉醇为24h、奥沙利铂为48h。上述细胞模型的构建方法，进一步地，还包括对细胞模型进行综合评估的步骤(4)：对加入紫杉醇或奥沙利铂的DRG细胞进行活性检测，通过活性检测结果评估细胞模型是否成功。
进一步地，步骤(4)中所述适用于奥沙利铂最佳活性检测方式为CCK-8法、适用于紫杉醇活性最佳检测方式为免疫荧光测量轴突法。
由上述任一项所述制备方法制得的化疗所致周围神经病变细胞模型。
有益效果：上述方法所制备的化疗所致周围神经病变细胞模型与公认构建方法制备的细胞模型相比，无明显形态学差异，且较易获得，成本降低；根据不同的化疗所致周围神经病变模型的特点以及经济条件选择其最佳的检测方法，在能保证科学有效的同时能够降低成本，简化步骤。化疗所致周围神经病变模型的构建与检测方法的确认可用于高通量的药物筛选。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实验中所采用的仪器和试剂如下：仪器：TECAN SPARK10M酶标仪,奥林巴斯IX71荧光显微镜。试剂：多聚赖氨酸、紫杉醇和奥沙利铂来自Sigma公司；胶原酶由Worthington公司提供；培养基、血清、双抗青霉素和链霉素均来源于Gibco公司；MTT粉末购自北京索莱宝公司；CCK-8与LDH试剂盒购自东仁生物；ATP试剂盒由美国Lonza公司提供；抗体均购自Abcam公司。
实施例1：造模细胞的培养
(1)分离提取新生SD大鼠背根神经节，放入含有1％双抗(均为100units/mL)的L15培养基中。离心弃上清液,再加入3mg/mL胶原酶37℃消化50min,消化后得到细胞混合液。
(2)加入1mL含有10％FBS的完全培养基终止消化，离心后弃上清液。用L15培养基洗2次，加入含有10ng/mLGDNF和10％FBS的Neurobasal-B27完全培养基,用吸管轻轻吹打制成细胞悬液。
(3)用70μm的细胞滤器过滤细胞悬液，用枪头吹散细胞即可接种于用多聚赖氨酸处理过的细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养24h后，于显微镜下拍照，细胞形态见图1A。
实施例2：化疗药物(OXA)周围神经病变细胞模型-CCK-8法检测活性
(1)采用实施例1的细胞培养方法，将细胞悬液调整细胞密度为5×104/mL，每孔100μl接种于96孔板培养24h。
(2)将3mM奥沙利铂母液溶于含有2％FBS的Neurobasal-B27完全培养基梯度稀释成终浓度为30μM、10μM、3μM、1μM、300nM。弃去旧培养基，空白组换为2％FBS的新鲜培养基，模型组加入制备的不同浓度的奥沙利铂，每组设置6个复孔，继续培养48h。
(3)避光条件下，于步骤(2)中细胞每孔加入10μL CCK-8溶液置于培养箱培养。4h后，直接用酶标仪在450nm波长下测定OD值。检测结果如图2A所示。
(4)结果分析：奥沙利铂在浓度3μM时即可对DRG细胞产生约40％的毒性，而且毒性呈剂量依赖型递增，在高浓度30μM时可高达80％。奥沙利铂处理过的DRG细胞对CCK-8检测方法敏感性强，且CCK-8法操作简便，稳定性强，可用于高通量的药物筛选。CCK-8法适用于体外评价奥沙利铂周围神经病变模型。
实施例3：化疗药物(PTX)周围神经病变细胞模型-测量轴突长度
(1)采用实施例1的细胞培养方法，将细胞悬液调整细胞密度为5×104/mL，每孔500μL接种于24孔板培养24h。
(2)将100mM紫杉醇母液溶于含有2％FBS的Neurobasal-B27完全培养基梯度稀释成终浓度为300nM、100nM、30nM、10nM、3nM。弃去旧培养基，空白组换为2％FBS的新鲜培养基，模型组加入制备的不同浓度的紫杉醇，每组设置3个复孔，继续培养24h。
(3)固定：弃去培养基，PBS洗三次，每次10min。用4％多聚甲醛固定10min。
(4)封闭：PBS洗三次，每次10min。用含5％正常羊血清、0.2％Triton X-100和0.5％Tween-20的封闭液室温下孵育1h。
(5)一抗：用兔抗βIII-Tublin多克隆抗体(1:1000)室温孵育过夜。
(6)二抗：PBS洗三次，每次10min。避光条件下，用含荧光素(FITC)的山羊抗兔抗体(1:100)室温孵育1h。
(7)拍片：PBS再洗3次，每次10min。立即在倒置荧光显微镜下观察拍照，细胞及轴突呈绿色荧光为荧光染色阳性。每组随机选取10个阳性细胞测量轴突。轴突数据见图3A，荧光图片见图4A。
(8)结果分析：紫杉醇处理后的DRG神经元细胞的轴突明显缩短，且长度缩减程度随紫杉醇浓度增加而加重；在紫杉醇浓度为30nM时，神经细胞的轴突长度仅为空白组的一半，300nM时几乎只可见细胞胞体(图4A)，可见紫杉醇神经病变细胞模型对此分析方法敏感。免疫荧光测量轴突长度法可用于体外评价紫杉醇周围神经病变模型。
对比实施例1：孕15天大鼠DRG细胞的培养
(1)分离提取孕15天大鼠的背根神经节，放入含有1％双抗(均为100units/mL)的L15培养基中。离心弃上清液,再加入3mg/mL胶原酶37℃消化50min,消化后得到细胞混合液。
(2)加入1mL含有10％FBS的完全培养基终止消化，离心后弃上清液。用L15培养基洗2次，加入含有10ng/mLGDNF和10％FBS的Neurobasal-B27完全培养基,用吸管轻轻吹打制成细胞悬液。
(3)用70μm的细胞滤器过滤细胞悬液，用枪头吹散细胞即可接种于用多聚赖氨酸处理过的细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养24h后，于显微镜下拍照，细胞形态见图1B。
结果分析：从孕15天大鼠提取的DRG细胞形态图(图1B)与新生SD大鼠提取的DRG(图1A)无明显差别，形态一致。提示新生大鼠DRG细胞保持了孕15天大鼠DRG的形态特征，可制备化疗药物周围神经病变细胞模型。
对比实施例2：化疗药物(OXA)周围神经病变细胞模型-MTT法检测活性
(1)采用实施例1的细胞培养方法，将细胞悬液调整细胞密度为5×104/mL，每孔100μL接种于96孔板培养24h。
(2)采用实施例2的细胞模型构建方法，弃去旧培养基，空白组换为2％FBS的新鲜培养基，模型组加入制备的不同浓度的奥沙利铂，每组设置6个复孔，继续培养48h。
(3)避光条件下，于步骤(2)中细胞每孔加入10μL 5mg/mL的MTT溶液置入培养箱。4h后，吸弃孔内液体，加入110μLDMSO溶液，摇匀。用酶标仪在490nm波长下测定OD值。检测结果如图5A所示。
(4)结果分析：奥沙利铂(3μM)处理48h后，细胞活性为50％左右，高于此浓度时毒性较大且与剂量呈线性关系。MTT法与CCK8法相比实验结果相似，价格低廉。但操作步骤较多，吸弃液体时易形成误差，稳定性不如CCK8法。
对比实施例3：化疗药物(PTX)周围神经病变细胞模型-MTT法检测活性
(1)采用实施例1的细胞培养方法，将细胞悬液调整细胞密度为5×104/mL，每孔100μL接种于96孔板培养24h。
(2)采用实施例3的细胞模型构建方法，弃去旧培养基，空白组换为2％FBS的新鲜培养基，模型组加入制备的不同浓度的紫杉醇，每组设置6个复孔，继续培养24h。
(3)避光条件下，于步骤(2)中细胞每孔加入10μL 5mg/mL的MTT溶液置入培养箱。4h后，吸弃孔内液体，加入110μLDMSO溶液，摇匀。用酶标仪在490nm波长下测定OD值。检测结果如图5B所示。
(4)结果分析：紫杉醇浓度在高浓度300nM时仅可产生30％左右的毒性。虽较为稳定。但是相对于免疫荧光测量轴突方法，MTT法敏感度较低。
对比实施例4：化疗药物(OXA)周围神经病变细胞模型-LDH法检测毒性
(1)采用实施例1的细胞培养方法，将细胞悬液调整细胞密度为5×104/mL，每孔100μl接种于96孔板培养24h。
(2)采用实施例2的细胞模型构建方法，弃去旧培养基，空白组换为2％FBS的新鲜培养基，模型组加入制备的不同浓度的奥沙利铂。同时参照LDH试剂盒说明书，设置各对照组。每组设置4个复孔，继续培养48h。。
(3)在高对照孔中加入10μL Lysis Buffer后，培养箱内培养30min。
(4)避光条件下，在每个孔中加入100μLWorking Solution室温反应30min。
(5)在每孔中加入50μL Stop Solution后，立刻用酶标仪测定490nm的吸光度。检测结果如图6A所示。
(6)结果分析：奥沙利铂浓度在300nM-3μM时产生的毒性仅为10％，10μM时可产生30％的毒性，高浓度30μM时可达到40％，敏感度较MTT法、CCK-8法低，且此分析方法较其他方法操作复杂，价格昂贵，不适宜作为评价奥沙利铂周围神经病变细胞模型的检测方法。
对比实施例5：化疗药物(PTX)周围神经病变细胞模型-LDH法检测毒性
(1)采用实施例1的细胞培养方法，将细胞悬液调整细胞密度为5×104/mL，每孔100μL接种于96孔板培养24h。
(2)采用实施例3的细胞模型构建方法，弃去旧培养基，空白组换为2％FBS的新鲜培养基，模型组加入制备的不同浓度的紫杉醇。同时参照LDH试剂盒说明书，设置各对照组。每组设置4个复孔，继续培养24h。
(3)在高对照孔中加入10μL Lysis Buffer后，培养箱内培养30min。
(4)避光条件下，在每个孔中加入100μL Working Solution室温反应30min。
(5)在每孔中加入50μL Stop Solution后，立刻用酶标仪测定490nm的吸光度。检测结果如图6B所示。
(6)结果分析：经不同浓度的紫杉醇处理后的细胞毒性和空白组相比，没有显著差异，各浓度之间也没有区别，且价格贵，综合来说此方法不适宜用来检测分析紫杉醇对DRG神经细胞的影响。
对比实施例6：化疗药物(OXA)周围神经病变细胞模型-检测ATP活性
(1)采用实施例1的细胞培养方法，将细胞悬液调整细胞密度为5×104/mL，每孔100μL接种于96孔白板培养24h。
(2)采用实施例2的细胞模型构建方法，弃去旧培养基，空白组换为2％FBS的新鲜培养基，模型组加入制备的不同浓度的奥沙利铂。每组设置6个复孔，继续培养48h。
(3)根据ATP试剂盒说明书，将96孔板取出恢复至室温后，每孔加入50μL LysisBuffer反应10min。
(4)每孔转移100μL液体到不透光96孔板中，再加入100μLATP monitoringreagent plus反应2min。用酶标仪测定化学发光强度。检测结果如图7A所示。
(5)结果分析：奥沙利铂浓度为3μM时即可对细胞产生40％的毒性，高于此浓度时毒性可达到50％甚至更高，可见此方法的敏感度较高，但是此方法所需试剂盒价格较CCK-8法和MTT法所用试剂价格贵，且需要特定的96孔板与化学发光仪。此方法性价比低，对评价奥沙利铂周围神经病变细胞模型并不是最佳方法。
对比实施例7：化疗药物(PTX)周围神经病变细胞模型-检测ATP活性
(1)采用实施例1的细胞培养方法，将细胞悬液调整细胞密度为5×104/mL，每孔100μL接种于96孔板培养24h。
(2)采用实施例3的细胞模型构建方法，弃去旧培养基，空白组换为2％FBS的新鲜培养基，模型组加入制备的不同浓度的紫杉醇。每组设置6个复孔，继续培养24h。
(3)根据ATP试剂盒说明书，将96孔板取出恢复至室温后，每孔加入50μLLysisBuffer反应10min。
(4)每孔转移100μL液体到不透光96孔板中，再加入100μLATP monitoringreagent plus反应2min。用酶标仪测定化学发光强度。检测结果如图7B所示。
(5)结果分析：紫杉醇在高浓度300nM时可减少细胞25％的活性，低于此浓度时，细胞活性和空白组相比没有差别，可见此方法较其他方法敏感度低，且价格昂贵，不宜作为评价紫杉醇周围神经病变模型的检测方法。
对比实施例8：化疗药物(OXA)周围神经病变细胞模型-测量轴突长度
(1)采用实施例1的细胞培养方法，将细胞悬液调整细胞密度为5×104/mL，每孔500μL接种于24孔板培养24h。
(2)采用实施例2的细胞模型构建方法，弃去旧培养基，空白组换为2％FBS的新鲜培养基，模型组加入制备的不同浓度的奥沙利铂。每组设置3个复孔，继续培养48h。
(3)固定：弃去培养基，PBS洗三次，每次10min。用4％多聚甲醛固定10min。
(4)封闭：PBS洗三次，每次10min。用含5％正常羊血清、0.2％Triton X-100和0.5％Tween-20的封闭液室温下孵育1h。
(5)一抗：用兔抗βIII-Tublin多克隆抗体(1:1000)室温孵育过夜。
(6)二抗：PBS洗三次，每次10min。避光条件下，用含荧光素(FITC)的山羊抗兔抗体(1:100)室温孵育1h。
(7)拍片：PBS再洗3次，每次10min。立即在倒置荧光显微镜下观察拍照，细胞及轴突呈绿色荧光为荧光染色阳性。每组随机选取10个阳性细胞测量轴突。轴突数据见图3B，荧光图片见图4B。
(8)结果分析：在奥沙利铂浓度为1μM-30μM时，细胞轴突长度减少了20％-50％；以此可见该方法敏感度不高，且其操作繁杂，周期长，不适宜体外评价奥沙利铂周围神经病变模型。
对比实施例9：化疗药物(PTX)周围神经病变细胞模型-CCK-8法检测活性
(1)采用实施例1的细胞培养方法，将细胞悬液调整细胞密度为5×104/mL，每孔100μL接种于96孔板培养24h。
(2)采用实施例3的细胞模型构建方法，弃去旧培养基，空白组换为2％FBS的新鲜培养基，模型组加入制备的不同浓度的紫杉醇。每组设置6个复孔，继续培养24h。
(3)避光条件下，于步骤(2)中细胞每孔加入10μLCCK-8溶液置于培养箱培养。4h后，直接用酶标仪在450nm波长下测定OD值。检测结果如图2B所示。
(4)结果分析：紫杉醇浓度在高浓度100nM-300nM时仅可减少细胞30％-40％左右的活性，此分析方法敏感度较免疫荧光测量轴突法低。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的实质精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.化疗所致周围神经病变细胞模型的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)选取大鼠背根神经节DRG为造模细胞，消化后制成单细胞悬液，用培养基进行培养；(2)培养24h后，弃去培养基，加入含有化疗药物的新鲜培养基继续培养；(3)化疗药物处理24～48h后，获得化疗所致周围神经病变细胞模型。
2.根据权利要求1所述的化疗所致周围神经病变细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述是指新生一天的SD大鼠。
3.根据权利要求1所述的化疗所致周围神经病变细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述消化是指用3mg/mL I型胶原蛋白酶消化50min，之后离心弃去胶原蛋白酶；所述制成细胞悬液是指用吸管吹打并用70μm细胞筛过滤组织团块制成细胞悬液。
4.根据权利要求1所述的化疗所致周围神经病变细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养基为含有终浓度为10ng/mL胶质细胞源性神经营养因子GDNF和10％胎牛血清FBS的Neurobasal-B27完全培养基,37℃、5％CO2条件下培养所述细胞。
5.根据权利要求1所述的化疗所致周围神经病变细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述化疗药物为300nM紫杉醇或3μM奥沙利铂。
6.根据权利要求1所述的化疗所致周围神经病变细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述新鲜培养基为含有2％胎牛血清(FBS)的Neurobasal-B27完全培养基。
7.根据权利要求1所述的化疗所致周围神经病变细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述化疗药物处理时间紫杉醇为24h、奥沙利铂为48h。
8.根据权利要求1所述的化疗所致周围神经病变细胞模型的构建方法，其特征还在于，还包括对细胞模型进行综合评估的步骤(4)：对加入紫杉醇或奥沙利铂的DRG细胞进行活性检测，通过活性检测结果评估细胞模型是否成功。
9.根据权利要求8所述的化疗所致周围神经病变细胞模型的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述适用于奥沙利铂活性最佳检测方式为CCK-8法、适用于紫杉醇活性最佳检测方式为免疫荧光测量轴突法。
10.由权利要求1～9任一项所述的构建方法制得的化疗所致周围神经病变细胞模型。
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