CN103393676B - 橙皮油素在制备抑制肠道病毒71型感染药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了橙皮油素在制备抑制肠道病毒71型感染药物中的应用，属于生物制药领域。本发明以带有GFP荧光蛋白报告基因的EV71病毒为筛选平台，选取可作为中草药的植物天然产物单分子作为分析对象，发现了一个可以明显抑制EV71感染的中草药成分—橙皮油素，其对EV71感染的抑制效果比已知的EV71病毒感染细胞抑制剂的效果更好，毒性更低，且对其他几种手足口病病原如柯萨奇病毒CA5、CA6、CA10、CA16等有明显的抑制作用，可以作为EV71病毒感染细胞的候选药物。

Description

橙皮油素在制备抑制肠道病毒71型感染药物中的应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明涉及橙皮油素在制备抑制肠道病毒71型感染药物中的应用。
背景技术
肠道病毒71型（EV71）属于小RNA病毒科（Picornaradae）肠道病毒属的成员，归属于人类肠道病毒A，和柯萨奇病毒A16（Coxsckie A16，CA16）是手足口病的主要病原，已在世界范围内引起多次暴发与流行，主要发病者为婴幼儿，严重危害儿童健康，柯萨奇病毒引起的症状轻微，而EV71可感染中枢神经系统细胞，导致多种如无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等与神经系统相关的疾病，易发生死亡，成为脊髓灰质炎病毒后第二个易致神经性疾病的肠道病毒。
近年来，EV71的流行在亚太地区呈上升趋势，然而，手足口病的相关科研工作比较薄弱，对EV71的关注很少，至今在临床上还没有有效的疫苗和药物对EV71进行有效的预防和控制。
目前，针对手足口病，尤其是EV71重症的临床治疗上，还缺乏特异、高效的药物。对EV71感染的重症患儿的治疗主要通过缓解并发症的方法，用呼吸机维持心肺正常功能，药物控制炎症和水肿等。一些广谱的抗病毒药物，例如阿昔洛韦、利巴韦林等在手足口病的临床实验中作用微弱。之前的研究报道，一些化学小分子处在体外实验阶段，并且没有临床用药基础，在有效性和安全性上都需要进一步优化和测试，因此离临床测试和应用还有很长的距离。
故此，面对EV71的频繁爆发，开发能够快速应用于临床的药物迫在眉睫。
发明内容
基于此，本发明为了克服上述现有技术的缺陷，提供了肠道病毒71型感染的一种新的抑制剂。
为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
橙皮油素在制备抑制肠道病毒71型感染药物中的应用。
在其中一个实施例中，所述橙皮油素在抑制肠道病毒71型感染药物中的浓度>0.3微克/毫升。
在其中一个实施例中，所述橙皮油素在抑制肠道病毒71型感染药物中的浓度>0.55微克/毫升。
本发明还提供了一种抑制肠道病毒71型感染的药物。
为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种抑制肠道病毒71型感染的药物，所述药物由作为活性成分的橙皮油素和药学上可接受的辅料组成。
在其中一个实施例中，所述橙皮油素在所述药物中的浓度>0.3微克/毫升。
在其中一个实施例中，所述橙皮油素在所述药物中的浓度>0.55微克/毫升。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以带有GFP荧光蛋白报告基因的EV71病毒(GFP-EV71)为筛选平台，选取可作为中草药的植物天然产物单分子作为分析对象，发现了一个可以明显抑制EV71感染的中草药成分—橙皮油素，其对EV71感染的抑制效果比已知的EV71病毒感染细胞抑制剂的效果更好，毒性更低，且对其他几种手足口病病原如柯萨奇病毒CA5、CA6、CA10、CA16等有明显的抑制作用，可以作为EV71病毒感染细胞的候选药物。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同浓度的橙皮油素对病毒感染细胞的抑制曲线图；
图2为本发明实施例2中不同浓度的橙皮油素对病毒感染细胞的细胞毒性图；
图3为本发明实施例3中橙皮油素对EV71-GFP感染人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH和人脑胶质瘤细胞U251的抑制作用图；其中，橙皮油素的添加浓度为2微克/毫升；
图4为本发明实施例4中橙皮油素在不同时间段对病毒感染细胞的抑制曲线图；
图5为本发明实施例5中橙皮油素对几种手足口病病原柯萨奇病毒CA5、CA6、CA10、CA16的抑制作用图，其中，VSV病毒为对照病毒。
具体实施方式
在以下实施例中，所使用的带有GFP荧光蛋白报告基因的EV71病毒(GFP-EV71)的制备方法请参阅专利申请号为201310134412.X，发明名称为肠道病毒71型感染荧光报告体系及其构建方法。
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的包含范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1抑制EV71病毒感染细胞的药物小分子的筛选
以带有GFP荧光蛋白报告基因的EV71病毒感染人横纹肌肉瘤细胞系RD-A细胞为报告体系，来测定502种天然中草药单分子库的药物小分子(中科院上海生化与细胞所化学生物学技术平台提供)对病毒感染细胞的抑制作用。药物小分子均是以DMSO进行配制的。
1、初筛
在96孔板中进行药物小分子抑制实验。104/孔人横纹肌肉瘤细胞系RD-A细胞传至96孔板24小时后，将终浓度为2ug/ml的药物小分子和40TCID50/孔荧光报告病毒混合后同时加入靶细胞孔内，18小时后通过荧光分析仪（PerkinElmerVictorX5）检测荧光强度，同体积DMSO加荧光报告病毒混合液的孔作为阴性对照，不加病毒孔作为阳性对照。初筛结果显示，从502种天然中草药单分子库的药物小分子中发现橙皮油素对于EV71感染的RD-A细胞有着明显的抑制作用。橙皮油素与药学上可接受的辅料可以制备抑制EV71病毒感染细胞的候选药物。
2、复筛
对初筛获得有明显抑制作用，并且镜检无细胞病变或死亡的药物小分子橙皮油素进行梯度浓度稀释的抑制实验，橙皮油素倍比稀释（0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4ug/ml）后与荧光报告病毒混合后加到96孔板靶细胞上，同体积DMSO加荧光报告病毒的靶细胞孔为阴性对照，同体积DMSO不加病毒组为阳性对照，18小时后通过荧光分析仪（PerkinElmer VictorX5）检测荧光强度，三个重复孔实验，绘制抑制曲线，确定橙皮油素的半有效浓度IC50。
以EV71-GFP为工具，以已报道的病毒感染细胞抑制剂——小分子石蒜碱为阳性对照，药物小分子的配制溶液DMSO为阴性对照，分析了橙皮油素对病毒感染细胞的抑制曲线，结果如图1所示。
从图1可知，石蒜碱的半有效浓度IC50为0.7微克/毫升，而橙皮油素的半有效浓度IC50为0.55微克/毫升，橙皮油素对病毒感染细胞的抑制效果比已知的病毒感染细胞抑制剂的效果更好。
实施例2橙皮油素的细胞毒性
MTT法检测实施例1筛选获得的EV71病毒感染细胞的候选药物橙皮油素的毒性。
104/孔RD-A细胞传至96孔板24小时后，加入梯度浓度(80，40，20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.15625，0.078125微克/毫升)橙皮油素与培养基（DMEM+10%FBS）的混合液，培养24小时后加入2mg/ml的MTT液（50ul/孔），继续培养3小时，吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150ul/孔），将培养板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解，酶标仪检测各孔OD值（检测波长490nm），记录结果，绘制细胞生长曲线，确定橙皮油素针对RD-A细胞的半毒性浓度CC50。
以石蒜碱为阳性对照，药物小分子的配制溶液DMSO为阴性对照，通过MTT细胞活性实验检测橙皮油素对RA-D细胞的细胞毒性，如图2所示。
由图2可知，石蒜碱对RA-D细胞的半毒性浓度CC50为2微克/毫升，橙皮油素对RA-D细胞的半毒性浓度CC50为30微克/毫升，橙皮油素比石蒜碱对细胞的毒性更低。
实施例3橙皮油素对EV71-GFP感染神经细胞的抑制作用
将带有荧光蛋白的EV71病毒(EV71-GFP)与2ug/ml橙皮油素同时加入人神经细胞系SK-N-SH细胞和U251细胞，以未加药物橙皮油素、加病毒为对照，在荧光显微镜下观察，结果如图3所示。
从图3可以观察到橙皮油素对EV71-GFP感染人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH和人脑胶质瘤细胞U251均具有明显的抑制作用。
实施例4橙皮油素对EV71感染细胞的抑制时间
将104/孔RD-A细胞传至96孔板24小时后,加入40TCID50/孔的病毒(EV71-GFP)，孵育梯度时间（15-180分钟），将橙皮油素(2ug/ml)加入到病毒与细胞的混合物中，37℃培养16小时后，通过荧光分析仪（PerkinElmer VictorX5）检测荧光强度，三个重复孔实验，绘制抑制曲线。
牛乳铁蛋白（lactoferrin）是已被报道可以明显抑制EV71与细胞粘附的成分，以此蛋白为阳性对照，通过梯度时间实验，绘制抑制曲线，结果如图4所示，可以发现：与阳性对照牛乳铁蛋白一样，橙皮油素的抑制作用也发生在病毒感染早期。
实施例5橙皮油素对其他几种手足口病病原的抑制作用
将104/孔RD-A细胞传至96孔板24小时后，将40TCID50/孔的柯萨奇病毒CA5，CA6，CA10，CA16(毒株保藏于深圳市疾病预防控制中心，本领域技术人员可以购买得到)与2ug/ml橙皮油素同时加入人横纹肌肉瘤细胞系RD-A细胞，阴性对照为仅加入同橙皮油素体积相等的DMSO的细胞与病毒的培养物，对照病毒为水泡性口炎病毒(VSV病毒)，16小时后显微镜观察病变，结果如图5所示。
从图5可知，橙皮油素对水泡性口炎病毒(VSV病毒)没有任何抑制作用，对多种柯萨奇病毒如CA5、CA6、CA10、CA16均有明显的抑制作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.橙皮油素在制备抑制肠道病毒71型感染药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述橙皮油素在抑制肠道病毒71型感染药物中的浓度>0.3微克/毫升。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述橙皮油素在抑制肠道病毒71型感染药物中的浓度>0.55微克/毫升。
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