CN110859856A - 一种降低gvhd发病率的移植物 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种降低GVHD发病率的移植物，其特征在于，所述移植物通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞混合培养得到；本发明通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞共同培养制备得到移植物，通过将该移植物进行回输，能够有效降低CVHD的发变绿和发病程度。

Description

一种降低GVHD发病率的移植物
技术领域
本发明实施例涉及造血干细胞移植技术领域，具体涉及一种降低GVHD发病率的移植物。
背景技术
移植物抗宿主疾病(GVHD)是骨髓移植后出现的多系统损害(皮肤、食管、胃肠，肝脏等)的全身性疾病，是造成死亡的重要原因之一。由于供受体之间存在着免疫遗传学差异，移植骨髓中的免疫活性细胞(主要是T淋巴细胞)识别了受体的不同组织相容性抗原而增生分化，在受体内增生到一定程度后把受体的某些组织或器官作为靶目标进行免疫攻击产生损害。
将同种反应性T淋巴细胞移植至免疫功能不健全的患者体内时，可能发生的一种潜在的可致死性临床并发症。供体T细胞一经被输注至受体体内，就会识别宿主细胞抗原，导致影响肝脏、胃肠道和皮肤的免疫级联反应。目前，GVHD的治疗和预防方法包括移植后进行常规免疫抑制、低强度预处理及在输注前耗竭或抑制同种反应性供体的T淋巴细胞。不过，这些方法的临床效果受多种副作用的限制。例如，常规免疫抑制与增加再次感染病毒及机会性病毒感染的风险有关联，而低强度预处理方案则与复发率增加有关联。目前，耗竭或抑制供体T淋巴细胞是最具前景的GVHD预防性治疗方法。通过淋巴细胞毒性剂、专用的T淋巴抑制剂及专门针对C0.9％NaCl生理盐水34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)选择的T细胞耗竭剂等多种方法，可实现该目的。尽管人们已经证实，这些方法可有效地降低GVHD发病率，但是，它们会降低受体重构免疫系统的速度，增加患者出现致命感染的危险并可能具有限制移植物抗白血病的效果；此外，现有技术直接将造血干细胞移植，临床GVHD发病率较高。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种降低GVHD发病率的移植物，以解决现有技术中GVHD发病率较高的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面提供一种降低GVHD发病率的移植物，所述移植物通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞混合培养得到。
本发明通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞共同培养制备得到移植物，通过将该移植物进行回输，能够有效降低CVHD的发变绿和发病程度。
进一步地，所述胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞的数量比为(4-6)∶1。
进一步地，所述培养具体为：
将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞的混合细胞按照2×106cell/瓶进行接种，每个培养瓶中的培养体系为15mLDMEM F12+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF液，然后盖盖，再将培养瓶置5％CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养。
进一步地，所述胎盘亚全能干细胞通过如下方法制得：
(a)选取胎盘羊膜并进行预处理；
(b)将清洗后的羊膜进行消化处理、过滤、离心、接种；
(c)对接种后的细胞进行培养扩增，即得所述胎盘亚全能干细胞。
进一步地，所述预处理为将羊膜置于含50mL 0.9％NaCl生理盐水液的无菌小烧杯内，用镊子反复涮洗后取出放入新的无菌烧杯中加入0.9％NaCl生理盐水液再次涮洗，如此用0.9％NaCl生理盐水清洗3次以上，去除溶血，再用镊子将羊膜取出放置在肾形盘上，去除黏膜和溶血组织，将羊膜分成3-4cm大小方块；再将处理后的羊膜移至含50mL0.9％NaCl生理盐水液的新的无菌烧杯内，反复涮洗后放入新的烧杯中加入0.9％NaCl生理盐水液再次涮洗，如此反复冲洗16次以上。
进一步地，所述消化处理包括如下步骤：
(1)清洗后羊膜置于无菌消化瓶中，加入同体积的0.25％胰蛋白酶液混匀，37℃培养箱中静止消化5-10min；
(2)待消化结束后，向消化瓶中加入0.9％NaCl生理盐水拧紧瓶盖，轻轻摇匀，再将消化瓶内的混合物倒入100mL烧杯中，用镊子夹住羊膜反复涮洗后移入新的烧杯中并加入50mL0.9％NaCl生理盐水再次涮洗，反复涮洗2-3次；
(3)将清洗后的羊膜移入消化瓶中并加入同体积的0.25％胰蛋白酶液混匀，37℃培养箱中静置消化15-20min。
进一步地，所述过滤为待消化结束后，加入0.9％NaCl生理盐水液充分摇匀，将消化羊膜组织液倒入100mL烧杯中，用镊子将羊膜取出，放入消化瓶中反复上述操作2-3次，然后用镊子将羊膜舍弃，将获得消化产物的溶液经200目滤网过滤至加有20mL0.25％胰蛋白酶液的200mL蓝盖瓶中，摇匀，再分装到4个50mL离心管中。
进一步地，所述离心为将滤液在2000rpm离心15min。
进一步地，所述接种为按照(4-5)×106cell/T75培养瓶进行接种，其中，T75培养瓶中的培养体系为15mLDMEM F12+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF液。
进一步地，所述培养扩增包括如下步骤：
(1)将接种后的细胞在5％CO2、饱和湿度、37℃条件下进行培养，培养5-7天后全量换液，随后每3-5天半量换液，待细胞80％融合时，采用0.25％胰蛋白酶消化，按照1∶3传代；
(2)按照1:3的传代比例后，接种至T75培养瓶中，且培养体系为15mLDMEM F12+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF液，待细胞生长80％融合度时，弃去上层培养液，吸取15mL0.9％NaCl生理盐水轻轻加入培养瓶内，弃去洗液；
(3)再将0.25％胰蛋白酶液1.5mL加入到培养瓶内，迅速盖盖，轻轻拍打或左右摇晃，当80％细胞呈单个时，迅速加入0.5-1mLFCS终止胰蛋白酶作用；
(4)向终止后的培养瓶中添加10mL0.9％NaCl生理盐水，用PEP枪反复吹打，使细胞完全变成单个时移入到50mL离心管中，充分混匀，用微量加样枪吸取25μL细胞悬液，用做细胞计数，随后离心管盖盖，封口膜封口，以1000rpm离心5min；
(5)离心结束，弃上清液，根据计数结果，按照2×106cell/培养瓶重新接种至新的培瓶内，其中，培养瓶中的培养体系为15mLDMEM F12+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF液；
(6)将培养瓶置于5％CO2，饱和湿度，37℃条件下进行培养；
(7)传代至P3代，按1×104个/ml接种到24孔板内，并加入DMEM F12+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF液进行培养，得到P4代胎盘亚全能干细胞。
进一步地，所述脐带血造血干细胞通过如下方法制得：
1)采集脐带血，并向脐带血中添加脐带血重量20％的HESPAN；
2)将添加HESPAN的脐带血进行混匀、离心，去除脐带血中的红细胞；
3)将去除红细胞的脐带血再次进行离心、抽取血浆，即得所述脐带血造血干细胞。
进一步地，所述步骤2)中，离心条件为10℃、50g、离心7min。
进一步地，所述步骤3)中，离心条件为10℃、747g、离心15min。
本发明实施例具有如下优点：
本发明通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞共同培养制备得到移植物，通过将该移植物进行回输，能够有效降低CVHD的发变绿和发病程度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实施例1中制备的胎盘亚全能干细胞显微镜观察图；
图2为本发明实验例1中提供的胎盘亚全能干细胞混合脐带血造血干细胞的油红O染色结果图；
图3为本发明实验例1中提供的胎盘亚全能干细胞的油红O染色结果图；
图4为本发明实验例2中提供的胎盘亚全能干细胞混合脐带血造血干细胞的茜素红染色结果图；
图5为本发明实验例2中提供的胎盘亚全能干细胞的茜素红染色结果图；
图6为本发明实施例3制备得到的胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞混合培养物的流式分析报告图；
图7为本发明实验例4中输注胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞混合培养物与未输注干细胞混合产物一年内CVHD死亡率图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例为胎盘亚全能干细胞的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1、实验准备
从4℃冰箱中取出所需试剂，放置在摇床上平衡至37℃；
将已灭菌的实验器械、器皿、废液缸放置在超净台上紫外灯照射30min以上。
2、选取胎盘羊膜：
取材：胎盘取自足月健康产妇；
观察胎盘状态；并用75％酒精将胎盘容器外表面进行消毒，用酒精棉球擦拭无菌自封袋口消毒，放置在超净台上。用止血钳夹住脐带根部，将母源面(粗糙面)向下放置在肾形盘上，有脐带的光滑面朝上放置；用20mL注射器取采集液分别注射入厌需氧瓶中做无菌检测，用镊子捏住胎盘最外层的羊膜层，用剪刀将羊膜层剪开(上层)，沿切口处将羊膜撕下，整个过程中应避免剪破胎盘血管；
3、预处理
将羊膜置于含50mL 0.9％NaCl生理盐水液的无菌小烧杯内，用镊子反复涮洗后取出放入新的无菌烧杯中加入0.9％NaCl生理盐水液再次涮洗，如此用0.9％NaCl生理盐水液清洗3次以上，去除溶血，再用镊子将羊膜取出放置在肾形盘上，去除黏膜和溶血组织，将羊膜分成3-4cm大小方块；再将处理后的羊膜移至含50mL0.9％NaCl生理盐水液的新的无菌烧杯内，反复涮洗后放入新的烧杯中加入0.9％NaCl生理盐水液再次涮洗，如此反复冲洗16次以上。
4、消化处理
将清洗后羊膜标本置于100mL无菌消化瓶中，加入同体积0.25％胰蛋白酶液混匀，37℃培养箱中静止消化5-10min；
消化结束后，向消化瓶中加入0.9％NaCl生理盐水液拧紧瓶盖，轻轻摇匀，再将羊膜倒入100mL烧杯中，用镊子夹住羊膜反复涮洗后移入新的烧杯中加入50mL0.9％NaCl生理盐水液再次涮洗，反复涮洗2-3次见洗液洁净；
将清洗后羊膜移入消化瓶中加入同体积0.25％胰蛋白酶液混匀，37℃培养箱中静止消化15-20min，间隔10min轻轻摇动一次。
5、过滤：
消化结束后，加入0.9％NaCl生理盐水液充分摇匀，将消化羊膜组织液倒入100mL烧杯中，用镊子将羊膜取出，放入消化瓶中反复上述操作2-3次，然后用镊子将羊膜舍弃，将获得消化产物的溶液经200目滤网过滤至加有20mLC液的200mL蓝盖瓶中，摇匀，再分装到4个50mL离心管中。
6、离心：
将滤液以2000rpm离心15min；
7计数：离心结束后，去上清加入20mL DMEM F12(来源于Gibco)+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF液吹打混匀，吸取两滴进行计数：
细胞总数＝活细胞数×稀释倍数×细胞悬液体积(mL)×104
活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)；
8、接种细胞：
细胞计数后，按(4-5)×106cell/T75培养瓶，15mLDMEM F12(Gibco)+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF液/瓶，进行接种。
9、培养扩增：
将培养瓶放置在5％CO2、饱和湿度、37℃培养箱培养，培养5-7天的细胞全量换液，以后每3-5天半量换液，观察细胞80％融合时，0.25％胰蛋白酶消化，按1：3传代；
弃去培养瓶内原有培养基，吸取15mL 0.9％NaCl生理盐水液轻轻加入培养瓶内(注意，不要将细胞吹打起来)，弃去洗液。
将0.25％胰蛋白酶液1.5mL加入到培养瓶内，迅速盖盖，可轻轻拍打/左右摇晃，有助于细胞消化，于倒置显微镜下，当80％细胞呈单个时，迅速加入0.5-1mLFCS终止胰蛋白酶作用；
随后加10mL0.9％NaCl生理盐水，用PEP枪反复吹打，使细胞完全变成单个时移入到50mL离心管中，充分混匀，用微量加样枪吸取25μL细胞悬液，用做细胞计数(按照《台盘兰拒染率计数的标准操作规程》进行，计数不着色细胞总数)；离心管盖盖，封口膜封口，1000rpm×5min离心；
离心结束，弃上清液，根据计数结果，按照2×106密度每个培养瓶重新接种至新的培瓶内；每个培养瓶培养体系为15mLDMEM F12(Gibco)+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF液；盖盖，置5％CO2，饱和湿度，37℃培养箱培养；
传代至P3代，按1×104个/ml接种到24孔板内(此时若解冻细胞，按冻存密度5*105个/ml计算，可铺6孔板10个孔，12孔板25个孔，24孔板50个孔)，加入DMEM F12(Gibco)+10ng/ml EGF+10ng/ml bFGF培养，得到胎盘亚全能干细胞。
采用显微镜观察制备得到的胎盘亚全能干细胞，观察结果如图1所示，由图1可知，本发明上述方法得到的细胞为胎盘亚全能干细胞。
实施例2
本实施例为脐带血造血干细胞的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1、检查脐带血状态，若脐血内有凝血块，用一次性无菌输血器过滤后再进行处理；
2、称重采集袋毛重，称重时应注意管子别掉到天平外面，以免称重不准确；
3、脐血重量＝采血袋毛重-采血袋净重
4、将采集袋中的脐血充分混匀，75％酒精消毒2次，20-30秒后，用无菌剪刀剪开消毒部位，用5mL注射器吸取1mL脐血样本，此样本用于做细胞计数、细胞活率检测和血型检测；
5、计算应加入HESPAN的体积，公式为：加入HESPAN的数量＝脐带血净重量(含抗凝剂)×0.2；
6、用50mL注射器准确加入所需HESPAN，将脐带血从采集袋转移至100mL脐血转移袋中(毛重大于135g的脐血建议用200ml脐血转移袋)，标明内部条形码号、脐血净重，并将空气排除出，热合管道封口；
7、将血袋放在微电脑采液控制器上，充分混匀5-10min；
8、倒置离心：打开低温离心机，配平，离心条件设定为10℃、50g、离心7min；
9、在离心期间开始细胞计数，并记录好数据(红细胞、白细胞、血小板)；
10、把离心过的采血袋倒置的悬挂在分浆夹的固定挤压板上，用止血钳夹住通向红细胞分离袋的管道，打开管道上白色的卡子，松开活动挤压板，并打开止血钳使红细胞缓慢的流出，将要流完时夹紧止血钳，封闭管道上白色的卡子，红细胞分离结束：
11、正置离心，离心条件设定为10℃、747g、离心15min；
12、离心结束后轻缓地将转移袋从离心杯中取出，置于分浆夹中，放入分浆夹内的过程要缓慢；
13、用碘伏对转移部位消毒1次，30秒后，75％酒精消毒2次，20～30秒后，用无菌剪刀剪开取样部位，排除空气；
14、取样：
采用注射器抽取血浆，即得脐带血造血干细胞。
实施例3
本实施例为一种降低GVHD发病率的移植物，该移植物通过将实施例1制备得到的胎盘亚全能干细胞和实施例2制备得到的脐带血造血干细胞混合培养得到，其中：
胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞的数量比为5:1；
培养具体为：
按照胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞的数量比为5:1的比例，取胎盘亚全能干细胞5×106cell，脐带血造血干细胞1×106cell，混匀，按照2×106cell/瓶密度重新接种至新的培养瓶内；每个培养瓶培养体系为15mLDMEM F12(Gibco)+10ng/ml EGF+10ng/mlbFGF液；然后盖盖，置5％CO2、饱和湿度、37℃培养箱培养。
实验例1
本实验例为体外定向诱导分化为脂肪细胞实验：
(1)配置FBS10％含量的HG-DMEM培养液；
(2)在配制完成的HG-DMEM培养液中加入1μM地塞米松,10μg/ml胰岛素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX；
(3)准备6孔培养板，将实施例3中得到的胎盘亚全能干细胞混合脐带血造血干细胞按照2×104个/cm2密度接种于原始HG-DMEM培养液中
(4)待细胞长至80％融合后，更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天，在用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天，如此交替循环培养至14天，使用红油O染色。
(5)对照组：将胎盘亚全能干细胞按照2×104个/cm2密度接种于原始HG-DMEM培养液中
(6)待细胞长至80％融合后，更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天，在用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天，如此交替循环培养至14天，使用红油O染色。
(7)3周末应用油红O染色法检测脂滴形成；
油红O染色法步骤：
(1)细胞爬片用PBS清洗两次，每次5min；
(2)加入4％多聚甲醛液(覆盖所有细胞即可)固定1h，室温(或4℃过夜)；
(3)PBS漂洗两次，每次5min；
(4)入60％异丙醇漂洗；
(5)用0.5％的油红―O‖染色1h(覆盖所有细胞即可)，室温；
(6)放入70％的乙醇中分化至间质清晰，然后再用蒸馏水洗涤3次；
(7)苏木素染液复染(覆盖所有细胞即可)，1-2min，蒸馏水洗涤3次；
(8)染色的细胞可以用肉眼在相差显微镜下进行观察确认(为避免皿内干燥影响观察，可留少许液体，且观察时间不宜超过15min或用甘油封盖后可长时间保存)；观察结果如图2、图3所示；
由图2、图3可知：胎盘亚全能干细胞混合脐带血造血干细胞成脂能力优于胎盘亚全能干细胞。
实验例2
本实验例为体外定向诱导间充质干细胞分化为成骨细胞：
(1)准备含10％FBS的α-MEM培养液；
(2)准备无菌有盖玻片(做细胞爬行片)的6孔细胞培养板；
(3)在备好的培养液中添加50μM抗坏血酸,10mmβ-磷酸甘油和100nm地塞米松；
(4)按照5×103个/平方厘米的密度将胎盘亚全能干细胞混合脐带血造血干细胞的实施例1中制备的胎盘亚全能干细胞接种于原始α-MEM培养液中；
(5)培养细胞至80％融合率后去除孔内培养液，然后在实验组每个孔中加入2毫升成骨培养基，将其置于培养箱内隔天换液一次，共同诱导三周；
(6)对照组：将胎盘亚全能干细胞按照2×104个/cm2密度接种于原始HG-DMEM培养液中
(7)待细胞长至80％融合后，更换上述制备完成的成脂诱导培养液培养2天，在用只含有10μg/ml胰岛素的成脂维持培养液培养1天，如此交替循环培养至14天，使用红油O染色。
(8)再第三周的默契加入茜素红S进行染色检测钙沉积。
茜素红染色方法介绍：
①去除细胞当前使用培养液，使用PBS清洗两次；
②使用10％甲醛室温固定15分钟，完成后使用重蒸馏水冲洗两次；
③按照1ml/孔加入40mM的茜素红染色液，室温孵育20min并轻微振荡；
④清除掉没有完全结合的染料，用重蒸馏水漂洗并振荡5min重复4次；
⑤倾斜放置2min，吸取多余的重蒸馏水；倒置显微镜观察拍照记录。
检测结果如图4、图5所示；
由图4、图5可知：胎盘亚全能干细胞混合脐带血造血干细胞混合培养后的产物成骨能力优于胎盘亚全能干细胞。
实验例3
本实验例为实施例3制备得到的胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞混合培养物的流式分析报告；
分析结果如图6所示：
由图6可知，胎盘亚全能干细胞与脐带血造血干细胞混合培养的产物的干细胞特性具备，并且混合制备产品的流式表达优于胎盘亚全能干细胞。
实验例4
本实验例为实施例3制备得到的移植物回输研究；
通过对本发明实施例3制备得到的移植物的临床研究，得出如下治疗数据：
Figure BDA0002241442370000121
研究患者死亡率图如图7所示；
由图7可知，静脉输注胎盘亚全能干细胞与脐带血造血干细胞混合培养的产物后，完全应答者患者的死亡率为37％，部分应答或者未应答患者的死亡率为72％；
由上述实验数据可知，本发明胎盘亚全能干细胞混合脐带血造血干细胞制备产物针对于GVHD疾病的治疗起到显著的治疗效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种降低GVHD发病率的移植物，其特征在于，所述移植物通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞混合培养得到。
2.根据权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞的数量比为(4-6)∶1。
3.根据权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述培养具体为：
将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞的混合细胞按照2×106cell/瓶进行接种，每个培养瓶中的培养体系为15mLDMEM F12+10ng/ml EGF+10ng/mlbFGF液，然后盖盖，再将培养瓶置5％CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养。
4.根据权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述胎盘亚全能干细胞通过如下方法制得：
(a)选取胎盘羊膜并进行预处理；
(b)将清洗后的羊膜进行消化处理、过滤、离心、接种；
(c)对接种后的细胞进行培养扩增，即得所述胎盘亚全能干细胞。
5.根据权利要求4所述的移植物，其特征在于，所述消化处理包括如下步骤：
(1)清洗后羊膜置于无菌消化瓶中，加入同体积的0.25％胰蛋白酶液混匀，37℃培养箱中静止消化5-10min；
(2)待消化结束后，向消化瓶中加入0.9％NaCl生理盐水拧紧瓶盖，轻轻摇匀，再将消化瓶内的混合物倒入100mL烧杯中，用镊子夹住羊膜反复涮洗后移入新的烧杯中并加入50mL0.9％NaCl生理盐水再次涮洗，反复涮洗2-3次；
(3)将清洗后的羊膜移入消化瓶中并加入同体积的0.25％胰蛋白酶液混匀，37℃培养箱中静置消化15-20min。
6.根据权利要求4所述的移植物，其特征在于，所述接种为按照(4-5)×106cell/T75培养瓶进行接种，其中，T75培养瓶中的培养体系为15mLDMEM F12+10ng/mlEGF+10ng/ml bFGF液。
7.根据权利要求4所述的移植物，其特征在于，所述培养扩增包括如下步骤：
(1)将接种后的细胞在5％CO2、饱和湿度、37℃条件下进行培养，培养5-7天后全量换液，随后每3-5天半量换液，待细胞80％融合时，按1∶3传代；
(2)按照1:3的传代比例后，接种至T75培养瓶中，且培养体系为15mLDMEM F12+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF液，待细胞生长80％融合度时，弃去上层培养液，吸取15mL 0.9％NaCl生理盐水轻轻加入培养瓶内，弃去洗液；
(3)再将0.25％胰蛋白酶液1.5mL加入到培养瓶内，迅速盖盖，轻轻拍打或左右摇晃，当80％细胞呈单个时，迅速加入0.5-1mLFCS终止胰蛋白酶作用；
(4)向终止后的培养瓶中添加10mL0.9％NaCl生理盐水，用PEP枪反复吹打，使细胞完全变成单个时移入到50mL离心管中，充分混匀，用微量加样枪吸取25μL细胞悬液，用做细胞计数，随后离心管盖盖，封口膜封口，以1000rpm离心5min；
(5)离心结束，弃上清液，根据计数结果，按照2×106cell/培养瓶重新接种至新的培瓶内，其中，培养瓶中的培养体系为15mLDMEM F12+10ng/ml EGF+10ng/mlbFGF液；
(6)将培养瓶置于5％CO2，饱和湿度，37℃条件下进行培养；
(7)传代至P3代，按1×104个/ml接种到24孔板内，并加入DMEM F12+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF液进行培养，得到P4代胎盘亚全能干细胞。
8.根据权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述脐带血造血干细胞通过如下方法制得：
1)采集脐带血，并向脐带血中添加脐带血重量20％的HESPAN；
2)将添加HESPAN的脐带血进行混匀、离心，去除脐带血中的红细胞；
3)将去除红细胞的脐带血再次进行离心、抽取血浆，即得所述脐带血造血干细胞。
9.根据权利要求8所述的移植物，其特征在于，所述步骤2)中，离心条件为10℃、50g、离心7min。
10.根据权利要求8所述的移植物，其特征在于，所述步骤3)中，离心条件为10℃、747g、离心15min。
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