JP5837742B2 - 細胞単離装置 - Google Patents

Description

本発明は、再生医療の臨床・研究の分野や細胞培養の分野において用いられる細胞単離装置に関し、特に有効には、組織（生体組織）から細胞を高生存率で単離することが可能な細胞単離装置に関するものである。

従来、生存した細胞を得るためには、組織を鋭利な刃物でミンスし、コラゲナーゼなどによる酵素処理を行い、細胞外マトリックスを消化し、単離細胞を得ていた。

上記手法において、コラゲナーゼ液による酵素処理では、酵素処理と細胞回収の手技を繰り返し行うものであり、非常に多くの時間を要するものであった。また、刃物でのミンス処理方法や酵素処理中の浸透速度等の差異を原因として細胞の回収率にばらつきが生じるなどの問題があった。

組織を回転により解離させる組織解離装置としては、解離させる組織と液体媒体を保持するための、無菌状態の内側を有する容器（１２）を含み、更に、組織と係合して組織を解離させるための解離要素（５４）を、容器（１２）の内側に含んでいる。本装置（１０）は、更に、組織の、解離要素（５４）による係合に応じた運動に抵抗するための抵抗要素（８１）を、容器（１２）の内側に含み、解離要素（５４）と抵抗要素（８１）の間の相対的な動きと、その結果として抵抗要素（８１）が付与する抵抗とによって、解離要素（５４）が組織を効果的に解離させるものである。動力式組織解離装置は、解離要素（５４）を動かして組織と係合させるために、解離要素（５４）に作動的に接続されている動力源を含んでいる（特許文献１参照）。

しかしながら、この装置においては、抵抗要素（８１）が付与する抵抗によって、解離要素（５４）が組織を効果的に解離させるものであることから、細胞が抵抗要素（８１）にぶつかることから、細胞の生存率が低下するおそれがある。

特表２００７−５０５６３１号公報

本発明は、上記のような細胞単離装置が有する問題点を解決せんとしてなされたもので、その目的は組織（生体組織）から細胞を高生存率で単離することが可能な細胞単離装置を提供することにある。また、作業時間を大幅に短縮可能な細胞単離装置を提供することを他の目的とする。

本発明に係る細胞単離装置は、組織に衝突して細胞を単離する単離用部材と、組織が入れられ、前記単離用部材が動く室を有する室体と、前記室体における前記単離用部材の動作を制御する制御部と、室内の溶液の液面を検出する液面センサと、を備え、前記制御部は、前記液面センサの検出結果として所定時間の変動が所定値を超える場合に、前記単離部材の回転数を低減するよう制御し、高生存率の細胞単離を行う。

本発明に係る細胞単離装置では、単離用部材は、複数の刃体を有することを特徴とする。

本発明に係る細胞単離装置は、室体内の温度または装置の温度を制御する温度制御手段を備えていることを特徴とする。

本発明に係る細胞単離装置は、室体内に液を注入するための液注入部を備えていることを特徴とする。

本発明に係る細胞単離装置では、単離用部材は、軸体と、この軸体に結合される複数の刃体と、軸体において複数の刃体を支持する支持手段とを具備していることを特徴とする。

本発明に係る細胞単離装置では、軸体が、単離用部材と非接触の磁気回転駆動部により回転されることを特徴とする。

本発明に係る細胞単離装置では、室体には、回転軸を受ける軸受が形成されていることを特徴とする。

本発明に係る細胞単離装置によれば、組織が入れられ、単離用部材が動く室を有する室体を備え、上記室体における上記単離用部材の動作を制御するので、細胞の生存率を高くすることが可能となる。

本発明に係る細胞単離装置によれば、単離用部材が、複数の刃体を有するので、効率的に細胞の単離を行うことができる。

本発明に係る細胞単離装置によれば、室内の溶液の液面を検出する液面センサを備え、制御部は、この液面センサによる検出結果に基づき前記単離用部材の動作を制御するので、室内の溶液を泡立てることなく、適切に攪拌を行い、細胞の生存率を高くすることが可能となる。

本発明に係る細胞単離装置によれば、室体内の温度または装置の温度を制御する温度制御手段を備えているので、酵素の活性と非活性の制御を行うことが可能である。

本発明に係る細胞単離装置によれば、室体内に液を注入するための液注入部を備えているので、酵素の作用を停止させたい場合にインヒビターを注入するなど、必要な液注入が可能である。

本発明に係る細胞単離装置によれば、単離用部材が、軸体と、この軸体に結合される複数の刃体と、軸体において複数の刃体を支持する支持手段とを具備しているので、所要の回転によって適切な攪拌状態を実現でき、細胞の生存率を高くすることが可能となる。

本発明に係る細胞単離装置によれば、軸体が、単離用部材と非接触の磁気回転駆動部により回転されるので、室体に蓋をしたままの状態で攪拌することが可能であり、外部からの不要物の侵入を防止できると共に外部を汚染することを防止できる効果がある。

本発明に係る細胞単離装置によれば、室体には、回転軸を受ける軸受が形成されているので、室内において安定した回転を確保することができる。

本発明の細胞単離装置の第１の実施例を示す組立斜視図。 本発明の細胞単離装置の第１の実施例を示す側方からの図。 本発明の細胞単離装置の第１の実施例の単離用部材を示す組立斜視図。 本発明の細胞単離装置の第１の実施例の単離用部材変形例を示す斜視図。 本発明の細胞単離装置の第２の実施例を示す組立斜視図。 本発明の細胞単離装置の第２の実施例を示す側方からの図。 本発明の細胞単離装置の第２の実施例の単離用部材を示す組立斜視図。 本発明の細胞単離装置の第２の実施例の単離用部材変形例を示す斜視図。 本発明手法と従来の手技による手法により得た細胞の取得量のグラフを示す図。 本発明手法と従来の手技による手法により得た単離細胞取得直後の単位細胞数あたりのクレアチンキナーゼ（CK）活性値のグラフを示す図。 本発明手法と従来の手技による手法により得た単離細胞取得直後から４日目における細胞の生存率のグラフを示す図。 図９から図１１のグラフを数値で示した図。

以下、添付図面を参照して本発明に係る細胞単離装置の実施例を説明する。各図において同一の構成要素には、同一の符号を付して重複する説明を省略する。図１は、第１の実施形態に係る細胞単離装置の組み立て斜視図である。図２は、組み立てた状態の側方からの図である。この細胞単離装置は、カップ状の室体１１と、室体１１の蓋体１２と、単離用部材２０と、制御装置３０とを主な構成要素としている。

室体１１は、組織が入れられ、単離用部材２０が動く室１３を有する。室体１１の開口部の内周壁には、段部１４が形成されている。この段部１４には、蓋体１２の蓋板１５における周縁部１５ａが当接して載置される。室体１１の底部には、この細胞単離装置を安定して設置することができるように鍔部１６が設けられている。

図３に示すように、単離用部材２０は、回転軸である軸体２１と、この軸体２１に結合される複数の刃体２２と、軸体２１において複数の刃体２２を支持する支持手段を備えている。刃体２２は、基部２２ａから先端部２２ｂに向かって幅狭に形成されている。刃体２２の平面形状は鋭角二等辺三角形の形状を有し、長辺の一つ或いは二つに、刃が形成されている。基部２２ａには、厚さ方向に孔２４が穿設されている。

軸体２１における下端部の近傍には、刃体２２の基部２２ａを収容する凹部２５が形成されており、この凹部２５から軸体２１には軸方向に向かってネジ穴２５ａが形成されている。ここでは、４枚の刃体２２がスペーサ２６を介して交互に重ねられ、２枚毎に先端部２２ｂが１８０度異なる方向を向くようにされている。この状態に重ねられた刃体２２は、ネジ２７が刃体２２の孔２４及びスペーさ２６を貫通して軸体２１のネジ穴２５ａに螺合され支持される。このように、凹部２５、ネジ穴２５ａ、スペーサ２６及びネジ２７は、複数の刃体２２を支持する支持手段を構成する。

刃体２２の上記数および突出方向は、一例に過ぎない。従って、図４に示すように９０度づつ異なる方向へ突出した刃体２２を備えるようにしても良い。

軸体２１の上端部は、角柱状の結合部２９となっており、制御装置３０のモータ３３に結合された軸受穴３４に結合する。蓋体１２の中央部に軸体２１が貫通する貫通孔１７が形成されており、軸体２１の結合部２９は、この貫通孔１７を介して軸受穴３４に結合する。

室体１１における室１３の底面中央部に、軸体２１の下端部２８を受ける軸受を構成する凹部１８が形成され、装置が組み立てられた状態において軸体２１の下端部２８が凹部１８において軸支される。この状態において、刃体２２は室体１１の室１３における底面から僅かに浮いた位置にあり、回転により組織と衝突して、組織を適切に単離可能とする。

蓋体１２には、室体１１内に液を注入するための液注入部を構成する孔１９が形成されている。この孔１９は、弾性部材によって構成されており、外方向からの押圧によって移動し、孔１９を介して外部と室体１１内部を連通させる蓋片１９Ａが、室体１１内部側に設けられている。従って、酵素の作用を停止させたい場合にインヒビターを注入するなどを吸引したスポイトを、蓋片１９Ａにより通常は閉じている孔１９に挿入して、必要な液注入を行うことが可能である。

制御装置３０は、細胞単離装置を制御するＣＰＵにより構成される制御部３１が備えられている。制御部３１は、各種のキーなどを備える操作部３２、Ｉ／Ｏ３５が接続されている。Ｉ／Ｏ３５は、モータ３３、回転センサ３３Ａ、温度センサを含む温度素子３６、液面センサ３７が接続されている。

回転センサ３３Ａは、モータ３３に接続されており回転数と回転方向を検出して制御部３１へ送信するものである。温度素子３６は、室体１１の外壁面或いは内壁面に設置され、温度を制御部３１へ送出すると共に制御部３１からの制御により加温・冷却を行い温度を制御する温度制御手段として機能する。液面センサ３７は、例えば、蓋体１２の室体１１内側に取り付けられ、室体１１の底面側の液面の高さデータ（取付位置からの液面までの距離）を検出して、制御部３１へ送信する。

以上の通りに構成された細胞単離装置では、次のようにして細胞単離処理を行うことができる。予め活性温度に加温した所定量の酵素液を室体１１に入れる。次に、生体から摘出した組織を室体１１に投入する。単離用部材２０、蓋体１２、制御装置３０を所定位置にセットして細胞単離装置を組み立てる。操作部３２から攪拌条件（回転数、回転の方法、時間などをセットし、温度条件をセットして処理スタートのキーを操作する。回転の方法としては、ａａ秒右回転、ｂｂ秒停止、ｃｃ秒左回転などであり、これを繰り返す時間を入力する。

制御部３１は、上記入力に従ってモータ３３を回転制御し、温度条件に従って温度素子３６を制御して所定温度を保持する。また、液面センサ３７による検出結果を用いて、所定時間の変動が所定閾値を超える場合、回転数を低減させるなどして適切な攪拌状態を実現し、生存率の高い細胞単離を行う。

上記のようにして処理された混濁液を室体１１から取り出し、メッシュ処理を行って単離細胞を取り出す。

次に、第２の実施形態に係る細胞単離装置の構成を説明する。細胞単離装置は、カップ状の室体１１Ａと、室体１１Ａの蓋体１２Ａと、単離用部材２０Ａと、制御装置３０Ａとを主な構成要素とする。

図５は、組み立て斜視図を示す。単離用部材２０Ａの軸体２１Ａは、偏平な円柱形状をなし、底面から突出している小さな円柱状の軸５１を備える。室体１１Ａの室１３における底面の中央部に、上記軸５１を回転可能に軸支する有底穴からなる軸受５２が形成されている。

図７に、単離用部材２０Ａの組み立て斜視図を示す。軸体２１Ａの側部の直径方向に対となる位置には、刃体２２の基部２２ａが挿入される開口部５３が形成されている。軸体２１Ａの天井部における中央部には、表面に貫通しないネジ穴５４が形成されている。

一つの開口部５３に、二枚の刃体２２がスペーサ２６を介して重ねられて挿入される。軸体２１Ａの底部における中央部には、表面に貫通する穴５５が形成されている。二つの開口部５３から挿入された合計４枚の刃体２２の孔２４には、上記穴５５を介してネジ２７が貫通され、ネジ２７がネジ穴５４と螺合して複数の刃体２２を支持する支持手段を構成する。

刃体２２の上記数および突出方向は、一例に過ぎない。従って、図８に示すように９０度づつ異なる方向へ突出した刃体２２を備えるようにしても良い。

図６に示す通り、室体１１Ａの下にスターラー駆動装置６１が設けられる。この実施形態では、スターラー駆動装置６１が制御装置３０Ａに内蔵された構成を示すが、スターラー駆動装置６１以外は別の位置に設けても良い。制御装置３０Ａの筐体に、室体１１Ａとの結合溝６２が形成されており、室体１１Ａの図示しない凸部と嵌合して固定される。

制御装置３０Ａの構成は、制御部３１Ａがスターラー駆動装置６１を制御してスターラーの回転子を構成する軸体２１Ａの回転を制御する以外は、第１の実施形態と同一の構成となっている。これにより、軸体２１Ａが回転子として、単離用部材２０Ａと非接触の磁気回転駆動部であるスターラー駆動装置６１により回転される。

以上の通りに構成された細胞単離装置では、次のようにして細胞単離処理を行うことができる。予め活性温度に加温した所定量の酵素液を室体１１Ａに入れる。次に、生体から摘出した組織を室体１１Ａに投入する。単離用部材２０Ａ、蓋体１２Ａ、制御装置３０Ａを所定位置にセットして細胞単離装置を組み立てる。この状態で、室体１１Ａの室１３が外部と遮断され、密閉状態とすることができる。結果、不要物が室体１１Ａ内に入る危険性が無く、また室体１１Ａ内の液などが外部へ飛び出す可能性はない。

操作部３２から攪拌条件をセットし、温度条件をセットして処理スタートのキーを操作すること、制御部３１Ａの制御下において処理が行われること、混濁液を室体１１から取り出し、メッシュ処理を行って単離細胞を取り出すこと、は第１の実施形態と同様である。

上記の第１の実施形態または第２の実施形態に係る細胞単離装置を用いて組織から細胞単離を行った。この場合、従来の手技による手法によって得られた細胞と、本発明によって得られた細胞の比較を行った。組織は、ラット新生児の心筋組織を用いた。攪拌条件は回転数２００ｒｐｍ、０．５秒回転１秒停止の間欠運転を３０分行った。メッシュは４０μｍのものを用いた。

図９に、同量の組織から得られた細胞の取得量の平均値と偏差を、本発明手法と従来の手技による手法により得たグラフを示す。また、図１２に平均値と偏差を数値として示している。この図９及び図１２から明らかなように、本発明手法が極めて高効率で細胞の取得が可能である。

また、図１０に、単離細胞取得直後の単位細胞数あたりのCK活性値の平均値と偏差を、本発明手法と従来の手技による手法により得たグラフを示す。また、図１２に平均値と偏差を数値として示している。この図１０及び図１２からは、単位細胞数あたりの心筋細胞の比率が分かる。本発明手法が、細胞へのダメージを少なくすることで従来の手技による手法よりも優れて生存した心筋細胞の取得が可能であることが分かる。

更に、図１１に、単離細胞取得後から４日目における細胞の生存率の平均値と偏差を、本発明手法と従来の手技による手法により得たグラフを示す。また、図１２に平均値と偏差を数値として示している。この図１１及び図１２から、本発明手法が細胞にダメージを与えることが少なく、従来の手技による手法よりも優れて高い生存率の細胞取得が可能であることが分かる。

１１、１１Ａ 室体 １２、１２Ａ 蓋体
１３ 室 １８ 凹部
１９ 孔 １９Ａ 蓋片
２０、２０Ａ 単離用部材 ２１、２１Ａ 軸体
２２ 刃体 ２４ 孔
２５ 凹部 ２５ａ ネジ穴
２６ スペーサ ２８ 下端部
２９ 結合部 ３０、３０Ａ 制御装置
３１、３１Ａ 制御部 ３２ 操作部
３３ モータ ３３Ａ 回転センサ
３４ 軸受穴 ３６ 温度素子
３７ 液面センサ ５１ 軸
５２ 軸受 ５３ 開口部
６１ スターラー駆動装置

Claims (7)

1. 組織に衝突して細胞を単離する単離用部材と、
   組織が入れられ、前記単離用部材が動く室を有する室体と、
   前記室体における前記単離用部材の動作を制御する制御部と、
   室内の溶液の液面を検出する液面センサと、
   を備え、
   前記制御部は、前記液面センサの検出結果として所定時間の変動が所定値を超える場合に、前記単離部材の回転数を低減するよう制御し、高生存率の細胞単離を行う細胞単離装置。
2. 単離用部材は、複数の刃体を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞単離装置。
3. 室体内の温度または装置の温度を制御する温度制御手段を備えていることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞単離装置。
4. 室体内に液を注入するための液注入部を備えていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞単離装置。
5. 単離用部材は、軸体と、この軸体に結合される複数の刃体と、軸体において複数の刃体を支持する支持手段と
   を具備していることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の細胞単離装置。
6. 軸体が、単離用部材と非接触の磁気回転駆動部により回転されることを特徴とする請求項５に記載の細胞単離装置。
7. 室体には、軸体を受ける軸受が形成されていることを特徴とする請求項５または６に記載の細胞単離装置。