CN111349603A - 一种乳腺癌临床穿刺样本的解离方法 - Google Patents

一种乳腺癌临床穿刺样本的解离方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳腺癌临床穿刺样本解离的方法，包括样本处理、自然沉降弃上清、离心洗涤、酶解、过筛、裂红洗涤、PBS+10％FBS重悬等步骤。本发明使用自主研发的酶解方案提升了乳腺癌临床穿刺样本的细胞得率，缩短了酶解的时间，提高了细胞的得率。本发明还公开了一种用于乳腺癌临床穿刺样本解离的组织解离液。

Description

一种乳腺癌临床穿刺样本的解离方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种乳腺癌临床穿刺样本解离的方法，具体涉及一种用于提高乳腺癌临床穿刺样本酶解效率的方法。
背景技术
众所周知，肿瘤方面的研究一直是众多科学家关注的热点。然而在多细胞生物中，不同细胞内mRNA的转录水平是有差异的。例如每个人都是从一个受精卵开始逐渐形成囊胚，最终发育成一个完整的个体，与此同时细胞会逐渐分化成免疫细胞，神经元，骨骼肌，上皮细胞等，这些细胞各自转录表达着不同的遗传信息，承担着不同的生理功能。而不同的肿瘤细胞由于发生各种突变，所以不同细胞在基因组和转录组存在着的差异就更大了。这就是所谓的遗传信息的异质性。研究细胞遗传信息的异质性首先需要将组织解离成单细胞悬液。
乳腺癌属于女性群体的高发性癌症，这就凸显了运用乳腺癌的临床样本开展细胞生物学与分子生物学研究的重要性。因此制备出高质量的人乳腺癌临床穿刺样本的单细胞悬液，能为其后续发病机理与药物靶点的研究提供很好的技术支撑。然而乳腺癌穿刺样本组织相对坚硬，导致剪切困难。穿刺样本中油脂含量高，使细胞离心沉降困难且抑制后续的酶解反应。乳腺癌临床穿刺样本较小，解离出4×105数量的单细胞相对困难。文献报道的的酶解方式多为胶原酶III过夜解离，该方法耗时且对细胞的损伤大，易产生大量的死细胞，且过长的酶解时间导致细胞内的转录水平发生变化，不能反映原始样本中细胞真实的转录情况。商品化的美天妮人肿瘤解离试剂盒，解离出的单细胞数量过少，难以满足后续的实验要求。因此解离出高质量的单细胞悬液尚有较大难度。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述问题，本发明在进行了大量的深入研究之后，提供了一种提高乳腺癌临床穿刺样本解离的方法。本发明提供的方法包括样本处理、自然沉降弃上清、离心洗涤、酶解、过筛、裂红洗涤、PBS+10％FBS重悬等步骤。本发明通过增加离心洗涤的次数减少油脂残留，采用自主研发的酶液提高酶解效率。
本发明提供了一种乳腺癌临床穿刺样本解离的方法，包括如下具体步骤：
(1)样本处理：取乳腺癌穿刺样本组织块进行PBS冲洗，然后将组织块剪碎；
(2)自然沉降弃上清：向步骤(1)剪碎后的组织块中加入PBS，待组织块自然沉降后弃上清得组织块；
(3)离心洗涤：继续向步骤(2)得到的组织块中加入PBS，离心后去上清得组织块；
(4)酶解：向步骤(3)离心后的组织块中加入DMEM培养基，然后进行酶解得细胞；
(5)过筛：向步骤(4)酶解后的单细胞悬液中加入含FBS的DMEM完全培养基，然后过细胞筛、离心，去除上清；
(6)裂红洗涤：向步骤(5)离心后的细胞沉淀中加入红细胞裂解试剂进行红细胞裂解，然后加入含有FBS的PBS，离心后弃上清；
(7)细胞重悬：向步骤(6)离心后的细胞沉淀中加入含有FBS的PBS进行重悬，镜检后再加入含有FBS的PBS将细胞调整至一定的浓度。
步骤(1)中，所述乳腺癌穿刺样本组织块取自于组织保存液中。
步骤(1)中将样本组织进行PBS冲洗的目的是将穿刺样本上的血液充分洗涤。
步骤(1)中，所述PBS冲洗的次数为0-2次；优选地，为2次。
步骤(1)中，所述PBS优选为预冷的PBS，即，所述PBS的温度为0-10℃；优选地，为4℃。
步骤(2)中，所述PBS优选为预冷的PBS，即，所述PBS的温度为0-10℃；优选地，为4℃。
步骤(2)中，所述PBS的加入量为1-2ml；优选地，为2ml。
步骤(3)中继续向步骤(2)得到的组织块中加入PBS的目的为除去组织块表面的脂肪块。
步骤(3)中，所述PBS优选为预冷的PBS，即，所述PBS的温度为0-10℃；优选地，为4℃。
步骤(3)中，所述离心的条件为：离心的转速为150G-500G，离心的温度为4℃-10℃，离心的时间为2min-5min；优选地，离心的转速为200G，离心的温度为4℃，离心的时间为5min。
步骤(4)中，所述DMEM培养基包含0.05％-0.2％胶原酶I(ThermoFisherScientific，17018029)、0.001％-0.002％DNaseI、0.1％-0.25％胰蛋白酶(Gibco，15090046)；优选地，所述DMEM培养基包含0.1％胶原酶I(ThermoFisherScientific，17018029)0.002％DNaseI与0.25％胰蛋白酶(Gibco，15090046)。
步骤(4)优选在培养箱中酶解。
步骤(4)中，所述酶解的温度为36-38℃；优选地，为37℃。
步骤(4)中，所述酶解的时间为0.5-2h；优选地，为2h。
步骤(5)中，所述过筛优选先过70um细胞筛(BDFalcon，352350)，再过40um细胞筛(BDFalcon，352340)。
步骤(5)中过细胞筛后还包括终止酶解反应步骤。
步骤(5)中，所述FBS的浓度为0.04％-10％；优选地，为10％。
步骤(5)中，所述离心的条件为：离心的转速为150G-500G，离心的温度为4℃-10℃，离心的时间为2min-5min；优选地，离心的转速为200G，离心的温度为4℃，离心的时间为5min。
步骤(6)中加入含有FBS的PBS后还包括终止裂解反应步骤。
步骤(6)中，所述裂红的温度为20℃-25℃；优选地，为室温。
步骤(6)中，所述裂红的时间为2-10min；优选地，为5mins。
步骤(6)中，所述FBS的浓度为0.04％-10％；优选地，为10％。
步骤(6)中，所述离心的条件为：离心的转速为150G-500G，离心的温度为4℃-10℃，离心的时间为2min-5min；优选地，离心的转速为200G，离心的温度为4℃，离心的时间为5min。
步骤(6)中，所述离心优选为两次离心。
步骤(7)中，所述重悬的具体步骤为弃上清后留50ul，加入1ml含有0.04％-10％FBS的PBS，用宽口的胶头滴管轻柔吹打混匀。
步骤(7)中，所述FBS的浓度为0.04％-10％；优选地，为10％。
步骤(7)中，所述细胞的浓度为7×105cells/ml-1.2×106cells/ml；优选地，为1×106cells/ml。
在一个具体的实施方式中，本发明所述方法的具体步骤为：
(1)样本处理，取组织保存液中的乳腺癌穿刺样本组织块，然后用预冷的PBS(CorningCellgro，21-040-CV)冲洗两遍，采用眼科镊将组织块移至细胞冻存管中，加入一滴PBS，用眼科剪将冻存管内的组织块充分剪碎，尽可能碎。
(2)自然沉降弃上清：向步骤(1)含有剪碎的组织块的冻存管中加入2ml预冷的PBS，待自然沉降后充分弃上清。
(3)离心洗涤：向步骤(2)含有组织块的冻存管中加入1ml预冷的PBS，然后将组织块转移至含有5ml预冷PBS的15ml离心管中，200G，4℃，离心5min后充分去上清。
(4)酶解：然后加入含0.1％胶原酶I(ThermoFisherScientific，17018029)、0.002％DNaseI与0.25％胰蛋白酶(Gibco，15090046)的2mlDMEM(ATCC，30-2002)培养基置于37℃培养箱中酶解2h。
(5)过筛：加入10mlDMEM(含10％FBS)后，轻柔混匀，先过70um细胞筛(BD Falcon，352350)，再过40um细胞筛(BDFalcon，352340)，200G，4℃，离心5min后去除上清。
(6)裂红洗涤：在超纯水(invitrogen，10977-015)中加入裂红试剂(MiltenyiBiotec，130-094-183)，室温裂红5mins，加入5ml含有10％FBS(ThermoFisherScientific，10100139C)的PBS后200G，4℃，离心5min去上清，再加入5ml含有10％FBS的PBS后200G，4℃，离心5min去上清。
(7)细胞重悬：加入1ml含有10％FBS的PBS重悬，镜检后再加入合适的PBS将细胞调整至合适的浓度。
本发明以上乳腺癌临床穿刺样本酶解步骤中，步骤(2)、(3)、(4)对于本发明获得高效酶解效率是至关重要的。
本发明还提供了一种用于乳腺癌临床穿刺样本解离的组织解离液，所述组织解离液包括含0.05％-0.2％胶原酶I(ThermoFisherScientific，17018029)、0.001％-0.002％DNaseI、0.1％-0.25％胰蛋白酶(Gibco，15090046)的DMEM(ATCC，30-2002)培养基；优选地，为含0.1％胶原酶I(ThermoFisherScientific，17018029)、0.002％DNaseI与0.25％胰蛋白酶(Gibco，15090046)的2mlDMEM(ATCC，30-2002)培养基。
本发明还提供了一种用于乳腺癌临床穿刺样本解离的组织解离液的制备方法，所述方法包括由于人乳腺癌穿刺样本中脂肪含量很多，因此本发明在组织块预处理时采用两步洗涤的方式，去除组织块中的脂肪及油脂，现有方案通过自然沉降或一步离心的方式去除组织块中的脂肪及油脂，这会有过多残留的脂肪及油脂干扰后续的细胞离心及酶解反应。本发明采用0.1％胶原酶I(TypeICollagenase)与0.25％胰蛋白酶溶于DMEM培养基中，胶原酶I(TypeICollagenase)：含有比较均匀的各种酶活力(包括胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性)。通常用作上皮细胞、肝、肺、脂肪和肾上腺组织细胞的制备。
本发明还提供了所述组织解离液在用于解离乳腺癌临床穿刺样本中的应用。
本发明还提供了所述组织解离液方法制备得到的组织解离液在用于解离乳腺癌临床穿刺样本中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：现有方法多用美天妮人肿瘤解离试剂盒与用胶原酶III(TypeIIICollagenase)进行解离。与文献报道的胶原酶III(TypeIIICollagenase)解离相比，本发明能够将乳腺癌细胞在2h之内酶解下来，并且得到的细胞大于4×105个，且细胞活率在90％以上，无需去死细胞，而胶原酶III(TypeIII Collagenase)酶解多要过夜解离，且会产生大量的死细胞，且过夜解离会影响细胞内的转录表达，影响实验的真实性。与美天妮试剂盒解离效果相比，美天妮解离的乳腺癌穿刺样本的细胞量在5x103-1x105个，细胞得率过低，难以满足后续的实验要求。本发明在时间上与细胞得率上有了明显的提高。
附图说明
图1：穿刺样本中脂肪含量(脂肪呈淡黄色)尽量少，好的穿刺样本应呈完整的白色条状。
图2：自研酶液解离结果(加DNase)：穿刺样本解离出的单细胞有大有小，细胞呈单个的状态，活细胞为圆形透亮的圆，死细胞被染上蓝色。
图3：美天妮解离试剂盒解离结果：穿刺样本解离出的单细胞过少，有较大的结团，活细胞为圆形透亮的圆，死细胞被染上蓝色。
图4：自研酶液解离结果(不加DNase)：穿刺样本解离出的单细胞悬液中细胞团较多。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1乳腺癌穿刺样本的解离效率的实验方法-加DNaseI
(1)取美天妮组织保存液中的乳腺癌穿刺样本组织(如图1所示)，预冷的PBS冲洗两遍，采用眼科镊将组织块移至细胞冻存管中，加入一滴PBS，用眼科剪将冻存管内的组织块充分剪碎，尽可能碎。
(2)冻存管加入2ml预冷的PBS，待组织块自然沉降后充分弃上清。
(3)在冻存管中加入1ml预冷的PBS，将组织块转移至含有5ml预冷PBS的15ml离心管中，200G，4℃，离心5min后充分去上清。
(4)加入含终浓度为0.1％的胶原酶I，0.002％DNaseI与0.25％的胰蛋白酶的2mlDMEM培养基置于37℃混匀仪中酶解2h。
(5)加入10mlDMEM后，轻柔混匀，先过70um细胞筛，再过40um细胞筛，200G，4℃，离心5min后去除上清。
(6)加入裂红试剂，室温裂红5mins，加入5ml含有10％FBS的PBS后200g，5mins离心，再加入5ml含有10％FBS的PBS后200G，4℃，离心5min去上清。
(7)加入1ml含有10％FBS的PBS重悬，镜检后再加入合适的PBS将细胞调整至合适的浓度。
结果及分析：
细胞计数采用台盼蓝染色，0.4％的台盼蓝与细胞悬液按1:1混匀，用移液枪吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞个数，计算方式为((S1+S2+S3+S4)/4/50*1000)个cells/ul。注：S1，S2，S3，S4分别代表4个计数区的细胞个数。光镜下死细胞会被染成蓝色，活细胞为透亮且轮廓清晰的圆。视野中细胞均匀分散开，无大量结团及细胞碎片，细胞活率良好(如表1、图2所示)。
实施例2乳腺癌穿刺样本的解离效率的实验方法-不加DNaseI
(1)取美天妮组织保存液中的乳腺癌穿刺样本组织，预冷的PBS冲洗两遍，采用眼科镊将组织块移至细胞冻存管中，加入一滴PBS，用眼科剪将冻存管内的组织块充分剪碎，尽可能碎。
(2)冻存管加入2ml预冷的PBS，待组织块自然沉降后充分弃上清。
(3)在冻存管中加入1ml预冷的PBS，将组织块转移至含有5ml预冷PBS的15ml离心管中，200G，4℃，离心5min后充分去上清。
(4)加入含终浓度为0.1％的胶原酶I与0.25％的胰蛋白酶的2mlDMEM培养基置于37℃培养箱中酶解2h。
(5)加入10mlDMEM后，轻柔混匀，先过70um细胞筛，再过40um细胞筛，200G，4℃，离心5min后去除上清。
(6)加入裂红试剂，室温裂红5min，加入5ml含有10％FBS的PBS后200G，4℃，离心5min去上清，再加入5ml含有10％FBS的PBS后200G，4℃，离心5min去上清。
(7)加入1ml含有10％FBS的PBS重悬，镜检后再加入合适的PBS将细胞调整至合适的浓度。
结果及分析：
细胞计数采用台盼蓝染色，0.4％的台盼蓝与细胞悬液按1:1混匀，用移液枪吸取10ul加到血球计数板的加样孔中计数，显微镜观察计数区的细胞个数，计算方式为((S1+S2+S3+S4)/4/50*1000)个cells/ul。注：S1，S2，S3，S4分别代表4个计数区的细胞个数。光镜下死细胞会被染成蓝色，活细胞为透亮且轮廓清晰的圆。视野中细胞部分结团，细胞活率与浓度均良好(如表1、图4所示)，其中，表1为自研试剂与美天妮解离试剂盒解离结果。
表1
Figure BDA0002316920940000071
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (12)

1.一种乳腺癌临床穿刺样本解离的方法，特征在于，具体包括以下步骤：
(1)样本处理：取乳腺癌穿刺样本组织块进行PBS冲洗，然后将组织块剪碎；
(2)自然沉降弃上清：向步骤(1)剪碎后的组织块中加入PBS，待组织块自然沉降后弃上清得组织块；
(3)离心洗涤：继续向步骤(2)得到的组织块中加入PBS，离心后去上清得组织块；
(4)酶解：向步骤(3)离心后的组织块中加入DMEM培养基，然后进行酶解得细胞；
(5)过筛：向步骤(4)酶解后的单细胞悬液中加入含FBS的DMEM完全培养基，然后过细胞筛、离心，去除上清；
(6)裂红洗涤：向步骤(5)离心后的细胞沉淀中加入红细胞裂解试剂进行红细胞裂解，然后加入含有FBS的PBS，离心后弃上清；
(7)细胞重悬：向步骤(6)离心后的细胞沉淀中加入含有FBS的PBS进行重悬，镜检后再加入含有FBS的PBS将细胞调整至一定的浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述PBS冲洗的次数为0-2次；和/或，所述PBS为预冷的PBS，所述PBS的温度为0-10℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述PBS的加入量为1-2ml；和/或，所述PBS为预冷的PBS，所述PBS的温度为0-10℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述PBS为预冷的PBS，所述PBS的温度为0-10℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述DMEM培养基包含0.05％-0.2％胶原酶I、0.001％-0.002％DNaseI、0.1％-0.25％胰蛋白酶。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述酶解的温度为36-38℃；和/或，所述酶解的时间为0.5-2h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述过筛先过70um细胞筛，再过40um细胞筛；和/或，所述FBS的浓度为0.04％-10％。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，所述裂解的温度为20℃-25℃；和/或，所述裂解的时间为2-10min；和/或，所述FBS的浓度为0.04％-10％。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(7)中，所述FBS的浓度为0.04％-10％；和/或，所述细胞的浓度为7×105cells/ml-1.2×106cells/ml。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)、(5)、(6)中，所述离心的条件为：离心的转速为150G-500G，和/或，离心的温度为4℃-10℃，和/或，离心的时间为2min-5min。
11.一种用于乳腺癌临床穿刺样本解离的组织解离液，其特征在于，所述组织解离液包括含0.05％-0.2％胶原酶I、0.001％-0.002％DNaseI、0.1％-0.25％胰蛋白酶的DMEM培养基。
12.如权利要求11所述的组织解离液在用于解离乳腺癌临床穿刺样本中的应用。
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