CN110520735A - 解离固定组织的基于尺寸的分离 - Google Patents

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Abstract

本公开提供一种自组织样品分出细胞颗粒,然后将细胞颗粒分选入两种或更多种细胞颗粒群体的方法。

Description

解离固定组织的基于尺寸的分离
对相关申请的交叉援引
本申请要求2017年4月14日提交的美国临时专利申请No.62/485,550的提交日的权益,据此通过援引将其公开内容完整收入本文。
发明背景
癌症是以异常细胞不受控制的增殖为标志的疾病。在正常组织中,细胞响应来自周围细胞的信号在组织内分裂和组织,导致由组织背景小心协调的正常细胞行为。癌细胞不响应来自周围组织的生长限制性背景线索,而且它们常常包含驱动它们增殖并在许多器官中形成肿瘤的遗传改变。随着肿瘤生长进展,遗传和表型改变继续积累,容许癌细胞群体克服另外的“检查点”,诸如抗肿瘤免疫应答,并表现为癌细胞更具攻击性的生长表型。如果留着不治疗的话,可能发生转移,癌细胞通过淋巴系统或血流传播至身体的远端区域。转移导致在多个部位形成继发性肿瘤,损害健康组织。大多数癌症死亡是由此类继发性肿瘤引起的。
尽管在癌症诊断和治疗中有数十年的进步,许多癌症直到它们的发展晚期才检测到。结果是,初始生长部位处的许多实体瘤含有遗传和/或表型异质肿瘤细胞群体,它们常常是空间上分隔的。原发性肿瘤内的这些癌细胞群体中的一个或多个可能产生继发性转移性肿瘤。另外,肿瘤块常常由或是由肿瘤募集以形成支持性环境(例如血管)或是最初作为防御机制由宿主吸引至肿瘤(例如免疫细胞),但稍后随着癌症进化而被克服的正常细胞组成。
发明概述
在本公开的一个方面是一种自组织样品分隔细胞颗粒的方法,其包含:(i)将组织样品匀浆以提供经过匀浆的组织样品；(ii)将经过匀浆的样品解离成离散单元细胞颗粒；并(iii)将经过匀浆的组织样品内的细胞颗粒分选入至少第一细胞颗粒群体和第二细胞颗粒群体,其中两种群体的尺寸分布的差异形成它们的分开的根本基础。在一些实施方案中,细胞颗粒的分选是用微流控装置实现的。在一些实施方案中,在分选前不进行染色。在一些实施方案中,在分选前进行染色(例如使用抗体染色,然后添加连接珠的二抗,它增强尺寸差异)。在一些实施方案中,细胞颗粒是细胞,且其中第一细胞颗粒群体包含正常细胞且第二细胞颗粒群体包含肿瘤细胞。在一些实施方案中,正常细胞具有小于12μm的平均直径且肿瘤细胞具有大于12μm的平均直径。在一些实施方案中,肿瘤细胞是自完整肿瘤,部分肿瘤,转移性肿瘤,部分转移性肿瘤,或淋巴结中至少一项衍生的。
在一些实施方案中,细胞颗粒是核,且其中第一细胞颗粒群体包含正常核且第二细胞颗粒群体包含肿瘤核。在一些实施方案中,正常核具有小于8.5μm的平均直径且肿瘤核具有大于8.5μm的平均直径。
在一些实施方案中,组织样品是自残留外科材料或活检样品中至少一项衍生的。在一些实施方案中,组织样品是在交联溶液中固定的组织样品。在一些实施方案中,组织样品是自在石蜡中包埋的固定样品衍生的。在一些实施方案中,在分选前进一步加工经过匀浆的样品,其中进一步加工包含消化经过匀浆的样品内的蛋白质,加热样品,或过滤经过匀浆的样品中至少一项。
在一些实施方案中,使用微流控装置来分开细胞颗粒群体。在一些实施方案中,微流控装置是确定性侧向位移装置。在一些实施方案中,微流控装置是水泳(Hydrophoretic)过滤装置。在一些实施方案中,微流控装置是流体动力学过滤装置。在一些实施方案中,微流控装置利用弯曲通道中的惯性聚焦。在一些实施方案中,微流控装置利用直行通道中的惯性聚焦。在一些实施方案中,直行通道中的惯性聚焦包含夹窄流分级加工或流体动力学扩散加工之一。
在一些实施方案中,该方法进一步包含对第一或第二细胞颗粒群体内的细胞颗粒测定第一生物标志物的步骤。在一些实施方案中,第一生物标志物的存在指示癌症,或以其它方式提供关于癌症患者的临床进展的信息。在一些实施方案中,第一生物标志物是免疫细胞标志物。在一些实施方案中,该方法进一步包含对第一和第二细胞颗粒群体分析RNA生物标志物。例如,可使用主要包含正常细胞的第一细胞颗粒群体的RNA表达分析来鉴定在浸润性免疫细胞中找到的免疫细胞群体的类型。在一些实施方案中,该方法进一步包含对第一和第二细胞颗粒群体分析蛋白质生物标志物。
在一些实施方案中,使用下一代测序对第一和第二细胞颗粒群体中每一项独立测序。在一些实施方案中,使用流式细胞术独立分析第一和第二细胞颗粒群体中每一项。在一些实施方案中,第一和第二细胞颗粒群体为患者提供匹配的肿瘤和正常样品。在一些实施方案中,分析匹配的肿瘤和正常样品以鉴定体细胞突变,拷贝数变异,或其它遗传改变。
在本公开的另一个方面是一种自组织样品分隔细胞的方法,其包含:将组织样品匀浆以提供经过匀浆的组织样品；并使用分选装置通过尺寸分选经过匀浆的样品中的细胞,其中将细胞分选入至少第一和第二细胞群体,第一细胞群体富含具有范围为约5μm至约12μm的平均直径的细胞,且第二细胞群体富含具有范围为约12μm至约50μm的平均直径的细胞。在一些实施方案中,第一细胞群体富集非肿瘤细胞,且其中第二细胞群体富集肿瘤细胞。
在一些实施方案中,第一细胞群体中至少80％的细胞具有范围为约5μm至约12μm的平均直径,且其中第二细胞群体中至少80％的细胞具有范围为约12μm至约50μm的平均直径(即经由装置的分选产生含有80％靶群体的样品)。在一些实施方案中,第一细胞群体中至少90％的细胞具有范围为约5μm至约12μm的平均直径,且其中第二细胞群体中至少90％的细胞具有范围为约12μm至约50μm的平均直径。
在一些实施方案中,第一或第二细胞群体是罕见的(低于10％),而且分选的成功结果会是将该群体富集至至少20％,至少30％,至少40％,至少50％,至少60％,至少70％,或至少80％。在一些实施方案中,分选推动任何靶群体的百分比量加倍(例如使靶群体自约20％富集至约40％)。
在一些实施方案中,使用下一代测序对至少第一和第二细胞群体中每一项独立测序。在一些实施方案中,至少第一和第二细胞群体为患者提供匹配的肿瘤和正常细胞样品。在一些实施方案中,分析匹配的肿瘤和正常细胞以鉴定体细胞突变,拷贝数变异,或其它遗传改变。
在一些实施方案中,组织样品是自完整肿瘤,部分肿瘤,和/或淋巴结衍生的。在一些实施方案中,肿瘤样品是自残留外科材料或活检样品衍生的。在一些实施方案中,肿瘤样品是自在石蜡中包埋的样品衍生的。在一些实施方案中,组织样品是经过固定的组织样品,新鲜的组织样品,或其任何组合。
在一些实施方案中,在分选前进一步加工经过匀浆的组织样品。在一些实施方案中,进一步加工包含消化经过匀浆的样品内的蛋白质和过滤经过匀浆的样品的步骤。
在一些实施方案中,分选装置是微流控装置。在一些实施方案中,微流控装置是确定性侧向位移装置。在一些实施方案中,经过匀浆的组织样品内具有小于约12μm的临界直径的细胞与通行穿过装置的流体的对流一起移动,而经过匀浆的样品内具有大于约12μm的临界直径的细胞以由阵列的排列规定的方向移动。在一些实施方案中,经过匀浆的组织样品内具有小于约8.5μm的临界直径的核与通行穿过装置的流体的对流一起移动,而经过匀浆的样品内具有大于约8.5μm的临界直径的核以由阵列的排列规定的方向移动。在一些实施方案中,微流控装置是水泳过滤装置。在一些实施方案中,微流控装置是流体动力学过滤装置。在一些实施方案中,微流控装置采用弯曲通道中的惯性聚焦。在一些实施方案中,微流控装置采用直行通道中的惯性聚焦。在一些实施方案中,直行通道中的惯性聚焦包含夹窄流分级加工或流体动力学扩散加工之一。在一些实施方案中,分选装置不要求将细胞或核染色的步骤。
在一些实施方案中,该方法进一步包含对第一或第二群体内的细胞测定第一生物标志物的步骤。在一些实施方案中,第一生物标志物是如果存在的话指示癌症的生物标志物。在一些实施方案中,第一生物标志物是免疫细胞标志物。在一些实施方案中,该方法进一步包含对第一和第二细胞颗粒群体分析RNA生物标志物。在一些实施方案中,该方法进一步包含对第一和第二细胞颗粒群体分析蛋白质生物标志物。
在本公开的另一个方面是一种自新鲜的组织样品分隔细胞的方法,其包含:将新鲜的组织样品匀浆以提供经过匀浆的组织样品；使用分选装置通过尺寸分选经过匀浆的组织样品中的细胞,其中将细胞分选入至少第一和第二细胞群体,第一细胞群体富含具有范围为约6μm至12μm的平均直径的细胞,且第二细胞群体富含具有大于12μm的平均直径的细胞。在一些实施方案中,在分选前进行染色。在一些实施方案中,在分选前不进行染色。
在一些实施方案中,分选装置是微流控装置。在一些实施方案中,微流控装置是确定性侧向位移装置。在一些实施方案中,经过匀浆的样品内具有小于约6μm的临界直径的细胞与通行穿过装置的流体的对流一起移动,而经过匀浆的样品内具有大于约6μm的临界直径的细胞以由阵列的排列规定的方向移动。在一些实施方案中,微流控装置是水泳过滤装置。在一些实施方案中,微流控装置是流体动力学过滤装置。在一些实施方案中,微流控装置利用弯曲通道中的惯性聚焦。在一些实施方案中,微流控装置利用直行通道中的惯性聚焦。在一些实施方案中,直行通道中的惯性聚焦包含夹窄流分级加工或流体动力学扩散加工之一。在一些实施方案中,分选装置不要求将细胞染色的步骤。
在本公开的另一个方面是一种对样品内的基因组材料测序的方法,其包含:将组织样品匀浆以提供经过匀浆的组织样品；并对细胞或细胞核的至少第一群体测序,其自经过匀浆的组织样品衍生,富集肿瘤细胞或肿瘤核。在一些实施方案中,用微流控装置分选经过匀浆的肿瘤样品内的细胞或细胞核以提供细胞或细胞核的两种群体。在一些实施方案中,第一细胞群体内至少70％的细胞或细胞核是肿瘤细胞。在一些实施方案中,第一细胞群体内至少70％的细胞或细胞核具有大于12μm(细胞)或8.5μm(核)的尺寸。在一些实施方案中,第一细胞群体内至少80％的细胞或细胞核是肿瘤细胞或肿瘤核。
在一些实施方案中,依照它们的流体动力学尺寸分选自经过匀浆的组织样品衍生的细胞或细胞核。在一些实施方案中,用微流控装置分选细胞或细胞核。在一些实施方案中,微流控装置不要求在分选前将细胞或细胞核染色。在一些实施方案中,微流控装置采用确定性侧向位移,水泳过滤,流体动力学过滤,弯曲通道中的惯性聚焦,和直行通道中的惯性聚焦之一。
在一些实施方案中,第一细胞或细胞核群体包含至少0.05微克基因组材料用于测序。在一些实施方案中,第一细胞或细胞核群体包含至少0.1微克基因组材料用于测序。在一些实施方案中,第一细胞或细胞核群体包含至少0.5微克基因组材料用于测序。在一些实施方案中,测序方法包含测序前至多4个扩增循环。在一些实施方案中,测序方法包含测序前至多6个扩增循环。在一些实施方案中,测序方法包含测序前至多8个扩增循环。在一些实施方案中,不需要测序前扩增循环。
在本公开的另一个方面是一种自肿瘤样品衍生肿瘤核的富集群体和正常核的富集群体的方法,其包含自肿瘤样品解离肿瘤和正常核；并用微流控分选装置通过尺寸分选肿瘤和正常核,其中微流控分选装置不要求在分选前染色或生物标志物分析的步骤。在一些实施方案中,肿瘤核的富集群体包含至少85％肿瘤核；且其中正常核的富集群体包含至少85％正常核。在一些实施方案中,肿瘤核的富集群体内的肿瘤核包含大于8.5μm的平均核尺寸。在一些实施方案中,正常核的富集群体内的正常核包含小于8.5μm的平均核尺寸。在一些实施方案中,分选推动任何靶群体的百分比量加倍(例如使靶群体自约20％富集至约40％)。
在一些实施方案中,该方法进一步包含对肿瘤核的富集群体和正常核的富集群体分开测序的步骤。在一些实施方案中,在肿瘤核的富集群体中鉴定体细胞突变,拷贝数变异,或其它遗传改变中至少一项。
在一些实施方案中,肿瘤样品是自完整肿瘤,部分肿瘤,一个或多个淋巴结,和/或在石蜡中包埋的样品衍生的。在一些实施方案中,肿瘤样品包含新鲜解离的组织。
在本公开的另一个方面是一种通过鉴定对特定治疗或活性药学组分有响应的癌症亚型来治疗癌症的方法,其中通过对富含肿瘤细胞的样品测序来鉴定癌症亚型,其中通过将输入组织(例如包含肿瘤,一个或多个淋巴结,或血液中至少一项的样品)匀浆；并用基于尺寸的分选装置分选经过匀浆的样品中的肿瘤细胞或肿瘤核与正常细胞或正常核使样品富集肿瘤细胞或肿瘤核,且其中基于尺寸的分选装置不要求在分选前将肿瘤细胞或肿瘤核染色。在一些实施方案中,在分选前实施染色。在一些实施方案中,富含肿瘤细胞或肿瘤核的细胞群体包含足够量的基因组材料,使得在测序前进行至多四个扩增循环。
在一些实施方案中,在测序前进行至多2个扩增循环。在一些实施方案中,基因组材料的数量是至少0.01微克。在一些实施方案中,基因组材料的数量是至少0.1微克。在一些实施方案中,基因组材料的数量是至少0.2微克。在一些实施方案中,基因组材料的数量是至少0.5微克。在一些实施方案中,在鉴定癌症亚型后,对自其衍生样品的患者提供治疗过程。在一些实施方案中,基于尺寸的分选装置不要求在分选前染色的任何步骤。在一些实施方案中,在分选前进行染色。
在本公开的另一个方面是一种通过鉴定肿瘤细胞或肿瘤核中的体细胞突变来治疗癌症的方法,其包含将自患者衍生的组织样品匀浆；解离经过匀浆的组织样品内的细胞；并用微流控装置分开解离的组织样品中的肿瘤细胞或肿瘤核与正常细胞或正常核以提供第一群体,其富集肿瘤细胞或肿瘤核,具有范围为约5μm至约12μm(细胞)或4μm至约8.5μm(核)的平均直径,和第二群体,其富集正常细胞或正常核,具有范围为约12μm至约50μm(细胞)或8.5μm至约25μm(核)的平均直径,其中微流控装置不要求在分选前染色或标记。在一些实施方案中,微流控装置采用确定性侧向位移,水泳过滤,流体动力学过滤,弯曲通道中的惯性聚焦,和直行通道中的惯性聚焦之一。在一些实施方案中,在没有首先将细胞染色的情况下富集细胞群体。
在本公开的另一个方面是一种自组织样品分隔细胞,核,或组织聚集体以推动下游分析的方法,其包含:自组织样品分开细胞,核,或组织聚集体以提供分开的样品；使用分选装置通过尺寸分选分开的样品中的细胞,核,或组织聚集体,其中将细胞,核,或组织聚集体分选入第一和第二群体,第一群体具有第一细胞,核,或组织聚集体平均直径且第二群体具有第二细胞,核,或组织聚集体平均直径。在一些实施方案中,分选装置是微流控装置。在一些实施方案中,微流控装置采用确定性侧向位移,水泳过滤,流体动力学过滤,弯曲通道中的惯性聚焦,和直行通道中的惯性聚焦之一。在一些实施方案中,该方法进一步包含对第一或第二群体中至少一项实施基因组分析的步骤。在一些实施方案中,该方法进一步包含对第一或第二群体中至少一项实施流式细胞术分析的步骤。在一些实施方案中,该方法进一步包含将第一或第二群体中至少一项针对至少一种生物标志物的存在染色的步骤。
在本公开的另一个方面是一种富集肿瘤细胞的组合物,肿瘤细胞具有大于12μm的尺寸,其中在没有首先将肿瘤或正常细胞染色的情况下分开肿瘤细胞与正常细胞。在本公开的另一个方面是一种富集肿瘤核的组合物,肿瘤核具有大于8.5μm的尺寸,其中在没有首先将肿瘤或正常核染色的情况下分开肿瘤核与正常核。在一些实施方案中,至少40％的组合物包含肿瘤细胞或核。在一些实施方案中,至少50％的组合物包含肿瘤细胞或核。在一些实施方案中,至少60％的组合物包含肿瘤细胞或核。在一些实施方案中,至少70％的组合物包含肿瘤细胞或核。在一些实施方案中,至少80％的组合物包含肿瘤细胞或核。在一些实施方案中,至少90％的组合物包含肿瘤细胞或核。在一些实施方案中,至少95％的组合物包含肿瘤细胞或核。在一些实施方案中,肿瘤群体是罕见的(低于10％),而且组合物在分选后会将该群体富集至至少20％,至少30％,至少40％,至少50％,至少60％,至少70％,或至少80％。在一些实施方案中,经过富集的样品的组合物是肿瘤群体的初始百分比的加倍。
在本公开的另一个方面是一种包含第一细胞群体和第二细胞群体的试剂盒,第一细胞群体实质性富集具有大于12μm的尺寸的肿瘤细胞,第二细胞群体实质性富集具有小于12μm的尺寸的正常细胞,第一和第二细胞群体是自相同的肿瘤样品衍生的,且其中肿瘤细胞和正常细胞是未染色的。在本公开的另一个方面是一种包含第一核群体和第二核群体的试剂盒,第一核群体实质性富集具有大于8.5μm的尺寸的肿瘤核,第二核群体实质性富集具有小于8.5μm的尺寸的正常核,第一和第二核群体是自相同肿瘤样品衍生的,且其中肿瘤核和正常核是未染色的。
当前的诊断工具在充分代表构成肿瘤块的遗传上异质的癌细胞和不同细胞类型方面面对重大障碍,主要因为当前的肿瘤采样方案对于所有诊断测试仅仅使用每个肿瘤很小的局部部分。申请人开发了一种对肿瘤采样的新办法,使得可以自采样的肿瘤衍生有意义的信息。如本文中详述的,实现这一目标容许更加精确的对驱动癌症的改变的快照,对于患者更好的治疗办法,和对治疗抗性的潜在机制更好的预测。
认为自复杂的,异质的混合物分离和分选细胞代表生物学,生物技术,和医学的许多领域的关键任务。确实,认为不同肿瘤具有不同百分比的肿瘤细胞和正常细胞。结果是,认为对来自具有较高百分比的污染性正常组织(例如由于免疫浸润)的肿瘤的代表性样品测序更加昂贵,因为一部分读数会“浪费”在正常DNA上。如本文中使用的,“读数”指在测序过程结束后获得的簇的序列,其最终是片段化核酸序列的独特片段的节段的序列。当前来自肿瘤组织卷(来自块)的临床测序也无意地在污染性正常组织上浪费读数(如本文中使用的,“组织卷”指自FFPE块切得的限定厚度的组织切片,通常用切片机)。如此,认为代表性样品和存档组织样品(来自块)二者中肿瘤和正常(免疫)细胞的混合物对肿瘤组织测序提出挑战。
另外,常常重要的是对来自相同患者的分开的非恶性组织来源测序从而定义除了非恶性组织中存在的遗传多态性之外真正的体细胞突变。对于存档肿瘤块,可能尚未收集这些非恶性组织。而且,可能有自肿瘤组织分离免疫成分对其而言是至关紧要的测序应用。鉴于此,需要自代表性样品和组织块富集正常组织。
肿瘤细胞和正常(免疫)细胞(其常常表达对每种类型的组织而言独特的生物标志物)的混合物还使得通过流式细胞术分析解离的代表性样品更加困难。认为在下游分析前分开不同细胞类型的能力会能够更加直截了当地通过流式细胞术分析解离的固定组织样品。
鉴于前述,申请人开发了一种分选方法,由此可以将肿瘤细胞颗粒和正常细胞颗粒的异质混合物富集或纯化成一种或多种明确定义的群体(例如肿瘤群体或正常细胞群体),从而增强研究,肿瘤分析,和其它下游加工任务(例如基因组测序,FACS分析,RNA或蛋白质生物标志物分析)的效率。在一些实施方案中,由申请人开发的方法不要求在分选前染色或标记细胞或核,如此建立与荧光激活细胞分选(FACS)或采用磁激活细胞分选的方法相比卓越的分选方法(尽管可以在分选前采用染色)。而且,认为依照本公开的生成细胞颗粒(例如细胞或细胞核)的富集群体的方法容许降低基因组测序的成本。申请人还认为本文中公开的方法可用于自一份患者样品,诸如自残留外科材料或提取的存档样品(来自石蜡块)生成匹配的肿瘤和正常细胞群体。
申请人还发现本文中描述的分选装置推动为每位患者提供匹配的肿瘤样品和正常样品,从而能够经由测序鉴定真正的体细胞突变,尤其是对于缺乏来自相同患者的非恶性组织样品的存档样品。认为肿瘤和正常群体的富集还可以降低测序的成本并潜在简化通过流式细胞术的分析。
附图简述
图1列出图示依照本公开的一个实施方案的方法的流程图。
图2列出图示依照本公开的另一个实施方案的方法的流程图。
图3列出图示依照本公开的另一个实施方案的方法的流程图。
图4列出图示依照本公开的另一个实施方案的方法的流程图。
图5A列出自代表性结肠腺癌肿瘤样品制备的核的尺寸分布,该图显示Coulter计数仪分析,使用移动平均平滑迹线。对颗粒定尺寸和计数的Coulter方法基于由在电解质中悬浮的非导电颗粒产生的电阻抗的可测量变化。将在Coulter计数仪上测量的颗粒分组入相同尺寸的仓(尺寸仓)。在水平轴上报告的尺寸仓数值指越来越大的颗粒直径。使用显微图像,我们凭经验估计约“50”的尺寸仓大致与约6μm直径相关；约“100”的尺寸仓大致与约9μm直径相关,而约“150”的尺寸仓大致与约14μm直径相关。
图5B列出自代表性肺鳞状细胞癌肿瘤样品制备的核的尺寸分布,该图显示Coulter计数仪分析,使用移动平均平滑迹线。
图6A提供自结肠肿瘤代表性样品分离的核的流式细胞术数据的直方图并进一步图示阳性细胞角蛋白(CK)染色可区分肿瘤核与正常核。左边的小图(i)代表CK染色强度,通过TSA-罗丹明101显现。为CK阳性和CK阴性核建立门。中间的小图(ii和iii)代表DAPI染色强度,作为由小图i中的门定义的CK阴性和阳性群体的DNA含量的读出。注意小图(ii)(CK阴性)中DAPI染色强度的单峰和小图iii(CK阳性)中的多峰。右边的小图(iv和v)显示依照小图(i)中确定的门流式分选的核的CK染色强度的直方图。小图iv显示作为CK阴性定义的富集的颗粒的分析,而小图v显示定义为CK阳性的那些的富集。
图6B提供自肺肿瘤代表性样品分离的核的流式细胞术数据的直方图并进一步图示阳性细胞角蛋白(CK)染色可区分肿瘤核与正常核。左边的小图(i)代表CK染色强度,通过TSA-罗丹明101显现。为CK阳性和CK阴性核建立门。中间的小图(ii和iii)代表DAPI染色强度,作为由小图i中的门定义的CK阴性和阳性群体的DNA含量的读出。注意小图(ii)(CK阴性)中DAPI染色强度的单峰和小图iii(CK阳性)中的多峰。右边的小图(iv和v)显示依照小图(i)中确定的门流式分选的核的CK染色强度的直方图。小图iv显示作为CK阴性定义的富集的颗粒的分析,而小图v显示定义为CK阳性的那些的富集。
图7A列出自代表性结肠腺癌肿瘤样品分选的核的尺寸分布。该图显示Coulter计数仪分析,使用移动平均平滑迹线。点迹线对应于未分选的核；短划迹线对应于使用FACS分选的细胞角蛋白(CK)阴性核；实迹线对应于使用FACS分选的细胞角蛋白(CK)阳性核。
图7B列出自代表性肺鳞状细胞癌肿瘤样品分选的核的尺寸分布。该图显示Coulter计数仪分析,使用移动平均平滑迹线。点迹线对应于未分选的核；短划迹线对应于使用FACS分选的细胞角蛋白(CK)阴性核；黑色迹线对应于使用FACS分选的细胞角蛋白(CK)阳性核。
图8列出自代表性肿瘤样品提取的单细胞的分布。图显示自结肠肿瘤解离的单细胞(顶部),自扁桃体解离的单细胞(底部),和自结肠肿瘤解离,然后用FACS分选的EpCAM阳性细胞的Coulter计数仪分析。
图9列出自福尔马林固定的扁桃体(黑色迹线)和福尔马林固定,石蜡包埋的扁桃体(灰色迹线)解离的细胞的尺寸分布。图显示Coulter计数仪分析,使用移动平均平滑迹线。
图10图示通过夹窄流分级的细胞分选。A)在夹窄的区段中,细胞首先被推向壁,然后在微流控通道变宽时按照尺寸分开。B)细胞在通道的夹窄的区段中对齐,并在离开夹窄的区段后遵循分开的流线从而通过尺寸分选。
图11图示通过确定性侧向位移的细胞分选。由于微流控通道中的微立柱的工程尺寸和间距,在初始流线中大细胞(以蓝色描绘)远离小细胞(以红色描绘)迁移。
图12图示通过流体动力学过滤的细胞分选。A)将细胞注射入微流控装置并推向出口。B)小细胞出近端分支离开而C)大细胞出远端分支离开。
图13A图示在包括一个主通道和多个侧通道的流体动力学过滤装置中进行几何定向滚动的一种办法。
图13B提供在主通道和侧通道之间的分支处的流速分布的特写视图。
图13C图示供在当前公开的方法内使用涵盖的另一种微流控装置。本文中公开的Vortex HE装置具有以8串联且以8并联的贮器。(a)最初细胞遍及通道截面分布。(b)在行进预定距离后,经历较大惯性升力的较大细胞(例如肿瘤细胞)朝向通道壁迁移。(c)位于壁附近的较大细胞(例如肿瘤细胞)经历足够的升力以进入贮器并保持稳定捕获,而较小细胞(例如正常细胞)或是不进入贮器或是不保持捕获并返回主流。
图14图示结肠和肺肿瘤样品的相对细胞尺寸的分布。
图15A图示FACS富集的肿瘤样品的测序数据,其中基于升高的克隆性肿瘤突变的等位基因分数将大细胞鉴定为肿瘤细胞。在这里,Coulter计数仪迹线显示来自结肠腺癌的未分选的和FACS富集的肿瘤核的相对尺寸。
图15B图示FACS富集的肿瘤样品的测序数据,其中基于升高的克隆性肿瘤突变的等位基因分数将大细胞鉴定为肿瘤细胞。在这里,条形图显示来自结肠肿瘤代表性样品匀浆物(未分选的)和FACS分选的肿瘤核(CK阳性)(来自图15A)的测序数据的样品覆盖率和肿瘤纯度。
图15C图示FACS富集的肿瘤样品的测序数据,其中基于升高的克隆性肿瘤突变的等位基因分数将大细胞鉴定为肿瘤细胞。在这里,在大块代表性样品匀浆物和FACS分选的肿瘤核二者中检测到肿瘤突变(n＝351)。另外,在仅FACS分选的核(n＝68)和仅匀浆物(n＝6)中检测到一些肿瘤突变。在FACS分选的核中更多地检测到肿瘤突变指示由于肿瘤核的富集提高基因组测定法的灵敏度。
图15D图示FACS富集的肿瘤样品的测序数据,其中基于升高的克隆性肿瘤突变的等位基因分数将大细胞鉴定为肿瘤细胞。图显示匀浆物对FACS分选的核中两种克隆性驱动物的等位基因频率。注意,对于FACS分选的肿瘤核,突变型等位基因频率(MAF％)接近50％,这是对显性克隆性驱动物突变预期的上限。
图16A提供自固定的扁桃体组织解离的核的明场图像。图示的插图显示增大的放大倍数的核。下部的小图显示用于ImageJ中的面积计算的掩模(黑色轮廓)。比例尺是100μm。
图16B提供显示使用(A)中扁桃体核和来自含有大于80％肿瘤含量的卵巢肿瘤的肿瘤核的图像计算尺寸范围的图。扁桃体核的平均尺寸计算为6.7μm,而肿瘤核的平均尺寸是13.0μm。8.5μm的截留会容许分开两种群体。
图16C提供显示使用扁桃体细胞和来自含有40％左右肿瘤细胞含量(通过流式细胞术测量,未显示)的结肠癌的肿瘤细胞的图像计算的尺寸范围的图。扁桃体细胞的平均尺寸计算为8.7+/-1.5μm,而由40％左右肿瘤细胞,60％正常细胞组成的结肠肿瘤样品中的细胞的平均尺寸是12.0+/-4.2μm。假设正常细胞遵循扁桃体细胞的尺寸分布,12μm左右的截留会容许富集肿瘤细胞。支持这一点,结肠肿瘤样品中40％的细胞为12μm或更大。
发明详述
概览
一般而言,本公开提供一种方法,其自组织样品(例如肿瘤样品,淋巴结样品,等)分开或分隔细胞颗粒(例如细胞,核)和/或小组织聚集体(步骤100),然后诸如通过尺寸或流体动力学尺寸,将细胞颗粒和/或小组织聚集体分选入两种或更多种群体(例如肿瘤细胞颗粒群体,正常细胞颗粒群体)(步骤110),使得可以分析每种细胞颗粒群体和/或小组织聚集体(步骤120)(见图1)。照此,本公开得以实现一种用于在测序和/或蛋白质或RNA生物标志物分析上游将固定的解离的组织分级的办法。在一些实施方案中,对每种细胞颗粒群体或其分选的级分富集特定类型的细胞颗粒(例如肿瘤细胞,正常细胞,肿瘤核,正常核)或肿瘤组织聚集体或正常组织聚集体。
本公开还提供用于富集和分析肿瘤细胞颗粒和正常细胞颗粒的亚群体(例如肿瘤细胞,正常细胞,肿瘤核,正常核)的装置,例如微流控装置,和使用此类装置的方法。在一些实施方案中,本公开的装置并入阵列,诸如阻碍物的阵列,其容许具有预定尺寸的细胞,核,或组织聚集体位移,从而提供一种机制来提供富含某种细胞群体,核,或组织聚集体的样品。在一些实施方案中,依照典型地与正常细胞或肿瘤细胞有关的,诸如本文中公开的尺寸确定阵列的尺寸。
本公开进一步提供通过分析来自受试者的样品(步骤120)诊断受试者中的状况,例如癌症的方法,其中将样品与组织分开(步骤100),然后分选(步骤110),诸如用微流控分选装置,之后分析(步骤120)。在一些实施方案中,本公开提供一种分析细胞样品中的癌细胞或核的方法,其通过将细胞样品引入具有至少一个通道的装置,该通道包括以第一方向引导癌细胞或核以产生富含癌细胞或核的第一输出样品且以第二方向引导非癌细胞或核以产生富含非癌细胞或核的第二输出样品的结构；并对富含癌细胞或核的群体实施分析,例如基因组分析。在一些实施方案中,对癌和非癌细胞或核群体二者实施基因组分析。
在一些实施方案中,该方法容许提供与富集的正常组织匹配的肿瘤富集的组织,从而降低测序成本并实现生物信息学分析。
定义
还应当理解的是,除非有清楚的相反指示,在本文中请求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中,方法的步骤或动作的次序不必限于叙述方法的步骤或动作的次序。
如本文中使用的,单数术语“一个”,“一种”和“该”包括复数所指物,除非上下文有清楚的另外指示。类似地,词语“或”意图包括“和”,除非上下文有清楚的另外指示。术语“包括”的定义是包括在内,使得“包括A或B”意味着包括A,B,或A和B。
如本文中在说明书和权利要求书中使用的,“或”应当理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的含义。例如,在分开列表中的项时,“或”或“和/或”应当解读为包括在内,即包括至少一项,但是还包括一些要件或要件列表中的多于一项,和任选的另外的未列出的项。只有术语清楚指示相反,诸如“仅仅之一”或“恰好之一”,或者当在权利要求书中使用时,“由……组成”会指包括一些要件或要件列表中的恰好一项要件。一般而言,如本文中使用的,术语“或”在伴有排他性的术语,诸如“任一”,“之一”,“仅仅之一”或“恰好之一”时仅仅应当解读为指示排他性替代方案(即“一或另一但非二者”)。当在权利要求书中使用时,“本质上由……组成”应当具有它在专利法领域中使用的普通含义。
如本文中在说明书中和在权利要求书中使用的,短语“至少一个/种”在提及一个/种或多个/种要件的列表时应当理解为意味着选自要件列表中的任何一个/种或多个/种要件的至少一个/种要件,但是不必包括要件列表内具体列出的每种和每一种要件中至少一项且不排除要件列表中的任何要件组合。这种定义还容许可以任选存在除了短语“至少一个/种”所指要件列表内具体鉴别的要件以外的要件,无论与具体鉴别的那些要件相关或无关。如此,作为非限制性例子,“A和B中至少一项”(或等同的“A或B中至少一项”或等同的“A和/或B中至少一项”)在一个实施方案中可以指至少一个,任选包括多于一个A,B不存在(且任选包括除了B以外的要件)；在另一个实施方案中指至少一个,任选包括多于一个B,A不存在(且任选包括除了A以外的要件)；在还有另一个实施方案中指至少一个,任选包括多于一个A,和至少一个,任选包括多于一个B(且任选包括其它要件)；等。
如本文中使用的,术语“包含”,“包括”,“具有”,等等可互换使用且具有相同的含义。具体地,每一种术语的定义与“包含”的常用美国专利法定义一致且因此解读为开放式术语,意味着“至少下述”且还解读为不排除另外的特征,限制,方面,等。如此,例如,“具有构件a,b,和c的装置”意味着装置至少包括构件a,b和c。类似地,短语“牵涉步骤a,b,和c的方法”意味着方法至少包括步骤a,b,和c。而且,虽然在本文中可能以特定次序概述步骤和过程,但是技术人员会认识到步骤和过程的次序可以变化。如本文中使用的,术语“扩增”指倍增原始数量的核酸模板以获得更大数量的原始核酸的过程。
同样,术语“扩增”指使用例如多种引物延伸反应任一复制核酸的一部分的过程。例示性引物延伸反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)。除非具体说明,“扩增”指单次复制或算术,对数,或指数扩增。一般而言,PCR是在没有克隆或纯化的情况下提高基因组DNA的混合物中的一段靶序列的浓度的方法。这种用于扩增靶序列的过程由将大大过量的两种寡核苷酸引物引入至含有期望靶序列的DNA混合物,继以在DNA聚合酶存在下精确顺序的热循环组成。两种引物与双链靶序列中它们各自的链互补。为了实现扩增,将混合物变性,然后使引物与靶分子内它们的互补序列退火。在退火后,用聚合酶(例如DNA聚合酶)延伸引物从而形成一对新的互补链。变性,引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即变性,退火和延伸构成一个“循环”；可以有众多“循环”)以获得高浓度的期望靶序列的扩增区段(扩增子)。期望靶序列的扩增区段的长度由引物彼此而言的相对位置决定,因此,这种长度是可控制的参数。聚合酶链式反应(“PCR”)描述于例如美国专利No.4,683,202；美国专利No.4,683,195；美国专利No.4,000,159；美国专利No.4,965,188；美国专利No.5,176,995),据此通过援引将每一篇的公开内容完整收入本文。
如本文中使用的,术语“生物学样品”或“组织样品”指自任何生物体,包括病毒获得的包括生物分子(诸如蛋白质,肽,核酸,脂质,碳水化合物,或其组合)的任何样品。生物体的其它例子包括哺乳动物(诸如人；兽医动物,像猫,犬,马,牛,和猪；和实验室动物,像小鼠,大鼠和灵长动物),昆虫,环节动物,节肢动物,有袋动物,爬行动物,两栖动物,细菌,和真菌。生物学样品包括组织样品(诸如组织切片和组织的针活检),细胞样品(诸如细胞学涂片,诸如Pap涂片或血液涂片或通过显微解剖获得的细胞的样品),或细胞级分,碎片或细胞器(诸如通过裂解细胞并通过离心或其它方式分开它们的成分而获得的)。生物学样品的其它例子包括血液,血清,尿液,精液,粪便,脑脊液,间质液,粘液,泪液,汗液,脓,活检组织(例如通过外科活检或针活检获得的),乳头抽吸物,耵聍,乳液,阴道液,唾液,拭子(诸如颊拭子),或自第一生物学样品衍生的含有生物分子的任何材料。在某些实施方案中,如本文中使用的,术语“生物学样品”指自肿瘤或其部分(自受试者获得的)制备的样品(诸如匀浆或液化样品)。
如本文中使用的,术语“生物标志物”指在血液,其它体液,或组织中找到的,作为正常或异常过程,或状况或疾病(诸如癌症)的迹象的生物学分子。可使用生物标志物来确定身体如何好地响应用于疾病或状况的治疗或受试者是否易患疾病或状况。在癌症的语境中,生物标志物指指示身体中癌症的存在的生物学物质。生物标志物可以是由肿瘤分泌的分子或身体对癌症的存在的特定响应。可使用遗传,表观遗传,蛋白质组,糖组,和成像生物标志物进行癌症诊断,预后,和流行病学。可以在非侵入性收集的生物流体中测定此类生物标志物,像血液或血清。早就在患者护理中使用数种基于基因和蛋白质的生物标志物,包括但不限于AFP(肝癌),BCR-ABL(慢性髓样白血病),BRCA1/BRCA2(乳腺/卵巢癌),BRAF V600E(黑素瘤/结肠直肠癌),CA-125(卵巢癌),CA19.9(胰腺癌),CEA(结肠直肠癌),EGFR(非小细胞肺癌),HER-2(乳腺癌),KIT(胃肠基质肿瘤),PSA(前列腺特异性抗原),S100(黑素瘤),等等。生物标志物作为诊断(用于鉴定早期阶段癌症)和/或预后(用于预报癌症有多具攻击性和/或预测受试者会如何响应特定治疗和/或癌症有多大可能复发)可能是有用的。
如本文中使用的,术语“富集的样品”意味着已经加工包含成分的样品以相对于样品中典型存在的其它成分提高感兴趣成分的相对数目(population)。在一些实施方案中,本文中公开的方法利用装置自包含细胞类型(例如肿瘤细胞和正常细胞)的混合物的流中的其它类型的细胞富集或分选至少一种类型的细胞。如本文中使用的,术语“富集”(和类似地术语“分离”或“分选”)并不意味着富集的靶细胞,核,或组织聚集体与其它非靶细胞,核,或组织聚集体是100％分离的,而是仅仅意味着与起始混合物相比混合物已经经历一些量的富集。例如,可以通过将感兴趣细胞的相对数目(population)提高至少10％,25％,50％,75％,100％或至少10,100,1,000,10,000,100,000,1,000,000,10,000,000,或甚至100,000,000的因子来富集样品。
如本文中使用的,术语“细胞颗粒”指个体细胞或自细胞释放的细胞器。在一些实施方案中,自细胞释放的细胞器是细胞核。在其它实施方案中,自细胞释放的细胞器是细胞核,其含有可用于鉴定核起源细胞的细胞质材料的残留物。例如,细胞角蛋白可保持附着于核且可用作源自肿瘤细胞的核的蛋白质标志物。
如本文中使用的,术语“固定的”指组织样品已经在交联溶液中温育,目的是保持组织样品的细胞和/或构造完整性。交联溶液的常见例子包括中性缓冲的福尔马林,甲醇,含醇福尔马林,Bouins,等。
如本文中使用的,术语“H&E”指用初染料苏木精和伊红的染色。
如本文中使用的,术语“流体动力学尺寸”意味着当与流,阻碍物,或其它颗粒相互作用时颗粒的有效尺寸。它用作流中颗粒体积,形状,和变形性的通项。
如本文中使用的,术语“匀浆”指使生物学样品达到使得样品的所有级分在组成上相等的状态的过程。在本公开中,“匀浆”一般会保持样品内大多数细胞的完整性,例如样品中至少50,80,85,90,95,96,97,98,99,99.9％或更大百分比的细胞会作为匀浆过程的结果而破裂或裂解。匀浆物可以是实质性解离成个体细胞(或细胞簇)的且所得匀浆物是实质性均质的(由相似要件组成或构成或整个均匀)。
如本文中使用的,术语“标记物”或“染料”指能够结合分析物,内在化或以其它方式吸收,并检测(例如经由形状,形态,颜色,荧光,发光,磷光,吸光度,磁性,或放射性发射)的试剂。
如本文中使用的,术语“淋巴结”指遍及身体(包括腋窝和胃)广泛存在且通过淋巴管连接的淋巴系统的椭圆或肾形器官。淋巴结含有多种免疫细胞,包括但不限于B细胞和T细胞。在一些实施方案中,淋巴结可含有隐藏的肿瘤细胞。
如本文中使用的,术语“微流控”意味着具有至少一个小于1mm的维度。
如本文中使用的,术语“下一代测序(NGS)”指与传统Sanger和基于毛细管电泳的办法相比具有高通量测序的测序技术,其中平行实施测序过程,例如一次生成数千或数百万相对较小序列读数。下一代测序技术的一些例子包括但不限于通过合成的测序,通过连接的测序,和通过杂交的测序。这些技术生成较短读数(25-500bp之间任何地方)但在相对较短时间中生成数十万或百万读数。术语“下一代测序”指当前得到Illumina,LifeTechnologies,和Roche等采用的所谓的平行化通过合成的测序或通过连接的测序平台。下一代测序方法还可以包括纳米孔测序方法或基于电子检测的方法,诸如由LifeTechnologies商业化的Ion Torrent技术。
如本文中使用的,术语“正常组织”指没有推定与疾病或在癌症的语境中的恶性的发生率升高有关的可检测损害或异常的组织。这些正常样品可以衍生自具有与疾病(遗传或其它方面的),癌症或恶性的发生率升高有关的遗传突变或状况的患者。正常组织可以是与来自相同个体,或不同个体的病理组织对应的相同类型的组织；或与来自相同个体或其他个体的病理组织无关的正常组织(例如来自身体中的不同位置或具有不同组织学类型)。
如本文中使用的,术语“阻碍物”指对通道(诸如微流控装置中的流通道)中的流的障碍,例如自一个表面的凸出。例如,阻碍物可以指在基础基质上突出的立柱或对水性流体的疏水性屏障。在一些实施方案中,阻碍物可以是部分可渗透的。例如,阻碍物可以是用多孔材料制成的立柱,其中孔容许水性成分穿透但对于分出的颗粒进入而言太小。
如本文中使用的,术语“代表性样品”和“代表性采样”指精确反映整体的成分的样品(或样品子集),因而样品是整个群体的无偏指示。一般而言,这意味着代表性样品或其部分内不同类型的细胞和它们的相对比例或百分比本质上精确反映或模拟整个组织标本(一般是实体瘤或其部分)内这些细胞类型的相对比例或百分比。
如本文中使用的,“测序”或“DNA测序”指用于测定DNA寡核苷酸中核苷酸碱基,腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶,和胸腺嘧啶的次序的生化方法。如术语在本文中使用的,测序可以包括但不限于平行测序或本领域技术人员知道的任何其它测序方法,例如链终止方法,快速DNA测序方法,游荡点分析,Maxam-Gilbert测序,染料-终止子测序,或使用任何其它现代自动化DNA测序仪器。
如本文中使用的,术语“实质性”意味着展现全部或接近全部程度的感兴趣特征或特性的定性条件。本领域技术人员会理解生物学和化学现象很少(如果有的话)完成和/或行进至完成或实现或避免绝对结果。在一些实施方案中,“实质性”意味着在约20％内。在一些实施方案中,“实质性”意味着在约15％内。在一些实施方案中,“实质性”意味着在约10％内。在一些实施方案中,“实质性”意味着在约5％内。
如本文中使用的,术语“肿瘤”指自身定义为通常比正常细胞生长更加快速且如果不治疗的话会继续生长,有时导致对邻近结构的损害的细胞的异常新生长的块或赘生物。肿瘤尺寸可以广泛变化。肿瘤可以是实体的或流体填充的。肿瘤可以是良性(非恶性,一般无害)或恶性(能够转移)生长。一些肿瘤可含有良性的赘生性细胞(诸如原位癌)且同时含有恶性癌细胞(诸如腺癌)。这应当理解为包括位于遍及身体的多个位置中的赘生物。因此,出于本公开的目的,肿瘤包括原发性肿瘤,淋巴结,淋巴组织,和转移性肿瘤。
如本文中使用的,术语“肿瘤样品”涵盖自肿瘤或潜在包含或怀疑包含癌细胞,或要测试癌细胞的潜在存在的样品制备的样品,诸如淋巴结。
自组织分出细胞颗粒
参考图1和2,在一些实施方案中,自组织分出细胞颗粒(例如细胞,核,和/或小组织聚集体)(步骤100),诸如通过将组织样品匀浆(步骤200),然后解离经过匀浆的样品中存在的细胞颗粒(步骤210)。然后可以分选(步骤220)和分析(步骤230)解离的细胞颗粒。
在一些实施方案中,用于匀浆(步骤200)和解离(步骤210)的组织样品是自肿瘤(癌性或非癌性),转移性损害,正常组织,完整血液,或淋巴结衍生的。在一些实施方案中,组织样品是残留外科样品,活检样品,或组织学样品。在一些实施方案中,组织样品是新鲜的样品,即未经保存的样品。在一些实施方案中,组织样品是固定的组织样品。在一些实施方案中,组织样品是自福尔马林固定,石蜡包埋的组织块衍生的。在一些实施方案中,可以组合多个组织来源,然后自集合的组织样品分出细胞颗粒,诸如细胞和/或核。在一些实施方案中,在没有匀浆步骤的情况下自组织样品解离细胞颗粒。
本文中在实施例中列出用于匀浆和/或自组织解离细胞颗粒的特定实施方案。
组织样品的匀浆
在一些实施方案中,通过将样品放置入机械剪切设备,例如混合仪或超声仪来将肿瘤样品,淋巴结样品,和/或其它组织样品匀浆(步骤200)。匀浆生成一系列组织碎片。制备经过匀浆的肿瘤样品或淋巴结样品的方法公开于共同悬而未决的PCT申请No.PCT/US2016/060861(2016年11月1日提交),据此通过援引将其公开内容完整收入本文。
在一些实施方案中,经过匀浆的样品是如本文中定义的代表性样品。因而,在足够的机械剪切以解离肿瘤,淋巴结,和/或其它组织样品后,在原始样品内最初在空间上分隔的所有肿瘤细胞亚群体遍及新匀浆的样品分布。就是说,作为肿瘤,一个或多个淋巴结,或其任何组合匀浆的结果,肿瘤内细胞的任何异质性在所得匀浆物或其部分或级分内实质性均质(均匀)分布,使得匀浆物(或其任何级分)实质性均质表达输入的肿瘤和/或淋巴结样品的异质性。通过将肿瘤和/或淋巴结匀浆以生成代表肿瘤整体的样品(或匀浆物),在一些实施方案中有可能表征肿瘤的景观(诸如异质性),例如,可能有可能对整体含有的不同细胞群体或核中每一项测序(步骤230),包括不同肿瘤亚群体,即具有不同基因组概况的那些。
自肿瘤解离细胞,核,和/或小组织聚集体
可以进一步解离和/或处理经过匀浆的样品(来自步骤200)以提供解离的细胞颗粒(诸如解离的细胞或核)和/或小组织聚集体(步骤210)。一般而言,主要有三种方法来解离组织,包括酶促解离,化学解离和机械解离或其任何组合。通常基于组织类型和组织起源进行解离方法的选择。
酶促解离是使用酶来消化组织碎片,由此自组织释放细胞的过程。在这种过程中可使用许多不同类型的酶,而且正如技术人员会领会的,某些酶对某些组织类型更加有效。技术人员还会领会,任何酶促解离过程可使用彼此组合的一种或多种酶,或与其它化学和/或机械解离方法组合的一种或多种酶。合适的酶的例子包括但不限于胶原酶,胰蛋白酶,弹性蛋白酶,透明质酸酶,木瓜蛋白酶,DNA酶I,中性蛋白酶,和胰蛋白酶抑制剂。
胶原酶是用于消化在细胞外基质中找到的蛋白质的一种蛋白水解酶。对酶蛋白酶独特的是,胶原酶能攻击和降解在结缔组织中常见的三股螺旋天然胶原原纤维。存在四种基本的胶原酶类型,即:对于在上皮,肝,肺,脂肪和肾上腺组织细胞标本中使用合适的类型1；鉴于它的高蛋白水解活性,对于在心,骨,肌肉,甲状腺和软骨肿瘤起源组织中使用合适的类型2；鉴于它的低蛋白水解活性,对于在乳腺细胞中使用合适的类型3；和鉴于它的胰酶活性,对于胰岛和其中受体完整性是重要的其它研究方案合适的类型4。
胰蛋白酶被描述为对牵涉精氨酸和赖氨酸氨基酸的羧基的肽键具有特异性的一种胰腺丝氨酸(一种氨基酸)蛋白酶。它被认为是特异性最高的蛋白酶之一。单独胰蛋白酶通常对于组织解离是无效的,因为它对细胞外蛋白质显示最低限度的选择性。通常将它与其它酶,诸如胶原酶或弹性蛋白酶组合。
弹性蛋白酶是对挨着中性氨基酸的肽键具有特异性的另一种胰腺丝氨酸蛋白酶。它水解天然弹性蛋白的能力在蛋白酶中是独特的。还能在血液成分和细菌中找到弹性蛋白酶。在一些实施方案中,它适合于自肺组织分离类型II细胞。
透明质酸酶是一种多糖酶,这种酶常常用于解离组织,典型地在与更加粗制的蛋白酶,诸如胶原酶组合时。它对在几乎所有结缔组织中找到的键具有亲和力。
木瓜蛋白酶是一种硫氢基蛋白酶,它具有广泛特异性且因此能比胰腺蛋白酶,即胰蛋白酶或弹性蛋白酶更加彻底地降解大多数蛋白质底物。木瓜蛋白酶频繁用于自组织分离神经元材料。
脱氧核糖核酸酶I(DNA酶I)频繁包括在酶促细胞分离规程中以消化渗漏入解离介质且能增大粘性和回收问题的核酸。不希望受任何特定理论束缚,认为DNA酶I不会破坏完整细胞。
中性蛋白酶,诸如(自Worthington Biochemical可得),是具有轻度蛋白水解活性的一种细菌酶,由于它维持细胞膜完整性的能力,对于分离原代和继代细胞培养物是有用的。发现与上皮样细胞相比,它更加有效地解离成纤维细胞样细胞。它受到EDTA抑制。
胰蛋白酶抑制剂主要衍生自大豆,它灭活胰蛋白酶,而且因此有时用于特定细胞分离方案。
化学解离利用阳离子参与细胞内键和细胞内基质的维持的事实。通过引入结合这些阳离子的EDTA或EGTA,细胞间键遭到破坏,由此容许解离组织结构。
最后,机械解离需要将组织切割,刮或擦成小块,然后在培养基中清洗切碎的组织以自组织分出细胞,而且有时还使用温和振荡来帮助松开细胞。在其它实施方案中,机械解离可牵涉将样品匀浆,如本文中进一步描述的。
在一些实施方案中,裂解经过匀浆的样品,或经过匀浆和过滤的样品内的细胞以释放细胞成分。例如,可以使用French压碎器或类似类型的裂解仪器,微流化仪,研磨,碾磨,化学或酶促裂解(包括上文描述的那些),和/或使用本领域知道的其它技术来裂解细胞。在一些实施方案中,自含有细胞成分的样品去除膜脂质和蛋白质(包括组蛋白)(例如通过添加表面活性剂或酶(蛋白酶))。
进一步将经过匀浆的,代表性的,或解离的样品加工成个体核需要去除细胞膜。当前用于新鲜细胞的核分离方法不需要酶来释放核,而且自福尔马林固定的样品分离核不是常用方法。为了有效分离个体核,同时维持会能够区分正常和肿瘤核的细胞骨架标志物,可使用酶(例如链霉蛋白酶,蛋白酶K,胃蛋白酶,胰蛋白酶,Accumax,胶原酶H)来去除核,没有会自受到处理的核释放DNA的过度破坏。自匀浆物或代表性样品分离核的特定方法公开于共同悬而未决的PCT申请No.PCT/US2016/060861,据此通过援引将其公开内容完整收入本文。
分出的细胞颗粒的分选
在自组织样品分出细胞颗粒(诸如细胞或核)和/或小组织聚集体(步骤100)或更加具体地,匀浆(步骤200)和解离(步骤210)细胞颗粒和/或小组织聚集体后,分选细胞颗粒和/或小组织聚集体(步骤110或220)。在一些实施方案中,分出的细胞颗粒和/或小组织聚集体的分选在不需要将细胞颗粒和/或小组织聚集体染色的情况下发生。
在一些实施方案中,基于细胞颗粒和/或小组织聚集体的尺寸将细胞颗粒和/或小组织聚集体分选入两种或更多种群体。在一些实施方案中,基于它们的流体动力学尺寸分选细胞颗粒和/或小组织聚集体。例如,认为肿瘤细胞,核,和/或肿瘤组织聚集体一般尺寸分别比正常细胞,正常核,和正常组织聚集体要大。因此,认为可使用分选装置来可再现地将包含肿瘤细胞或核和正常细胞或核二者的异质样品分配入至少两种离散单元群体(步骤220),之后是下游加工或分析(步骤230)。
申请人发现解离的,固定的肿瘤组织可再现地分布为具有两种不同尺寸分布的颗粒(见本文中的实施例)。事实上,在将样品针对荧光肿瘤标志物染色并FACS分选“肿瘤”和“正常”群体后,申请人发现肿瘤和正常材料(细胞和核二者)之间存在显著且可再现的尺寸差异。申请人显示较小级分中的细胞颗粒对于肿瘤标志物呈阴性且含有二倍体DNA,而较大级分中的细胞颗粒对于肿瘤标志物呈阳性且具有较高的DNA含量,指示处于周期中或非整倍体细胞(确认它们很可能是肿瘤细胞)(见本文中的实施例)。
在一些实施方案中,认为正常细胞具有范围为介于约4μm至约12μm之间的尺寸,当然取决于细胞或细胞起源的组织的类型,和细胞起源的组织是否是保存的,例如福尔马林固定,石蜡包埋的。在一些实施方案中,自福尔马林固定的组织分离的正常细胞具有范围为介于约5μm至约12μm之间的尺寸。在还有其它实施方案中,来自固定的组织的正常细胞具有小于12μm的尺寸。
在一些实施方案中,认为肿瘤细胞具有范围为介于约9μm至约100μm之间的尺寸,当然取决于细胞或细胞起源的组织的类型,和细胞起源的组织是否是保存的,例如福尔马林固定,石蜡包埋的。在一些实施方案中,自固定的组织分离的肿瘤细胞具有范围为介于约9μm至约20μm之间的尺寸。在其它实施方案中,自固定的组织分离的肿瘤细胞具有范围为介于约9μm至约50μm之间的尺寸。在其它实施方案中,自固定的组织细胞分离的肿瘤具有范围为介于约12μm至约25μm之间的尺寸。在还有其它实施方案中,自固定的组织分离的肿瘤细胞具有大于12μm的尺寸。
在一些实施方案中,肿瘤细胞可具有比相应的正常细胞大至少约30％的平均尺寸。在其它实施方案中,肿瘤细胞可具有比相应的正常细胞大至少约35％的平均尺寸。在还有其它实施方案中,肿瘤细胞可具有比相应的正常细胞大至少约40％的平均尺寸。在别的实施方案中,肿瘤细胞可具有比相应的正常细胞大至少约45％的平均尺寸。在还有别的实施方案中,肿瘤细胞可具有比相应的正常细胞大至少约50％的平均尺寸。在甚至别的实施方案中,肿瘤细胞可具有比相应的正常细胞大至少约55％的平均尺寸。在甚至别的实施方案中,肿瘤细胞可具有比相应的正常细胞大至少约70％的平均尺寸。在甚至别的实施方案中,肿瘤细胞可具有比相应的正常细胞大至少约90％的平均尺寸。在甚至别的实施方案中,肿瘤细胞可具有比相应的正常细胞大至少约100％的平均尺寸。
认为自新鲜的实体瘤组织分离的肿瘤和正常细胞会具有与固定的组织相似的不同相对尺寸。新鲜解离的组织指在预定时间段内自身体移出并加工成单细胞的组织,例如在24小时内,在18小时内,在12小时内,或在6小时内移出并加工的组织,没有放置在福尔马林中且在任何固定过程前,导致主要是完整,存活细胞。在解离后,可以在分析前培养或简短固定(典型地在约3％低聚甲醛中)自新鲜组织衍生的细胞。新鲜的组织的解离可以使用多种先前描述的方案或可商购的试剂盒来实现,典型地牵涉机械和酶促步骤二者(诸如本文中公开的)。
在一些实施方案中,认为自固定的组织分离的正常核具有范围为介于约4.5μm至约9μm之间的尺寸,当然取决于细胞或核起源的组织的类型,和核起源的组织是否是保存的,例如福尔马林固定,石蜡包埋的。在其它实施方案中,正常核具有范围为介于约5μm至约8.5μm之间的尺寸。在还有其它实施方案中,正常细胞具有小于8.5μm的尺寸。预期自新鲜组织分离的正常核可具有比自固定组织分离的那些相似或略微更大的尺寸范围。
认为自固定的组织分离的肿瘤核具有范围为介于约7.5μm至约20μm之间的尺寸,当然取决于细胞或核起源的组织的类型,和核起源的组织是否是保存的,例如福尔马林固定,石蜡包埋的。在其它实施方案中,肿瘤核具有范围为介于约8.5μm至约20μm之间的尺寸。在其它实施方案中,肿瘤核具有范围为介于约9μm至约18μm之间的尺寸。在其它实施方案中,肿瘤核具有范围为介于约9.5μm至约15μm之间的尺寸。在还有其它实施方案中,肿瘤细胞具有大于约8.5μm的尺寸。
在一些实施方案中,解离可产生更加容易解离的单体正常细胞(例如免疫细胞)并生成不太容易解离的肿瘤细胞聚集体。在一些实施方案中,可以通过尺寸区分肿瘤细胞聚集体与单体正常细胞。在一些实施方案中,解离的固定的正常细胞尺寸范围为约4至约8.5μm。肿瘤细胞聚集体可以由约2至大于100个细胞组成,取决于组织的特性和使用的解离方法。肿瘤细胞聚集体可以由比约20μm,约50μm,约100μm,约300μm,或约500μm大的细胞组共同构成。
在一些实施方案中,将具有第一尺寸范围的细胞颗粒(例如细胞或细胞核)分选入第一群体,并将具有第二尺寸范围的细胞颗粒(例如细胞或细胞核)分选入第二群体,其中第一群体包含至多30％的具有第二尺寸范围的细胞颗粒。在一些实施方案中,第一群体包含至多25％的具有第二尺寸范围的细胞颗粒。在一些实施方案中,第一群体包含至多20％的具有第二尺寸范围的细胞颗粒。在一些实施方案中,第一群体包含至多15％的具有第二尺寸范围的细胞颗粒。在一些实施方案中,第一群体包含至多10％的具有第二尺寸范围的细胞颗粒。在一些实施方案中,第一群体包含至多7.5％的具有第二尺寸范围的细胞颗粒。在一些实施方案中,第一群体包含至多5％的具有第二尺寸范围的细胞颗粒。在一些实施方案中,第一群体包含至多2.5％的具有第二尺寸范围的细胞颗粒。在一些实施方案中,第一群体包含至多1％的具有第二尺寸范围的细胞颗粒。
分选装置
在一些实施方案中,分选装置是以第一方向引导具有第一尺寸的细胞或核,且以第二方向引导具有第二尺寸的细胞或核的仪器或设备,没有首先将细胞或核染色或用任何药剂(例如磁性颗粒,等)标记它们。
在一些实施方案中,分选装置是微流控装置。微流控是可以实现细胞和/或核依照尺寸的分选的一种技术。因而,在一些实施方案中,使用基于微流控的技术来实现分选。在一些实施方案中,使用微流控装置,诸如一次性微流控装置来实现分选。本文中描述了微流控技术的非限制性例子。下面的参考文献中公开了可以作为本方法的一部分执行的微流控技术的另外的例子,通过援引将其每一篇完整收入本文:(i)C.Wyatt Shields IV,Dr.Catherine D.Reyes,and Prof.Gabriel P.López,Microfluidic Cell Sorting:AReview of the Advances in the Separation of Cells from Debulking to Rare CellIsolation,Lab Chip.2015 February 16；15(5):1230-1249；和(ii)P.Sajeesh and AshisKumar Sen,Particle Separation and Sorting in Microfluidic Devices:A Review,Microfluid Nanofluid(2014)17:1-52。
在一些实施方案中,分选装置是采用间隙网络的阵列的装置,其中流动穿过间隙的流体不相等地分入后续的间隙。“间隙”意味着流体或颗粒能流动穿过的开口。例如,间隙可以是其中流体能流动的两个阻碍物之间的空间,或其中水性流体受到限制的其它地方疏水性表面上的亲水性样式。阵列包括安排成使得流动穿过间隙的流体不相等划分的间隙网络,尽管间隙的维度可能是相同的。在一些实施方案中,该方法利用携带要经由间隙阵列分开的细胞的流。在一些实施方案中,流就阵列的视线而言以小角度(流角)对齐。在一些实施方案中,具有比临界尺寸大的流体动力学尺寸的细胞或核沿着视线,即侧向迁移穿过阵列,而那些具有比临界尺寸小的流体动力学尺寸的遵循平均流方向。不希望受任何特定理论束缚,认为装置中的流在层流条件下发生。本公开的装置任选配置成连续流装置。在一些实施方案中,临界尺寸是至少8.5μm。在其它实施方案中,临界尺寸是至少9μm。在还有其它实施方案中,临界尺寸是至少10μm。在别的实施方案中,临界尺寸是至少12μm。当然,技术人员会领会可以修改临界尺寸以容纳不同类型的细胞,来自不同起源的细胞,和新鲜较之固定的细胞。本领域技术人员还会领会可以增大或缩小临界尺寸以改善收集的群体的纯度或产量。
在一些实施方案中,通过分选装置分开细胞可以基于至少一种靶细胞较之非靶细胞的差异滚动特征。在某些实施方案中,靶细胞是分享受到在三维结构上涂覆的细胞粘附实体识别的共同特征的细胞。一般而言,靶细胞通过细胞滚动而转向远离大流的方向,而不受细胞粘附实体识别的非靶细胞并不滚动且并不转向远离大流的方向。虽然本公开一般将转向的细胞称作“靶细胞”,但是会领会的是这是任意的指定,而且在某些实施方案中,可以以负选择模式实施分开细胞,由此真正的“靶细胞”事实上是不转向的细胞。
技术人员会领会可以串联使用多个分选装置,例如,可以使细胞通过均采用确定性侧向位移的第一和第二装置,或者可以使细胞通过利用确定性侧向位移的第一装置和采用不同微流控技术的第二装置。在一些实施方案中,第一分选装置将输入材料分选入第一和第二群体,而第二分选装置细化分选,例如将第一群体分选入第一和第二亚群体。在一些实施方案中,可以将分选装置与第二富集技术偶联,第二富集技术任选需要染色或标记分出的细胞或核(例如流式细胞术,磁分离)。
确定性侧向位移
确定性侧向位移(DLD)是连续分开的一种立体方法,其利用阻碍物周围的层流的不对称分岔(见图11)。例如,移动穿过间隙比颗粒尺寸大的阻碍物的阵列的颗粒(这里是细胞或核)基于它们的尺寸和变形性确定性地选择它们的路径。认为给定尺寸和变形性的颗粒遵循等同的迁移路径,产生一种有效分离方法。
一般而言,分离的临界直径由Dc＝2ηdε来描述,其中η是无单位参数,d是相邻阻碍物的边缘之间的距离且ε是行移位分数(参见例如Huang et al.,Science 2004,304(5673):987-990)。Ε定义为ε＝Δd/W,其中W是同一行中两个相邻阻碍物的中心至中心距离且Δd是连续行中的两个相邻阻碍物之间的侧向移位。比Dc大的颗粒(例如细胞)通过反复碰撞阻碍物被迫相对于大流的方向以一定角度移动。在本公开的语境中可以有利地使用反复碰撞来促进细胞和用细胞粘附实体涂覆的阻碍物表面之间的相互作用。
阵列中的阻碍物典型地自分选通道的内表面(例如下表面,上表面,侧壁或其组合)凸出。在某些实施方案中,凸出跨越分选通道的下和上表面之间的距离。阻碍物可具有任何形状,例如但不限于正方形,矩形,三角形,梯形,六边形,泪滴,多边形,椭圆形,圆形,弧形,波浪形,和/或其组合。
在一些实施方案中,装置设计成与具有平均直径D的细胞一起使用且临界直径Dc设计为小于D。在一些实施方案中,分选通道可具有小于约7μm,约7.5μm,约8μm,约8.5μm,约9μm,约10μm,或小于约12μm的临界直径Dc。在一些实施方案中,分选通道可具有大于约7μm,约7.5μm,约8μm,约8.5μm,约9μm,约10μm,或大于约12μm的临界直径Dc。在某些实施方案中,分选通道可具有在介于这些值中任两项之间的范围中的临界直径Dc。例如,在某些实施方案中,分选通道可具有在约6μm至约8.5μm,例如约7μm至约9μm,约9μm至约12μm,等的范围中的临界直径Dc。本领域技术人员会领会可以增大或缩小临界直径以改善收集的群体的纯度或产量。
流体动力学聚焦
在一些实施方案中,分选通道利用流体动力学聚焦来分开细胞。一般地,依赖于流体动力学聚焦的分选通道会包含收缩区域和扩张区域。流体动力学聚焦通过迫使细胞沿着纵方向排成单列(通过用鞘流覆盖样品流)来起作用。在本公开的某些实施方案中,细胞在扩张区域中的位置(在细胞滚动缺失下)可以通过Wp＝{W2/W1)d来确定,其中d是细胞的直径,W1是收缩区域的宽度且W2是扩张区域的宽度。典型地,鞘流迫使细胞接触收缩区域的侧壁,而且在本公开的语境中,这可用于促进细胞和用细胞粘附实体涂覆的侧壁表面之间的相互作用。如图13中显示的,涂层的存在可引起在其它情况中会在位置Wp处到达扩张区域的细胞沿着扩张区域的侧壁滚动并在扩张区域中的不同位置处离开。会领会的是可以根据分选的细胞的性质和涂层的性质来调节W1和W2的具体维度以及鞘和样品流的流速。
声泳(Acoustophoresis)
无标记物声学流控(acoustofluidic)系统一般基于它们尺寸的差异来分选细胞。这种细胞分选方法依赖于最初远离压力节点在流线中放置细胞使得它们在装置开动时快速位移至节点,由此分开具有不同尺寸或声学特性的细胞。
在一些实施方案中,使用流体动力将细胞或核引导至声学流控装置的侧壁,随后它们以与它们的体积成比例的速率朝向声学驻波的节点迁移。认为较大细胞在声学驻波中经历较大力,如此较快响应辐射力,如此将较大细胞引导至中心出口(例如节点)并将较小细胞引导至侧出口。声泳方法至少进一步描述于(i)Petersson F,Nilsson A,Holm C,Jonsson H,Laurell T.The Analyst.2004；129:938-943[PubMed:15457327]；(ii)Petersson F,Nilsson A,Holm C,Jonsson H,Laurell T.Lab Chip.2005；5:20-22[PubMed:15616735]；(iii)Petersson F,Aberg L,Sward-Nilsson AM,LaurellT.Analytical Chemistry.2007；79:5117-5123[PubMed:17569501]；(iv)Dykes J,LenshofA,Astrand-Grundstrom I,Laurell T,Scheding S.PloS one.2011；6:e23074[PubMed:21857996]；(v)Augustsson P,Magnusson C,Nordin M,Lilja H,LaurellT.Anal.Chem.2012；84:7954-7962[PubMed:22897670]；(vi)Yang AH,Soh HT.Analyticalchemistry.2012；84:10756-10762[PubMed:23157478]；和(vii)Fong EJ,Johnston AC,Notton T,Jung SY,Rose KA,Weinberger LS,Shusteff M.The Analyst.2014；139:1192-1200[PubMed:24448925],据此通过援引将其公开内容完整收入本文。
弯曲通道中的惯性聚焦
惯性力可导致诱导细胞或颗粒在层流流动中跨越流线迁移。典型地,惯性力源自邻近微流控通道壁的流体流动的边界效应,引起升举。弯曲通道中的惯性聚焦指用于细胞分级的独特现象学技术子集,其包括使用蛇形或阿基米德螺旋样式进行细胞排序和分选。
用于执行弯曲通道中的惯性聚焦的装置和技术至少进一步描述于下面的参考文献,据此通过援引将其公开内容完整收入本文:(i)Di Carlo D,Edd JF,Irimia D,Tompkins RG,Toner M.Analytical Chemistry.2008；80:2204-2211[PubMed:18275222]；(ii)Oakey J,Applegate RW Jr,Arellano E,Di Carlo D,Graves SW,TonerM.Analytical chemistry.2010；82:3862-3867[PubMed:20373755]；(iii)Russom A,GuptaAK,Nagrath S,Di Carlo D,Edd JF,Toner M.New J Phys.2009；11:75025；(iv)Kuntaegowdanahalli SS,Bhagat AA,Kumar G,Papautsky I.Lab Chip.2009；9:2973-2980[PubMed:19789752]；(v)Hou HW,Warkiani ME,Khoo BL,Li ZR,Soo RA,Tan DS-W,Lim W-T,Han J,Bhagat AAS,Lim CT.Scientific Reports.2013；3:1-8；(vi)Nivedita N,Papautsky I.Biomicrofluidics.2013；7:54101[PubMed:24404064]；和(v)Guan G,Wu L,Bhagat AA,Li Z,Chen PC,Chao S,Ong CJ,Han J.Sci Rep.2013；3:1475[PubMed:23502529]。
夹窄流和流体动力学扩散
在弯曲通道(上文记录的)以外,惯性力还能在直行通道中发挥至关紧要作用。夹窄流分级和流体动力学扩散是惯性力在使细胞排序以进行后续分选中发挥作用的两个例子。当细胞的流动流受到狭窄通道截面挤压时发生夹窄流分级,使得细胞受到约束并靠着侧壁对齐,随后一旦通道变宽时由于层流概况通过尺寸分开(见图10)。这种对齐效应典型地得到鞘流体增强,鞘流体将细胞推向壁,使得较大细胞的中心比较小细胞的中心离壁表面更远,如此在通道变宽时对不同尺寸的细胞给予略微不同的流动轨迹。通过添加多个不对称出口以实现更好的流体动力学控制以及通过微流控装置的空间重取向以实现不同尺寸和质量的细胞群体之间以重力增强的分开,这种分选方法得到扩展。
用于执行夹窄流和流体动力学扩散的装置和技术至少进一步描述于下面的参考文献,据此通过援引将其公开内容完整收入本文:(i)Di Carlo D.Lab Chip.2009；9:3038-3046[PubMed:19823716]；(ii)Di Carlo D,Irimia D,Tompkins RG,Toner M.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America.2007；104:18892-18897[PubMed:18025477]；(iii)Di Carlo D,Edd JF,Irimia D,Tompkins RG,Toner M.Analytical Chemistry.2008；80:2204-2211[PubMed:18275222]；(iv)Oakey J,Applegate RW Jr,Arellano E,Di Carlo D,Graves SW,Toner M.Analyticalchemistry.2010；82:3862-3867[PubMed:20373755]；(v)Russom A,Gupta AK,Nagrath S,Di Carlo D,Edd JF,Toner M.New J Phys.2009；11:75025；(vi)Kuntaegowdanahalli SS,Bhagat AA,Kumar G,Papautsky I.Lab Chip.2009；9:2973-2980[PubMed:19789752]；(vii)Hou HW,Warkiani ME,Khoo BL,Li ZR,Soo RA,Tan DS-W,Lim W-T,Han J,BhagatAAS,Lim CT.Scientific Reports.2013；3:1-8；(viii)Nivedita N,PapautskyI.Biomicrofluidics.2013；7:54101.[PubMed:24404064]；(ix)Guan G,Wu L,Bhagat AA,Li Z,Chen PC,Chao S,Ong CJ,Han J.Sci Rep.2013；3:1475[PubMed:23502529]；(x)Warkiani ME,Guan G,Luan KB,Lee WC,Bhagat AA,Chaudhuri PK,Tan DS,Lim WT,LeeSC,Chen PC,Lim CT,Han J.Lab Chip.2014；14:128-137[PubMed:23949794]；(xi)Parichehreh V,Medepallai K,Babbarwal K,Sethu P.Lab Chip.2013；13:892-900[PubMed:23307172]；和(xii)Yamada M,Nakashima M,Seki M.AnalyticalChemistry.2004；76:5465-5471[PubMed:15362908]。
水泳(hydrophoretic)过滤
脊诱导的水泳过滤依赖于改变流的微样式所致微流控通道内侧向压力梯度的形成。微通道底面和顶面上的倾斜阻碍物的连续阵列诱导跨越通道宽度的压力梯度,从而依照类型将细胞聚焦于所生成的局部压力场内的精确位置,然后分开那些细胞。用于水泳过滤的装置和技术至少进一步描述于下面的参考文献,据此通过援引将其公开内容完整收入本文:(i)Choi S,Song S,Choi C,Park JK.Lab Chip.2007；7:1532-1538[PubMed:17960282]；(ii)Hsu CH,Di Carlo D,Chen C,Irimia D,Toner M.Lab Chip.2008；8:2128-2134[PubMed:19023476]；(iii)Stott SL,Hsu CH,Tsukrov DI,Yu M,Miyamoto DT,Waltman BA,Rothenberg SM,Shah AM,Smas ME,Korir GK,Floyd FP Jr,Gilman AJ,LordJB,Winokur D,Springer S,Irimia D,Nagrath S,Sequist LV,Lee RJ,Isselbacher KJ,Maheswaran S,Haber DA,Toner M.Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America.2010；107:18392-18397[PubMed:20930119]；(iv)Sollier E,Go DE,Che J,Gossett DR,O'Byrne S,Weaver WM,Kummer N,Rettig M,Goldman J,Nickols N,McCloskey S,Kulkarni RP,Di Carlo D.Lab Chip.2014；14:63-77[PubMed:24061411]；和(v)Hyun KA,Kwon K,Han H,Kim SI,Jung HI.Biosensors&bioelectronics.2013；40:206-212[PubMed:22857995]。
尺寸排阻过滤
代替设计均匀间隔的立柱的尺寸和样式来分选细胞,尺寸排阻过滤指使用具有分层(即越来越小)间距(作为距离的函数)的立柱以非二元方式分选细胞。尺寸排阻滤器由通过尺寸和形状将细胞选择性分组的柱的一系列线性阵列组成。
错流过滤
含有细胞的流体的过滤是最早用于将细胞群体分级的方法之一。这些滤器的例子包括含有大屏障来捕获大细胞的堰式滤器,含有一行相同尺寸的微立柱来捕获大细胞的柱式滤器,和在底面或顶面上含有孔阵列来捕获大细胞的膜滤器。
错流过滤,有时称作切向流过滤,使用以流的方向对齐的侧向狭缝的阵列通过尺寸将细胞群体分级。不希望受任何特定理论束缚,认为这种过滤方法较之早期类型的滤器,诸如堰,柱,和膜是一项重大进步,因为它们阻塞的可能性降低,因为行为比闭端滤器更像筛。
流体动力学过滤
在流体动力学过滤中,通过多个分支出口将细胞分开,由此自出口排出的流体以依照它们的尺寸成比例的速率自主通道的壁拉细胞(见图12)。较小细胞离开近端出口,因为它们的中心更靠近微流控通道的壁,使得它们能够与较大细胞受控分流。
如图13A中显示的,依赖于流体动力学过滤的分选通道可包含一个主通道和多个侧通道。如图13B中显示的,在主和侧通道之间的分支处,流速比决定细胞(或核)是继续流动穿过主通道还是进入侧通道离开。一般地,在细胞滚动缺失下,通过反复靠着侧壁对齐,比某种宽度大的细胞被迫流动穿过主通道,而非侧通道。在本公开的语境中,可使用此类反复对齐来促进细胞和用细胞粘附实体涂覆的通道壁表面之间的相互作用。有利的是,可引起在正常情况下会继续沿着主通道行进的细胞(或核)进入侧通道滚动,如图13A中显示的。在某些实施方案中,因此用细胞粘附实体涂覆主通道的侧壁,使得靶细胞能在侧壁上拘束和滚动。
Vortex分选装置
在一些实施方案中,分选装置是Vortex HE装置,自Vortex Biosciences可得。在一些实施方案中,Vortex HE装置是使用用于颗粒聚焦的高长宽比微流控通道,继以多个扩张区域的微流控装置(见图14)。不希望受任何特定理论束缚,认为由于剪切梯度升力发生颗粒(或细胞)进入狭窄聚焦通道后面的扩张区域。升力是推动颗粒远离壁的壁升力和由颗粒周围的流体速度概况决定的横向剪切梯度升力之间的平衡。小颗粒(或细胞)并不经历足够剪切梯度升力,并且聚焦朝向通道中部,而且并不进入扩张区域。通过缩小上游聚焦通道的横截面积来提高升力容许较小颗粒(或细胞)迁移跨越主流并进入扩张区域(例如扩张区域中捕获的细胞)。Vortex HE装置进一步描述于PCT/US2016/038230,据此通过援引完整收录其公开内容。Vortex分开方法还公开于Manjima Dhar et al.,"High EfficiencyVortex Trapping of Circulating Tumor Cells,"Biomicrofluidics 9,064116(2015),据此通过援引将其公开内容完整收入本文。
另外的分选装置
还可以通过其它装置或仪器来分选分出的样品,包括常规过滤(例如使用细胞过滤器或筛)；切向过滤；基于柱的过滤；和离心(密度梯度离心)。
微流控装置制造
一般而言,可以使用本领域技术人员知道的平板印刷或其它技术在实践中对用作微流控装置的任何材料生成样式。用于制备合适装置的例示性方法公开于美国专利No.6,197,575,美国专利公开文本No.2010/0112026和美国专利公开文本No.2010/0304485,通过援引将其完整内容收入本文。在各种实施方案中,微流控装置可以全部或部分自聚(二甲基硅氧烷)(PDMS),玻璃,二氧化硅,或氟聚合物制作。在某些实施方案中,可以用材料处理通道的壁以改变亲水性,蛋白质亲和力,细胞亲和力,或这些的任何组合。例示性处理材料包括但不限于聚乙二醇(例如聚(3-三甲氧基甲硅烷基)-甲基丙烯酸丙酯-r-聚(乙二醇)甲基醚或TMSMA-r-PEGMA),形成自组装单层的有机硅烷,乙醇,等。
进一步的分析
在一些实施方案中,进一步分析分选的或富集的细胞群体,核,和/或小组织聚集体(步骤120,230,330,430,和440)。在一些实施方案中,分选装置可以与检测仪,显微镜,细胞计数仪(例如Coulter计数仪),质谱仪,FACS,PCR装置,RT-PCR装置,基因组测序仪,成像系统,等流体连通。或者,而且在其它实施方案中,分选装置可以提供数种细胞群体,核,或小组织聚集体,保留供稍后分析。
测序
在一些实施方案中,对分选的细胞或核的群体(步骤320或420)中至少一项测序(步骤330或440)。为测序制备细胞和/或分选的核的方法公开于例如PCT/US2016/060835,据此通过援引将其公开内容完整收入本文。
可以依照本领域普通技术人员知道的任何方法实施测序(步骤330或440)。在一些实施方案中,测序方法包括Sanger测序和染料-终止子测序,以及下一代测序技术,诸如焦磷酸测序,纳米孔测序,基于微孔的测序,纳米球测序,MPSS,SOLiD,Illumina,IonTorrent,Starlite,SMRT,tSMS,通过合成的测序,通过连接的测序,质谱术测序,聚合酶测序,RNA聚合酶(RNAP)测序,基于显微术的测序,微流控Sanger测序,基于显微术的测序,RNAP测序,隧道电流DNA测序,和体外病毒测序。参见WO2014144478,WO2015058093,WO2014106076和WO2013068528,据此通过援引完整收录其每一篇。
在一些实施方案中,可以通过多种不同方法实施测序(步骤330或440),诸如通过采用通过合成技术的测序。依照现有技术的通过合成的测序定义为监测在测序反应期间在掺入特定脱氧核苷三磷酸时副产物的生成的任何测序方法(Hyman,1988,Anal.Biochem.174:423-436；Rhonaghi et al.,1998,Science 281:363-365)。通过合成反应的测序的一个突出的实施方案是焦磷酸测序方法。在这种情况中,通过导致化学发光信号生成的酶促级联监测在核苷酸掺入期间焦磷酸的生成。454基因组测序仪系统(RocheApplied Science目录号04 760 085 001),通过合成的测序的一个例子,基于焦磷酸测序技术。对于454GS20或454FLX仪器上的测序,平均基因组DNA片段尺寸分别在200或600bp的范围中,如产品文献中描述的。
在一些实施方案中,通过合成反应的测序或者可以基于终止子染料类型的测序反应。在这种情况中,掺入的染料脱氧核苷三磷酸(ddNTP)构建块包含可检测标记物,其优选是阻止新生DNA链进一步延伸的荧光标记物。然后在将ddNTP构建块掺入模板/引物延伸杂合物(例如通过使用包含3′-5′外切核酸酶或校对活性的DNA聚合酶)时去除并检测标记物。
在一些实施方案中,而且在基因组测序仪工作流(Roche Applied Science目录号04 896 548 001)的情况中,在第一步中,通过乳液PCR实施(克隆式)扩增。如此,通过乳液PCR方法实施扩增步骤也在本公开的范围内。携带克隆式扩增的靶核酸的珠然后可以变成依照制造商的方案任意转移入皮级滴定板并提交焦磷酸测序反应供序列测定。
在一些实施方案中,使用下一代测序方法实施测序,诸如由Illumina公司提供的(“Illumina测序方法”)。不希望受如何特定理论束缚,Illumina下一代测序技术使用克隆式扩增和通过合成的测序(SBS)化学以能够快速,精确测序。该过程在将DNA碱基掺入核酸链时同时鉴定它们。每个碱基在它添加至生长中的链时发出独特的荧光信号,使用它来测定DNA序列的次序。
在一些实施方案中,使用单分子实时测序实施测序,诸如自Pacific Biosciencesof California公司可得的PacBio。
在一些实施方案中,将分选的细胞针对特定生物标志物染色和/或标记。例如,可以将两种细胞群体之一或二者针对特定表面标志物的存在染色和/或标记。
流式细胞术
在一些实施方案中,在分选解离的细胞(步骤420)后进行流式细胞术分析(步骤430)(图4)。流式细胞术是容许对流动穿过光学/电子检测设备的单细胞的物理和/或化学特征的同时多参数分析的一种技术。流式细胞术和它的用途是本领域技术人员公知的(参见例如Ormerod,Flow Cytometry 2nd ed.,Springer-Verlag,New York(1999),通过援引将其收入本文)。此类用途包括但不限于使用单克隆抗体对细胞表面抗原的免疫荧光标记。临床应用包括但不限于白血病和淋巴瘤的免疫表型分析,检测微小残留疾病,干细胞计数,实体器官移植,包括T细胞交叉匹配和手术后监测,检测自身抗体,HIV感染,胎儿-母体出血,免疫缺陷疾病,阵发性夜间血红蛋白尿,网织红细胞分析,细胞循环分析,细胞增殖,凋亡,RNA含量,蛋白质含量,动态分析细胞内酶,膜通透性,膜电位,细胞内氧化性种类的生成,测量药物摄取,配体的结合和内吞,细胞内钙离子,细胞内pH,细胞内谷胱甘肽,染色体分析和分选,跟踪细胞,测量细胞存活力,监测电通透,监测细胞的融合或聚簇,微珠技术,等等。
申请人发现解离的肿瘤样品的流式细胞术分析是一项挑战,因为肿瘤中有具有不同物理特征的多种细胞。某些例行规程诸如双联体鉴别依赖于有具有相当同质特征的细胞群体；例如,在混合群体中,可能难以与肿瘤细胞区分正常细胞的双联体。通过提供两种细胞群体–一种富集肿瘤,一种富集正常细胞–每种单独会更容易染色和分析,解离的样品的基于尺寸的分级会简化流式细胞术分析。在基于尺寸的富集后,染色和FACS会容许技术人员容易地分选对特定标志物呈阳性的免疫群体或对特定标志物呈阳性的肿瘤群体,并分析该特定群体的基因组学或蛋白质组学。它还会允许测定对特定标志物呈阳性的肿瘤细胞或免疫细胞的百分比,即使技术人员不关心收集和进一步分析该群体。
生物标志物分析
在一些实施方案中,在测定法中将富集的细胞,核,或小组织聚集体的群体染色以鉴定特定靶分子。靶分子可以是核酸序列或蛋白质。技术人员会领会靶蛋白质可以是自与疾病相关(例如有联系,有因果关系,等)的靶核酸序列生成的。在具体的非限制性例子中,靶蛋白质是由与赘生物(例如癌症)相关的靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)生成的。已经在赘生性细胞中,尤其是在癌细胞,诸如B细胞和T细胞白血病,淋巴瘤,乳腺癌,结肠癌,神经学癌症等等中鉴定出众多染色体异常(包括易位和其它重排,扩增或删除)。因此,在一些例子中,靶分子的至少一部分是由在样品中的至少一种子集的细胞中扩增或删除的核酸序列(例如基因组靶核酸序列)生成的。
在其它例子中,靶蛋白质是自在恶性细胞中删除(丢失)的作为肿瘤抑制基因的核酸序列(例如基因组靶核酸序列)生成的。例如,位于染色体9p21上的p16区(包括D9S1749,D9S1747,p16(INK4A),p14(ARF),D9S1748,p15(INK4B),和D9S1752)在某些膀胱癌中删除。牵涉染色体1短臂远端区域(其涵盖例如SHGC57243,TP73,EGFL3,ABL2,ANGPTL1,和SHGC-1322),和染色体19着丝粒周围区域(例如19p13-19q13)(其涵盖例如MAN2B1,ZNF443,ZNF44,CRX,GLTSCR2,和GLTSCR1)的染色体删除是中枢神经系统的某些类型的实体瘤的特征性分子特征。
本领域普通技术人员知道与赘生性转化和/或生长有关的众多其它细胞遗传学异常。由已经与赘生性转化关联且在所公开的方法中有用的核酸序列(例如基因组靶核酸序列)生成的靶蛋白质还包括EGFR基因(7p12；例如GENBANKTM登录号NC-000007,核苷酸55054219-55242525),C-MYC基因(8q24.21；例如GENBANKTM登录号NC-000008,核苷酸128817498-128822856),D5S271(5p15.2),脂蛋白脂肪酶(LPL)基因(8p22；例如GENBANKTM登录号NC-000008,核苷酸19841058-19869049),RB1(13q14；例如GENBANKTM登录号NC-000013,核苷酸47775912-47954023),p53(17p13.1；例如GENBANKTM登录号NC-000017,互补链,核苷酸7512464-7531642)),N-MYC(2p24；例如GENBANKTM登录号NC-000002,互补链,核苷酸151835231-151854620),CHOP(12q13；例如GENBANKTM登录号NC-000012,互补链,核苷酸56196638-56200567),FUS(16p11.2；例如GENBANKTM登录号NC-000016,核苷酸31098954-31110601),FKHR(13p14；例如GENBANKTM登录号NC-000013,互补链,核苷酸40027817-40138734),以及例如:ALK(2p23；例如GENBANKTM登录号NC-000002,互补链,核苷酸29269144-29997936),Ig重链,CCND1(11q13；例如GENBANKTM登录号NC-000011,核苷酸69165054.69178423),BCL2(18q21.3；例如GENBANKTM登录号NC-000018,互补链,核苷酸58941559-59137593),BCL6(3q27；例如GENBANKTM登录号NC-000003,互补链,核苷酸188921859-188946169),MALF1,AP1(1p32-p31；例如GENBANKTM登录号NC-000001,互补链,核苷酸59019051-59022373),TOP2A(17q21-q22；例如GENBANKTM登录号NC-000017,互补链,核苷酸35798321-35827695),TMPRSS(21q22.3；例如GENBANKTM登录号NC-000021,互补链,核苷酸41758351-41801948),ERG(21q22.3；例如GENBANKTM登录号NC-000021,互补链,核苷酸38675671-38955488)；ETV1(7p21.3；例如GENBANKTM登录号NC-000007,互补链,核苷酸13897379-13995289),EWS(22q12.2；例如GENBANKTM登录号NC-000022,核苷酸27994271-28026505)；FLI1(11q24.1-q24.3；例如GENBANKTM登录号NC-000011,核苷酸128069199-128187521),PAX3(2q35-q37；例如GENBANKTM登录号NC-000002,互补链,核苷酸222772851-222871944),PAX7(1p36.2-p36.12；例如GENBANKTM登录号NC-000001,核苷酸18830087-18935219),PTEN(10q23.3；例如GENBANKTM登录号NC-000010,核苷酸89613175-89716382),AKT2(19q13.1-q13.2；例如GENBANKTM登录号NC-000019,互补链,核苷酸45431556-45483036),MYCL1(1p34.2；例如GENBANKTM登录号NC-000001,互补链,核苷酸40133685-40140274),REL(2p13-p12；例如GENBANKTM登录号NC—000002,核苷酸60962256-61003682)和CSF1R(5q33-q35；例如GENBANKTM登录号NC-000005,互补链,核苷酸149413051-149473128)。
试剂盒
在一些实施方案中,本公开提供一种试剂盒,其包含将来自输入样品的细胞,核,或小组织聚集体匀浆,解离,和分选需要的成分。例如,试剂盒可以包括自特定类型的组织解离细胞需要的试剂,而且试剂盒还可以包括对于分选具有特定尺寸的细胞适宜的微流控装置。
实施例
材料
用来自IKA-Works的IKA Works Tube Mill控制系统(0004180001；Staufen imBreisgau,德国)实施机械解离。所使用的所有滤器来自Pluriselect(San Diego,CA)。所使用的缓冲液来自下述公司:CC1(950-124；Ventana Medical Systems,Tucson,AZ),autoMACS缓冲液(130-091-221,Miltenyi Biotech),dPBS(14190,Fisher Scientific,美国)。Tween 20购自Fisher Scientific,美国(AC233362500)。下述试剂购自Sigma,美国:精胺四氯化物(S2876),DAPI(D9542),胃蛋白酶(P7012)。蛋白酶K购自VWR,美国(0706)。酪胺-罗丹明101是使用购自Sigma的化学药品内部合成的。小鼠抗细胞角蛋白8/18抗体(760-4344)和HRP缀合的山羊抗小鼠抗体(760-4310)来自Ventana Medical Systems。缀合Alexa488或Alexa 647的山羊抗小鼠抗体购自Invitrogen(A-11001)。
组织模型和临床样品
将所有组织样品在Ventana Medical Systems中在10％中性缓冲的福尔马林中固定24小时。人扁桃体是自Northwest Medical Center(Tucson,AZ)获得的。肿瘤样品是自GLAS/(Winston-Salem,NC http://glaswpcopy.wpengine.com/)获得的。
实施例1–固定组织解离
在IKA混合仪中在加热至85℃的CC1缓冲液(1:5)中机械解离固定扁桃体组织,于85℃温育30分钟,然后在IKA混合仪中再次混合(2分钟,10秒间隔)。将混合材料交换入1:10MACS缓冲液(1:10)并过滤穿过40μm滤器。使用Coulter计数仪对经过过滤的解离细胞分析产量和尺寸分布。
对于肿瘤组织,首先以1:1肿瘤:MACS比在IKA混合仪中在MACS缓冲液中进行大块机械解离。如上文关于扁桃体所述在CC1缓冲液中进一步混合总匀浆物的小样。将混合材料过滤穿过1mm x 1mm金属筛。通过在台式微量离心机(Eppendorf)中以300xg离心1分钟将CC1缓冲液交换dPBS(1:10)；所有后续液体交换是以相同方式实施的。离心后,在含有1mg/ml蛋白酶K的dPBS中1:1重悬浮团粒并于50℃温育10分钟。为了淬灭蛋白酶K和为了进一步解离,将样品交换入含5mg/ml胃蛋白酶的150mM NaCl,pH 1.5。用pH条测试溶液的pH并根据需要使用5M HCl重调节至1.5-2。将样品于37℃温育30分钟,每10分钟温和混合。通过用5MNaOH将pH调节至8以上来灭活胃蛋白酶,然后将含有胃蛋白酶的溶液交换autoMACS缓冲液,1％Tween 20和1.5mM精胺四氯化物(MACS-T-STC)。使用10ml MACS-T-STC将消化样品过滤穿过40μm滤器,通过离心来收集,并在500μl MACS-T-STC中重悬浮,供在下游应用前贮存。
实施例2–自固定组织提取单细胞
首先以1:1比在IKA混合仪中在MACS缓冲液中混合固定组织(扁桃体或肿瘤)以生成匀浆物,其能贮存供进一步使用。为了提取完整单细胞,实施下述步骤:
1.以1:5比在CC1缓冲液中悬浮匀浆物并于85℃加热30分钟
2.在IKA混合仪中混合预加热的悬浮液(2次,每次2分钟,10秒间隔)
3.用1mm金属筛过滤混合悬浮液
4.用20um细胞过滤器再次过滤滤出液
5.用10um细胞过滤器过滤滤出液
6.滤出液主要含有单细胞而残留物含有不同尺寸片段
7.将单细胞悬浮液以500g离心并在PBS中重悬浮
实施例3–自石蜡块提取组织
将含有组织的石蜡块于65℃熔化30分钟,并丢弃过量的蜡。将温热的组织切成尺寸小于1mm2的碎片,并将组织碎片放置在具有网眼侧面的盒中。将盒放置在Leica自动加工仪中并在二甲苯中于42℃搅动温育2小时。将盒交换入乙醇并于室温搅动温育1小时。使用两次1.5L dH2O交换将组织于室温搅动重水合1小时。如上文所述解离重水合组织。
实施例4–用于自原发性人肿瘤获得单细胞悬浮液的样品规程(自肿瘤样品解离细胞)
1.在用肿瘤胶原酶消化前,使用解剖刀将原发性人肿瘤横切成小块并完全切碎直至接近液体；确保切组织而非撕组织。
2.基于组织的量添加胶原酶。胶原酶:9份培养基199对每1份胶原酶/透明质酸酶。补足200-250个单位的胶原酶混合物每mL肿瘤,将总体积调节至肿瘤的尺寸,不超过3-4mL。
3.将胶原酶溶液中的切碎的肿瘤转移入50mL锥形管。
4.将50mL锥形管放置入37℃摇床或水浴。如果在摇床中的话,将运动设置为65rpm达30分钟至1小时,中途混合。否则的话,在水浴中温育多至1小时,每15分钟混合。
5.使用具有18或23号针头的5mL注射器将混合物滴定20-25次。悬浮液应当穿过针头。
6.通过以所添加的胶原酶混合物的至少等量添加2％FBS/HBSS混合物来停止消化。
7.然后将细胞以40g离心30秒以分开单细胞/成纤维细胞与细胞器(上清液会含有单细胞,团粒细胞器)或过滤穿过40uM尼龙筛细胞过滤器,然后以1000rpm离心5分钟,吸掉上清液,并在2％FBS/HBSS混合物中重悬浮团粒。
8.用2％FBS/HBSS混合物清洗两次。
9.任选的差异沉降步骤,以分开细胞的聚集体与单细胞,如下文所述:
9.1第一次用M-199清洗后,在10mL M-199中重悬浮细胞。用手振荡,然后静置15分钟
9.2自沉降至管底的细胞小心去除液体并搁置。
9.3将前两个步骤重复一次并前进。确保对上清液和形成团粒的细胞二者进行细胞计数。
10.最后一次清洗后,在5-10mL培养基中悬浮细胞和/或冷冻细胞器。将50μL小样取至Coulter计数仪。对核计数,这样你就知道存在多少细胞。
11.以期望的密度,通常以106个细胞每个35mm板在5％IH中将细胞铺板。以5-10x106个细胞每个安瓿在冷冻培养基中冷冻未铺板的细胞。
实施例5–细胞尺寸分析
使用酪胺信号放大(TSA)的染色
将核(3x 107个颗粒每管)以300xg离心2分钟,之后在0.3ml 3％H2O2中重悬浮。温育15分钟后,将细胞用含0.1％Tween 20,0.1％BSA的PBS清洗3次。添加TSA封闭缓冲液(0.3ml)达5分钟,继以在0.2ml一抗中于37℃温育30分钟。将细胞用含0.1％Tween 20,0.1％BSA的PBS清洗3次,然后在0.2ml缀合辣根过氧化物酶的山羊抗物种抗体中于37℃重悬浮30分钟。在1.2ml 20μM酪胺-罗丹明101中稀释细胞并温育5分钟,继以1.2ml TSA H2O2达30分钟。将细胞用含0.5％右旋糖酐,0.1％Tween 20,0.1％BSA的PBS清洗3次并在MACS-T-STC中重悬浮供贮存。在成像或流式细胞术前,将细胞用3μM DAPI染色10分钟。
流式细胞术
在分析前将样品过滤穿过40μm滤器。在Sony SH800细胞分选仪上进行分析和分选。使用DAPI脉冲宽度和面积进行双联体鉴别。
细胞/核的产量和尺寸分布的测量
在Isoton II溶液(Beckman Coulter)中1:10,000稀释样品并在Multisizer 4e(Beckman Coulter)上分析。通过监测来自相同肿瘤的不同制备物的颗粒的尺寸分布来评估再现性。对FACS分选的细胞和核类似地测量尺寸分布。
来自图像的细胞/核的尺寸分布的测量
将核/细胞样品稀释至105个颗粒每ml左右并铺在载玻片上。在先前已经校准像素:微米转换的Zeiss Axio显微镜上在多个视野(至少6个每份样品)间以20倍放大倍数取得明场图像。在ImageJ中对图像进行阈值处理以产生二元掩模,然后用于确定单细胞的面积。使用面积测量来计算每个视野中的所有单细胞或核的直径。
结果
解离的肿瘤核的尺寸分布的分析
在使用Coulter计数仪确定组织解离方法的产量的再现性时,我们注意到来自不同类型的肿瘤的核分布成具有相似相对尺寸分布的两种群体,如图5A和5B中描绘的。
解离的肿瘤核的FACS分选
为了确定肿瘤核是否可以通过流式细胞术来分析和使用FACS来分选,我们将来自相同的解离的肿瘤样品的核针对细胞角蛋白染色。细胞角蛋白保持与核联合且充当肿瘤起源的核的“核表面标志物”。我们另外用揭示DNA含量的DAPI将核染色。图6显示对于结肠和肺癌样品二者,我们能够鉴定含有比细胞角蛋白阴性(正常)群体更高DNA含量的细胞角蛋白阳性群体(小图i-iii),确认细胞角蛋白阳性核很可能是自肿瘤细胞衍生的,而细胞角蛋白阴性核很可能是自代表性样品中的正常细胞衍生的。使用FACS分选这些核(分选的纯度检查在小图iv-v中显示)。这项实验提供细胞角蛋白阳性和阴性核供通过Coulter计数仪的分析。
分选的肿瘤核的尺寸分布的分析
我们接下来使用Coulter计数仪分析细胞角蛋白阳性和细胞角蛋白阴性核的尺寸分布。图7显示自先前的实验中获得的结肠和肺肿瘤分选的群体的分析,覆盖在来自图4的相对尺寸分布上。细胞角蛋白阴性核(虚线)与较小群体对齐,而细胞角蛋白阳性核(实线)与较大群体对齐。这些数据支持较小核衍生自正常细胞,而较大核衍生自肿瘤细胞。这些数据与在组织学H&E染色的载片(未显示)中看到的肿瘤核相对于免疫核尺寸更大一致。
解离的肿瘤细胞的尺寸分布的分析
通过Coulter计数仪对自固定的肿瘤(结肠和肺)解离的细胞基于尺寸的分析可再现地产生双峰分布(图8)。为了更好地理解分布的性质,分析自固定的结肠肿瘤解离的EpCAM阳性细胞。EpCAM阳性细胞的尺寸与解离的肿瘤细胞内的较大细胞群体的尺寸对齐。还混合固定的扁桃体并将提取的单细胞的尺寸与肿瘤解离细胞的尺寸比较。扁桃体解离细胞的尺寸与解离的肿瘤细胞内的较小细胞群体的尺寸对齐(图8)。
自石蜡提取的组织的尺寸分布的分析
我们接下来试图确定自石蜡块提取的组织是否可以解离成在尺寸上与自没有在蜡中包埋的福尔马林固定的组织分离的细胞相似的细胞。这项实验的目的是确定任何基于尺寸的颗粒区分是否可应用于自蜡提取的组织,诸如存档的肿瘤块样品。为了测试这一点,我们机械解离从未在蜡中包埋的福尔马林固定的扁桃体组织并使用Coulter计数仪分析细胞(图9,黑色)。我们还自石蜡块提取扁桃体组织(见方法),并类似地解离和分析它(图9,灰色)。这些数据显示自从未包埋的组织分离的细胞与自石蜡提取的组织相比有相似的尺寸分布。
使用基于正交图像的方法对来自扁桃体组织和肿瘤组织的核和细胞的尺寸分布 的分析
为了验证核和细胞的确切尺寸,我们对自扁桃体和肿瘤组织分离的核和细胞实施基于图像的分析(图16)。这些数据支持使用Coulter方法鉴定的肿瘤和正常细胞颗粒之间的尺寸差异,而且提供可用于分开群体的确切直径的估计。
实施例6–下一代测序方法学
使用Roche High Pure FFPET DNA分离试剂盒(Roche,产品号:06650767001)遵循制造商推荐的规程自每份样品纯化基因组DNA,只是将在摇动温箱中于56℃蛋白酶K消化时间延长至2小时。通过NanoDrop 8000(ThermoFisher)上的分析测量纯化的gDNA的产量。
使用SeqCap EZ HyperCap Workflow用户指南,v1.0(Roche测序方案)自1ug纯化的输入gDNA构建文库,下面仅是简要细节以突显来自用户指南的关键步骤。依照制造商的说明书(Roche测序方案)使用KAPA HyperPlus文库制备试剂盒酶促片段化提取的gDNA,修复,并为靶富集做好准备。具体而言,将来自每份样品的1ug gDNA于37℃片段化40分钟,于65℃修复末端和加A尾30分钟,并以45pM的衔接头终浓度使用SeqCap单索引衔接头(RocheSeqCap衔接头试剂盒A和B)于16℃连接衔接头16小时。不对文库实施pre-cap LM-PCR扩增。遵循上文提到的用户指南使用SeqCap EZ MedExome富集试剂盒(Roche)实施靶富集；具体而言,47℃,16小时。捕捉后LM-PCR实施总共14个循环,代替用户指南中推荐的7至9。
合并文库,为测序做好准备,并遵循HiSeq 2500系统指南(Illumina文件号15035786 v01)使用HiSeq HO V3试剂盒在Illumina HiSeq 2500仪器上测序。
工业实用性的声明
本公开具有医学和诊断学领域中的工业实用性。
通过援引将本说明书中提到的和/或申请数据表中列出的所有美国专利,美国专利申请出版物,美国专利申请,外国专利,外国专利申请和非专利出版物完整收入本文。如有必要可以修改实施方案的各方面以采用各种专利,申请和出版物的概念以提供还有别的实施方案。
尽管已经提及一些例示性实施方案来描述本公开,应当理解的是本领域技术人员能设计出会落在本公开的原理的精神和范围内的众多其它修改和实施方案。更加特别地,在不脱离本公开的精神的情况下,在前述公开,附图,和所附权利要求书的范围内的主题组合布置的组成部分和/或布置中做出合理变异和修改是可能的。在组成部分和/或布置中的变异和修改以外,备选用途对于本领域技术人员而言也会是显而易见的。
另外的实施方案
另外的实施方案1.一种自组织样品分隔细胞的方法,其包含:将组织样品匀浆以提供经过匀浆的组织样品；通过尺寸分选经过匀浆的样品中的细胞,其中将细胞分选入至少第一和第二细胞群体,第一细胞群体富含具有范围为约4μm至约12μm的平均直径的细胞,且第二细胞群体富含具有范围为约12μm至约50μm的平均直径的细胞。
另外的实施方案2.另外的实施方案1的方法,其中第一细胞群体中至少90％的细胞具有范围为4μm至12μm的平均直径,且其中第二细胞群体中至少90％的细胞具有范围为12μm至50μm的平均直径。
另外的实施方案3.前述另外的实施方案任一项的方法,其中第一细胞群体富集非肿瘤细胞,且其中第二细胞群体富集肿瘤细胞。
另外的实施方案4.前述另外的实施方案任一项的方法,其中肿瘤细胞具有范围为约12μm至约50μm的平均直径。
另外的实施方案5.前述另外的实施方案任一项的方法,其中组织样品是自完整肿瘤,部分肿瘤,和/或淋巴结衍生的。
另外的实施方案6.前述另外的实施方案任一项的方法,其中组织样品是自残留外科材料或活检样品衍生的。
另外的实施方案7.另外的实施方案6的方法,其中组织样品是自在石蜡中包埋的样品衍生的。
另外的实施方案8.另外的实施方案1至6任一项的方法,其中在分选前进一步加工经过匀浆的组织样品。
另外的实施方案9.另外的实施方案8的方法,进一步加工包含消化经过匀浆的样品内的蛋白质和过滤经过匀浆的样品的步骤。
另外的实施方案10.另外的实施方案1至6任一项的方法,其中通过尺寸分选经过匀浆的样品中的细胞不要求将细胞染色的步骤。
另外的实施方案11.另外的实施方案10的方法,其中利用微流控装置通过尺寸分选经过匀浆的样品中的细胞。
另外的实施方案12.另外的实施方案11的方法,其中微流控装置是确定性侧向位移装置。
另外的实施方案13.另外的实施方案12的方法,其中经过匀浆的组织样品内具有小于约12μm的临界直径的细胞与通行穿过装置的流体的对流一起移动,而经过匀浆的组织样品内具有大于约12μm的临界直径的细胞以由阵列的排列规定的方向移动。
另外的实施方案14.另外的实施方案11的方法,其中微流控装置是水泳过滤装置。
另外的实施方案15.另外的实施方案11的方法,其中微流控装置是流体动力学过滤装置。
另外的实施方案16.另外的实施方案11的方法,其中微流控装置利用弯曲通道中的惯性聚焦。
另外的实施方案17.另外的实施方案11的方法,其中微流控装置利用直行通道中的惯性聚焦。
另外的实施方案18.另外的实施方案17的方法,其中直行通道中的惯性聚焦包含夹窄流分级加工或流体动力学扩散加工之一。
另外的实施方案19.另外的实施方案1至6任一项的方法,其进一步包含对第一或第二群体内的细胞测定第一生物标志物的步骤。
另外的实施方案20.另外的实施方案19的方法,其中第一生物标志物的存在指示癌症。
另外的实施方案21.另外的实施方案19的方法,其中第一生物标志物是免疫细胞标志物。
另外的实施方案22.另外的实施方案1至6任一项的方法,其中使用下一代测序对第一和第二细胞群体中每一项独立测序。
另外的实施方案23.另外的实施方案1至6任一项的方法,其中第一和第二细胞群体为患者提供匹配的肿瘤和正常细胞样品。
另外的实施方案24.另外的实施方案23的方法,其中分析匹配的肿瘤和正常细胞以鉴定体细胞突变,拷贝数变异,或其它遗传改变。
另外的实施方案25.一种对样品内的基因组材料测序的方法,其包含:将组织样品匀浆以提供经过匀浆的组织样品；并对至少富集肿瘤细胞的第一细胞群体测序。
另外的实施方案26.另外的实施方案25的方法,其中用微流控装置分选经过匀浆的样品的内细胞以提供至少两种细胞群体,其中分选后第一细胞群体内至少80％的细胞是肿瘤细胞。
另外的实施方案27.另外的实施方案25至26任一项的方法,其中第一细胞群体内至少80％的细胞具有大于12μm的尺寸。
另外的实施方案28.另外的实施方案25至27任一项的方法,其中依照它们的流体动力学尺寸分选细胞。
另外的实施方案29.另外的实施方案25至28任一项的方法,其中肿瘤样品是自外科切除衍生的。
另外的实施方案30.另外的实施方案26至29任一项的方法,其中微流控装置不要求在分选前将细胞染色。
另外的实施方案31.另外的实施方案26至30任一项的方法,其中微流控采用确定性侧向位移,水泳过滤,流体动力学过滤,弯曲通道中的惯性聚焦,和直行通道中的惯性聚焦之一。
另外的实施方案32.另外的实施方案25至31任一项的方法,其中以第一细胞群体的总重量计,第一细胞群体包含至少0.05微克基因组材料用于测序。
另外的实施方案33.另外的实施方案25至31任一项的方法,其中以第一细胞群体的总重量计,第一细胞群体包含至少0.1微克基因组材料用于测序。
另外的实施方案34.另外的实施方案25至33任一项的方法,其中该方法包含测序前至多4个扩增循环。
另外的实施方案35.一种自肿瘤样品衍生肿瘤核的富集群体和正常核的富集群体的方法,其包含自肿瘤样品解离肿瘤和正常核；用微流控分选装置通过尺寸分选肿瘤和正常核,且其中微流控分选装置不要求在分选前染色或生物标志物分析的步骤。
另外的实施方案36.另外的实施方案35的方法,其中肿瘤核的富集群体包含至少85％肿瘤核；且其中正常核的富集群体包含至少85％正常核。
另外的实施方案37.另外的实施方案35至36任一项的方法,其中肿瘤核的富集群体内的肿瘤核具有大于8.5μm的平均核尺寸。
另外的实施方案38.另外的实施方案35至37任一项的方法,其中正常核的富集群体内的正常核包含小于8.5μm的平均核尺寸。
另外的实施方案39.另外的实施方案35至38任一项的方法,其进一步包含对肿瘤核的富集群体和正常核的富集群体分开测序的步骤。
另外的实施方案40.另外的实施方案39的方法,其中在肿瘤细胞的富集群体中鉴定体细胞突变,拷贝数变异,或其它遗传改变中至少一项。
另外的实施方案41.另外的实施方案35至40任一项的方法,其中肿瘤样品是自完整肿瘤,部分肿瘤,一个或多个淋巴结,和/或在石蜡中包埋的样品衍生的。
另外的实施方案42.另外的实施方案35至41任一项的方法,其中肿瘤样品包含新鲜解离的组织。
另外的实施方案43.一种通过鉴定对特定治疗或活性药学组分有响应的癌症亚型来治疗癌症的方法,其中通过对富含肿瘤细胞的样品测序来鉴定癌症亚型；其中该方法包含通过:(i)将包含肿瘤,一个或多个淋巴结,或血液中至少一项的输入组织样品匀浆；并(ii)用基于尺寸的分选装置分选肿瘤细胞与正常细胞使样品富集肿瘤细胞,其中基于尺寸的分选装置不要求在分选前将肿瘤细胞染色。
另外的实施方案44.另外的实施方案43的方法,其中富含肿瘤细胞的细胞群体包含足够量的基因组材料,使得在测序前进行至多四个扩增循环。
另外的实施方案45.另外的实施方案44的方法,其中在测序前进行至多2个扩增循环。
另外的实施方案46.另外的实施方案44的方法,其中基因组材料的数量是至少0.01微克。
另外的实施方案47.另外的实施方案44的方法,其中基因组材料的数量是至少0.1微克。
另外的实施方案48.另外的实施方案44的方法,其中基因组材料的数量是至少0.2微克。
另外的实施方案49.另外的实施方案44的方法,其中基因组材料的数量是至少0.5微克。
另外的实施方案50.另外的实施方案43至49任一项的方法,其中在鉴定癌症亚型后,对自其衍生样品的患者提供治疗过程。
另外的实施方案51.一种通过鉴定肿瘤细胞中的体细胞突变来治疗癌症的方法,其包含:(i)将自患者衍生的组织样品匀浆；(ii)解离经过匀浆的组织样品内的细胞；并(iii)用微流控装置分开解离的肿瘤样品中的肿瘤细胞与正常细胞以提供:(a)富集肿瘤细胞的第一群体,其中第一群体内的肿瘤细胞具有大于12μm的平均直径,和(b)富集正常细胞的第二群体,其中第二群体内的正常细胞具有小于12μm的平均直径,且其中微流控装置不要求在分选前染色或标记。
另外的实施方案52.另外的实施方案51的方法,其中微流控装置采用确定性侧向位移,水泳过滤,流体动力学过滤,弯曲通道中的惯性聚焦,和直行通道中的惯性聚焦之一。
另外的实施方案53.一种自组织样品分隔细胞,核,或组织聚集体以推动下游分析的方法,其包含:
自组织样品分开细胞,核,或组织聚集体以提供分开的样品；
使用分选装置通过尺寸分选分开的样品中的细胞,核,或组织聚集体,其中将细胞,核,或组织聚集体分选入第一和第二群体,第一群体具有第一细胞,核,或组织聚集体平均直径且第二群体具有第二细胞,核,或组织聚集体平均直径。
另外的实施方案54.另外的实施方案53的方法,其中第一群体富集肿瘤细胞,核或组织聚集体；且第二群体富集正常细胞,核或组织聚集体；且其中第一群体的平均直径大于第二群体的平均直径。
另外的实施方案55.另外的实施方案53至54任一项的方法,其中分选装置采用确定性侧向位移,水泳过滤,流体动力学过滤,弯曲通道中的惯性聚焦,和直行通道中的惯性聚焦之一。
另外的实施方案56.另外的实施方案53至55任一项的方法,其进一步包含对第一或第二群体中至少一项实施基因组分析的步骤。
另外的实施方案57.另外的实施方案53至56任一项的方法,其进一步包含对第一或第二群体中至少一项实施流式细胞术分析的步骤。
另外的实施方案58.另外的实施方案53至57任一项的方法,其进一步包含将第一或第二群体中至少一项针对至少一种生物标志物的存在染色的步骤。
另外的实施方案59.一种自新鲜的组织样品分隔细胞的方法,其包含:
将新鲜的组织样品匀浆以提供经过匀浆的组织样品；
通过尺寸分选经过匀浆的新鲜肿瘤样品中的细胞,其中将细胞分选入第一和第二细胞群体,第一细胞群体富含具有范围为约6μm至12μm的平均直径的细胞,且第二细胞群体富含具有大于12μm的平均直径的细胞。
另外的实施方案60.另外的实施方案59的方法,其中第一细胞群体富集非肿瘤细胞,且其中第二细胞群体富集肿瘤细胞。
另外的实施方案61.另外的实施方案59至60任一项的方法,其中新鲜的肿瘤样品是自新鲜的完整肿瘤,新鲜的部分肿瘤,和/或新鲜的淋巴结衍生的。
另外的实施方案62.另外的实施方案59至60任一项的方法,其中新鲜的肿瘤样品是自新鲜的残留外科材料或新鲜的活检样品衍生的。
另外的实施方案63.另外的实施方案59至62任一项的方法,其中分选装置不要求将细胞染色的步骤。
另外的实施方案64.另外的实施方案63的方法,其中分选装置是微流控装置。
另外的实施方案65.另外的实施方案64的方法,其中微流控装置是确定性侧向位移装置。
另外的实施方案66.另外的实施方案65的方法,其中经过匀浆的新鲜的肿瘤样品内具有小于12μm的直径的细胞与通行穿过确定性侧向位移装置的流体的对流一起移动,而经过匀浆的样品内具有大于12μm的临界直径的细胞以由阵列的排列规定的方向移动。
另外的实施方案67.另外的实施方案64的方法,其中微流控装置是水泳过滤装置。
另外的实施方案68.另外的实施方案64的方法,其中微流控装置是流体动力学过滤装置。
另外的实施方案69.另外的实施方案64的方法,其中微流控装置利用弯曲通道中的惯性聚焦。
另外的实施方案70.另外的实施方案64的方法,其中微流控装置利用直行通道中的惯性聚焦。
另外的实施方案71.另外的实施方案70的方法,其中直行通道中的惯性聚焦包含夹窄流分级加工或流体动力学扩散加工之一。
另外的实施方案72.另外的实施方案59至62任一项的方法,其进一步包含对第一或第二群体内的细胞测定第一生物标志物的步骤。
另外的实施方案73.另外的实施方案72的方法,其中第一生物标志物的存在指示癌症。
另外的实施方案74.另外的实施方案72的方法,其中第一生物标志物是免疫细胞标志物。
另外的实施方案75.一种自组织样品分隔细胞的方法,其包含:将肿瘤样品匀浆以提供经过匀浆的组织样品；通过尺寸分选经过匀浆的组织样品中的细胞,其中将细胞分选入第一和第二细胞群体,第一细胞群体富含具有小于12μm的平均直径的细胞,且第二细胞群体富含具有大于12μm的平均直径的细胞。
另外的实施方案76.一种富集肿瘤细胞的组合物,肿瘤细胞具有大于12μm的尺寸,其中在没有首先将肿瘤或正常细胞染色的情况下分开肿瘤细胞与正常细胞。
另外的实施方案77.另外的实施方案76的组合物,其中至少50％的组合物包含肿瘤细胞。
另外的实施方案78.另外的实施方案76的组合物,其中至少65％的组合物包含肿瘤细胞。
另外的实施方案79.另外的实施方案76的组合物,其中至少80％的组合物包含肿瘤细胞。
另外的实施方案80.另外的实施方案76的组合物,其中至少95％的组合物包含肿瘤细胞。
另外的实施方案81.一种包含第一细胞群体和第二细胞群体的试剂盒,第一细胞群体实质性富集具有大于12μm的尺寸的肿瘤细胞,第二细胞群体实质性富集具有小于12μm的尺寸的正常细胞,第一和第二细胞群体是自相同肿瘤样品衍生的,且其中肿瘤细胞和正常细胞是未染色的。
另外的实施方案82.一种测试遗传异常的方法,其包含对另外的实施方案81的细胞群体中每一项实施基因组分析。
另外的实施方案83.另外的实施方案82的方法,其进一步包含对另外的实施方案81的细胞群体中至少一项鉴定生物标志物的步骤。
另外的实施方案84.一种用于分开自组织样品衍生的细胞的装置,该装置包含立柱,阻碍,或阻碍物中一项或多项,使得具有小于12μm的尺寸的细胞以第一方向流动,而具有大于12μm的尺寸的细胞以第二方向流动。
另外的实施方案85.一种富集肿瘤核的组合物,肿瘤核具有大于8.5μm的尺寸,其中在没有首先将肿瘤或正常核染色的情况下分开肿瘤核与正常核。
另外的实施方案86.另外的实施方案85的组合物,其中至少50％的组合物包含肿瘤核。
另外的实施方案87.另外的实施方案85的组合物,其中至少65％的组合物包含肿瘤核。
另外的实施方案88.另外的实施方案85的组合物,其中至少80％的组合物包含肿瘤核。
另外的实施方案89.另外的实施方案85的组合物,其中至少95％的组合物包含肿瘤核。
另外的实施方案90.一种包含第一核群体和第二核群体的试剂盒,第一核群体实质性富集具有大于8.5μm的尺寸的肿瘤核,第二核群体实质性富集具有小于8.5μm的尺寸的正常核,第一和第二核群体是自相同肿瘤样品衍生的,且其中肿瘤核和正常核是未染色的。
另外的实施方案91.一种测试遗传异常的方法,其包含对另外的实施方案90的细胞群体中每一项实施基因组分析。
另外的实施方案92.一种用于分开自肿瘤样品衍生的核的装置,该装置包含立柱,阻碍,或阻碍物中一项或多项,使得具有小于8.5μm的尺寸的核以第一方向流动,而具有大于8.5μm的尺寸的核以第二方向流动。

Claims (60)

1.一种自组织样品分隔细胞颗粒的方法,其包含:(i)将组织样品匀浆以提供经过匀浆的样品；并(ii)通过尺寸将经过匀浆的组织样品中的细胞颗粒分选入至少第一细胞颗粒群体和第二细胞颗粒群体。
2.权利要求1的方法,其中细胞颗粒包括细胞。
3.前述权利要求任一项的方法,其中细胞颗粒包括细胞核。
4.前述权利要求任一项的方法,其中第二细胞颗粒群体包含自肿瘤细胞衍生的细胞颗粒。
5.权利要求4的方法,其中自肿瘤细胞衍生的细胞颗粒具有范围为介于约12μm至约50μm之间或介于约8.5μm至约30μm之间的平均直径。
6.权利要求5的方法,其中肿瘤细胞是自完整肿瘤,部分肿瘤,转移性肿瘤,部分转移性肿瘤,或淋巴结中至少一项衍生的。
7.前述权利要求任一项的方法,其中组织样品是自残留外科材料或活检样品中至少一项衍生的。
8.前述权利要求任一项的方法,其中组织样品是在交联溶液中固定的组织样品。
9.前述权利要求任一项的方法,其中组织样品是自在石蜡中包埋的样品衍生的。
10.前述权利要求任一项的方法,其中在分选前进一步加工经过匀浆的组织样品,其中进一步加工包含消化经过匀浆的样品内的蛋白质,加热样品,或过滤经过匀浆的样品中至少一项。
11.前述权利要求任一项的方法,其中通过尺寸分选经过匀浆的样品中的细胞颗粒不要求将细胞颗粒染色的步骤。
12.前述权利要求任一项的方法,其中用微流控装置分选经过匀浆的组织样品内的细胞颗粒。
13.权利要求12的方法,其中微流控装置是确定性侧向位移装置。
14.权利要求13的方法,其中经过匀浆的样品内具有小于约12μm的临界直径的细胞颗粒与通行穿过确定性侧向位移装置的流体的对流一起移动,而经过匀浆的样品内具有大于约12μm的临界直径的细胞以由阵列的排列规定的方向移动。
15.权利要求12的方法,其中微流控装置是水泳(hydrophoretic)过滤装置。
16.权利要求12的方法,其中微流控装置是流体动力学过滤装置。
17.权利要求12的方法,其中微流控装置利用弯曲通道中的惯性聚焦。
18.权利要求12的方法,其中微流控装置利用直行通道中的惯性聚焦。
19.权利要求18的方法,其中直行通道中的惯性聚焦包含夹窄流分级加工或流体动力学扩散加工之一。
20.前述权利要求任一项的方法,其进一步包含对至少第一或第二群体内的细胞颗粒测定第一生物标志物的步骤。
21.权利要求20的方法,其中第一生物标志物的存在指示癌症。
22.权利要求20的方法,其中第一生物标志物是免疫细胞标志物。
23.前述权利要求任一项的方法,其中使用下一代测序对第一和第二细胞颗粒群体中每一项独立测序。
24.前述权利要求任一项的方法,其中使用流式细胞术独立分析第一和第二细胞颗粒群体中每一项。
25.前述权利要求任一项的方法,其中第一和第二细胞颗粒群体为患者提供匹配的肿瘤和正常样品。
26.权利要求25的方法,其中分析匹配的肿瘤和正常样品以鉴定体细胞突变,拷贝数变异,或其它遗传改变。
27.前述权利要求任一项的方法,其进一步包含对第一和第二细胞颗粒群体分析RNA生物标志物。
28.权利要求1至26任一项的方法,其进一步包含对第一和第二细胞颗粒群体分析蛋白质生物标志物。
29.一种自组织样品分隔细胞的方法,其包含:
将组织样品匀浆以提供经过匀浆的组织样品；
通过尺寸分选经过匀浆的组织样品中的细胞,其中将细胞分选入至少富含具有小于12μm的平均直径的细胞的第一细胞群体和富含具有大于12μm的平均直径的细胞的第二细胞群体,且其中使用微流控装置分选经过匀浆的组织样品内的细胞。
30.权利要求29的方法,其中微流控装置选自由确定性侧向位移装置,水泳过滤装置,流体动力学过滤装置,利用弯曲通道中的惯性聚焦的微流控装置,和利用直行通道中的惯性聚焦的微流控装置组成的组。
31.权利要求29至30任一项的方法,其中微流控装置不要求在分选前对细胞染色。
32.权利要求29至31任一项的方法,其进一步包含对第一或第二细胞群体中至少一项分析RNA生物标志物或蛋白质生物标志物之一。
33.权利要求29至32任一项的方法,其进一步包含对第一或第二细胞群体中至少一项测序。
34.权利要求33的方法,其中第一或第二细胞群体中测序可用的基因组材料的量是至少0.05微克。
35.权利要求34的方法,其中基因组材料的量是至少0.1微克。
36.权利要求33至35任一项的方法,其中在测序前进行至多四个扩增循环。
37.权利要求33至36任一项的方法,其中测序采用下一代测序。
38.权利要求29至37任一项的方法,其中第一和第二细胞群体为患者提供匹配的肿瘤和正常样品。
39.权利要求29至38任一项的方法,其中第一细胞群体富含正常细胞且第二细胞群体富含肿瘤细胞。
40.一种自组织样品至少衍生肿瘤核的富集群体和正常核的富集群体的方法,其包含:自组织样品解离肿瘤和正常核；并用微流控分选装置通过尺寸分选肿瘤和正常核；其中正常核的富集群体内的正常核具有小于8.5μm的平均核尺寸；且其中肿瘤核的富集群体内的肿瘤核具有大于8.5μm的平均核尺寸。
41.权利要求40的方法,其中微流控分选装置不要求在分选前染色或生物标志物分析的步骤。
42.权利要求40或权利要求41的方法,其进一步包含对肿瘤核的富集群体或富集群体或正常核中至少一项分析RNA生物标志物或蛋白质生物标志物之一。
43.权利要求40至42任一项的方法,其进一步包含对肿瘤核的富集群体或正常核的富集群体中至少一项测序。
44.权利要求43的方法,其中第一或第二细胞群体中测序可用的基因组材料的量是至少0.05微克。
45.权利要求44的方法,其中基因组材料的量是至少0.1微克。
46.权利要求40至45任一项的方法,其进一步包含使用流式细胞术分析肿瘤核的富集群体或正常核的富集群体中至少一项。
47.权利要求40至46任一项的方法,其中组织样品是自完整肿瘤,部分肿瘤,转移性肿瘤,部分转移性肿瘤,或淋巴结中至少一项衍生的。
48.权利要求40至47任一项的方法,其中组织样品是自残留外科材料或活检样品中至少一项衍生的。
49.权利要求40至48任一项的方法,其中组织样品是在交联溶液中固定的组织样品。
50.权利要求40至49任一项的方法,其中组织样品是自在石蜡中包埋的样品衍生的。
51.一种自组织样品分隔细胞颗粒的方法,其包含:(i)将组织样品匀浆以提供经过匀浆的样品；并(ii)将经过匀浆的组织样品内的细胞颗粒分选入至少第一群体和第二群体,其中在微流控装置内分选细胞颗粒且其中在分选前不进行染色。
52.权利要求51的方法,其中细胞颗粒是细胞,且其中第一群体包含正常细胞且第二群体包含肿瘤细胞。
53.权利要求52的方法,其中正常细胞具有小于12μm的平均直径且肿瘤细胞具有大于12μm的平均直径。
54.权利要求51的方法,其中细胞颗粒是核,且其中第一群体包含正常核且第二群体包含肿瘤核。
55.权利要求53的方法,其中正常核具有小于8.5μm的平均直径且肿瘤核具有大于8.5μm的平均直径。
56.一种自组织样品分隔细胞颗粒的方法,其包含:(i)将组织样品匀浆以提供经过匀浆的样品；并(ii)将经过匀浆的组织样品内的细胞颗粒分选入至少第一群体和第二群体,其中在微流控装置内分选细胞颗粒且其中在分选前进行染色。
57.权利要求56的方法,其中细胞颗粒是细胞,且其中第一群体包含正常细胞且第二群体包含肿瘤细胞。
58.权利要求57的方法,其中正常细胞具有小于12μm的平均直径且肿瘤细胞具有大于12μm的平均直径。
59.权利要求56的方法,其中细胞颗粒是核,且其中第一群体包含正常核且第二群体包含肿瘤核。
60.权利要求59的方法,其中正常核具有小于8.5μm的平均直径且肿瘤核具有大于8.5μm的平均直径。
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