JP6990713B2 - 解離した固定組織のサイズに基づいた分離 - Google Patents
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Description
本出願は、2017年4月14日に出願された米国仮特許出願第62/485,550号の出願日の利益を主張し、その米国仮特許出願の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
一般的に、本開示は、細胞粒子(例えば、細胞、核)および/または小さい組織凝集物を組織試料(例えば、腫瘍試料、リンパ節試料など)から分離または分別し(工程100)、その後、細胞粒子および/または小さい組織凝集物を2つ以上の集団(例えば、腫瘍細胞粒子集団、正常細胞粒子集団)へ、例えば、サイズまたは水力学的サイズにより、選別し(工程110)、その結果、細胞粒子および/または小さい組織凝集物の各集団が分析され得る(工程120)方法を提供する(図1参照)。そのようなものとして、本開示は、シーケンシングおよび/またはタンパク質もしくはRNAバイオマーカー分析の上流の、固定された解離組織の分画のための手法を可能にする。いくつかの実施形態において、各細胞粒子集団またはそれの選別された画分は、特定の型の、細胞粒子(例えば、腫瘍細胞、正常細胞、腫瘍核、正常核)または腫瘍組織凝集物もしくは正常組織凝集物に富む。
明らかに反することが示されていない限り、1つより多い工程または行為を含む本明細書に主張された任意の方法において、本方法の工程または行為の順序は、本方法の工程または行為が列挙されている順序に必ずしも限定されないこともまた、理解されるべきである。
図1および2に関して、いくつかの実施形態において、細胞粒子(例えば、細胞、核、および/または小さい組織凝集物)が、組織試料をホモジナイズし(工程200)、その後、ホモジナイズ試料に存在する細胞粒子を解離させる(工程210)ことによるなど、組織から分離される(工程100)。その後、解離した細胞粒子は、選別され(工程220)、分析される(工程230)。
いくつかの実施形態において、腫瘍試料、リンパ節試料、および/または他の組織試料が、その試料を機械的剪断装置、例えば、ブレンダーまたは超音波処理装置へ入れることにより、ホモジナイズされる(工程200)。ホモジナイズは、様々な範囲の組織断片を生じる。ホモジナイズ腫瘍試料またはリンパ節試料を調製する方法が、同時係属中のPCT出願第PCT/US2016/060861号(2016年11月1日出願)に開示されており、そのPCT出願の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
(工程200からの)ホモジナイズ試料はさらに、解離および/または処理されて、解離した細胞粒子(例えば、解離した細胞または核)および/または小さい組織凝集物を得ることができる(工程210)。一般的に、酵素的解離、化学的解離、および機械的解離を含む組織解離のための3つの主な方法、またはその任意の組合せがある。解離のための方法の選択は、通常、組織の型および組織の起源に基づいてなされる。
組織試料からの細胞粒子(例えば、細胞または核)および/もしくは小さい組織凝集物の分離(工程100)、またはより具体的には、細胞粒子および/もしくは小さい組織凝集物のホモジナイズ(工程200)および解離(工程210)の後、細胞粒子および/もしくは小さい組織凝集物は選別される(工程110または220)。いくつかの実施形態において、分離された細胞粒子および/または小さい組織凝集物の選別は、その細胞粒子および/または小さい組織凝集物を染色する必要性なしに起こる。
いくつかの実施形態において、選別デバイスは、最初に細胞または核を染色することなく、またはそれらをいかなる作用物質(例えば、磁気粒子など)でも標識することなく、第1のサイズを有する細胞または核を第1の方向に方向づけ、第2のサイズを有する細胞または核を第2の方向に方向づける機器または装置である。
決定論的横変位(DLD)は、障害物の周りの層流の非対称分岐を利用する連続分離の立体的方法である(図11参照)。例えば、粒子サイズより大きいギャップを有する障害物のアレイを通って移動する粒子(本明細書では、細胞または核)は、それらのサイズおよび変形能に基づいて決定論的にそれらの経路を選択する。所定のサイズおよび変形能の粒子が、同等の移動経路をたどり、効率的な分離方法をもたらす。
いくつかの実施形態において、選別チャネルは、細胞を分離するために水力学的フォーカスを利用する。一般的に、水力学的フォーカスに頼る選別チャネルは、狭窄領域および拡大領域を含む。水力学的フォーカスは、試料フローをシースフローで覆うことによって縦方向に沿って一列に並べるように細胞をフォーカスすることにより機能する。本開示のある特定の実施形態において、(細胞ローリングがない場合の)拡大領域における細胞の位置は、Wp={W2/W1)d(式中、dは細胞の直径であり、W1は狭窄領域の幅であり、W2は拡大領域の幅である)により決定され得る。典型的には、シースフローは、細胞を狭窄領域の側壁と接触するように強制し、本開示の関連において、これは、細胞と、細胞接着実体でコーティングされている側壁の表面との間の相互作用を促進するために用いることができる。図13に示されているように、コーティングの存在は、そうでなければ、拡大領域の位置Wpに到達するであろう細胞を、拡大領域の側壁に沿ってローリングして、拡大領域における異なる位置から出て行かせることができる。特定の寸法W1およびW2、ならびにシースフローおよび試料フローのフロー速度が、選別されることになっている細胞の性質およびコーティングの性質に依存して調整され得ることは認識されているであろう。
標識を含まない音響流体システムは、一般的に、細胞を、それらのサイズの差に基づいて選別する。この細胞選別方法は、デバイスの作動での節への細胞の迅速な転置について、波節から離れた流線における細胞の最初の位置に頼り、それにより、異なるサイズまたは音響学的性質の細胞を分離する。
慣性力は、層流ストリームにおける流線を横切る細胞または粒子の誘導された移動を生じ得る。典型的には、慣性力は、マイクロ流体チャネルの壁に隣接した流体フローの境界効果から発し、揚力を引き起こす。曲線チャネルにおける慣性集束は、細胞分画のための明確な現象論的技術の一部を指し、その技術は、細胞順序付けおよび選別のための蛇行またはアルキメデスらせんパターンの使用を含む。
(上記で言及された)曲線チャネルに加えて、慣性力は、直線チャネルにおいて重要な役割を果たし得る。ピンチドフロー分画および水力学的スプレッディングは、慣性力が次の選別のための細胞の順序付けにおいて役割を果たしている2つの例である。ピンチドフロー分画は、細胞のフローストリームが、狭いチャネル横断面により狭められて、その結果、細胞が、圧迫されて、側壁に対して一列整列し、その後、チャネルが層流プロファイルによって広がったならば、サイズにより分離する時に起こる(図10参照)。この一列整列効果は、典型的には、シース流体により増強され、そのシース流体は、細胞を壁に押しつけ、その結果、より大きい細胞の中心は、より小さい細胞の中心より壁表面から遠くにあり、したがって、チャネルの広がりにより、異なるサイズの細胞にわずかに異なるフロー軌道を与える。この選別のための方法は、より良い水力学的コントロールのための複数の非対称出口の追加により、加えて、異なるサイズおよび質量の細胞集団間の分離の重力による増強のためのマイクロ流体デバイスの空間的な再配向により、拡張されている。
隆起誘導性流体泳動的濾過は、フロー交代性マイクロパターンによるマイクロ流体チャネル内の側圧勾配の形成に頼る。マイクロチャネルの床および天井上の傾斜した障害物の連続アレイは、チャネルの幅に渡る圧力勾配を誘導して、細胞を、型に従って、発生した局所的圧力場内の正確な位置へフォーカスし、その後、それらの細胞を分離する。流体泳動的濾過のためのデバイスおよび技術はさらに、少なくとも以下の参考文献に記載されており、その参考文献の開示は全体として参照により本明細書に組み入れられている:(i)Choi S、Song S、Choi C、Park JK. Lab Chip. 2007;7:1532~1538.[PubMed:17960282];(ii)Hsu CH、Di Carlo D、Chen C、Irimia D、Toner M. Lab Chip. 2008;8:2128~2134.[PubMed:19023476];(iii)Stott SL、Hsu CH、Tsukrov DI、Yu M、Miyamoto DT、Waltman BA、Rothenberg SM、Shah AM、Smas ME、Korir GK、Floyd FP Jr、Gilman AJ、Lord JB、Winokur D、Springer S、Irimia D、Nagrath S、Sequist LV、Lee RJ、Isselbacher KJ、Maheswaran S、Haber DA、Toner M. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010;107:18392~18397.[PubMed:20930119];(iv)Sollier E、Go DE、Che J、Gossett DR、O’Byrne S、Weaver WM、Kummer N、Rettig M、Goldman J、Nickols N、McCloskey S、Kulkarni RP、Di Carlo D. Lab Chip. 2014;14:63~77.[PubMed:24061411];および(v)Hyun KA、Kwon K、Han H、Kim SI、Jung HI. Biosensors & bioelectronics. 2013;40:206~212.[PubMed:22857995]。
細胞を選別するために均等に間隔を置いたポストのサイズおよびパターンを操作する代わりに、サイズ排除濾過は、細胞を選別するための距離の非バイナリー形式での関数として段階的(すなわち、徐々に減少していく)間隔でのポストの使用を指す。サイズ排除フィルターは、サイズおよび形により細胞を選択的にグループ化するピラーの一連の直線アレイからなる。
細胞含有流体の濾過は、細胞集団を分画するために用いられる最も初期の方法の1つである。これらのフィルターの例には、大細胞を捕捉するための大きなバリアを含有する堰フィルター、大細胞を捕捉するための1列の同じサイズのマイクロポストを含有するピラーフィルター、および大細胞を捕捉するための床または天井上の細孔のアレイを含有する膜フィルターが挙げられる。
水力学的濾過において、細胞は、複数の分岐した出口により分離され、それにより、出口から排出される流体は、細胞を、それらのサイズに従って増加減少する速度で主チャネルの壁から引き寄せる(図12参照)。より小さい細胞は、近位の出口から出て行き、それらの中心が、マイクロ流体チャネルの壁により近いからであり、それらのコントロールされた、より大きい細胞からの分路を可能にする。
いくつかの実施形態において、選別デバイスは、Vortex Biosciencesから入手できるVortex HEデバイスである。いくつかの実施形態において、Vortex HEデバイスは、複数の拡大領域が続く、粒子フォーカスのために用いられる高アスペクト比マイクロ流体チャネルを用いる、マイクロ流体デバイスである(図14参照)。いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、狭いフォーカスチャネルに続く拡大領域への粒子(または細胞)の流入は、ずり勾配揚力により起こると考えられる。揚力は、粒子を壁から離すように押す壁揚力と、粒子の周りの流体速度プロファイルにより決定される横方向ずり勾配揚力との間のバランスである。小さい粒子(または細胞)は、十分なずり勾配揚力を受けず、チャネルの中央へフォーカスし、拡大領域へ入らない。上流フォーカスチャネルの断面積を減少させることにより揚力を増加させることは、より小さい粒子(または細胞)が主流を横切って移動し、拡大領域に入ることを可能にする(例えば、拡大領域における捕捉された細胞)。Vortex HEデバイスはさらに、PCT/US2016/038230に記載されており、その開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。ボルテックス分離方法はまた、Manjima Dharら、「High Efficiency Vortex Trapping of Circulating Tumor Cells」、Biomicrofluidics 9、064116(2015)に開示されており、その開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
分離された試料はまた、通常の濾過(例えば、細胞ストレーナーまたは篩を用いること)、タンジェント濾過、カラムに基づいた濾過、および遠心分離(密度勾配遠心分離)を含む他のデバイスまたは機器により選別され得る。
一般的に、当業者に知られたリソグラフィー技術または他の技術が、マイクロ流体デバイスとして用いるのに実際に、任意の材料をパターン形成するために用いられ得る。適切なデバイスを調製するための例示的な方法は、米国第6,197,575号、米国特許公開第2010/0112026号、および米国特許公開第2010/0304485号に開示されており、それらの全内容は、参照により本明細書に組み入れられている。様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)、ガラス、二酸化珪素、またはフルオロポリマーから、全部または一部において製作され得る。ある特定の実施形態において、チャネルの壁は、親水性、タンパク質親和性、細胞親和性、またはこれらの任意の組合せを改変するための材料で処理され得る。例示的な処理材料には、ポリエチレングリコール類(例えば、ポリ(3-トリメトキシリル)-プロピルメタクリレート-r-ポリ(エチレングリコール)メチルエーテル、またはTMSMA-r-PEGMA)、自己組織化単分子膜を形成するオルガノシラン、エタノールなどが挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態において、細胞、核、および/または小さい組織凝集物の選別または濃縮された集団はさらに分析される(工程120、230、330、430、および440)。いくつかの実施形態において、選別デバイスは、検出器、顕微鏡、細胞カウンター(例えば、Coulterカウンター)、質量分析計、FACS、PCRデバイス、RT-PCRデバイス、ゲノムシーケンサー、画像化システムなどと流体連絡し得る。代替として、および他の実施形態において、選別デバイスは、後の分析のために貯蔵される細胞、核、または小さい組織凝集物のいくつかの集団を提供し得る。
いくつかの実施形態において、選別された細胞または核の集団(工程320または420)の少なくとも1つは、シーケンシングされる(工程330または440)。シーケンシングのための細胞および/または選別された核を調製する方法は、例えば、PCT/US2016/060835に開示されており、その開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
いくつかの実施形態において、解離した細胞の選別(工程420)の後にフローサイトメトリー分析が行われる(工程430)(図4)。フローサイトメトリーは、光学的/電子工学的検出装置を流れる単一細胞の物理的および/または化学的特性の同時的多パラメータ分析を可能にする技術である。フローサイトメトリーおよびそれの使用は、当業者によく知られている(例えば、参照により本明細書に組み入れられている、Ormerod、Flow Cytometry 第2版、Springer-Verlag、New York(1999)参照)。そのような使用には、モノクローナル抗体を用いる細胞表面抗原の免疫蛍光標識が挙げられるが、それに限定されない。臨床適用には、白血病およびリンパ腫(lumphoma)の免疫表現性分析、微小残存病変の検出、幹細胞列挙、T細胞交差適合および術後モニタリングを含む、臓器移植、自己抗体、HIV感染、胎児母体出血、免疫不全疾患、発作性夜間血色素尿症の検出、網状赤血球分析、細胞周期分析、細胞増殖、アポトーシス、RNA含有量、タンパク質含有量、細胞内酵素の動態解析、膜透過性、膜電位、細胞内酸化種の生成、薬物取り込みの測定、リガンドの結合およびエンドサイトーシス、細胞内カルシウムイオン、細胞内pH、細胞内グルタチオン、染色体分析および選別、細胞のトラッキング、細胞生存率の測定、電気透過処理のモニタリング、細胞の融合またはクラスター形成のモニタリング、マイクロビーズテクノロジーなどが挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態において、濃縮された細胞、核、または小さい組織凝集物の集団は、特定の標的分子を同定するアッセイにおいて染色される。標的分子は、核酸配列またはタンパク質であり得る。標的タンパク質が、疾患と関連した(例えば、相関した、原因として関与したなど)標的核酸配列から産生され得ることを当業者は認識しているであろう。特定の非限定的例において、標的タンパク質は、新生物(例えば、がん)と関連した標的核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)により産生される。多数の染色体異常(転位置および他の再配置、増幅または欠失を含む)は、腫瘍性細胞、特にがん細胞、例えば、B細胞およびT細胞白血病、リンパ腫、乳がん、結腸がん、神経系がんなどにおいて同定されている。したがって、いくつかの例において、標的分子の少なくとも一部分は、試料中の細胞の少なくともサブセットにおいて増幅された、または欠失した核酸配列(例えば、ゲノム標的核酸配列)により産生される。
いくつかの実施形態において、本開示は、インプット試料由来の細胞、核、または小さい組織凝集物をホモジナイズし、解離させ、および選別するために必要とされる成分を含むキットを提供する。例えば、キットは、特定の型の組織から細胞を解離させるのに必要とされる試薬を含み得、キットはまた、特定のサイズを有する細胞を選別するのに適切なマイクロ流体デバイスを含み得る。
機械的解離を、IKA-Works(0004180001;Staufen im Breisgau、Germany)製のIKA Works Tube Mill Controlシステムを用いて実施した。用いられた全てのフィルターは、Pluriselect(San Diego、CA)製であった。用いられたバッファーは、以下の会社製であった:CC1(950-124;Ventana Medical Systems、Tucson、AZ)、autoMACSバッファー(130-091-221、Miltenyi Biotech)、dPBS(14190、Fisher Scientific、USA)。Tween 20を、Fisher Scientific、USA(AC233362500)から購入した。以下の試薬を、Sigma、USAから購入した:四塩化スペルミン(S2876)、DAPI(D9542)、ペプシン(P7012)。プロテイナーゼKをVWR、USA(0706)から購入した。チラミド-ローダミン101を、Sigmaから購入した化学物質を用いて社内合成した。マウス抗サイトケラチン8/18抗体(760-4344)およびヤギ抗マウスHRPコンジュゲート型抗体(760-4310)は、Ventana Medical Systems製であった。Alexa 488またはAlexa 647とコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体を、Invitrogen(A-11001)から購入した。
全ての組織試料を、Ventana Medical Systemsにおいて、10%中性緩衝ホルマリン中、24時間、固定した。ヒト扁桃をNorthwest Medical Center(Tucson、AZ)から入手した。腫瘍細胞をGLAS/(Winston-Salem、NC http://glaswpcopy.wpengine.com/)から入手した。
固定組織解離
固定された扁桃組織を、IKAブレンダーにおいて、CC1バッファー(1:5)(85℃に加熱され、85℃で30分間、インキュベートされている)中、機械的に解離させ、その後、再び、IKAブレンダーにおいて混ぜた(2分間、10秒間の間隔)。混ぜられた材料を、1:10 MACSバッファー(1:10)へ交換し、40μmフィルターに通して濾過した。濾過された解離細胞を、Coulterカウンターを用いて収量およびサイズ分布について分析した。
固定組織からの単一細胞の抽出
固定組織(扁桃または腫瘍)を、まず、IKAブレンダーにおいて、MACSバッファー中1:1の比で混ぜて、さらなる使用のために保存することができるホモジネートを作製した。無傷の単一細胞を抽出するために、以下の工程を実施した:
1. ホモジネートを、CC1バッファー中1:5の比で懸濁し、85Cで30分間、加熱した。
2. 予熱された懸濁液を、IKAブレンダーにおいて混ぜた(10秒間の間隔を以て、それぞれ2分間、2回)。
3. 混ぜられた懸濁液を、1mm金属篩で濾過した。
4. 濾液を20um細胞ストレーナーで再び、濾過した。
5. 濾液を10um細胞ストレーナーで濾過した。
6. 濾液は大部分、単一細胞を含有したが、残留物は異なるサイズの断片を含有した。
7. 単一細胞懸濁液を、500gで遠心分離し、PBS中に再懸濁した。
パラフィンブロックからの組織の抽出
組織を含有するパラフィンブロックを、65℃で30分間、融解し、過剰なワックスを捨てた。温かい組織を、サイズが1mm2未満の小片へ切り、組織片を、メッシュの側面を有するカセット内へ置いた。カセットを、Leica自動プロセッサー内に置き、キシレン中、撹拌しながら42℃で2時間、インキュベートした。カセットをエタノール中へ交換し、撹拌しながら室温で1時間、インキュベートした。組織を、1.5L dH2Oの2回の交換を用いて、撹拌しながら、室温で1時間、再水和させた。再水和した組織を、上記のように解離させた。
原発性ヒト腫瘍から単一細胞懸濁液を得るための試料手順(腫瘍試料からの細胞の解離)
1. 腫瘍コラゲナーゼでの消化の前に、原発性ヒト腫瘍を、解剖用メスを用いることにより、小片へと横に切り、ほぼ液体まで完全に細かく切り刻む;組織を切断するのであって、組織を引き裂くのではないことに気をつける。
2. 組織の量に基づいてコラゲナーゼを加える。コラゲナーゼ:1のコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼに対して9の培地199。1mLの腫瘍あたり200~250ユニットのコラゲナーゼミックスを作製し、総体積は、腫瘍のサイズに適応させ、3~4mLを超えない。
3. コラゲナーゼ溶液中の細かく切断された腫瘍を50mLコニカルチューブへ移す。
4. 50mLコニカルチューブを37℃振盪機またはウォーターバスへ入れる。振盪機内の場合、65rpmで30分間~1時間に動作を設定し、その間の途中で混合する。さもなければ、ウォーターバス内で最大1時間、インキュベートし、15分間ごとに混合する。
5. 18ゲージ針かまたは23ゲージ針のいずれかを有する5mLシリンジを用いてその混合物を20~25回、滴定する。その懸濁液はその針を通り抜けるはずである。
6. 加えられたコラゲナーゼミックスの少なくとも等量で2%FBS/HBSSミックスを加えることにより消化を停止させる
7. その後、オルガノイドから単一細胞/線維芽細胞を分離するために、細胞を、40gで30秒間、遠心分離するか(上清は単一細胞を含有し、ペレットはオルガノイドを含有する)、または40uMナイロンメッシュ細胞ストレーナーに通して濾過し、その後、1000rpmで5分間、遠心分離するかのいずれかであり、上清を吸引して除去し、ペレットを2%FBS/HBSSミックス中に再懸濁する。
8. 2%FBS/HBSSミックスで2回、洗浄する。
9. 下記のような、細胞の凝集物を単一細胞から分離するための、任意の差別沈降工程:
9.1 M-199での1回目の洗浄後、10mL M-199中に細胞を再懸濁する。手による撹拌、その後、15分間、おく。
9.2 慎重に、チューブの底に沈殿している細胞から液体を除去し、取っておく。
9.3 前の2つの工程を1回、繰り返して進める。必ず、上清とペレット化細胞の両方に対して細胞計数を行うこと。
10. 最後の洗浄後、5~10mL培地中に細胞を再懸濁し、および/またはオルガノイドを凍結させる。Coulter Countへ50μLのアリコートを取る。核をカウントする(ご存じであろうが、どれくらい多くの細胞が存在することか)。
11. 細胞を5%IHにおいて所望の密度で、通常、35mmプレートあたり106個の細胞で、蒔く。蒔かれない細胞を、凍結培地中アンプルあたり5~10×106個の細胞で凍結させる。
細胞サイズ分析
チラミドシグナル増幅(TSA)を用いる染色
核(チューブあたり3×107個の粒子)を、0.3ml 3% H2O2中での再懸濁の前に、300x gで2分間、遠心分離した。15分間のインキュベーション後、細胞を、PBS中0.1%Tween 20、0.1%BSAで3回洗浄した。TSAブロッキングバッファー(0.3ml)を5分間、加え、その後、0.2ml一次抗体中、37℃で30分間、インキュベートした。細胞を、PBS中0.1%Tween 20、0.1%BSAで3回洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗種抗体の0.2ml中、37℃で30分間、再懸濁した。細胞を、1.2ml 20μMチラミド-ローダミン101中に希釈し、5分間、インキュベートし、その後、1.2ml TSA H2O2中30分間、インキュベートした。細胞を、PBS 3×中0.5%デキストラン、0.1%Tween20、0.1%BSAで洗浄し、保存のためにMACS-T-STC中に再懸濁した。画像化またはフローサイトメトリーの前に、細胞を3μM DAPIで10分間、染色した。
試料を、分析前に40μmフィルターに通して濾過した。分析および選別を、Sony SH800セルソーターにおいて行った。ダブレット識別を、DAPIパルス幅および面積を用いて行った。
試料を、Isoton II溶液(Beckman Coulter)中に1:10,000希釈し、Multisizer 4e(Beckman Coulter)において分析した。再現性を、同じ腫瘍についての異なるプレップ由来の粒子のサイズ分布をモニターすることにより評価した。サイズ分布を同様に、FACS選別された細胞および核について測定した。
核/細胞試料を、1mlあたり約105個の粒子へ希釈し、スライドグラス上に置いた。明視野画像を、ピクセル:ミクロン変換が予め較正されているZeiss Axio顕微鏡上での複数の視野(1試料あたり少なくとも6つ)にわたる20×倍率で取得した。画像を、ImageJにおいて閾値設定して、バイナリーマスクを作成し、その後、それを用いて、シングレット細胞の面積を決定した。面積測定値を用いて、各視野における全てのシングレット細胞または核についての直径を計算した。
解離した腫瘍核のサイズ分布の分析
Coulterカウンターを用いて、組織解離方法の収量の再現性を決定すると同時に、本発明者らは、図5Aおよび5Bに描かれているように、異なる型の腫瘍由来の核が、類似した相対的サイズ分布の2つの集団へ分配されたことを認めた。
腫瘍核がフローサイトメトリーにより分析され、FACSを用いて選別され得るかどうかを決定するために、本発明者らは、同じ解離した腫瘍試料由来の核をサイトケラチンについて染色した。サイトケラチンは、核に付随したままであり、腫瘍起源の核についての「核表面マーカー」としての役割を果たす。本発明者らは、加えて、核をDAPIで染色し、それにより、DNA含有量が明らかにされる。図6は、結腸がん試料と肺がん試料の両方について、本発明者らが、サイトケラチン陰性(正常)集団より高いDNA含有量を含有したサイトケラチン陽性集団を同定することができたことを示し(パネルi~iii)、代表試料において、サイトケラチン陽性核が腫瘍細胞に由来する可能性が高く、サイトケラチン陰性核が正常細胞に由来する可能性が高いことを確認した。これらの核を、FACSを用いて選別した(選別の純度チェックはパネルiv~vに示されている)。この実験は、Coulterカウンターによる分析についてサイトケラチン陽性および陰性の核を提供した。
本発明者らは、次に、Coulterカウンターを用いてサイトケラチン陽性核およびサイトケラチン陰性核のサイズ分布を分析した。図7は、図4からの相対的サイズ分布上にオーバーレイされた、前の実験で得られた結腸腫瘍および肺腫瘍由来の選別された集団の分析を示す。サイトケラチン陰性核(破線のトレース)はより小さい集団と同調し、一方、サイトケラチン陽性核(実線のトレース)は、より大きい集団と同調した。これらのデータは、より小さい核が正常細胞に由来し、一方、より大きい核が腫瘍細胞に由来することを支持している。これらのデータは、組織学的H&E染色スライド(未呈示)に見られた免疫核に対して腫瘍核のより大きいサイズと一致している。
Coulterカウンターによる固定腫瘍(結腸および肺)から解離した細胞のサイズに基づいた分析は、再現性よく、二峰性分布を生じた(図8)。分布の性質をより良く理解するために、固定化結腸腫瘍から解離したEpCAM陽性細胞を分析した。Ep-CAM陽性細胞のサイズは、解離した腫瘍細胞内のより大きい細胞集団のサイズと同調した。固定扁桃もまた混ぜて、抽出された単一細胞のサイズを、腫瘍から解離した細胞のサイズと比較した。扁桃から解離した細胞のサイズは、解離した腫瘍細胞内のより小さい細胞集団のサイズと同調した(図8)。
本発明者らは、次に、パラフィンブロックから抽出された組織が、ワックスで包埋されていないホルマリン固定組織から単離された細胞とサイズが類似している細胞へ解離され得るかどうかを決定しようとした。この実験の目的は、粒子のサイズに基づいたいかなる識別も、アーカイブの腫瘍ブロック試料などのワックスから抽出されている組織へ適用され得るかどうかを決定することである。これを試験するために、本発明者らは、ワックスで包埋されていなかったホルマリン固定扁桃組織を機械的に解離させ、Coulterカウンターを用いて細胞を分析した(図9、黒色)。本発明者らはまた、パラフィンブロックから扁桃組織を抽出し(方法参照)、それを同様に解離および分析した(図9、灰色)。パラフィンから抽出されている組織と比較して、包埋されていない組織から単離された細胞の類似したサイズ分布があることをこれらのデータは示している。
核および細胞の正確なサイズを検証するために、本発明者らは、扁桃および腫瘍組織から単離された核および細胞の画像に基づいた分析を実施した(図16)。これらのデータは、coulter方法を用いて同定された腫瘍細胞粒子と正常細胞粒子のサイズ差を支持し、それらの集団を分離するために用いることができる正確な直径の推定を提供する。
次世代シーケンシング方法
ゲノムDNAを、Roche High Pure FFPET DNA Isolation Kit(Roche、製品No.:06650767001)を用いて、振盪インキュベーターにおける56℃でのプロテイナーゼK消化時間を2時間に増加させる点を除いては製造会社の推奨手順に従って、各試料から精製した。精製されたgDNAの収量を、NanoDrop 8000(ThermoFisher)における分析により測定した。
追加の実施形態1
組織試料から細胞を分別する方法であって、組織試料をホモジナイズしてホモジナイズ組織試料を得ること;ホモジナイズ試料中の細胞をサイズにより選別することであって、細胞が少なくとも第1および第2の細胞集団に選別され、第1の細胞集団が、約4μmから約12μmまでの範囲の平均直径を有する細胞について濃縮されており、第2の細胞集団が、約12μmから約50μmまでの範囲の平均直径を有する細胞について濃縮されている、細胞を選別することを含む方法。
追加の実施形態2
第1の細胞集団における細胞の少なくとも90%が約4μmから12μmまでの範囲の平均直径を有し、第2の細胞集団における細胞の少なくとも90%が12μmから50μmまでの範囲の平均直径を有する、追加の実施形態1に記載の方法。
追加の実施形態3
第1の細胞集団が非腫瘍細胞に富み、第2の細胞集団が腫瘍細胞に富む、追加の実施形態1および2のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態4
腫瘍細胞が約12μmから約50μmまでの範囲の平均直径を有する、追加の実施形態1~3のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態5
組織試料が腫瘍全体、部分的腫瘍、および/またはリンパ節に由来する、追加の実施形態1~4のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態6
組織試料が残存外科的材料または生検試料に由来する、追加の実施形態1~5のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態7
組織試料が、パラフィンに包埋された試料に由来する、追加の実施形態6に記載の方法。
追加の実施形態8
ホモジナイズ組織試料が選別前にさらに処理される、追加の実施形態1~6のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態9
さらなる処理が、ホモジナイズ試料内のタンパク質を消化する工程およびホモジナイズ試料を濾過する工程を含む、追加の実施形態8に記載の方法。
追加の実施形態10
ホモジナイズ試料中の細胞をサイズにより選別することが、細胞を染色する工程を必要としない、追加の実施形態1~6のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態11
マイクロ流体デバイスが、ホモジナイズ試料中の細胞をサイズにより選別するために利用される、追加の実施形態10に記載の方法。
追加の実施形態12
マイクロ流体デバイスが決定論的横置換デバイスである、追加の実施形態11に記載の方法。
追加の実施形態13
約12μm未満の臨界直径を有する、ホモジナイズ組織試料内の細胞が、デバイスを通過する流体の対流と共に移動し、一方、約12μmより大きい臨界直径を有する、ホモジナイズ組織試料内の細胞が、アレイの配置により決定づけられた方向に移動する、追加の実施形態12に記載の方法。
追加の実施形態14
マイクロ流体デバイスが流体泳動的濾過デバイスである、追加の実施形態11に記載の方法。
追加の実施形態15
マイクロ流体デバイスが水力学的濾過デバイスである、追加の実施形態11に記載の方法。
追加の実施形態16
マイクロ流体デバイスが曲線チャネルにおける慣性集束を利用する、追加の実施形態11に記載の方法。
追加の実施形態17
マイクロ流体デバイスが直線チャネルにおける慣性集束を利用する、追加の実施形態11に記載の方法。
追加の実施形態18
直線チャネルにおける慣性集束が、ピンチドフロー分画法または水力学的スプレッディング法の1つを含む、追加の実施形態17に記載の方法。
追加の実施形態19
第1または第2の集団内の細胞を第1のバイオマーカーについてアッセイする工程をさらに含む、追加の実施形態1~6のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態20
第1のバイオマーカーの存在ががんを示す、追加の実施形態19に記載の方法。
追加の実施形態21
第1のバイオマーカーが免疫細胞マーカーである、追加の実施形態19に記載の方法。
追加の実施形態22
第1および第2の細胞集団のそれぞれが独立して、次世代シーケンシングを用いてシーケンシングされる、追加の実施形態1~6のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態23
第1および第2の細胞集団が、患者についてのマッチングした腫瘍細胞試料と正常細胞試料を提供する、追加の実施形態1~6のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態24
マッチングした腫瘍細胞と正常細胞が、体細胞突然変異、コピー数多型、または他の遺伝子変化を同定するために分析される、追加の実施形態23に記載の方法。
追加の実施形態25
試料内のゲノム材料をシーケンシングする方法であって、組織試料をホモジナイズしてホモジナイズ組織試料を得ること;および腫瘍細胞に富む、少なくとも第1の細胞集団をシーケンシングすることを含む方法。
追加の実施形態26
ホモジナイズ試料内の細胞が、マイクロ流体デバイスで選別されて、少なくとも2つの細胞集団を提供し、選別後の第1の細胞集団内の細胞の少なくとも80%が腫瘍細胞である、追加の実施形態25に記載の方法。
追加の実施形態27
第1の細胞集団内の細胞の少なくとも80%が、12μmより大きいサイズを有する、追加の実施形態25~26のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態28
細胞がそれらの水力学的サイズに従って選別される、追加の実施形態25~27のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態29
腫瘍試料が外科的切除に由来する、追加の実施形態25~28のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態30
マイクロ流体デバイスが選別前に細胞の染色を必要としない、追加の実施形態26~29のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態31
マイクロ流体が、決定論的横置換、流体泳動的濾過、水力学的濾過、曲線チャネルにおける慣性集束、および直線チャネルにおける慣性集束の1つを使用する、追加の実施形態26~30のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態32
第1の細胞集団が、全重量の第1の細胞集団によるシーケンシングのために、少なくとも0.05マイクログラムのゲノム材料を含む、追加の実施形態25~31のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態33
第1の細胞集団が、全重量の第1の細胞集団によるシーケンシングのために、少なくとも0.1マイクログラムのゲノム材料を含む、追加の実施形態25~31のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態34
シーケンシング前に多くても4回の増幅サイクルを含む、追加の実施形態25~33のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態35
腫瘍試料から、濃縮された腫瘍核集団および濃縮された正常核集団を取り出す方法であって、腫瘍試料から腫瘍核および正常核を解離させること、腫瘍核および正常核を、選別前に染色またはバイオマーカー分析の工程を必要としないマイクロ流体選別デバイスでサイズにより選別することを含む方法。
追加の実施形態36
濃縮された腫瘍核集団が、少なくとも85%の腫瘍核を含み、濃縮された正常核集団が少なくとも85%の正常核を含む、追加の実施形態35に記載の方法。
追加の実施形態37
濃縮された腫瘍核集団内の腫瘍核が、8.5μmより大きい平均核サイズを有する、追加の実施形態35~36のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態38
濃縮された正常核集団内の正常核が、8.5μm未満の平均核サイズを含む、追加の実施形態35~37のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態39
濃縮された腫瘍核集団および濃縮された正常核集団を別々にシーケンシングする工程をさらに含む、追加の実施形態35~38のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態40
体細胞突然変異、コピー数多型、または他の遺伝子変化の少なくとも1つが、濃縮された腫瘍細胞集団において同定される、追加の実施形態39に記載の方法。
追加の実施形態41
腫瘍試料が、腫瘍全体、部分的腫瘍、1つもしくは複数のリンパ節、および/またはパラフィンに包埋された試料に由来する、追加の実施形態35~40のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態42
腫瘍試料が新鮮に解離した組織を含む、追加の実施形態35~41のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態43
特定の処置または医薬品有効成分に応答性のがんサブタイプを同定することによりがんを処置する方法であって、がんサブタイプが、腫瘍細胞について濃縮された試料をシーケンシングすることにより同定され、方法が、(i)腫瘍、1つもしくは複数のリンパ節、または血液の少なくとも1つを含むインプット組織試料をホモジナイズすること;および(ii)腫瘍細胞を正常細胞から、サイズに基づいた選別デバイスで選別することであって、サイズに基づいた選別デバイスが、選別前に腫瘍細胞を染色することを必要としない、腫瘍細胞を正常細胞から選別することにより、試料を腫瘍細胞で富ませることを含む方法。
追加の実施形態44
腫瘍細胞について濃縮された細胞集団が、シーケンシング前に多くても4回の増幅サイクルが行われるような、十分な量のゲノム材料を含む、追加の実施形態43に記載の方法。
追加の実施形態45
シーケンシング前に多くても2回の増幅サイクルが行われる、追加の実施形態44に記載の方法。
追加の実施形態46
ゲノム材料の量が、少なくとも0.01マイクログラムである、追加の実施形態44に記載の方法。
追加の実施形態47
ゲノム材料の量が、少なくとも0.1マイクログラムである、追加の実施形態44に記載の方法。
追加の実施形態48
ゲノム材料の量が、少なくとも0.2マイクログラムである、追加の実施形態44に記載の方法。
追加の実施形態49
ゲノム材料の量が、少なくとも0.5マイクログラムである、追加の実施形態44に記載の方法。
追加の実施形態50
がんサブタイプの同定後、その試料が由来した患者へ処置コースが提供される、追加の実施形態43~49のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態51
腫瘍細胞において体細胞突然変異を同定することによりがんを処置する方法であって、(i)患者に由来する組織試料をホモジナイズすること;ならびに(ii)ホモジナイズ組織試料内の細胞を解離させること;ならびに(ii)解離した組織試料において腫瘍細胞を正常細胞からマイクロ流体デバイスで分離して、(a)腫瘍細胞に富む第1の集団であって、第1の集団内の腫瘍細胞が12μmより大きい平均直径を有する、第1の集団、および(b)正常細部に富む第2の集団であって、第2の集団内の正常細胞が12μm未満の平均直径を有する、第2の集団を提供することを含み、マイクロ流体デバイスが選別前に染色または標識を必要としない、方法。
追加の実施形態52
マイクロ流体デバイスが、決定論的横置換、流体泳動的濾過、水力学的濾過、曲線チャネルにおける慣性集束、および直線チャネルにおける慣性集束の1つを使用する、追加の実施形態51に記載の方法。
追加の実施形態53
下流分析を促進するために、組織試料から細胞、核、または組織凝集物を分別する方法であって、
組織試料から細胞、核、または組織凝集物を分離して分離された試料を得ること;
分離された試料中の細胞、核、または組織凝集物を、選別デバイスを用いてサイズにより選別することであって、細胞、核、または組織凝集物が第1の集団および第2の集団に選別され、第1の集団が、第1の細胞、核、または組織凝集物の平均直径を有し、第2の集団が、第2の細胞、核、または組織凝集物の平均直径を有する、細胞、核、または組織凝集物を選別すること
を含む方法。
追加の実施形態54
第1の集団が腫瘍の細胞、核、または組織凝集物に富み、第2の集団が正常な細胞、核、または組織凝集物に富み、第1の集団の平均直径が第2の集団の平均直径より大きい、追加の実施形態53に記載の方法。
追加の実施形態55
選別デバイスが、決定論的横置換、流体泳動的濾過、水力学的濾過、曲線チャネルにおける慣性集束、および直線チャネルにおける慣性集束の1つを使用する、追加の実施形態53~54のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態56
第1の集団または第2の集団の少なくとも1つにゲノム解析を実施する工程をさらに含む、追加の実施形態53~55のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態57
第1の集団または第2の集団の少なくとも1つにフローサイトメトリー分析を実施する工程をさらに含む、追加の実施形態53~56のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態58
第1の集団または第2の集団の少なくとも1つを少なくとも1つのバイオマーカーの存在について染色する工程をさらに含む、追加の実施形態53~57のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態59
新鮮な組織試料から細胞を分別する方法であって、
新鮮な組織試料をホモジナイズしてホモジナイズ組織試料を得ること;
ホモジナイズ新鮮腫瘍試料中の細胞をサイズにより選別することであって、細胞が第1および第2の細胞集団に選別され、第1の細胞集団が、約6μmから約12μmまでの範囲の平均直径を有する細胞について濃縮されており、第2の細胞集団が、約12μmより大きい平均直径を有する細胞について濃縮されている、細胞を選別すること
を含む方法。
追加の実施形態60
第1の細胞集団が非腫瘍細胞に富み、第2の細胞集団が腫瘍細胞に富む、追加の実施形態59に記載の方法。
追加の実施形態61
新鮮な腫瘍試料が新鮮な腫瘍全体、新鮮な部分的腫瘍、および/または新鮮なリンパ節に由来する、追加の実施形態59~60のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態62
新鮮な腫瘍試料が新鮮な残存外科的材料または新鮮な生検試料に由来する、追加の実施形態59~60のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態63
選別デバイスが細胞を染色する工程を必要としない、追加の実施形態59~62のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態64
選別デバイスがマイクロ流体デバイスである、追加の実施形態63に記載の方法。
追加の実施形態65
マイクロ流体デバイスが決定論的横置換デバイスである、追加の実施形態64に記載の方法。
追加の実施形態66
約12μm未満の直径を有する、ホモジナイズ新鮮腫瘍試料内の細胞が、決定論的横置換デバイスを通過する流体の対流と共に移動し、一方、12μmより大きい臨界直径を有する、ホモジナイズ試料内の細胞が、アレイの配置により決定づけられた方向に移動する、追加の実施形態65に記載の方法。
追加の実施形態67
マイクロ流体デバイスが流体泳動的濾過デバイスである、追加の実施形態64に記載の方法。
追加の実施形態68
マイクロ流体デバイスが水力学的濾過デバイスである、追加の実施形態64に記載の方法。
追加の実施形態69
マイクロ流体デバイスが曲線チャネルにおける慣性集束を利用する、追加の実施形態64に記載の方法。
追加の実施形態70
マイクロ流体デバイスが直線チャネルにおける慣性集束を利用する、追加の実施形態64に記載の方法。
追加の実施形態71
直線チャネルにおける慣性集束が、ピンチドフロー分画法または水力学的スプレッディング法の1つを含む、追加の実施形態70に記載の方法。
追加の実施形態72
第1または第2の集団内の細胞を第1のバイオマーカーについてアッセイする工程をさらに含む、追加の実施形態59~62のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態73
第1のバイオマーカーの存在ががんを示す、追加の実施形態72に記載の方法。
追加の実施形態74
第1のバイオマーカーが免疫細胞マーカーである、追加の実施形態72に記載の方法。
追加の実施形態75
組織試料から細胞を分別する方法であって、腫瘍試料をホモジナイズしてホモジナイズ組織試料を得ること;ホモジナイズ組織試料中の細胞をサイズにより選別することであって、細胞が第1および第2の細胞集団に選別され、第1の細胞集団が、12μm未満の平均直径を有する細胞について濃縮されており、第2の細胞集団が、12μmより大きい平均直径を有する細胞について濃縮されている、細胞を選別することを含む方法。
追加の実施形態76
12μmより大きいサイズを有する腫瘍細胞に富む組成物であって、腫瘍細胞が、腫瘍細胞も正常細胞も最初に染色することなく、正常細胞から分離された、組成物。
追加の実施形態77
組成物の少なくとも50%が腫瘍細胞を含む、追加の実施形態76に記載の組成物。
追加の実施形態78
組成物の少なくとも65%が腫瘍細胞を含む、追加の実施形態76に記載の組成物。
追加の実施形態79
組成物の少なくとも80%が腫瘍細胞を含む、追加の実施形態76に記載の組成物。
追加の実施形態80
組成物の少なくとも95%が腫瘍細胞を含む、追加の実施形態76に記載の組成物。
追加の実施形態81
第1の細胞集団および第2の細胞集団を含むキットであって、第1の細胞集団が、12μmより大きいサイズを有する腫瘍細胞に実質的に富み、第2の細胞集団が、12μm未満のサイズを有する正常細胞に実質的に富み、第1および第2の細胞集団が、同じ腫瘍試料に由来し、腫瘍細胞および正常細胞が染色されていない、キット。
追加の実施形態82
追加の実施形態81に記載の細胞集団のそれぞれにゲノム解析を実施することを含む、遺伝子異常について試験する方法。
追加の実施形態83
追加の実施形態81の細胞集団の少なくとも1つにおけるバイオマーカーを同定する工程をさらに含む、追加の実施形態82に記載の方法。
追加の実施形態84
12μm未満のサイズを有する細胞が第1の方向に流れ、一方、12μmより大きいサイズを有する細胞が第2の方向に流れるように、1つまたは複数のポスト、閉塞物、または障害物を含む、組織試料に由来する細胞を分離するためのデバイス。
追加の実施形態85
8.5μmより大きいサイズを有する腫瘍核に富む組成物であって、腫瘍核が、腫瘍核も正常核も最初に染色することなく、正常核から分離された、組成物。
追加の実施形態86
組成物の少なくとも50%が腫瘍核を含む、追加の実施形態85に記載の組成物。
追加の実施形態87
組成物の少なくとも65%が腫瘍核を含む、追加の実施形態85に記載の組成物。
追加の実施形態88
組成物の少なくとも80%が腫瘍核を含む、追加の実施形態85に記載の組成物。
追加の実施形態89
組成物の少なくとも95%が腫瘍核を含む、追加の実施形態85に記載の組成物。
追加の実施形態90
第1の核集団および第2の核集団を含むキットであって、第1の核集団が、8.5μmより大きいサイズを有する腫瘍核に実質的に富み、第2の核集団が、8.5μm未満のサイズを有する正常核に実質的に富み、第1および第2の核集団が、同じ腫瘍試料に由来し、腫瘍核および正常核が染色されていない、キット。
追加の実施形態91
追加の実施形態90に記載の細胞集団のそれぞれにゲノム解析を実施することを含む、遺伝子異常について試験する方法。
追加の実施形態92
腫瘍試料に由来する核を分離するためのデバイスであって、8.5μm未満のサイズを有する核が第1の方向に流れ、一方、8.5μmより大きいサイズを有する核が第2の方向に流れるように、1つまたは複数のポスト、閉塞物、または障害物を含むデバイス。
Claims (15)
- 組織試料から細胞粒子を分別する方法であって、(i)組織試料をホモジナイズしてホモジナイズされた試料を提供すること;ならびに(ii)ホモジナイズされた組織試料中の細胞粒子をサイズにより少なくとも第1の細胞粒子集団および第2の細胞粒子集団に選別することを含み、ホモジナイズされた組織試料内の細胞粒子がマイクロ流体デバイスで選別され、
(a)細胞粒子は細胞核であり、第1の細胞粒子集団は、8.5μm未満の平均直径を有する細胞粒子について濃縮されており、第2の細胞粒子集団は、8.5μmより大きい平均直径を有する細胞粒子について濃縮されている;又は
(b)細胞粒子は細胞であり、第1の細胞粒子集団は、12μm未満の平均直径を有する細胞粒子について濃縮されており、第2の細胞粒子集団は、12μmより大きい平均直径を有する細胞粒子について濃縮されている、方法。 - 第2の細胞粒子集団が、腫瘍細胞に由来する細胞粒子を含み、腫瘍細胞に由来する細胞粒子が、12μmより大きく50μmまで、または8.5μmより大きく30μmまでの範囲の平均直径を有する、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍細胞が、腫瘍全体、部分的腫瘍、転移腫瘍、部分的転移腫瘍、またはリンパ節の少なくとも1つに由来する、請求項2に記載の方法。
- 組織試料が、残存外科的材料または生検試料の少なくとも1つに由来するか、組織試料が、架橋溶液中で固定されたものであるか、または組織試料が、パラフィンに包埋された試料に由来する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- ホモジナイズされた組織試料が、選別前にさらに処理され、さらなる処理が、ホモジナイズされた試料内のタンパク質を消化すること、試料を加熱すること、またはホモジナイズされた試料を濾過することの少なくとも1つを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- ホモジナイズされた試料中の細胞粒子をサイズにより選別することが、細胞粒子を染色する工程を必要としない、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- マイクロ流体デバイスが決定論的横置換デバイスである、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 12μm未満の臨界直径を有する、ホモジナイズされた試料内の細胞粒子が、決定論的横置換デバイスを通過する流体の対流と共に移動し、一方、12μmより大きい臨界直径を有する、ホモジナイズされた試料内の細胞が、アレイの配置により決定づけられた方向に移動する、請求項7に記載の方法。
- マイクロ流体デバイスが曲線チャネルにおける慣性集束を利用するか、またはマイクロ流体デバイスが直線チャネルにおける慣性集束を利用する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 直線チャネルにおける慣性集束が、ピンチドフロー分画プロセスまたは水力学的スプレッディングプロセスの1つを含む、請求項9に記載の方法。
- 少なくとも第1または第2の細胞粒子集団内の細胞粒子を第1のバイオマーカーについてアッセイする工程をさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 第1のバイオマーカーの存在ががんを示すか、または第1のバイオマーカーが免疫細胞マーカーである、請求項11に記載の方法。
- 第1および第2の細胞粒子集団のそれぞれが独立して、次世代シーケンシングを用いてシーケンシングされるか、または第1および第2の細胞粒子集団のそれぞれが独立して、フローサイトメトリーを用いて分析される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
- 第1および第2の細胞粒子集団が、患者についてのマッチングした腫瘍試料と正常試料を提供し、マッチングした腫瘍試料と正常試料が、体細胞突然変異、コピー数多型、または他の遺伝子変化を同定するために分析されてもよい、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
- 第1および第2の細胞粒子集団を、RNAバイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカーについて分析することをさらに含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
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