CN115137708B - 装载yap1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

装载yap1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明制备得到的巨噬细胞膜包被纳米粒具备优良纳米特性，能够高效负载YAP1核酸序列，实现基因干预作用。此外，巨噬细胞膜包被纳米粒制备方法简单、粒径分布均匀且具备良好生物相容性，协同巨噬细胞膜，主动靶向肝纤维化病变炎症部位，调控胶原纤维的生成，进而控制肝纤维化进展。

Description

装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属医药制剂技术领域，具体涉及一种装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
肝脏受到病毒、炎症介质、药物副作用、化学试剂等致病因素的持续作用引起慢性肝损伤，造成肝星状细胞(HSCs)持续激活并转化为肝肌成纤维细胞，细胞外基质过量积累，沉积在肝内导致肝纤维化。肝纤维化是由多种细胞因子和分子途径参与的复杂病理变化。肝纤维化发生过程中,多种促炎、促纤维化因子以自分泌和旁分泌的形式作用HSCs使其发生活化和表型转化，活化的HSCs分泌成纤维化因子,刺激门脉纤维细胞、成纤维细胞及骨髓衍生的肌成纤维细胞产生胶原蛋白、促进纤维化。因此，HSCs活化增殖、凋亡、衰老以及静息恢复等过程中涉及的关键分子和信号通路均可作为肝纤维化治疗的潜在靶点。近年来，研究发现，Yes-associated protein 1(YAP1)基因与HSCs的增殖活化有所关联，研究者指出，YAP1的激活是肝星状细胞活化的关键驱动力，激活的YAP1转位到胞核后，促进包括结缔组织生长因子和血小板衍生生长因子在内的促生长基因的上调，这些基因通过转化生长因子和脂多糖通路促进HSCs的增殖和活化，从而加重肝纤维化。因此，抑制HSCs活化过程中YAP1表达的为肝纤维化治疗提供了潜在思路。同时，由于YAP1是参与机体生长发育的关键调节因子，靶向抑制肝脏中活化的HSCs中的YAP1表达成为肝纤维化高效、安全治疗的关键。
近年来，研究表明，基于纳米颗粒的治疗、预防和检测方式有可能极大地影响疾病管理的方式。随着可用的纳米颗粒种类繁多，基于特定应用的纳米载体的设计已变得越来越普遍。然而，一旦进入体内，纳米颗粒就会遇到一个高度复杂的环境，该环境擅长识别和消除外来元素。例如，在血液中有各种基于蛋白质和细胞的成分，与其中任何一种接触都会迅速影响性能。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明提供一种装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明利用巨噬细胞膜包被纳米技术，将YAP1-PLGA通过血液循环招募至肝纤维化病变部位，从而增加YAP1-PLGA在肝纤维化病变部位的积蓄，增强基因干预作用。本发明利用具有良好生物相容性且可降解的PLGA作为纳米载体，负载具有干扰YAP1的质粒，制备纳米颗粒YAP1-PLGA，并将巨噬细胞膜包被于YAP1-PLGA纳米颗粒表面，制备得到巨噬细胞膜包被的纳米粒，该纳米粒具备较好的纳米特性，能够实现高效肝纤维化病变部位靶向功能，不但能够有效抑制肝纤维化发展，且具有较好的生物安全性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒，其特征在于，聚乳酸-羟基乙酸共聚物包载YAP1制备得到YAP1-PLGA纳米粒作为内核，巨噬细胞膜作为衣壳包覆于YAP1-PLGA纳米粒表面。
本发明所述YAP1核酸序列为GCGGTTGAAACAACAGGAATT。
上述装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒，YAP1与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1:9-20。优选YAP1与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶9-10。最优选YAP1与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶10。
所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物分子量为3.8-5.4kDa。该分子量的聚合物PLGA构建的纳米粒作为内核，能包载YAP1核酸序列，具有较好的稳定性。
每10mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物使用的巨噬细胞膜提取自1×106-1×107个巨噬细胞。
所述的巨噬细胞膜是将巨噬细胞经低渗溶液梯度破碎得到细胞裂解液，采用差速离心及探头超声破碎提取获得。优选所述的低渗溶液梯度具体为细胞悬液依次通过加入含有蛋白酶抑制剂的0.75×、0.5×、0.25×缓冲溶液，冰上裂解2h后探头超声5min使细胞充分裂解，收集细胞裂解液，4℃，1000rpm，5min，小心收集上清；再4℃，14000rpm、20000rpm，10min依次除去细胞碎片、细胞器，收集沉淀以获得巨噬细胞膜。优选所述的将巨噬细胞膜经探头超声破碎的步骤具体为超声强度30％，4℃，5min进一步破碎得到巨噬细胞膜囊泡。将得到的巨噬细胞膜重悬于超纯水中，利用微型膜挤出器依次通过400、200nm聚碳酸酯膜反复挤出10-20次，以获得巨噬细胞膜囊泡用于后续纳米粒包被，将获得的巨噬细胞膜囊泡置于-80℃冰箱储存备用，与既往单一低渗溶液破碎提取方式相比，可高效得到高纯度巨噬细胞细胞膜。
所述的YAP1-PLGA纳米粒采用纳米沉淀法制备得到，包括如下制备步骤：PLGA用DMSO溶解，加入YAP1核酸序列得到聚合物与质粒混溶的溶剂相YAP1-PLGA-DMSO，将溶剂相YAP1-PLGA-DMSO加入到注射溶媒中，于恒温震荡箱中使DMSO挥发，随后将制备得到的YAP1-PLGA用透析袋在注射溶媒中透析，去除游离YAP1核酸序列及有机溶剂，得到YAP1-PLGA纳米粒。
优选纳米沉淀法步骤如下：精密称取10mg PLGA放入到圆底烧瓶，加入1mL DMSO于恒温震荡箱中缓慢震荡(25℃，100rpm)使其充分溶解,随后加入1mg YAP1核酸序列得到聚合物与质粒混溶的溶剂相，将上述1mL溶剂相(YAP1-PLGA-DMSO)逐滴缓慢自高处搅拌加入到3mL注射溶媒中，于恒温震荡箱中缓慢震荡(25℃，100rpm)使DMSO挥发。随后将制备得到的YAP1-PLGA用透析袋(MW:14000)在注射溶媒中透析24h，去除游离YAP1核酸序列及有机溶剂，得到YAP1-PLGA纳米粒，4℃保存备用。
上述装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将巨噬细胞经低渗溶液梯度破碎得到的细胞裂解液，采用差速离心及探头超声破碎提取得到巨噬细胞膜；
(2)将步骤(1)中得到的巨噬细胞膜使用微型膜挤出器依次通过400、200nm聚碳酸酯膜反复挤出10-20次，以获得巨噬细胞膜囊泡。
(3)取聚乳酸羟基乙酸共聚物和YAP1采用纳米沉淀法制得YAP1-PLGA纳米粒；
(4)将步骤(2)制备的巨噬细胞膜囊泡与步骤(3)中制备的YAP1-PLGA纳米粒通过小型膜挤出器反复推挤(10-20次)，制成巨噬细胞膜包被的靶向YAP1调控肝纤维化进程的纳米粒。
所述巨噬细胞膜囊泡平均粒径为260-280nm，所述的YAP1-PLGA纳米粒平均粒径为100-120nm(聚合物多分散系数为0.209±0.0248)，包被巨噬细胞膜后最终粒径为150-170nm(图1)聚合物多分散系数为0.131±0.0030)，粒径均一(图2)，能够保留巨噬细胞膜完整蛋白表达及趋化因子受体特征蛋白(图3、图4)。
本发明还提供上述装载YAP1核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒在制备用于靶向炎症条件下调控肝纤维化进展药物中的应用。
本发明实施例中主要采用四氯化碳诱导的慢性肝纤维化作为疾病模型。
本发明中，所述聚合物构建的纳米粒内核和细胞膜囊泡通过疏水作用以及静电作用相结合，在聚合物内核表面包被脂质双分子层，形成核壳结构的纳米级粒子。纳米粒利用巨噬细胞膜的天然募集炎症部位作用，能够主动靶向肝纤维化炎症病变部位，为实现肝纤维化的靶向治疗提供新思路。
本发明所制的新型肝纤维化靶向药物递送系统的给药方式为尾静脉注射。
与现有技术比较本发明的优点与效果：
(1)本发明利用纳米沉淀法制备YAP1-PLGA纳米粒，制备过程较为简单，所得纳米粒粒径均一，安全且高效。
(2)采用特定的巨噬细胞膜中蛋白质与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比范围，避免得到的纳米粒边界不清、纳米粒包裹不充分的问题，使得到的纳米粒呈现出边界清晰的壳-核结构。
(3)巨噬细胞膜表面相关趋化因子受体能高度靶向炎性状态下的肝脏，这一趋化特性为实现通过全身给药将药物靶向递送至肝纤维化病变部位提供可能，从而实现高效治疗效果。此外，使用天然细胞膜材料能够避免生物安全性问题。
(4)所筛选的PLGA为NMPA和FDA批准的具备良好安全性、降解性、生物兼容性性的纳米材料，内核载药能力强，且具缓释效果；减少给药频次、避免药物瞬时大量释放产生毒性的问题。
(5)生物相容性及安全性较高，纳米粒表面包覆的巨噬细胞膜免疫原性极低，内核为NMPA和FDA批准所认可的生物可降解材料，本发明制剂可以大大提升患者用药依从性，因此具有较高的安全性和医学转化前景。
本发明利用巨噬细胞膜表面趋化因子受体蛋白主动靶向肝纤维化病变部位——炎症浸润及氧化应激，有效提高含YAP1核酸序列载体向肝纤维化病变部位的主动募集，调控炎症浸润，进而调控胶原纤维的生成，为肝脏疾病治疗提供了新的思路，具有较高的临床实践意义。
本发明描述了该药物递释系统的制备方案，并提供了该系统体内外靶向性的结果以及药效学评价。
附图说明
图1是将巨噬细胞囊泡与YAP1-PLGA按1∶1混合挤出所制得巨噬细胞膜包被的装载YAP1纳米粒的透射电镜图；
图2是对纳米递药系统的粒径、分散系数和Zeta电位的表征图；A：巨噬细胞膜包被纳米粒电位(YAP1NPs/MM)粒径表征；B：YAP1NPs/MM电位表征(重复三次电位测定结果)；C：巨噬细胞膜囊泡(MM)、纳米粒(YAP1NPs)、YAP1NPs/MM；D：MM、YAP1NPs、YAP1NPs/MM电位；E：MM、YAP1NPs、YAP1NPs/MM聚合物多分散指数；
图3为考马斯亮蓝染色法对膜蛋白的完整性进行表征SDS-PAGE凝胶图；
图4为流式细胞术检测巨噬细胞表面趋化因子受体CCR2表达平均荧光强度(MFI)定量图；
图5为免疫组织化学检测肝纤维化状态下肝脏CCL2趋化因子的表达图；
图6为巨噬细胞膜包被纳米粒小鼠体内转染水平RT-qPCR检测图；
图7为巨噬细胞膜包被纳米粒肝脏靶向性FCM检测肝纤维化小鼠肝脏荧光强度；A：荧光标记的纳米粒(NPs)及巨噬细胞膜包被纳米粒(NPs/MM)在肝纤维化小鼠肝脏中的聚集；B：对A图定量分析；
图8为巨噬细胞膜包被纳米粒对小鼠肝纤维化程度的影响肝脏羟脯氨酸含量测定。
具体实施方式
为了进一步说明本发明及其优点，下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，应理解这些实施例仅帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
主要试剂来源：
Figure BDA0003713672570000051
实施例1：
YAP1核酸序列(21bp)
GCGGTTGAAACAACAGGAATT
采用纳米沉淀法制备得到YAP1-PLGA纳米粒。
纳米沉淀法步骤如下：
(1)精密称取10mg PLGA放入到圆底烧瓶，加入1mL DMSO于恒温震荡箱中缓慢震荡(25℃，100rpm)使其充分溶解；
(2)随后加入1mg YAP1核酸序列得到聚合物与质粒混溶的溶剂相，将上述1mL溶剂相(YAP1-PLGA-DMSO)逐滴缓慢自高处搅拌加入到3mL注射溶媒中，于恒温震荡箱中缓慢震荡(25℃，100rpm)使DMSO挥发；
将制备得到的YAP1-PLGA用透析袋(MW:14000)在注射溶媒中透析24h，去除游离YAP1核酸序列及有机溶剂，得到YAP1-PLGA纳米粒，进行透射电镜及粒径电位表征。
巨噬细胞膜包被纳米粒的微观形态通过透射电子显微镜进行观察，将巨噬细胞膜包被生物材料稀释30倍后滴于铜网上，静置风干，样品置于透射电子显微镜下进行观测。
YAP1-PLGA、巨噬细胞膜囊泡、巨噬细胞膜包被纳米粒在水溶液中的粒径、Zeta电位及多分散系数利用马尔文激光粒度仪进行测定，所有待测样品用超纯水稀释10-20倍后重复三次测定。
透射电镜结果显示巨噬细胞膜包被纳米粒具有近球形形态且大小均一(150-170nm)。结果表明巨噬细胞膜成功包被在YAP1-PLGA表面，形成了以纳米颗粒为“核”，巨噬细胞膜为“壳”的核壳结构。
动态光散射测试结果显示，本项研究制备得到的巨噬细胞膜囊泡粒径为272.37±1.70nm，YAP1-PLGA及巨噬细胞膜包被纳米粒粒径分别为119.5±5.24nm(PDI：0.209±0.0248)及161.73±12.29nm(PDI：0.131±0.0030)，具有较低的PDI值，表明其均具备较好均一性及分散性。
除此以外，表面Zeta电位测试结果显示YAP1-PLGA和巨噬细胞膜囊泡表面电位分别为-19.1±2.35mV和-15.6±0.36mV，而巨噬细胞膜包被纳米粒表面电位为-17.2±2.81mV，展现出与巨噬细胞膜囊泡相近的表面电位，这也预示着巨噬细胞膜成功包被在YAP1-PLGA表面且巨噬细胞膜包被纳米粒溶液体系具有良好的稳定性。
实施例2：
采用纳米沉淀法制备得到YAP1-PLGA纳米粒。
纳米沉淀法步骤如下：
(1)精密称取15mg PLGA放入到圆底烧瓶，加入1mL DMSO于恒温震荡箱中缓慢震荡(25℃，100rpm)使其充分溶解；
(2)随后加入1mg YAP1核酸序列得到聚合物与质粒混溶的溶剂相，将上述1mL溶剂相(YAP1-PLGA-DMSO)逐滴缓慢自高处搅拌加入到3mL注射溶媒中，于恒温震荡箱中缓慢震荡(25℃，100rpm)使DMSO挥发；
将制备得到的YAP1-PLGA用透析袋(MW:14000)在注射溶媒中透析24h，去除游离YAP1核酸序列及有机溶剂，得到YAP1-PLGA纳米粒，进行透射电镜及粒径电位表征。
实施例3：
采用纳米沉淀法制备得到YAP1-PLGA纳米粒。
纳米沉淀法步骤如下：
(1)精密称取20mg PLGA放入到圆底烧瓶，加入1mL DMSO于恒温震荡箱中缓慢震荡(25℃，100rpm)使其充分溶解；
(2)随后加入1mg YAP1核酸序列得到聚合物与质粒混溶的溶剂相，将上述1mL溶剂相(YAP1-PLGA-DMSO)逐滴缓慢自高处搅拌加入到3mL注射溶媒中，于恒温震荡箱中缓慢震荡(25℃，100rpm)使DMSO挥发；
将制备得到的YAP1-PLGA用透析袋(MW:14000)在注射溶媒中透析24h，去除游离YAP1核酸序列及有机溶剂，得到YAP1-PLGA纳米粒，进行透射电镜及粒径电位表征。
实施例4：
巨噬细胞膜包被纳米粒的膜蛋白组成及特征性趋化受体蛋白检测
(1)巨噬细胞的提取：Raw264.7细胞在T25培养瓶中培养至约90％融合，用细胞刮将其缓慢刮取下来，电动移液枪快速吹打使细胞重悬。将得到的细胞悬液转移到离心管中，1000rpm离心3分钟后去除上清，用缓冲溶液清洗一遍后，再次离心去除上清后重悬为细胞悬液；
(2)细胞悬液依次通过加入含有蛋白酶抑制剂的0.75×、0.5×、0.25×缓冲溶液，冰上裂解2h后探头超声5min使细胞充分裂解；
收集细胞裂解液，4℃，1000rpm，5min，小心收集上清；再4℃，14000rpm、20000rpm，10min依次除去细胞碎片、细胞器，收集沉淀以获得巨噬细胞膜；
将巨噬细胞膜经探头超声破碎的步骤具体为超声强度30％，4℃，5min进一步破碎得到巨噬细胞膜囊泡。
将得到的巨噬细胞膜重悬于注射溶媒中，利用微型膜挤出器依次通过400、200nm聚碳酸酯膜反复挤出10-20次，以获得巨噬细胞膜囊泡用于后续纳米粒包被。
将巨噬细胞、巨噬细胞膜囊泡和巨噬细胞膜包被的纳米粒用蛋白裂解液提取后，经SDS-PAGE凝胶电泳，采用经典的考马斯亮蓝染色法对膜蛋白的完整性进行表征。
为确认巨噬细胞膜包被纳米粒保留了与肝纤维化病变部位结合的特征蛋白受体，巨噬细胞、巨噬细胞膜表面趋化因子CCR2受体用荧光标记后经流式细胞仪检测；
(1)小鼠巨噬细胞Raw264.7接种于内置细胞爬片的24孔板中，每孔细胞数量为1×105个，含0.5mL DMEM生长培养基，37℃，5％二氧化碳的细胞培养箱中，培养12h使其贴壁；
(2)荧光标记：细胞贴壁后，每孔加入0.5mL多聚甲醛室温固定15min后，PBS清洗细胞三遍；每孔加入0.5mL 5％BSA室温封闭1h，随后每孔加入0.2mL CCR2抗体(1：60，兔来源)，4℃孵育16h以上；PBS清洗细胞三遍后，每孔加入0.2mL Dylight 594马抗兔原液(美国Vector公司)，37℃孵育30min后PBS清洗细胞；
(3)流式检测：使用流式细胞仪测定荧光强度进行数据分析。具体操作步骤如下：PBS清洗细胞三遍后，用细胞刮将其刮取下来收集于EP管中，0.5mL PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测荧光强度。
SDS-PAGE凝胶(图3)结果显示，Raw264.7细胞、巨噬细胞膜及巨噬细胞膜包被的纳米粒经染色后出现蛋白条带且条带均一致，而单独的YAP1-PLGA无蛋白条带，这表明着通过“共挤出”方式制备的巨噬细胞膜包被的纳米粒能够保留巨噬细胞膜原始蛋白组成。巨噬细胞细胞膜的磷脂双分子结构及膜蛋白组成成功保留在纳米颗粒表面，这为实现巨噬细胞膜包被纳米粒生物功能化提供了保障。
流式检测巨噬细胞CCR2表达(图4)显示，与PBS对照组相比，荧光标记巨噬细胞膜表面CCR2组平均荧光强度更高，表明巨噬细胞表面具有CCR2趋化因子受体，这为巨噬细胞膜包被的纳米颗粒与肝纤维化病变部位的主动靶向提供了基础。
实施例5：
验证肝纤维化小鼠肝脏中CCL2趋化因子表达明显增加。
四氯化碳肝纤维化小鼠模型构建方法如下：
巨噬细胞膜包被纳米粒干预组，实验小鼠腹腔注射CCl4橄榄油溶液(0.5mL/kg)每周3次；第4周起，尾静脉注射巨噬细胞膜包被的YAP1纳米粒(2mg/kg)，每周3次，持续5周。造模完成后，所有实验小鼠腹腔注射1％戊巴比妥(10mL/kg)麻醉，收集肝脏制备石蜡切片。
小鼠肝脏CCL2趋化因子的检测：
将小鼠肝组织石蜡切片进行免疫组化CCL2染色，检测肝组织中趋化因子表达。
(1)脱蜡水化：二甲苯脱蜡—酒精梯度水化；
(2)抗原修复：将切片浸入到已预先加热沸腾的柠檬酸修复液中，微波炉调至解冻，微波修复30min后，取出切片自然冷却至室温，将切片浸入TBS缓冲溶液中洗涤3次，每次5min；
(3)淬灭内源性过氧化物酶：将切片浸入到3％过氧化氢溶液中，室温避光孵育35min，孵育完成后，将切片浸入TBS缓冲溶液中洗涤3次，每次5min；
(4)血清封闭：将切片用力甩干，纸巾擦拭，用免疫组化笔在组织周围画圈防止封闭血清流走，用移液器在样本上滴加10μL与二抗同源的血清，将切片放入湿盒中，放入37℃恒温培养箱孵育30min；
(5)一抗孵育：轻轻甩掉切片上的封闭血清，用移液器在样本上滴加10μL稀释的一抗(Anti-CCL2，兔来源，1：25)，随后将切片放入湿盒中，4℃冰箱过夜(14-16h)孵育；
(6)二抗孵育：将切片浸入TBS缓冲溶液中洗涤3次，每次5min，用力甩干切片，纸巾擦拭，用移液器在样本上滴加10μL按1：200稀释的二抗(山羊抗兔,美国Vector公司)，接着将切片放入湿盒中，放入37℃恒温培养箱孵育30min；
(7)卵白素-生物素(A+B)孵育：将切片浸入TBS缓冲溶液中洗涤3次，每次5min，用力甩干切片，纸巾擦拭，用移液器在样本上滴加10μL按1％稀释的A液+B液，接着将切片放入湿盒中，放入37℃恒温培养箱孵育30min；
(8)DAB染色：将切片浸入TBS缓冲溶液中洗涤3次，每次5min，甩干切片用移液器在样本上滴加现配的DAB染液，镜下观察染色，当切片样本呈现棕黄色即为阳性，清水冲洗；
(9)细胞核复染：将切片浸入苏木素染色液内5min，流水冲洗多余染料后饱和碳酸锂返蓝；
(10)脱水透明封片：将漂洗后的切片酒精梯度(70％酒精30s，80％酒精30s，95％酒精2min，无水乙醇5min)脱水—二甲苯透明，中性树脂封片，晾干后，光学显微镜下观察，采集图像分析。如图5所示，肝纤维化组小鼠CCL2表达明显多于对照组小鼠，这表明CCL2在肝纤维化小鼠中过度表达，这为巨噬细胞膜包被的纳米颗粒与肝纤维化病变部位的主动靶向提供了基础。
实施例6：
验证巨噬细胞膜包被纳米粒装载YAP1核酸序列后可与RNA相互作用以调控实验小鼠的YAP1表达。
四氯化碳肝纤维化小鼠模型构建方法如下：
巨噬细胞膜包被纳米粒干预组，实验小鼠腹腔注射CCl4橄榄油溶液(0.5mL/kg)每周3次；第4周起，尾静脉注射巨噬细胞膜包被的YAP1纳米粒(2mg/kg)，每周3次，持续5周。造模完成后，所有实验小鼠腹腔注射1％戊巴比妥(10mL/kg)麻醉，收集肝脏提取RNA进行RT-qPCR检测。
RT-qPCR检测方法及结果如下所述：
(1)肝组织总RNA抽提：取出肝组织，精密称取100mg，加液氮研磨成粉末状，向组织中加入1mL Trizol RNA提取液混匀，将匀浆液吸取至RNase-free EP管中，冰上静置5min，4℃，12000g离心5min，小心吸取上清液，移入新的EP管中，向上清液中加入氯仿200uL(Trizol的1/5体积的量)，盖紧离心管盖，混合至溶液呈乳白色；静置5min；4℃，12000g离心15min；离心完毕，小心吸取含RNA的上清液，转移至另一新的EP管内；向上清液中加入1mL异丙醇(0.5倍～1倍Trizol体积的量)，上下颠倒混匀，静置10min；4℃，12000g离心10min，可见底部出现RNA沉淀；小心弃去上清，加入1mL 75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，4℃，7500g离心5min；重复上一步骤，加入1mL 75％乙醇再洗一次(可根据情况反复清洗2～3次)；小心弃去上清，切勿触及沉淀；打开离心管盖，室温干燥，将离心管内液体吹干(可放于超净台内吹干)；沉淀干燥后，向离心管内加入200μL RNase-free水将沉淀溶解，混匀；吸取1～2μL Total RNA测浓度；
(2)RNA逆转录：将上述提取的到的RNA浓度归一化后，根据RNA逆转录试剂盒说明书配制反应液(配制过程需在冰上进行)进行逆转录；
(3)cDNA扩增：将上述逆转录得到的cDNA根据SYBR试剂盒说明书配制PCR反应体系并进行PCR扩增反应(体系引物序列如附表1所示)；
表1 RT-qPCR引物
Figure BDA0003713672570000091
Figure BDA0003713672570000101
RT-qPCR结果表示，尾静脉注射装载巨噬细胞膜包被YAP1核酸序列纳米粒组相较对照组YAP1的RNA表达明显降低，这一结果表明本项研究制备得到的巨噬细胞膜包被纳米粒能够通过装载核酸序列现对YAP1基因表达的干预(如图6所示)。
小鼠分为两组，分别尾静脉注射巨噬细胞膜包被纳米粒及YAP1-PLGA，1％戊巴比妥麻醉后脱颈，收取肝脏，将其放入含有800μL预冷的PEB缓冲溶液EP管中，固定每个组织剪50次剪成碎片，加入300μL含胶原酶的消化液，37℃，120rpm孵育15min(消化液用PEB配制，含1mg/ml胶原酶IV)。MACS组织处理器处理，并用40目筛的细胞过滤器过滤，PEB冲洗定容至5mL。4℃，50g,离心3min，收集细胞沉淀，加入1mL PEB，吹打至单细胞悬液，随后流式上机检测。
流式检测结果显示巨噬细胞膜包被纳米粒组小鼠肝脏内荧光强度较YAP1-PLGA组更强，为YAP1-PLGA组的6倍(如图7所示)。这验证了巨噬细胞膜包被的纳米粒具备良好的肝脏靶向性。
实施例7
利用装载YAP1核酸序列的巨噬细胞膜包被纳米粒调控肝纤维化
四氯化碳肝纤维化小鼠模型构建方法如下：
巨噬细胞膜包被纳米粒干预组，实验小鼠腹腔注射CCl4橄榄油溶液(0.5mL/kg)每周3次；第4周起，尾静脉注射巨噬细胞膜包被的YAP1纳米粒(2mg/kg)，每周3次，持续5周，随后注射1％戊巴比妥麻醉处死小鼠，收集肝脏。
肝组织羟脯氨酸含量测定实验步骤如下：
(1)根据南京建成羟脯氨酸含量测定试剂盒说明书，精密称取肝组织100mg，准确加入1mL水解液，混匀，沸水浴水解20min，水解时每隔10min混匀一次，使水解更充分；
(2)根据试剂盒说明书调节水解液pH值，配制反应体系混匀，60℃水浴15min，冷却后，3500rpm，离心10min，取上清于波长550nm处，测定各组吸光度值进行计算
胶原纤维主要由胶原蛋白构成，而羟脯氨酸是胶原蛋白的特征性含量之一，在非胶原蛋白中含量很低甚至缺乏。因此，通过检测羟脯氨酸含量以检测胶原蛋白水平可以反映组织纤维化程度。如图8所示，模型组羟脯氨酸含量明显高于对照组；巨噬细胞膜包被纳米粒治疗组羟脯氨酸含量显著低于模型组，提示通过巨噬细胞膜包被纳米粒YAP1核酸序列的表达能够有效减少肝组织中胶原蛋白含量，表明巨噬细胞膜包被的纳米粒具有更优越的靶向肝纤维化病变部位从而调控纤维化进程的作用。

Claims (6)

1.一种装载YAP1shRNA核酸序列的肝纤维化靶向纳米颗粒，其特征在于：聚乳酸-羟基乙酸共聚物包载YAP1shRNA核酸序列制备得到YAP1-PLGA纳米粒作为内核，巨噬细胞膜囊泡作为衣壳包覆于YAP1-PLGA纳米粒表面；所述YAP1shRNA核酸序列为GCGGTTGAAACAACAGGAATT。
2.如权利要求1所述肝纤维化靶向纳米颗粒，其特征在于：所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物分子量为3.8 -5.4  kDa。
3.如权利要求1或2所述肝纤维化靶向纳米颗粒，其特征在于：每10mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物使用的巨噬细胞膜提取自1×106-1×107个巨噬细胞。
4.如权利要求1或2所述肝纤维化靶向纳米颗粒，其特征在于：所述巨噬细胞膜囊泡平均粒径为260-280 nm；所述的YAP1-PLGA纳米粒平均粒径为100-120 nm；包被巨噬细胞膜囊泡后最终粒径为150-170 nm。
5.如权利要求1-4任一项所述肝纤维化靶向纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
 (1)将巨噬细胞经低渗溶液梯度破碎得到的细胞裂解液，采用差速离心及探头超声破碎提取得到巨噬细胞膜；
(2)将步骤(1)中得到的巨噬细胞膜使用微型膜挤出器依次通过400、200 nm聚碳酸酯膜反复挤出10-20次，以获得巨噬细胞膜囊泡；
(3)取聚乳酸羟基乙酸共聚物和YAP1shRNA制得YAP1-PLGA纳米粒；
(4)将步骤(2)制备的巨噬细胞膜囊泡与步骤(3)中制备的YAP1-PLGA纳米粒通过小型膜挤出器反复推挤10-20次，制成巨噬细胞膜囊泡包被的肝纤维化靶向纳米颗粒。
6.如权利要求1-4任一项所述肝纤维化靶向纳米颗粒在制备用于靶向炎症条件下调控肝纤维化进展药物中的应用。
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