CN113425701A - 一种巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒及其制备方法 - Google Patents
一种巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒及其制备方法。本发明聚乳酸‑羟基乙酸共聚物包载雷帕霉素制备得到雷帕霉素‑PLGA纳米粒并作为内核,巨噬细胞膜作为衣壳包覆于雷帕霉素‑PLGA纳米粒表面;其中,雷帕霉素与聚乳酸‑羟基乙酸共聚物的质量比为1∶9‑20,巨噬细胞膜中蛋白质与聚乳酸‑羟基乙酸共聚物的质量比为1∶1‑1.5。本发明制成的纳米粒生物相容性好,制备方法简单,纳米粒粒径分布均匀。利用巨噬细胞膜表面生物分子主动靶向年龄相关性黄斑变性的关键病变——脉络膜新生血管,有效提高含药载体向新生血管的主动募集,在抑制新生血管的同时也具有在炎症条件下保护视网膜色素上皮的效果。
Description
技术领域
本发明属药物制剂技术领域,具体涉及一种基于巨噬细胞膜包被的装载的雷帕霉素的脉络膜新生血管靶向纳米粒及其制备方法。
背景技术
随着经济社会的发展和人口老龄化进程的加深,致盲性眼病已成为了主要影响人类健康和生活质量的疾病之一。这其中,年龄相关性黄斑变性(AMD)是世界范围内老年人视力损伤的首要原因。目前全球约有2亿人受到年龄相关性黄斑变性所引起的致盲威胁。在我国,随着人口老龄化的加速,AMD的患病率逐年升高,65 岁以上人群中AMD患病率约为13.65%。AMD发病机制多样且复杂,尚无定论,但高龄、基因易感性、氧化应激、炎症等是患病的危险因素。目前,定期向玻璃体腔内注射抗血管内皮生长因子(VEGF)则被证实是唯一有效的治疗方式。尽管抗 VEGF治疗能有效延缓AMD进程,但多中心研究提示,只有约三分之一的病人在初次注射后可获得视力提升。此外,患者在频繁的玻璃体腔注射过程中,将面临疼痛、出血、感染、医源性损伤、视网膜脱离和眼内炎等严重危及视力甚至生命的风险。再者,长期的抗VEGF治疗还被指出会增加地图状萎缩和视网膜纤维化的风险,这将患者的视力置于另一种危险的境地。由此,找到一个AMD根本的通用的发病机制,并且开发靶点针对性的药物,是改变或者辅助现有治疗手段和攻克AMD最可能成功的手段。
在绝大多数的AMD患者中,视网膜色素上皮RPE变性是疾病的原发病变;脉络膜新生血管(CNV)的形成则是该病致盲的首要原因。大量先前研究提示,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的过度激活在RPE变性和CNV形成中均扮演了重要作用,而mTOR的特异性抑制剂雷帕霉素则被证实具有保护RPE和抑制CNV的双重功效,是一种极具前景的AMD治疗药物。由于眼球自身血-眼屏障的存在和内皮网状系统的摄取作用,全身用药达有效血药浓度时,眼内药物浓度几近微量,因此,向玻璃体腔内注射药物成为了目前治疗视网膜变性疾病的首选。除了上述玻璃体腔注射的风险外,目前研究报道提示璃体腔内注射雷帕霉素由于药物瞬时释放所导致的毒性,仍会引起眼内炎等严重并发症。综上,如果能有一种方式,可以通过全身给药,将雷帕霉素靶向递送至视网膜,则可在提升雷帕霉素生物利用度的同时避免玻璃体腔注射的风险。
近年来,纳米给药系统用于AMD治疗的研究屡见报道。通过使用生物兼容性好、可降解的高分子纳米材料,可实现药物的缓释,增加药效。目前针对小分子药物的递送均局限于玻璃体腔注射,但这一给药方式下,病人的用药依从性差。尚未有静脉给纳米制剂治疗视网膜疾病的报道。在AMD的病程中,来自血液的外源性巨噬细胞向眼部的募集观察病程始终,且在数量上均远远多于其他类型的免疫细胞。更重要的是,这些巨噬细胞已被证实是源自外周血,而非原先存在于眼部的。这意味着巨噬细胞在正常状态下不会进入眼内,却能在炎症的病理状态下穿过血-眼屏障进入视网膜。既往研究指出,巨噬细胞这一炎症趋化特性主要是由其细胞膜上的蛋白质实现的。由此我们提出,如果将巨噬细胞膜对药物进行包覆,则不但能减少内皮网状系统对雷帕霉素的无效摄取,还能利用膜表面的蛋白质对炎性的AMD病变组织所释放的趋化因子、信号分子的主动识别作用,将雷帕霉素通过血液循环招募至 CNV区域,从而增加雷帕霉素在AMD区域的积蓄,增强药效。
由此,本申请的发明人探索用巨噬细胞膜制剂靶向眼部治疗CNV。拟提供一种巨噬细胞膜包被的CNV靶向纳米粒及其制备方法,该系统在抑制新生血管的同时也具有在炎症条件下保护视网膜色素上皮的效果。
发明内容
本发明的目的在于构建一种巨噬细胞膜包被的装载雷帕霉素的生物可降解的仿生纳米粒子(简称MRaNP)及其制备方法。
该纳米载体系统中,一方面利用巨噬细胞天然募集至炎症部位血管的原理,靶向脉络膜新生血管(CNV)并释放药物,从而抑制CNV的生成;另一方面利用CNV 与受损的视网膜色素上皮(RPE)紧密相连的解剖位置,使得雷帕霉素能同时被RPE 摄取,发挥其在炎性条件下的保护作用。
本发明的目的是通过以下方式实现的:
一种巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒,聚乳酸-羟基乙酸共聚物包载雷帕霉素制备得到雷帕霉素-PLGA纳米粒并作为内核,巨噬细胞膜作为衣壳包覆于雷帕霉素-PLGA纳米粒表面;其中,雷帕霉素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶9-20,巨噬细胞膜中蛋白质与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶1-1.5。优选雷帕霉素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶9-10,巨噬细胞膜中蛋白质与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶1-1.2。最优选雷帕霉素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶10,巨噬细胞膜中蛋白质与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为 1∶1。
所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物分子量为50-100kDa。该分子量的聚合物PLGA构建的纳米粒作为内核,能包载疏水的雷帕霉素,具有较高的机械稳定性。
每10mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物使用的巨噬细胞膜材需提取自2×106-2×107个巨噬细胞。巨噬细胞是由SD大鼠或C57小鼠通过预先给予巯基乙酸盐肉汤刺激腹腔后获得,或直接为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系Raw264.7细胞。
所述的巨噬细胞膜由是将巨噬细胞经离心、液氮反复冻融、破碎后得到的细胞裂解液采用差速离心法提取得到的。优选所述的差速离心法具体为细胞裂解液先通过3200g、20000g差速离心,分别收集上清液,依次除去大细胞碎片、细胞器,最后利用100000g超高速离心,弃去上清液,获得细胞膜。与既往低速(30000g以下) 提取方式相比,可以高效地得到高纯度的细胞膜。优选所述的将细胞经离心、液氮反复冻融、破碎的步骤具体为500g×5min离心3次,经液氮反复冻融3次,反复研磨20次进一步破碎细胞得到细胞裂解液。利用差速离心法获得细胞膜,与既往低速 (30000g以下)提取方式相比,可以高效地得到高纯度的细胞膜。
所述的雷帕霉素-PLGA纳米粒采用纳米沉淀法制备得到。优选纳米沉淀法步骤如下:在聚乳酸-羟基乙酸共聚物-二甲亚砜溶液中加入雷帕霉素,混匀至完全溶解,离心,集液;得到的雷帕霉素-PLGA-DMSO溶液在快速搅拌的条件下自高处缓慢滴加至注射溶媒,使用注射溶媒透析24h,得到雷帕霉素-PLGA纳米粒。
上述巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)将巨噬细胞经离心、液氮反复冻融、破碎后得到的细胞裂解液采用差速离心法提取得到巨噬细胞膜;
(2)将步骤(1)中得到的巨噬细胞膜使用高压纳米挤出机反复推挤得到巨噬细胞膜囊泡;优选高压纳米挤出机配备400nm和200nm滤膜;反复推挤的次数优选15-25 次;
(3)取聚乳酸-羟基乙酸共聚物和雷帕霉素采用纳米沉淀法制得雷帕霉素-PLGA纳米粒(简称RaNP);雷帕霉素-PLGA纳米粒粒径均一;
(4)将步骤(2)制备的巨噬细胞膜囊泡与步骤(3)中制备的雷帕霉素-PLGA纳米粒通过超声法整合,制成巨噬细胞膜包被的装载雷帕霉素的纳米粒(MRaNP)。
所述巨噬细胞膜囊泡平均粒径为200-220nm,所述的雷帕霉素-PLGA纳米粒平均粒径为70-90nm,包被巨噬细胞膜之后最终粒径为90-110nm。
优选步骤(4)中超声法所述的条件为42kHz,100W条件下超声3分钟。
上述装载雷帕霉素的脉络膜新生血管靶向纳米颗粒在制备用于制备靶向脉络膜新生血管和炎症或氧化应激条件下保护视网膜色素上皮的药物中的用途。
上述实验中主要采用炎性因子诱导的人脐静脉内皮细胞系HUVEC细胞为炎性血管模型。
本发明中,所述聚合物构建的纳米粒内核和细胞膜囊泡通过疏水作用以及静电作用相结合,在聚合物内核表面包被膜-蛋白脂质双分子层,形成核壳结构的纳米级仿生粒子。纳米粒利用巨噬细胞膜的伪装,能够逃避自内皮网状系统的无效摄取,有别于传统的聚乙二醇修饰,为实现制剂的长循环提供新思路。
本发明所制的新型CNV靶向药物递送系统的给药方式为静脉注射。
本发明主要利用巨噬细胞天然募集至炎症部位血管的原理,将雷帕霉素靶向运送至AMD的标志性病理特征,也是首要致盲原因——CNV,提高局部雷帕霉素浓度,从而高效地抑制CNV的生成;另一方面利用CNV与受损的视网膜色素上皮 (RPE)紧密相连的解剖位置,使得雷帕霉素能同时被RPE摄取,发挥其在炎性条件下的保护作用。
与现有技术比较本发明的优点与效果:
(1)本发明利用纳米沉淀法制备雷帕霉素-PLGA纳米粒,制备过程简单,对实验设备要求较低,无易挥有机溶剂部分,但所得纳米粒药物包封率、载药量高,安全且高效。
(2)采用特定的雷帕霉素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比范围,避免纳米粒出现聚集,RaNP呈乳光状均一、透明态,且载药效率高。
(3)采用特定的巨噬细胞膜中蛋白质与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比范围,避免得到的纳米粒边界不清、纳米粒包裹不充分的问题,使得到的MRaNP呈现出边界清晰的壳-核结构。
(4)巨噬细胞膜表面相关黏附分子能高度靶向炎性状态下的CNV。与其他血液中常见血细胞,如红细胞、血小板、中性粒细胞相比,巨噬细胞在AMD疾病中CNV 趋化特性能减少内皮网状系统的无效摄取并将药物运输至AMD病变区域,且贯穿疾病发生发展的始终。且在数量上均远远多于其他类型的血细胞,这为实现通过全身给药将药物靶向递送至病变提供可能,从而实现高效地治疗疾病。而且,使用天然细胞膜材料也不存在生物安全性问题。
(5)所筛选的PLGA为国家食品药品监督管理总局和FDA批准的安全、可降解、生物兼容性好的纳米材料,内核载药能力强,且具药物缓释效果;减少给药频次、解决药物瞬时大量释放产生毒性的问题。
(6)生物相容性和安全性高:MRaNP表面包覆的巨噬细胞膜不存在遗传物质以及细胞器等,免疫原性极低,内核为中国药品监督管理局和美国食品药品管理及所认可的生物可降解材料,本发明制剂可以大大提升病人用药依从性,因此具有较高的安全性和医学转化前景。
本发明利用巨噬细胞膜表面生物分子主动靶向年龄相关性黄斑变性的关键病变——脉络膜新生血管,有效提高含药载体向新生血管的主动募集,改变传统治疗中反复、长期玻璃体腔注射的给药方式,在抑制新生血管的同时也具有在炎症条件下保护视网膜色素上皮的效果,为年龄相关性黄斑变性的治疗提供了新的思路,具有较高的临床实践意义。
本发明描述了该药物递释系统的制备方案,并提供了该系统体内外靶向性的结果以及药效学评价。
附图说明
图1为考马斯亮蓝染色法对膜蛋白的完整性进行表征图。
图2为免疫印迹法对巨噬细胞、巨噬细胞膜囊泡和MRaNP的几类特异性粘附蛋白进行表征图。
图3中A、B和C图分别是对纳米递药系统的粒径、分散系数和Zeta电位的表征图。
图4是将巨噬细胞囊泡与RaNP按蛋白质∶PLGA质量比为1∶1混合所制得巨噬细胞膜包被的装载雷帕霉素的纳米粒的透射电镜图。
图5中,A图是小鼠尾静脉注射不同DiI标记纳米粒后CNV区域的DiI荧光图,B 图是对DiI荧光强度进行半定量的结果。
图6中,A图是小鼠尾静脉注射不同药物后CNV区域的IB4荧光染色图,B图是对CNV区域面积进行半定量的结果图。
图7为不同雷帕霉素比聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量比下所得纳米粒的雷帕霉素载药率和包封率。
图8为将巨噬细胞囊泡与RaNP按蛋白质∶PLGA质量比为1∶2混合所制得巨噬细胞膜包被的装载雷帕霉素的纳米粒的透射电镜图。
图9为炎性条件下内皮细胞对不同DiI标记纳米粒的摄取情况以及黏附分子CD49d和CD11b所对应的配体ICAM-1和VCAM-1的表达情况图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行进一步解释说明:
实施例1
(1)巨噬细胞的提取:25gC57雄性小鼠腹腔注射4%的巯基乙酸盐肉汤1mL,3 天后处死小鼠,全身浸入75%乙醇消毒,分两次注入5mL培养基提取腹腔巨噬细胞,提取后的细胞在37℃。5%CO2的条件下培养至80%-90%;
(2)将所得细胞收集到离心管中,500g×5min离心3次,再经液氮反复冻融3次以裂解细胞,再用杜恩斯匀浆器反复研磨20次进一步破碎细胞;
收集细胞裂解液于离心管中,3200g×5min,4℃离心以除去大细胞碎片;
收集上清液,20000g×25min,4℃离心以除去细胞器;
收集上清液,100000g×60min,4℃离心,弃去上清液,所得白色沉淀即为细胞膜;将细胞膜沉淀重悬于超纯水中,使用配备400nm和200nm滤膜的高压纳米挤出机反复推挤20次,得到巨噬细胞膜囊泡;
(3)纳米沉淀法制备装载雷帕霉素的纳米粒RaNP:准备体积质量浓度为10mg/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA-二甲亚砜DMSO溶液1ml,按雷帕霉素占聚乳酸- 羟基乙酸共聚物质量百分比为10%加入雷帕霉素原药,斡旋混匀至完全溶解,离心集液,得到雷帕霉素-PLGA-DMSO溶液;
(4)将(3)中所得的雷帕霉素-PLGA-DMSO溶液快速搅拌的条件下自高处缓慢滴加至注射溶媒,使用5L注射溶媒透析24h,得到RaNP。
采用高效液相色谱法(HPLC)测定装载雷帕霉素的纳米粒RaNP中雷帕霉素的载药量LE和包封率EE。结果:当雷帕霉素占聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)质量百分比为10%时,所得雷帕霉素载药率和包封率分别为6.9%和73.9%;
(5)将步骤(2)所得巨噬细胞囊泡与步骤(4)所得RaNP按蛋白质:PLGA质量比为1∶1混合,在42kHz,100W条件下超声3分钟,得到巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒MRaNP。
将巨噬细胞、巨噬细胞膜囊泡和MRaNP用蛋白裂解液溶液,PAGE凝胶电泳后采用经典的考马斯亮蓝染色法对膜蛋白的完整性进行表征。
采用免疫印迹法对巨噬细胞、巨噬细胞膜囊泡和MRaNP的几类特异性粘附蛋白进行表征。结果:通过比较MRaNP与巨噬细胞膜囊泡的考马斯亮蓝染色结果(如图1)发现,两者蛋白条带基本一致,说明将细胞膜转移到PLGA内核表面的同时,膜蛋白也成功转移到PLGA纳米粒表面。通过进一步的蛋白质印迹法WB分析,证明相较于巨噬细胞,MRaNP与巨噬细胞膜囊泡表明CD49d和CD11b等粘附分子表达明显升高(如图2)。
采用粒度/Zeta电位测定仪测定各粒子的粒径、多分散性(PDI)和Zeta电位。采用透射电镜观察MRaNP的形态。结果:包膜前的纳米粒RaNP粒径为84.3nm,包膜后粒径增大了17nm,即粒径在100nm左右,大小合适,能穿过血-眼屏障;Zeta 电位由原来的-32.8mV变为-29.6mV,即表面负电位,可以避免减少内皮网状系统的无效摄取,增加到达眼部的雷帕霉素的浓度,与巨噬细胞膜囊泡的-28.7mV基本一致(如图3)。透射电镜下可看到中央的PLGA核结构和外层10nm左右厚度的细胞膜,进一步提示巨噬细胞膜包被纳米粒的成功(如图4)。
实施例2
(1)巨噬细胞的提取:从SD大鼠腹腔注射4%的巯基乙酸盐肉汤1mL,3天后处死小鼠,全身浸入75%乙醇消毒,分两次注入5mL培养基提取腹腔巨噬细胞,提取后的细胞在37℃。5%CO2的条件下培养至80%-90%;
(2)将所得细胞收集到离心管中,500g×5min离心3次,再经液氮反复冻融3次以裂解细胞,再用杜恩斯匀浆器反复研磨20次进一步破碎细胞;
收集细胞裂解液于离心管中,3200g×5min,4℃离心以除去大细胞碎片;
收集上清液,20000g×25min,4℃离心以除去细胞器;
收集上清液,100000g×60min,4℃离心,弃去上清液,所得白色沉淀即为细胞膜;将细胞膜沉淀重悬于超纯水中,使用配备400nm和200nm滤膜的高压纳米挤出机反复推挤20次,得到巨噬细胞膜囊泡;
(3)纳米沉淀法制备装载雷帕霉素的纳米粒RaNP:准备体积质量浓度为10mg/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA-二甲亚砜DMSO溶液1ml,按雷帕霉素占聚乳酸- 羟基乙酸共聚物质量百分比为5%加入雷帕霉素原药,斡旋混匀至完全溶解,离心集液,得到雷帕霉素-PLGA-DMSO溶液;
(4)将(3)中所得的雷帕霉素-PLGA-DMSO溶液快速搅拌的条件下自高处缓慢滴加至注射溶媒,使用5L注射溶媒透析24h,得到RaNP。
采用高效液相色谱法(HPLC)测定装载雷帕霉素的纳米粒RaNP中雷帕霉素的载药量LE和包封率EE。结果:当雷帕霉素占聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量百分比为 5%时,所得雷帕霉素载药率和包封率分别为3.8%和80.4%;
(5)将步骤(2)所得巨噬细胞囊泡与步骤(4)所得RaNP按蛋白质∶PLGA质量比为1∶1混合,在42kHz,100W条件下超声3分钟,得到巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒MRaNP。
实施例3
制备细胞膜橙红色荧光探针DiI标记的装载雷帕霉素的巨噬细胞膜包被纳米颗粒制剂。
(1)直接从小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系Raw264.7细胞获得巨噬细胞,在37℃,5%CO2的条件下培养至80%-90%;
(2)刮取(1)中所得巨噬细胞,收集到离心管中,500g×5min离心3次,再经液氮反复冻融3次以裂解细胞,再用杜恩斯匀浆器反复研磨20次进一步破碎细胞;收集细胞裂解液于离心管中,3200g×5min,4℃离心以除去大细胞碎片;
收集上清液,20000g×25min,4℃离心以除去细胞器;
收集上清液,100000g×60min,4℃离心,弃去上清液,所得白色沉淀即为细胞膜;将细胞膜沉淀重悬于超纯水中,使用配备400nm和200nm滤膜的高压纳米挤出机反复推挤20次,得到巨噬细胞膜囊泡;
(3)制备体积质量浓度为10mg/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA-二甲亚砜 DMSO溶液1ml,加入1mg雷帕霉素原药+10ugDiI探针,斡旋混匀至完全溶解,离心集液;
(4)将(3)中所得的雷帕霉素-PLGA-DMSO溶液在快速搅拌的条件下自高处缓慢滴加至注射溶媒,使用5L注射溶媒透析24h,注意避光,得到DiI标记的巨噬细胞膜包被的装载雷帕霉素的纳米粒DiI-RaNP,所得雷帕霉素载药率和包封率分别为 7.0%和75.1%;
(5)将步骤(2)所得巨噬细胞囊泡与步骤(4)所得RaNP按蛋白质∶PLGA质量比为1∶1混合,在42kHz,100W条件下超声3分钟,得到DiI标记的装载雷帕霉素的巨噬细胞膜包被纳米颗粒制剂DiI-MRaNP;
C57小鼠构建模拟AMD的激光诱导CNV模型:小鼠5%水合氯醛麻醉后,散瞳,借助8mm圆形细胞爬片+卡波姆凝胶在裂隙灯下窥及小鼠眼底,在视神经周围 1.5个视盘直径处,利用氩激光诱导小鼠CNV形成(3个激光点每只眼);
(7)CNV模型构建后的第4天,通过给小鼠尾静脉注射DiI-MRaNP,发现较之 DiI-RaNP,其在CNV区域中有显著的蓄积,与未包膜的DiI-RaNP相比,包膜后的 DiI-MRaNP在CNV区域的蓄积提升约5.6倍,提示了本制剂良好的CNV靶向性(如图5)。
实施例4
利用装载雷帕霉素的巨噬细胞膜包被纳米颗粒制剂治疗CNV
(1)采用实施例1中的方法制备巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒MRaNP;
(2)采用实施例3中的方法构建CNV模型;
(3)CNV模型构建后第1天-第7天,每天按0.75mg/kg雷帕霉素量通过给小鼠尾静脉注射游离雷帕霉素Rapa、RaNP或MRaNP,或注射等体积生理盐水Saline,发现MRaNP组CNV面积与其他三组有明显的差异,提示本制剂在通过提升雷帕霉素在CNV区的特异性蓄积后能大大提升其抑制CNV的作用(如图6)。
对比例1
(1)准备体积质量浓度为10mg/ml的聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA-二甲亚砜 DMSO溶液lml,按雷帕霉素比聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量百分比为15%加入雷帕霉素原药,斡旋混匀至完全溶解,离心集液;
(2)其他步骤按实施例1方法制备装载雷帕霉素的PLGA纳米粒RaNP;
(3)结果:当雷帕霉素占聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量百分比为15%时,可发现纳米粒出现聚集,而按实施例1的方法当质量百分比为10%时,RaNP呈乳光状均一、透明态(如图7)。提示本发明方法中雷帕霉素比聚乳酸-羟基乙酸共聚物质量最优百分比为10%,小于此百分比则载药效率低下,高于此百分比则无法制备出可使用的纳米粒。
对比例2
(1)采用实施例1中的方法制备巨噬细胞囊泡与装载雷帕霉素的纳米颗粒PLGA 纳米粒(RaNP);
(2)按巨噬细胞膜中蛋白质的质量∶PLGA质量比为1∶2混合,在42kHz,100W 条件下超声3分钟,其余步骤与实施例1相同,得到巨噬细胞膜包被的装载雷帕霉素的纳米粒MRaNP;
(3)采用透射电镜观察MRaNP形态,可见纳米粒边界欠清、纳米粒包裹不充分(如图8)。与之对比,实施例1中MRaNP呈现出边界清晰的壳-核结构(如图3)。提示此种方法中细胞膜蛋白质∶PLGA质量最优比为1∶1。
对比例3
制备DiI标记的装载雷帕霉素的红细胞膜包被纳米颗粒制剂(RRaNP)并比较其与MRaNP靶向CNV的能力。
(1)采用Che-Ming J等于《Erythrocyte membrane-camouflaged polymericnanoparticles as a biomimetic delivery platform》(Proc Natl Acad Sci U SA.2011 Jul 5;108(27):10980-10985)一文中报道的方法制备红细胞膜囊泡;
(2)采用实施例3中的方法制备DiI标记的装载雷帕霉素的PLGA纳米粒 (DiI-RaNP);
(3)将红细胞膜囊泡和DiI-RRaNP按蛋白质∶PLGA质量比为1∶1混合,在42kHz,100W条件下超声3分钟,得到红细胞膜包被的装载雷帕霉素的纳米粒RRaNP;
(4)将人脐静脉内皮细胞系HUVEC种于共聚焦玻璃皿中,生长至80%融合度时给予炎性因子TNF-α刺激12小时以建立炎性血管模型;
(5)将HUVEC分别与DiI-RRaNP、DiI-RaNP和DiI-MRaNP孵育4小时;
(6)PBS洗三次,4%多聚甲醛固定后加入CD11b的配体ICAM-1或CD49d的配体VCAM-1对应的一抗,过夜;
(7)加入对应的二抗,DAPI染细胞核;
(8)共聚焦显微镜下观察细胞,结果示炎性条件下HUVEC表面黏附分子ICAM-1 和VCAM-1表达增高(绿色),从而导致HUVEC对DiI-MRaNP摄取增多,但并未见到HUVEC对DiI-RRaNP或DiI-RaNP的明显摄取(红色)。此结果说明炎性条件下,通过增加对应配体的表达,HUVEC能增加对巨噬细胞膜修饰的MRaNP 的摄取。而由于红细胞膜表面缺乏ICAM-1和VCAM-1的表达,红细胞膜的修饰无法提升HUVEC对纳米粒的摄取。进一步表明MRaNP具有类似于巨噬细胞的生物学特性,相较于红细胞膜包被的装载雷帕霉素的纳米粒RRaNP,巨噬细胞膜包被的纳米粒MRaNP具有更优越的靶向炎性CNV的作用。
Claims (10)
1.一种巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒,其特征在于,聚乳酸-羟基乙酸共聚物包载雷帕霉素制备得到雷帕霉素-PLGA纳米粒并作为内核,巨噬细胞膜作为衣壳包覆于雷帕霉素-PLGA纳米粒表面;其中,雷帕霉素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶9-20,巨噬细胞膜中蛋白质与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶1-1.5。
2.根据权利要求1所述的巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒,其特征在于,所述雷帕霉素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶9-10,巨噬细胞膜中蛋白质与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1∶1-1.2。
3.根据权利要求1所述的巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒,其特征在于,所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物分子量为50-100kDa。
4.根据权利要求1所述的巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒,其特征在于,所述的巨噬细胞膜是将巨噬细胞经离心、液氮反复冻融、破碎后得到的细胞裂解液采用差速离心法提取得到的。
5.根据权利要求1所述的巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒,其特征在于,所述的巨噬细胞是由SD大鼠或C57小鼠通过预先给予巯基乙酸盐肉汤刺激腹腔后获得,或直接为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系Raw264.7细胞。
6.根据权利要求1所述的巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒,其特征在于,所述的雷帕霉素-PLGA纳米粒采用纳米沉淀法制备得到。
7.根据权利要求6所述的巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒,其特征在于,所述的纳米沉淀法步骤如下:在聚乳酸-羟基乙酸共聚物-二甲亚砜溶液中加入雷帕霉素,混匀至完全溶解,离心,集液;得到的雷帕霉素-PLGA-DMSO溶液在快速搅拌的条件下自高处缓慢滴加至注射溶媒,使用注射溶媒透析24h,得到雷帕霉素-PLGA纳米粒。
8.一种巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒的制备方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)将巨噬细胞经离心、液氮反复冻融、破碎后得到的细胞裂解液采用差速离心法提取得到巨噬细胞膜;
(2)将步骤(1)中得到的巨噬细胞膜使用高压纳米挤出机反复推挤得到巨噬细胞膜囊泡;
(3)取聚乳酸-羟基乙酸共聚物和雷帕霉素采用纳米沉淀法制得雷帕霉素-PLGA纳米粒;
(4)将步骤(2)制备的巨噬细胞膜囊泡与步骤(3)中制备的雷帕霉素-PLGA纳米粒通过超声法整合,制成巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒。
9.根据权利要求8所述的巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒的制备方法,其特征在于,所述巨噬细胞膜囊泡平均粒径为220-240nm,所述的雷帕霉素-PLGA纳米粒平均粒径为70-90nm,包被巨噬细胞膜之后最终粒径为90-110nm。
10.权利要求1所述的巨噬细胞膜包被的脉络膜新生血管靶向纳米粒在制备用于靶向脉络膜新生血管和炎症/氧化应激条件下保护视网膜色素上皮的药物中的用途。
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