CN114057818A - 抑制损伤血管内膜增生的纳米药物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体公开了抑制损伤血管内膜增生的纳米药物及其应用。本发明以抗增殖药物RAPA作为模型药物，采用苯硼酸和甘露糖合成具有ROS响应性的两亲性载体PBAP‑CDI‑Mannose(PCM)包载RAPA构成纳米粒子PMR并将巨噬细胞膜包覆于其上制得多功能仿生纳米粒子MM@PMR。本发明制备出来的仿生纳米粒子MM@PMR，粒径均一，分散性良好，生物相容性较好，具有免疫逃逸功能、并能靶向病理部位药物递送，将其运用于制备治疗血管损伤的药物中，可以抑制损伤血管内膜增生。

Description

抑制损伤血管内膜增生的纳米药物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及抑制损伤血管后内膜增生的纳米药物及其应用。
背景技术
心血管疾病已经成为了当今常见疾病，攻克相关疾病的研究持续不断，许多血管疾病的病理进程都与内膜和中膜功能异常有关，血管损伤引起的内膜增生被认为是多种血管疾病重要的病理进程。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是中风、心肌梗死和心脏死亡的主要潜在原因，内皮损伤导致的功能障碍被认为是AS的起始，经皮介入治疗后对内膜的损伤被认为是术后再狭窄的始动因素。血管内皮层受损或功能障碍导致的炎症浸润会诱导中膜层平滑肌细胞跨越弹力板向管腔内迁移进而造成管腔狭窄，最终会引起终端组织缺血等问题，改善和抑制血管损伤的病理进程有着重要的意义。
目前，纳米药物递送系统的功能化发展有了较为全面的提升，在增加药物溶解度、延长体内循环时间、靶向递送等方面都有良好的表现。如何能够基于病理特性实现药物靶向递送和可控释放一直是药物递送领域研究的关键问题。对病理部位靶向递送药物既可以使药物高效地作用于靶部位，还可以降低对非靶部位的毒副作用。为了实现药物的局部控释和靶向递送，大量响应外部刺激和内部刺激的递送功能化生物材料已被广泛报道，如响应光照、磁场、超声波、电场、pH刺激和ROS的载体材料已被运用到药物递送的实践中。仿生膜包被技术是一种可使外源物质“隐身”的策略，通过生物膜的包被对外源物质加以伪装，可以降低免疫系统对其的摄取，且活细胞具有的先天靶向机制可以提高药物在特定病灶组织或细胞中的积累，进一步结合纳米技术可以显著改善药物递送系统的效用性及安全性。
为抑制管腔细胞的恶性增殖，治疗药物的选择应具有针对性。雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)是一种从真菌的次生代谢物中分离得到的抗生素，RAPA靶向哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)，具有较好的抗增殖和免疫抑制作用。但因其溶解度低，在实际应用中多有受限，通过纳米递送系统的包载可以提高其溶解度，大大提升药物生物利用率。RAPA显示优异的抗增殖和免疫抑制作用，可用于抑制炎症反应和内膜增生的应用，但是其靶向性、免疫逃逸性、ROS响应性等功能欠佳。
综上，亟需通过仿生纳米药物递送技术可以构建具有病理部位靶向性、局部可控释放、低毒副作用的多功能纳米药物，用于抑制损伤血管内膜增生。
发明内容
本发明为了解决上述问题，选用抗增殖药物RAPA作为模型药物，提供了一种多功能仿生纳米粒子MM@PMR的制备方法，制备得到的仿生纳米粒子具有良好的病理部位靶向性、免疫逃逸性、ROS响应性。
本发明目的之一在于提供一种具有ROS响应的两亲性载体PCM的制备方法，后续用其制备仿生纳米粒子MM@PMR，具体技术方案如下：
制备具有ROS响应的两亲性载体PCM的方法，步骤如下：
Figure BDA0003293220710000021
具体的，所述PBAP和CDI的摩尔比为1：2。
具体的，将所述PBAP-CDI、甘露糖和DMAP溶解透析制得载体PCM；所述PBAP-CDI，甘露糖和DMAP的摩尔比为3：1：3。
本发明目的之二在于提供一种仿生纳米粒子MM@PMR的制备方法，以抗增殖药物RAPA作为模型药物，采用苯硼酸和甘露糖合成具有ROS响应性的两亲性载体PBAP-CDI-Mannose(PCM)包载RAPA构成纳米粒子PMR并将巨噬细胞膜包覆于其上制得，具体技术方案如下：
仿生纳米粒子MM@PMR的制备方法，制备过程如下，
(1)利用权利要求1所述的方法制备得到的PCM和RAPA溶解透析得到所述PMR纳米粒子；
(2)提取巨噬细胞膜；
(3)将巨噬细胞膜包被所述PMR纳米粒子制得仿生纳米粒子MM@PMR。
具体的，所述PCM和RAPA的质量比为10：1。
具体的，步骤(3)中用孔径为200nm的脂质体挤出器将巨噬细胞膜和PMR纳米粒子共混挤出制得生纳米粒子MM@PMR。
本发明目的之三在于提供一种仿生纳米粒子MM@PMR，其具有响应病理环境高浓度水平ROS的潜力，这可以加快RAPA释放，从而提高药物的局部有效治疗浓度，具体技术方案如下：
一种仿生纳米粒子MM@PMR，巨噬细胞膜包裹PMR，所述PMR是粒径为40-55nm的球状，所述巨噬细胞膜的厚度为5nm。
具体的，水合状态下，所述PMR的粒径为109.4nm，所述巨噬细胞膜的厚度为20nm。
具体的，所述巨噬细胞膜包括CCR2蛋白，整合素α4β1和CD47。
具体的，所述仿生纳米粒子MM@PMR的电位为-16.1±0.7mV。
本发明目的之四在于将上述仿生纳米粒子MM@PMR运用于制备治疗损伤血管内膜增生的药物或药物载体。
本发明的有益之处在于：本发明制备方法简单，合成了具有ROS响应的纳米颗粒PMR，可以有效实现雷帕霉素的增溶，利用其制备出来的仿生纳米粒子MM@PMR，粒径均一，分散性良好，生物相容性较好，具有免疫逃逸功能、并能对病理部位进行靶向药物递送，特别对炎性内皮靶向性更强。
附图说明
图1为本发明实施例1中PBAP-CDI和PCM的1H-NMR图谱；
图2为PMR、MM@PMR及巨噬细胞膜微囊(MM)的水合尺寸和电位图(n＝3)；
图3为PMR和MM@PMR纳米粒子的TEM图；
图4为PMR及MM@PMR在PBS和H2O2浓度为10μM的PBS中的体外RAPA药物释放曲线图(n＝3)；
图5为巨噬细胞总蛋白、巨噬细胞膜蛋白及MM@PMR膜蛋白的SDS-PAGE凝胶成像图；
图6为巨噬细胞、巨噬细胞膜微囊及MM@PMR上CCR2、整合素α4β1和CD47的蛋白质免疫印迹检测图；
图7为激光扫描共聚焦显微镜表征巨噬细胞对DiDPMR或MM@DiDPMR的吞噬作用图；
图8为巨噬细胞吞噬实验图片：(a)巨噬细胞吞噬DiDPMR或MM@DiDPMR的流式细胞图。(b)巨噬细胞吞噬DiDPMR或MM@DiDPMR的荧光定量分析图(n＝3)；
图9为正常内皮细胞及用TNF-α刺激活化后的内皮细胞吞噬DiDPMR及MM@DiDPMR的荧光图；
图10为正常内皮细胞及活化后的内皮细胞吞噬DiDPMR或MM@DiDPMR后的流式分析图(a.共孵育1h，b.共孵育3h；1.和5.正常HVEC+DiDPMR，2.和6.激活HVEC+DiDPMR，3.和7.正常HVEC+MM@DiDPMR，4.和8.激活HVEC+MM@DiDPMR)；
图11为正常及活化后的内皮细胞吞噬DiDPMR或MM@DiDPMR后的荧光定量分析图(n＝3)；
图12为不同浓度下RAPA、PMR、MM@PMR抗VSMCs增殖活力图(n＝5)；
图13为RAPA、PMR、MM@PMR的细胞迁移照片(n＝5)；
图14为Blank、RAPA、PMR、MM@PMR组的细胞迁移率统计图(n＝5)；
图15为溶血实验图：(a)PMR及MM@PMR溶血实验离心后图片，(b)离心后PMR及MM@PMR上清吸光度的统计图(n＝3)；
图16为载体PCM和MM@PCM的内皮毒性柱状图(n＝5)；
图17为不同浓度的PCM和MM@PCM对斑马鱼胚胎的毒性影响观察图。
上述所有图片中ns表示无显著性差异。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的结构思路、使用范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 载体PBAP-CDI-Mannose(PCM)的合成线路及原理
Figure BDA0003293220710000041
PBAP上的-OH可以与CDI上的咪唑结构反应生成脂键，通过在合成过程中控制投料比。可以控制CDI上的咪唑结构与PBAP的结合个数。本实验中合成的PBAP-CDI上保留了一个咪唑结构用于下一步与甘露糖的结合。甘露糖是一种亲水性很好的六碳糖，类似的，其上的-OH可以与咪唑结构反应生成脂键，实验中在40℃条件下过夜搅拌并加入催化剂4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,DMAP)保证PBAP-CDI与甘露糖的充分结合。由于PBAP部分表现出疏水特性且甘露糖部分表现出亲水特性，载体PCM具有两亲性，可以通过纳米沉淀法制备得到纳米载体。
这里列举具体的操作步骤对其进行说明：
将4mmol PBAP和8mmol CDI分别于5mL DCM中充分溶解，随后混合于50mL圆底烧瓶，在40℃油浴锅中搅拌反应1h。用超纯水洗反应产物3次，生理盐水洗1次，再加入无水硫酸镁封口干燥4h。过滤后，收集产物于旋转蒸发仪上充分去除DCM直至获得白色固体，即前体PBAP-CDI的纯物质。
将1.5mmol PBAP-CDI、0.5mmol甘露糖和1.5mmol DMAP溶解于4mL DMF中，在40℃恒温下搅拌过夜。随后，将产物置于500Da的透析袋中，在超纯水中透析12h，期间多次换水，去除有机溶剂、催化剂和未反应的原料。收集产物于-80℃冰箱冷冻为固体后，通过真空干燥获得载体PCM的固体纯物质。
核磁共振是现代结构分析的重要手段，可以在不破坏样品的情况下获得多种样品信息，如化学位移、耦合常数及各种核的信号强度比。通过对上述信息的分析，可得特定原子的化学环境、原子个数、临接基团的种类和分子的空间构型。本实验中为验证载体PCM的成功合成，对PBAP-CDI和PCM进行了1H-NMR分析，结果如图1所示，PBAP-CDI图谱上e，f位置H原子对应峰值在PCM图谱上被大幅削弱，同时PCM图谱上g，h位置H原子对应的峰值出现，表明甘露糖与PBAP-CDI成功结合。
实施例2 仿生纳米粒子MM@PMR的制备方法
仿生纳米粒子MM@PMR的制备方法，制备过程如下，
(1)利用实施例1中的制得到的PCM和RAPA溶解透析得到所述PMR纳米粒子；
(2)提取巨噬细胞膜；
(3)将巨噬细胞膜包被所述PMR纳米粒子制得仿生纳米粒子MM@PMR。
具体的，所述PCM和RAPA的质量比为10：1。
具体的，步骤(3)中用孔径为200nm的脂质体挤出器将巨噬细胞膜和PMR纳米粒子共混挤出制得生纳米粒子MM@PMR。
此处列举具体实施过程：
(1)载RAPA纳米粒子PMR的合成
将10mg实施例1中制得的载体PCM与1mg RAPA充分溶解于200μL DMF中，将上述有机混合物逐滴滴加入5mL高速旋转的超纯水中。随后将产物置于1000Da的透析袋中，在超纯水中透析12h，期间多次换水，去除有机溶剂和未成功包载的载体和RAPA。
(2)提取巨噬细胞膜
①巨噬细胞培养：使用由DMEM培养基与血清按9：1比例配成的完全培养基在恒温箱(37℃，5％CO2)内培养小鼠来源的巨噬细胞RAW 264.7细胞系，细胞隔天换液，待细胞融合率达90％时传代。
②细胞收集：完全移除培养基后用无菌PBS轻柔快速洗长满的RAW细胞3次，细胞刮刮下细胞并转移至2mL离心管中，1500rpm离心5min后，收集管底的白色细胞沉淀。
③细胞膜提取：
1)细胞预处理：在室温下融解膜蛋白提取缓冲A液后迅速置于冰上保存，4℃环境下以A液为溶剂溶解PMSF使其终浓度为1Mm，得到提取工作液后迅速于其中分散细胞，冰浴处理10-15min。
2)细胞破碎：收集经预处理的细胞悬液于预冷的玻璃细胞匀浆器，4℃环境下缓慢匀速匀浆35下，使细胞在物理作用下充分裂解。
3)分离纯化：收集上一步产物于2mL离心管，4℃，700g离心10min，小心收集上清液。4℃，14000g离心30min，收集管底沉淀，即为巨噬细胞膜碎片。重悬膜碎片于超纯水中，冷冻干燥后置于-80℃冰箱保存。
(3)MM@PMR的合成
采用共挤出的方式制备巨噬细胞膜包被的仿生纳米粒子MM@PMR。将从5将从PM个RAW细胞中提取的细胞膜碎片与含1mg纳米粒子的分散液充分混合，在42kHz、100W的条件下超声2min。将共混后的分散液加入纳米脂质体挤出器中，200nm孔径下反复挤出16次后收集产物，于4℃冰箱保存。
实施例3 仿生粒子的表征分析
1、制备所得的PMR、MM@PMR的粒径、电位和TEM形貌表征分析
通过马尔文激光粒度分析仪对制备的PMR、MM@PMR纳米粒子及巨噬细胞膜微囊(MM)在室温下进行了水合尺寸和电位的测量，结果如图2所示，其中，PMR的粒径为109.4nm，PDI为0.123，显示实验成功合成了水合粒径在100nm左右的PMR纳米粒子且纳米粒子的尺寸均一性良好，纳米粒子的尺寸呈集中的正态分布。MM@PMR是通过将PMR纳米粒子与巨噬细胞膜微囊共混后共挤出制备得到的，在通过一定孔径的纳米孔时，物理挤压会使柔性的脂质微囊包覆与PMR纳米粒子上，形成“核-壳”结构仿生纳米颗粒MM@PMR。由于有细胞膜附在PMR纳米颗粒的外部，在水合尺寸上，MM@PMR较PMR增大了约20nm，为129.6nm，同时PDI也略微有增大至0.177大，显示仿生纳米粒子MM@PMR仍具有良好均一性。MM组为制备得到的巨噬细胞微囊，其尺寸在220nm左右，PDI在0.2左右，同样具有较好的均一性。
电位结果反映了纳米粒子的表面带电情况，从测试结果可见，PMR纳米粒子与巨噬细胞微囊均呈负电性，其数值分别为-22.7mV和-14.6mV均，共挤出得到的MM@PMR的电位居于二者之间且更接近于巨噬细胞微囊的表面电位，为-16.1mV，表明巨噬细胞膜成功包被了PMR纳米粒子。
进一步确定细胞膜成功包覆于PMR纳米粒子表面，通过透射电子显微镜对样品进行可视观察。结果如图3所示，左图为PMR纳米粒子，右图为MM@PMR纳米粒子，从右图中可以观察到白色核的外围有一层灰色阴影，此处即为细胞膜结构，厚度约为5nm，证明巨噬细胞膜成功包被于PMR纳米粒子上。图中两种纳米粒子的直径均在40nm。图中两种纳范围内，相较于水合尺寸有大幅度减小，这是因为TEM拍照的样品都是经过脱水处理。上述两个实验表明，本实验中成功制备了外形呈球形、粒径均一的“核-壳”结构仿生纳米粒子MM@PMR。
2、PMR在H2O2条件下的水解
实验中制备的PMR纳米粒子的水合粒径在100nm左右，由于丁达尔效应，PMR分散液呈现蓝紫色，在纳米粒子水解后，由于纳米粒子解组装不再具有纳米结构，故蓝紫色会逐渐消退，通过对处于不同时间的分散液拍照，可以用肉眼观察分散液的颜色以判断水解的进程。实验中用30％过氧化氢溶液配置成H2O2浓度为1mM的反应溶液，观察PMR在ROS环境中的水解情况。反应1h后，H2O2组分散液已可通过肉眼观察到颜色变化，在反应至24h时，H2O2组分散液基本呈无色，而PMR的超纯水分散液肉眼观察不到变化，说明PMR纳米粒子可以在ROS环境下触发降解。
3、PMR及MM@PMR的体外药物释放
本实验中研究了PMR及MM@PMR在PBS(pH＝7.4)和H2O2浓度为10μM的PBS环境下5天内的体外RAPA药物释放曲线。如图4所示，从释放曲线的整体趋势上来看，四个实验组均在前2h快速释放，释放速度随后逐渐减慢。为了更好的对比各组间的释放速度，计算了释放率达到50％时各组所用的时间T1/2，单纯PBS环境下，PMR及MM@PMR的T1/2分别为59min和116min，而在H2O2浓度为10μM的PBS环境下PMR及MM@PMR的T1/2分别为41min和55min。可见，ROS环境对PMR和MM@PMR的RAPA释放均有明显的促进作用。另外，对比PMR及MM@PMR处于同一释放环境时的释放速度，发现MM@PMR相较PMR释放较慢，原因是MM@PMR外部的膜结构起到了屏障作用，阻碍了内部PMR中RAPA的释放。这一差距在PBS环境中十分明显，二者间的T1/2相差57min，而在ROS环境中两者的T1/2之差缩短至14min，且在ROS环境中，MM@PMR的T1/2相较不含ROS的环境缩短了一半以上，原因可能是ROS破坏了膜结构，使得处于内部的PMR直接与ROS接触，加快了RAPA的释放。这表明MM@PMR有响应病理环境处的高浓度水平ROS的潜力，这可以加快RAPA释放，从而提高药物的局部有效治疗药物浓度。以上结果表明，该纳米粒子能够提高药物靶向治疗效用，降低治疗过程的毒副作用。
4、聚丙烯酰胺凝胶电泳表征MM@PMR表面膜蛋白
膜蛋白是细胞实现生理功能的重要组分，仿生纳米药物最重要的设计思路就是通过保留细胞原有的膜结构及其功能蛋白，从而实现对外源物质的“伪装”。因此，验证仿生纳米粒子MM@PMR上包覆的巨噬细胞膜仍保留有与原细胞膜蛋白相似的蛋白组成是实现仿生功能的关键。实验中对于巨噬细胞总蛋白、巨噬细胞膜蛋白及MM@PMR膜蛋白进行SDS-PAGE凝胶成像实验，观察各个样品的蛋白组成情况。从图5中可见，巨噬细胞总蛋白的蛋白条带分布较其他两组更广，因为总蛋白中不仅包含膜蛋白，还有浆蛋白。观察可见，巨噬细胞膜蛋白与MM@PMR膜蛋白的蛋白条带一致性良好，说明MM@PMR成功保留了巨噬细胞膜的原有蛋白，这预示着仿生纳米粒子会较好地模拟巨噬细胞的生物功能。
5、蛋白质免疫印迹验证MM@PMR表面功能蛋白
位于巨噬细胞膜上的功能蛋白具有一系列重要的生理过程，如巨噬细胞的特异性招募、与病理部位的特异性结合和免疫逃逸等等。为验证仿生纳米粒子MM@PMR是否保留下来了重要的表面功能蛋白，通过蛋白质免疫印迹法对其进行检测。巨噬细胞膜表面表达的CCR2蛋白是单核细胞趋化蛋白-1的受体，介导炎症过程中病理部位对单核细胞的招募。整合素α4β1可以与炎性内皮高表达的血管粘附分子VCAM-1特异性结合。CCR2和整合素α4β1的保留有利于MM@PMR被病理部位招募和特异性结合，进而实现药物的靶向递送。CD47可通过与信号调节蛋白-α(SIRP-α)相互识别介导细胞的免疫逃逸，MM@PMR膜上CD47的保留有利于抑制自身免疫系统对其的清除，有利于实现仿生纳米粒子在体内的长效循环。从图6中可见，MM@PMR上CCR2，整合素α4、整合素β1及CD47的保留情况良好，表明巨噬细胞膜的关键功能被很好的保留，是保障仿生纳米粒子内源性仿生及靶向药物递送功能的基础。
实施例4 体外分析
1、实验材料与设备
(1)主要实验材料及试剂
Figure BDA0003293220710000081
(2)主要仪器
Figure BDA0003293220710000082
2、实验方法
(1)HVEC、HVSMC、RAW细胞培养
细胞培养条件如下：RAW 264.7使用DMEM(含10％FBS)培养，HVEC和HVSMC使用RPMI1640(含10％FBS)培养。37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养细胞，细胞融合置90％时传代，每天换液。
(2)体外巨噬细胞吞噬
将RAPA内核用分子量相近的荧光染料DiD替换，依前述方法制备红色荧光纳米粒子DiDPMR或MM@DiDPMR。
激光共聚焦拍照表征：在加入细胞爬片的24孔板中每孔接种5×105个RAW细胞，37℃，5％CO2条件下培养过夜，随后每孔加入100μg DiDPMR或MM@DiDPMR纳米粒子，与RAW细胞分别孵育1h，3h。依下述步骤进行后处理：完全移除培养基→PBS轻柔洗3次→4％PFA固定20min→完全移除PFA→PBS轻柔洗3次→DAPI染色15min→完全移除DAPI→PBS轻柔洗3次。取出爬片置于CLSM下观察并拍照。
流式细胞术表征：在6孔板中每孔接种1.2×106个RAW细胞，37℃，5％CO2条件下培养过夜，随后每孔加入100μg DiDPMR或MM@DiDPMR纳米粒子，与RAW细胞分别孵育1h，3h。依下述步骤进行后处理：完全移除培养基→无菌PBS轻柔洗3次→胰蛋白酶消化→无菌PBS离心洗2次→于500μL无菌PBS中重悬。上流式细胞仪检测样品的荧光强度。
巨噬细胞是自身免疫系统重要的组成部分，负责清除体内的“异己”物质。给纳米粒子穿上细胞膜的外衣就是为了将其“伪装”成自体细胞从而免于被自身免疫系统清除，表达于细胞膜上的CD47是实现“免疫逃逸”的关键信号分子，它会释放“别吃我”的信号，从而避免巨噬细胞的摄取。
实验中采用体外实验评估巨噬细胞对纳米粒子的摄取动力学。为了便于可视观测纳米粒子被巨噬细胞的摄入情况，实验中用红色荧光染料DiD替换原有，采用与合成PCM和MM@PCM相同的方法合成了荧光内核的纳米粒子DiDPMR和MM@DiDPMR。从图7中可见，在巨噬细胞与DiDPMR或MM@DiDPMR共孵育时间相同时，DiDPMR组相较MM@DiDPMR组的荧光强度更高，说明DiDPMR组的巨噬细胞摄取了更多的荧光纳米粒子。这表明相较于DiDPMR，MM@DiDPMR能够降低巨噬细胞对其的识别和摄取，预示MM@DiDPMR具有更好的长效血液循环能力。
为定量分析巨噬细胞吞噬的纳米粒子荧光强度，采用流式细胞术对各组样品进行测量。从图8(a)中可见，巨噬细胞对纳米粒子的摄取呈时间依赖特性，随时间推移，各组细胞对纳米粒子的摄取量有明显增加。在同一孵育时间下，MM@DiDPMR组的荧光强度弱于DiDPMR组，与图7中的现象一致。对流式得出的荧光强度进行定量分析的结果如图8(b)，在共孵育1h时，DiDPMR组与MM@DiDPMR组的摄取量已有较为显著的差异，在共孵育达3h时，两组间的差异十分显著，说明仿生纳米粒子MM@DiDPMR对巨噬细胞的识别和清除有抑制作用。总体来讲，体外巨噬细胞吞噬实验通过共聚焦显微镜和流式细胞术验证了包覆细胞膜可以减弱巨噬细胞对纳米粒子的清除作用。
(3)体外炎性内皮细胞吞噬
激光共聚焦拍照表征：在加入细胞爬片的24孔板中每孔接种2.5×105个HVEC细胞，37℃，5％CO2条件下培养过夜。随后，正常内皮细胞组换液以控制实验变量，在活化内皮细胞组中换液加入炎症因子TNF-α使其最终浓度为40ng/mL，继续诱导24h使内皮活化。在正常内皮细胞和活化内皮细胞中分别加入100μg DiDPMR或MM@DiDPMR纳米粒子，分别孵育1h，3h。依下述步骤进行后处理：完全移除培养基→PBS轻柔洗3次→4％PFA固定20min→完全移除PFA→PBS轻柔洗3次→DAPI染色15min→完全移除DAPI→PBS轻柔洗3次。取出爬片置于CLSM下观察并拍照。
流式细胞术表征：在6孔板中每孔接种1.2×106个HVEC细胞，依前法处理正常组/活化组细胞后，每孔分别加入100μg DiDPMR或MM@DiDPMR纳米粒子，分别孵育1h，3h。依下述步骤进行后处理：完全移除培养基→无菌PBS轻柔洗3次→胰蛋白酶消化→无菌PBS离心洗2次→于500μL无菌PBS中重悬。上流式细胞仪检测样品的荧光强度。
血管的损伤部位往往伴随着炎症浸润，在炎症因子的诱导下，内皮细胞会表达一系列黏附分子，进而不断招募血液中的单核细胞，这是血管植入支架后再狭窄发生和动脉粥样硬化斑块发展的重要生理进程。本实验中用肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导内皮细胞产生炎症，构建内皮激活模型，进而验证仿生纳米粒子对病理部位的靶向作用。通过激光扫描共聚焦显微镜观察正常内皮和炎性内皮对DiDPMR或MM@DiDPMR荧光纳米粒子的摄取情况，选取共孵育时间为1h和3h两个时间点，结果如图9。对共孵育1h时四组荧光强度进行对比，仅在激活的内皮细胞与MM@DiDPMR共孵育时观察到较强的摄取，激活的内皮细胞对DiDPMR也有摄取但较为微弱，而未激活的内皮细胞对DiDPMR或MM@DiDPMR的摄取几乎难以观测到。在孵育至3h时，组间差异更为明显。可见，激活的内皮细胞相较未激活的内皮细胞，对DiDPMR和MM@DiDPMR的摄取量均有明显提高，同时，激活内皮对MM@DiDPMR的摄取量明显高于DiDPMR。这是由于MM@PMR外部包载了巨噬细胞膜，其上的整合素α4β1和CCR2可以与炎性内皮上高表达的VCAM-1和MCP-1特异性结合，进而实现了对炎性内皮的高效靶向。
为了进一步定量分析各组的荧光摄取情况，用流式细胞术对样品进行分析，相关流式分析图如图10，并统计荧光强度，结果如图11。对图中各组进行对比可发现，激活内皮细胞对于MM@DiDPMR的摄取明显多于正常内皮细胞，这得益于巨噬细胞膜上的整合素α4β1和CCR2与炎性内皮细胞高表达的VCAM-1和MCP-1的特异性结合，加速了细胞对荧光纳米粒子的摄取。从图中可观察到，激活后的内皮细胞相较未激活的内皮细胞，对两种纳米粒子的摄取量均处于较高的水平，这可能是因为炎性环境下高水平的ROS加速了载体材料的降解，加速了内部荧光分子的释放。从图11中还可见，无论内皮细胞是否被激活，在相同孵育时间下，对于荧光纳米粒子MM@DiDPMR的摄取量均略高于DiDPMR，这是因为细胞膜结构加速了细胞的摄取融合。
综上，通过共聚焦显微镜拍照和流式细胞术证明了合成的MM@DiDPMR对于炎性内皮细胞具有较好的靶向作用，说明实验合成的仿生纳米粒子在体内实验中也具有良好的应用潜力。
(4)体外平滑肌细胞增殖抑制
在96孔板中每孔接种2×103个HVSMC细胞，于37℃，5％CO2条件下培养24h。换无血清培养基饥饿处理2h后，将等RAPA当量的裸RAPA、PMR、MM@PMR用完全培养基分别配成0.5、1、5、10μg/mL浓度后换液加入，继续培养24h后移除培养液，用PBS轻柔清洗3次后每孔换液加入100μL MTS工作液(新鲜1640：MTS＝10：1)，避光孵育40min后，上酶标仪在490nm波长下检测各孔的吸光度。依下述公式计算细胞活力：
Figure BDA0003293220710000111
CV：细胞活力
A：实验组吸光度(具有细胞、MTS和药物溶液)
N：阴性对照组吸光度(具有培养基和MTS溶液而没有细胞)
P：阳性对照组吸光度(具有细胞、MTS溶液而没有药物溶液)
血管损伤再狭窄的主要原因是中膜内的VSMCs跨越弹力板迁移至血管腔内，逐渐堵塞管腔。因此，验证MM@PMR在体外环境下对VSMCs的活力抑制情况十分有必要。实验中设置了RAPA、PMR、MM@PMR三个实验组及阴性、阳性对照组，根据阴性、阳性对照组将实验组的细胞活力归一化在0到100％间，结果如图12所示。可见，随着浓度的升高，三个组对VSMCs的活力抑制均展现出剂量依赖效应。在同一浓度下对三个实验组进行对比，发现裸RAPA的抑制效果最强，原因可能是裸药组可以使药物直接与细胞进行接触，而其他两组存在药物从纳米粒子中释放的过程。MM@PMR组较PMR组的抑制效果较强可能是因为细胞膜的流动性加速了VSMCs对MM@PMR的摄取。虽然此实验中裸药组表现出最好的效果，然而在生物体内，裸药不仅面临着溶解度低的问题还会因其异源性被自身免疫系统高效清除，具备免疫逃逸特性的MM@PMR可能更有优势。
(5)细胞划痕实验
在6孔板中每孔接种5×105个HVSMC细胞，37℃，5％CO2条件下培养至融合率达100％。用10μL枪头力道均匀地在孔中划间距为1cm的三道横线和一道竖线，用PBS轻柔洗2次以去除划下的细胞。加入无血清培养基饥饿处理1h后，将RAPA、PMR、MM@PMR用低血清培养基(0.2％FBS)配成RAPA等当量且浓度为2.5μg/mL的溶液，换液加入后继续培养，在第0、6、12、24h时在显微镜下观察细胞的迁移情况并拍照。用软件对划痕区域面积进行测量统计，计算各组在不同时间点下的迁移率并进行统计分析。迁移率计算依下述公式：
Figure BDA0003293220710000112
MR：迁移率
S0：0h时的划痕面积
S1：6、12、24h时各组的划痕面积
通过细胞划痕实验验证RAPA、PMR、MM@PMR对VSMCs迁移的影响，拍照结果如图13。从图13中结果可见，添加药物或纳米粒子后，VSMCs的迁移幅度较空白组均有减小。从统计图14中可见，三个实验组中，裸RAPA组对细胞迁移的抑制作用最为明显，其次是MM@PMR组，而PMR组的迁移率虽在数值上小于空白组，但是无显著性差异。本实验选取的RAPA等当量浓度为2.5μg/mL，小于RAPA的最大溶解度，故药物可以在培养液中充分溶解。裸RAPA组因为可以使药物与细胞最大限度地直接接触，显示出对细胞迁移最强的抑制效果。MM@PMR组较好的抑制效果可能得益于膜的流动性加速了VSMCs对MM@PMR的摄取。
(6)溶血实验
从健康新西兰大白兔耳中动脉取血4mL，加入PBS溶解的EDTA以抗凝兔血。将4mL抗凝兔血与5mL生理盐水混合得到稀释抗凝兔血。设置超纯水(阳性对照)、5％葡萄糖水溶液(阴性对照)、PMR(1mg/mL)、MM@PMR(1mg/mL)四组，设置体积为2mL，每组3个重复。将各样品置于37℃恒温水浴锅中预热30min。随后，每个样品中加入40μL稀释抗凝兔血，37℃水浴1h。在1500rpm下离心5min后小心吸取上清液，于紫外分光光度计下(检测波长545nm)测量各组上清的吸光度。计算公式如下：
Figure BDA0003293220710000121
HR：实验样品的溶血率
A：实验样品组吸光度
N：阴性对照组吸光度
P：阳性样品组吸光度
溶血作用是判断生物材料与血液相容性的重要评价指标。为了验证本实验中制备的纳米粒子的生物相容性，参照国家药品监督管理局发布的标准“血作用是判断生物材料与血液相容性的，采用体外直接接触法对PMR及MM@PMR的溶血性能进行检测。如图15(a)中所示，超纯水构建的阳性对照组里红细胞完全涨破，而5％葡萄糖溶液的阴性对照组和两个实验组中的红细胞离心后均富集于离心管底且从上清中未观察到肉眼可见的溶血现象发生。为定量测试各样品的溶血情况，收集离心后各组的上清于紫外分光光度计波长545nm处测量各样品的吸光度并计算溶血率如表4.1。可见，PMR组和MM@PMR组的溶血率分别为4.47％和1.05％，均满足国标里对于溶血率小于5％的要求，表明实验中合成的仿生纳米粒子具有良好的血液相容性。
表4.1 PMR和MM@PMR的溶血率(n＝3)
Table 4.1.Hemolysis ratio of the PMR and MM@PMR(n＝3)
Figure BDA0003293220710000122
Figure BDA0003293220710000131
(7)载体PCM、PCM@MM对内皮细胞的毒性评价
将100mg PCM溶于100μL DMF中，逐滴加入5mL高速旋转的超纯水中。随后将产物置于500Da的透析袋中透析12h，获得PCM纳米粒子分散液。依前述方法通过共挤出使巨噬细胞膜包覆于PCM上，获得MM@PCM。
在96孔板中每孔接种2×104个HVEC细胞，37℃，5％CO2条件下培养至细胞融合率达100％。换无血清培养基饥饿处理2h后，将PCM和MM@PCM用无血清培养基分别配成50、100、250、500μg/mL浓度后换液加入，继续培养48h后移除培养液，用PBS轻柔清洗3次后每孔换液加入100μL MTS工作液(新鲜1640：MTS＝10：1)，避光孵育40min后，上酶标仪在490nm波长下检测各孔吸光度。依公式4.1计算细胞活力。
为保证合成纳米粒子时引入的载体对于血管内环境安全无害，选取血管内皮细胞为模式细胞，验证载体PCM和MM@PCM的内皮毒性。设定实验组中等当量PCM浓度为50、100、250、500μg/mL，与内皮细胞共孵育48h后测试各孔细胞活力，依前述实验方法计算得细胞活性如图16。可见，PCM和MM@PCM对内皮细胞的活力影响无显著性差异，在载体浓度达到500μg/mL时，两组的细胞活力仍处于80％以上，说明合成的纳米载体具有较好的内皮生物相容性。在载体浓度达到500μg/mL时，对应的药物浓度可达50μg/mL以上，与RAPA 2.6μg/mL的溶解度相比，溶解度增加了19倍，能显著增溶药物。
(8)载体PCM、PCM@MM对斑马鱼胚胎的毒性评价
依3.3.7中方法制备PCM和MM@PCM载体纳米粒子。将PCM和MM@PCM分别溶于小鱼水中，分别配成等当量PCM浓度为10、50、100、250、500μg/mL的溶液。选取12hpf(受精后12小时)的健康AB野生型斑马鱼胚胎于12孔板中，每孔10枚，每组设置3个重复。将斑马鱼胚胎与不同浓度的载体纳米粒子混合，每24h更换一次新鲜的培养液，分别于24hpf、48hpf和72hpf用体式显微镜观察胚胎的存活情况、幼鱼的生长和畸形情况并拍照。
因斑马鱼基因组与人类基因组具有较高的同源性，斑马鱼胚胎发育毒性实验已成为验证生物材料毒性的重要评价实验。本实验中选取AB野生型斑马鱼作为模式动物，观察斑马鱼胚胎在等当量PCM浓度为50、100、250、500μg/mL的纳米载体分散液中的孵化情况和幼鱼的生长和畸形情况。于24hpf、48hpf和72hpf时在体式显微镜下拍照，结果如图17所示。可见，PMR组和MM@PMR组的幼鱼孵化率均达到了100％且未观察到幼鱼有身体畸形的情况出现，说明实验中合成的纳米载体具有良好的体内生物相容性。
主要结论如下：
①通过体外巨噬细胞吞噬实验证实了仿生纳米粒子MM@DiDPMR可以降低巨噬细胞对其的摄取，表明巨噬细胞的包被可以使纳米粒子实现“免疫逃逸”。
②通过体外炎性内皮细胞吞噬实验证实了与正常内皮细胞相比炎性内皮对MM@DiDPMR的摄取作用更强，说明巨噬细胞包被后纳米粒子对病理部位有较好的靶向作用，MM@PMR有良好的体内应用潜力。
③通过平滑肌增殖抑制实验和细胞划痕实验证实了仿生纳米粒子MM@PMR对于血管平滑肌的增殖和迁移有显著的抑制作用，证明MM@PMR对遏制AS和血管再狭窄的病情进展有应用的价值和潜力。
④通过溶血实验证实了MM@PMR有良好的血液相容性。在等当量RAPA浓度为1mg/mL时，MM@PMR的溶血率为1.05％，低于国标要求的5％，说明仿生纳米粒子可以安全地用于体内的药物递送。
⑤为保证实验引入的载体具有良好的生物相容性，采用两个实验对载体PCM和MM@PCM的毒性进行验证。通过MTS法验证内皮毒性，结果显示在与两种纳米载体共孵育48h后，两个组的内皮细胞活性均可达80％以上，且二者间无显著性差异，说明在PCM等当量浓度小于500μg/mL，引入的载体未表现出明显的内皮毒性；将两种载体在斑马鱼胚胎12hpf时加入共培养，发现在载体PCM等当量浓度小于500μg/mL，胚胎孵化率达100％且幼鱼未见畸形，显示良好的生物相容性，满足临床用药需求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.制备具有ROS响应的两亲性载体PCM的方法，其特征在于，步骤如下：
Figure FDA0003293220700000011
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBAP和CDI的摩尔比为1：2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述PBAP-CDI、甘露糖和DMAP溶解透析制得载体PCM；所述PBAP-CDI，甘露糖和DMAP的摩尔比为3：1：3。
4.仿生纳米粒子MM@PMR的制备方法，其特征在于，制备过程如下，
(1)利用权利要求1所述的方法制备得到的PCM和RAPA溶解透析得到所述PMR纳米粒子；
(2)提取巨噬细胞膜；
(3)将巨噬细胞膜包被所述PMR纳米粒子制得仿生纳米粒子MM@PMR。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述PCM和RAPA的质量比为10：1。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中用孔径为200nm脂质体挤出器将巨噬细胞膜和PMR纳米粒子共混挤出制得生纳米粒子MM@PMR。
7.一种仿生纳米粒子MM@PMR，其特征在于，巨噬细胞膜包裹PMR，所述PMR是粒径为40-55nm的球状，所述巨噬细胞膜的厚度为5nm。
8.根据权利要求7所述的仿生纳米粒子MM@PMR，其特征在于，水合状态下，所述PMR的粒径为109.4±5.3nm，所述巨噬细胞膜的厚度为20±0.5nm。
9.根据权利要求7所述的仿生纳米粒子MM@PMR，其特征在于，所述巨噬细胞膜包括CCR2蛋白，整合素α4β1和CD47。
10.权利要求7-9任一所述的仿生纳米粒子MM@PMR在制备抑制损伤血管内膜增生的药物中的应用。
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