CN108186603A - 一种用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统。其成分包括磁性介孔二氧化硅纳米微球，siRNA药物和靶向抗体。循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTCs)作为一种代表原发肿瘤的“液态活检标本”，有助于实时、无创性地进行组织学鉴定。本发明基于在磁性介孔二氧化硅纳米(FE3O4‑MSNs)微球中载入siRNA药物，并经过修饰能够识别和结合循环肿瘤细胞表面生物标记物的靶向抗体(CD133和EPCAM双抗体修饰)，最后开发出一种全新的FE3O4‑MSNs_siRNA@CD133‑EPCAM共载体系，该体系可以初步实现对循环肿瘤的靶向捕获及抑制。

Description

一种用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送 系统

技术领域

本发明涉及生物细胞学领域，尤其涉及一种用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统。

背景技术

循环肿瘤细胞是肿瘤发生远处转移的必经之路，在外周血中有肿瘤细胞预示着有转移潜力肿瘤的发生，良性肿瘤细胞不会进入外周血。因此，针对循环肿瘤细胞的检测和抑制可以在癌症早期进行治疗。用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统，利用经过修饰的磁性纳米可特异性结合循环肿瘤细胞，在癌症发生早期识别循环肿瘤细胞。另外，目前大部分的化疗药物把实体肿瘤作为靶向治疗的一个靶标，但是化疗药物不能区分恶性肿瘤细胞和正常细胞，因此在杀死癌细胞的同时，也会大量杀死人体正常的细胞，造成骨髓细胞、肝细胞和其他具备较强更新能力细胞的死亡。特异性的靶向并下调癌症基因成为癌症治疗的新挑战。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是真核生物细胞与生俱来的一种高度保守、高精确度的序列特异的靶基因沉默调控方式，从理论上来讲，RNA i技术可以干扰任何一个与病理相关的基因表达。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统，该系统由磁性介孔二氧化硅纳米(FE3O4-MSNs)微球，siRNA药物和靶向抗体组成。

本发明所述的磁性介孔二氧化硅纳米(FE3O4-MSNs)微球其孔道大小可调整，比表面积高，修饰性良好，适合作为新型生物医药(包括化疗药物、蛋白质药物和核酸等)的缓释载体。

本发明所述的siRNA药物作为一种新型的癌症治疗策略，可抑制和干扰癌症相关的基因表达。本发明所述的siRNA药物包括但不限于：1.上皮特异性基因：干扰EPCAM基因表达的siRNA药物，干扰Cytokeratin7,8,18,19,20基因表达的siRNA药物，干扰HEA基因表达的siRNA药物。2.肿瘤特异性基因：用于肺癌治疗的AKt1/WTI/H1299/EZH2/VEGF基因表达的siRNA药物，用于卵巢癌治疗的MDR-1/BCL-2/EphA2/STAT3/FAK/VEGF基因表达的siRNA药物，用于肝癌治疗的HBV/VEGF基因表达的siRNA药物，用于乳腺癌治疗的MDR-1基因表达的siRNA药物，用于宫颈癌治疗的E6/E7基因表达的siRNA药物，用于前列腺癌治疗的cofilin-1/HSP27基因表达的siRNA药物。

本发明所述的耦联靶向抗体由上皮细胞粘附分子EPCAM和CD133抗体组成。

本发明所述的中心材料和表面抗体的链接方式为共价链接方式进行。所用的中间连接体为氨基化PEG，羧基化PEG或者氨基羧基化PEG。

本发明所述的siRNA药物装载进入中心材料孔道的方式为强疏水作用或静电作用方式。

本发明所述的中心材料表面反应官能团为氨基，羧基或者巯基。

本发明为一种用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统，由中心纳米材料磁性介孔二氧化硅纳米(FE3O4-MSNs)微球，siRNA药物和靶向抗体组成。磁性介孔二氧化硅纳米(FE3O4-MSNs)由于其孔道大小可调整，高比表面积，易修饰性以及良好的生物相容性，可以作为十分理想的药物输送载体。外围耦联部分由上皮细胞粘附分子EPCAM和CD133双抗体组成，实验表明，采用双抗体捕获循环肿瘤细胞的效率要显著高于单抗体捕获。中心纳米材料的孔道内可以根据癌症种类的不同负载不同的肿瘤特异性基因siRNA药物，也可以负载肿瘤细胞共有的特异性siRNA药物。该系统可以通过靶向抗体在癌症细胞转移初期捕获循环肿瘤细胞，释放孔道中心siRNA药物，通过干扰癌细胞的mRNA转录水平和蛋白质表达水平，有效地抑制癌症基因的表达，最终控制肿瘤生长。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明的目的在于避免了传统的实体肿瘤为靶标的靶向化学药物治疗过程中对人体大量的正常细胞的伤害，提供了一种新型的以循环肿瘤细胞为靶标的RNA干扰治疗策略。不仅能够在癌症发生的早期进行有效的干预治疗，而且siRNA药物的应用也可以实现对肿瘤细胞实现更加精准的治疗效果。

附图说明：

图1为本发明实施例中FE3O4-MSN的TEM图像。

图2为本发明实施例中FE3O4-MSNs_siRNA@CD133-EPCAM共载体系与循环肿瘤干细胞结合共聚焦图片。

图3为本发明实施例中FE3O4-MSNs的XRD图谱。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。

实施例：

本发明实施例提供了一种用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统，该系统由磁性介孔二氧化硅纳米(FE3O4-MSNs)微球，siRNA药物和靶向抗体组成。

磁性介孔二氧化硅纳米(FE3O4-MSNs)微球其孔道大小可调整，比表面积高，修饰性良好，适合作为新型生物医药(包括化疗药物、蛋白质药物和核酸等)的缓释载体。

siRNA药物作为一种新型的癌症治疗策略，可抑制和干扰癌症相关的基因表达。siRNA药物包括但不限于：1.上皮特异性基因：干扰EPCAM基因表达的siRNA药物，干扰Cytokeratin7,8,18,19,20基因表达的siRNA药物，干扰HEA基因表达的siRNA药物。2.肿瘤特异性基因：用于肺癌治疗的AKt1/WTI/H1299/EZH2/VEGF基因表达的siRNA药物，用于卵巢癌治疗的MDR-1/BCL-2/EphA2/STAT3/FAK/VEGF基因表达的siRNA药物，用于肝癌治疗的HBV/VEGF基因表达的siRNA药物，用于乳腺癌治疗的MDR-1基因表达的siRNA药物，用于宫颈癌治疗的E6/E7基因表达的siRNA药物，用于前列腺癌治疗的cofilin-1/HSP27基因表达的siRNA药物。

耦联靶向抗体由上皮细胞粘附分子EPCAM和CD133抗体组成。

中心材料和表面抗体的链接方式为共价链接方式进行。所用的中间连接体为氨基化PEG，羧基化PEG或者氨基羧基化PEG。

siRNA药物装载进入中心材料孔道的方式为强疏水作用或静电作用方式。

中心材料表面反应官能团为氨基，羧基或者巯基。

本发明为一种用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统，由中心纳米材料磁性介孔二氧化硅纳米(FE3O4-MSNs)微球，siRNA药物和靶向抗体组成。磁性介孔二氧化硅纳米(FE3O4-MSNs)由于其孔道大小可调整，高比表面积，易修饰性以及良好的生物相容性，可以作为十分理想的药物输送载体。外围耦联部分由上皮细胞粘附分子EPCAM和CD133双抗体组成，实验表明，采用双抗体捕获循环肿瘤细胞的效率要显著高于单抗体捕获。中心纳米材料的孔道内可以根据癌症种类的不同负载不同的肿瘤特异性基因siRNA药物，也可以负载肿瘤细胞共有的特异性siRNA药物。该系统可以通过靶向抗体在癌症细胞转移初期捕获循环肿瘤细胞，释放孔道中心siRNA药物，通过干扰癌细胞的mRNA转录水平和蛋白质表达水平，有效地抑制癌症基因的表达，最终控制肿瘤生长。

本发明用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统制备方法，包括以下步骤：

称取一定量的CTAB溶于去离子水中溶于去离子水中，加入0.3g乙酸钠、适量醇和乙酸钠、适量醇和乙酸钠、适量醇和1mol·L-1的氢氧化钠，搅拌升温到一定度至溶液澄清透明在下滴加适量TEOS，恒温高速搅拌2h，随后用适量水和乙醇溶液反复多次离心洗涤、室温下干燥。称取量干燥后的粉末悬于浓盐酸-乙醇混合液(5∶90)中85℃回流24h，继续用适量水和，继续用适量水和乙醇溶液反复多次离心洗涤去除表面活性剂，终产物于100℃真空干燥8h，即得球形介孔二氧化硅纳米颗粒。

磁性Fe3O4纳米微球的制备其基本过程是：称取2.35g的FeS04·(NH4)2S04·6H20，溶解在40mL的去离子水中，配制成Fe2+前躯体溶液待用。称量0.2g的NaOH置于100mL的圆底烧瓶中，同时加入20mL的油酸和20mL的无水乙醇，然后在室温下搅拌至均匀的乳白色溶液。然后倒入Fe2+前躯体溶液，不停地搅拌直到溶液呈黑色。最后将反应液移至100mL的反应釜中，放人烘箱中，在180℃温度下反应10h。待反应结束后，将反应釜中的溶液倒入到烧杯中，然后向烧杯中加入20mL的正己烷和20mL的无水乙醇，静置片刻，待溶液分层，吸出上层黑色的液体储存备用。

FE3O4-MSNs纳米微球的制备其基本过程是：将0.6mgFe3O4纳米颗粒分散在0.74mL氯仿中，随后加入5mL含0.15gCTAB的水溶液，充分搅拌后得到均一的水包油乳液，随后将溶液在70℃搅拌10分钟，去除多余的氯仿，得到水相分散的Fe3O4纳米颗粒。同时，将APTES与FITC以10:1的比例在0.5mL乙醇中避光反应2小时，使得FITC连接到APTES上。将Fe3O4纳米颗粒加入到45mL去离子水中，随后依次加0.3mLNaOH溶液(2M)、0.5mLTEOS、0.5mLFITC-APTES、3mL乙酸乙酯。将得到的混合物在70℃条件下以600rpm的搅拌速度搅拌3小时，随后将产物离心，乙醇和水洗涤5次。最后，将洗涤后的纳米颗粒用NH4NO3的乙醇溶液超声1小时去除模板剂CTAB，并重复三次，得到FITC标记的FE3O4-MSN。制备出来的FE3O4-MSNs的TEM图像如图1所示。XRD图谱如图3所示。

FE3O4-MSNs_siRNA的制备其基本过程是：在1.5mL离心管中加2mg/mL的FE3O4-MSN颗粒100μL，12000rpm离心后用42μL的无水乙醇重悬。向42μL的颗粒无水乙醇重悬中加入8μL含有4MGuan-HCl溶液，涡旋振荡，然后加入10μL的siRNA(1mg/mL)，涡旋振荡，室温静置1h。接着用13500rpm离心，弃上清，用无水乙醇清洗一次后用100μL无水乙醇重悬，此时的颗粒状态记为FE3O4-MSN_siRNA。

FE3O4-MSN_siRNA@CD133-EPCAM共载体系的制备其基本过程是：生物素化的的EpCAM和CDl33溶于5ml DMSO，加入400mg NH2-PEG-NH2(平均分子量2000)于磁力搅拌器，室温反应24h。将所得的溶液用20ml去离子水稀释，离心洗涤三次。然后将上清液渗析纯化，冷冻干燥到NH2-PEG-CD133-EPCAM。上述反应均避光进行。FE3O4-MSN_siRNA在酸性条件下(9MOL·L-1浓硫酸)回流水解24h，水洗离心纯化三次，冷冻干燥，即得FE3O4-MSN/COOH产物。取冻干FE3O4-MSN/COOH60mg，分散于2-(N-吗啡啉)乙磺酸(IVIES)缓冲溶液，加入EDAC(60mg)和NHS(30mg)反应1h，活化纳米粒表面羧基。将活化后的纳米粒离心，除去过量的EDAC/NHS和水溶性异脲副产物，重新分散于10mlPBS缓冲液，加入40mgNH-PEG-CD133-EPCAM，磁力搅拌下反应24h。反应产物用PBS缓冲液洗涤离心三次，以除去未结合的PEG，冷冻干燥得到最终产物(FE3O4-MSN_siRNA@CD133-EPCAM)。上述反应均避光进行。制备出的FE3O4-MSN_siRNA@CD133-EPCAM共载体系与循环肿瘤干细胞结合工共聚焦图片如图2所示。

实验可知，循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTCs)作为一种代表原发肿瘤的“液态活检标本”，有助于实时、无创性地进行组织学鉴定。本发明基于在磁性介孔二氧化硅纳米(FE3O4-MSNs)微球中载入siRNA药物，并经过修饰能够识别和结合循环肿瘤细胞表面生物标记物的靶向抗体(CD133和EPCAM双抗体修饰)，最后开发出一种全新的FE3O4-MSNs_siRNA@CD133-EPCAM共载体系，该体系可以初步实现对循环肿瘤的靶向捕获及抑制。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (6)

1.一种用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统，其特征在于，其成分包括磁性介孔二氧化硅纳米微球，siRNA药物和靶向抗体。

2.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统，其特征在于，所述的siRNA药物包括上皮特异性基因、肿瘤特异性基因的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统，其特征在于，所述的靶向抗体由上皮细胞粘附分子EPCAM和CD133抗体组成。

4.根据权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统，其特征在于，所述循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统的中心材料和表面抗体的链接方式为共价链接方式进行。

5.根据权利要求4所述的用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统，其特征在于，所述的共价链接方式中间连接体为氨基化PEG，羧基化PEG或者氨基羧基化PEG。

6.根据权利要求4所述的用于循环肿瘤细胞捕获及治疗的二氧化硅纳米材料递送系统，所述的中心材料表面反应官能团为氨基，羧基或者巯基。