DE4305063A1 - Rezeptorderivate - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt Rezeptorderivate, die aus der Rezeptorfamilie, die Bindungsstellen für humane Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" aufweisen, abgeleitet sind, ihre Verwendung sowie für die Rezeptorderivate kodierende DNA.

Humane Rhinoviren repräsentieren eine große Gattung innerhalb der Familie der Picornaviren und schließen etwa 115 verschiedene Serotypen ein (Melnick, J. L. (1980) Prog. Med. Virol. 26, 214-232). Diese RNA-Viren befallen den Respirationstrakt des Menschen und verursachen akute Infektionen, die zu Erkältungskrankheiten führen.

Die humanen Rhinoviren können in zwei Gruppen unterteilt werden, wenn als Kriterium der Zuordnung die Kompetition um Bindungsstellen an der Oberfläche humaner Zell­ kultur-Zellen, wie z. B. HeLa-Zellen, herangezogen wird. Diese Experimente zeigen, daß - bis auf eine einzige Ausnahme (Serotyp 87) - zwei voneinander verschiedene Rezeptoren an der Zelloberfläche existieren. Bisher konnten 91 Serotypen der "großen Rhinovirus-Rezeptor­ gruppe" und 10 Serotypen der "kleinen Rhinovirus-Re­ zeptorgruppe" zugeordnet werden (Abraham und Colonno R.J. (1984) J. Virol. 51, 340-345; Uncapher et al. (1991) Virology 180, 814-817).

Der Rezeptor der "großen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" wurde gereinigt und als ICAM-1 identifiziert, einem zur Immunglobulinsuperfamilie zugehörigen Protein, das als Zelladhäsionsmolekül fungiert (Tomassini et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 4907-4911; Staunton et al. (1989) Cell 56, 849-853; Greve et al. (1989) Cell 56, 839-847). Durch den Nachweis einer spezifischen Bindung des gereinigten ICAM-1 an das Virus und durch die Fähigkeit durch Gentransfer die Rhinovirus-Bindungsaktivität auf Zellen zu übertragen, die vor dem Transfer keine entsprechende Aktivität besaßen, konnte eindeutig nachgewiesen werden, daß ICAM-1 der Rezeptor für die Mehrzahl der Rhinoviren ist (Greve et al. (1989) loc. cit.; Staunton et al. (1989) loc. cit). Außerdem konnte gezeigt werden, daß monoklonale Antikörper gegen ICAM-1 die Bindung und Infektion von HeLa-Zellen durch Rhinoviren verhindern (Staunton et al. (1989), loc. cit.). Weiterhin können monoklonale Antikörper, die die Bindung von ICAM-1 zu Leukozyten via LFA-1 ("lymphocyte function associated antigen-1") - einem anderen natürlichen Liganden des ICAM-1 - inhibieren, auch die Rhinovirus-Bindung an den Rezeptor blockieren. Die LFA-1 und Rhinovirus- Bindungsstellen müssen also zumindest benachbart sein. Versuche mit chimären und mutierten ICAM-1-Molekülen zeigten zusätzlich, daß die Bindungsstelle für die Rhinovirus-ICAM-1 Wechselwirkung nicht mit der Bindungsstelle für LFA-1 zusammenfällt (Staunton et al. (1990) Cell 61, 243-254).

Die Rezeptor-Bindungsstelle des menschlichen Rhinovirus Serotyp 14, einem Vertreter der "großen Rhinovirus- Rezeptorgruppe", liegt in einem sogenannten "Canyon", einer Vertiefung der Virusoberfläche (Rossmann et al. (1985) Nature 317, 145-153). Dabei sind die Aminosäuren, die in diesem "Canyon" liegen, relativ stark konserviert, während die Aminosäuren in der Umgebung variabel sind und Bindungsstellen für neutralisierend wirkende Antikörper darstellen. Nach dieser "Canyon-Hypothese" können Viren Mutationen in den hypervariablen Antikörper-Bindungsstellen akzeptieren und so der natürlichen Immunantwort entgehen. Auf diese Weise bleibt eine konstante Rezeptor-Bindungsstelle erhalten, die für Antikörper nicht zugänglich ist (Rossmann und Palmenberg (1988) Virology 164, 373-382).

Soweit bis heute bekannt, vermittelt der Rezeptor der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" die Aufnahme von etwa 10 Serotypen der humanen Rhinoviren in die entsprechenden Wirtszellen. Dieser membranständige Rezeptor wurde durch verschiedene Reinigungsschritte isoliert, wobei die Bindungsaktivität in den verschiedenen Fraktionen mittels eines Filterbindungs-Assays nachgewiesen wurde (Mischak et al. (1988) J. Gen. Virol., 69, 2653-2656). Das scheinbare Molekulargewicht des nativen Rezeptors in Gegenwart von nicht ionischen Detergentien (mittels Gelchromatographie bestimmt) entspricht etwa 450 kD, das der denaturierten Form etwa 120 kD, wobei jedoch auch eine Reihe anderer Formen gefunden wurde (Mischak (1988) loc. cit.). Außerdem stellte sich heraus, daß ein aus dem Zellkulturüberstand von HeLa-Zellen isoliertes Protein die Fähigkeit besitzt, Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" zu binden (Hofer et al. (1992) J. gen. Virol. 73, 627-632).

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß als Rezeptoren für Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezep­ torgruppe" die Mitglieder der LDL ("low density lipoprotein")-Rezeptorfamilie dienen.

Die Identität der Rezeptoren der LDL-Rezeptorfamilie mit den Rezeptoren der Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus- Rezeptorgruppe" erlaubt nun überraschenderweise Polypeptide bereitzustellen, die mindestens eine Bindungsstelle für Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus- Rezeptorgruppe" besitzen sowie die für diese Polypeptide kodierenden DNA-Moleküle.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide selbst werden im folgenden als "funktionelle Derivate" der Rezeptor­ proteine bezeichnet. Ein funktionelles Derivat ist demnach eine Komponente mit der biologischen Aktivität, die im wesentlichen der biologischen Aktivität des nativen Rezeptors der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" entspricht. Diese biologische Aktivität bezieht sich auf das Bindungsvermögen des Rezeptors für Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe". Der Ausdruck "funktionelle Derivate" soll "Varianten" und "chemische Derivate" umfassen. Dabei bezieht sich der Ausdruck Derivat auf jedes Polypeptid, das gemessen am nativen Rezeptorprotein, eine verkleinerte Form darstellt und mindestens eine Bindungsstelle für Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" besitzt. Eine "Variante" umfaßt die Moleküle, die im wesentlichen in Funktion und Struktur vom nativen Rezeptormolekül abgeleitet sind, wie zum Beispiel alle Formen. Demnach beeinhaltet der Ausdruck "Variante" Moleküle, die Rhinoviren der "kleinen Rhinoviren-Rezeptorgruppe" binden können, aber z. B. eine veränderte Aminosäuresequenz besitzen.

Ein "chemisches Derivat" schließt zusätzliche chemische Gruppen ein, die normalerweise nicht Teil dieses Moleküls sind. Diese Gruppen können die Moleküllöslichkeit, die Absorption, die biologische Halbwertszeit usw. verbessern oder alternativ die Toxizität oder unerwünschte Nebeneffekte verringern. Gruppen, die solche Effekte vermitteln, sind bekannt (Remington′s Pharmaceutical Sciences (1980)).

Die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Rezeptorderivate bzw. die nach Modifizierung erhaltenen chemischen Derivate kann mit aus dem Stand der Technik bekannten Methoden überprüft werden, zum Beispiel mit dem von Mischak et al. beschriebenen Filter-Bindungs-Assay (Mischak et al. (1988) J. Gen. Virol. 69, 2653-2656 und Mischak et al. (1988) Virology 163, 19-25): Dabei kann das Polypeptid auf eine geeignete Membran, zum Beispiel Nitrocellulose, aufgetragen werden. Zur Blockierung unspezifischer Bindung wird anschließend mit einem Detergentiengemisch abgesättigt. Die so vorbehandelte Membran wird dann zur Überprüfung der spezifischen Bindung mit markiertem Rhinovirus, zum Beispiel mit ³⁵S-Methionin markiertem HRV2, inkubiert. Nach Waschen und Trocknen der Membran kann dann eine spezifische Bindung mittels Autoradiographie sichtbar gemacht werden.

Ein Aspekt der Erfindung sind die Rezeptorderivate, die in Form extrazellulärer, löslicher Polypeptide von Rezeptor-tragenden Zellen in das Medium abgegeben werden. Das Phänomen der Abgabe eines löslichen Rezeptorderivates ist für viele Rezeptorproteine beschrieben worden, zum Beispiel für den Interleukin-4- und Interleukin-7-Rezeptor (Mosley et al. (1989) Cell 59, 335-348; Goodwin et al. (1990) Cell. 60, 941-951).

Natürlich können lösliche Rezeptorderivate auch durch enzymatische, insbesondere proteolytische oder chemische Abspaltung gebildet werden. Dazu können z. B. Rezeptor-tragende Zellinien eingesetzt werden, die mit Enzymen wie Papain, Trypsin usw. umgesetzt werden. Ist die Aminosäuresequenz des Rezeptormoleküls bekannt, kann der Fachmann natürlich durch Auswahl geeigneter Proteasen gezielt extrazelluläre Derivate herstellen. Das Bindungsvermögen solcher Derivate kann mit dem oben beschriebenen Filterbindungs-Assay überprüft werden, so daß auf diese Weise gezielt verkleinerte Rezeptorderivate, die Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" binden können, hergestellt werden können. Neben einer enzymatischen Abspaltung ist ebenfalls die Abspaltung von extrazellulären Rezeptorbereichen durch chemische Methoden möglich, zum Beispiel durch eine Spaltung mit Bromcyan.

Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist die Bildung von löslichen Derivaten durch enzymatische oder chemische Spaltung von nativen Rezeptormolekülen. Nach Isolierung eines nativen Rezeptorproteins kann zum Beispiel durch eine Umsetzung mit Proteasen oder durch chemische Spaltung (wie oben beschrieben) das native Rezeptorprotein gespalten und der verkleinerte, Rhinoviren-bindende Bereich z. B. durch den Filterbindungs-Assay identifiziert und isoliert werden. Geeignete Proteasen sind aus der jeweiligen Aminosäuresequenz des Rezeptorproteins ableitbar. Für die chemische Spaltungsreaktionen bietet sich auch hier Bromcyan oder auch die Aufspaltung des Rezeptorproteins durch reduktive Behandlung, z. B. mit Dithiothreitol, an.

Überraschenderweise wurde nun festgestellt, daß Proteine der LDL-Rezeptorfamilie Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" binden und internalisieren können. Damit können nun alle Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie herangezogen werden, um Derivate herzustellen, die Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" binden können.

Die LDL-Rezeptorfamilie wird aus drei strukturell verwandten Zelloberflächen-Rezeptoren gebildet, die die Endocytose von Lipoproteinen und anderen Plasmaproteinen bewerkstelligen (Brown et al. (1991) Curr. Opin. Lipidology 2, 65-72). Die Rezeptoren haben folgende gemeinsame Merkmale: Cystein-reiche Repeats, die für die Ligandenbindung verantwortlich sind, Cystein-reiche Repeats des EGF ("epidermal growth factor")-Typs, Y-W-T-D-Repeats, eine einzelne, die Membran überspannende Region und wenigstens ein NPXY-Internalisationssignal (Willnow et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 26172-21180).

Überraschenderweise konnte gezeigt werden, daß alle drei Mitglieder dieser Familie - der LDL-Rezeptor, das α₂MR/LRP (α₂-Macroglobulin-LDL-receptor related protein) und auch das pg330 (Heymann Nephritis antigen gp330) - in der Lage sind, Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" zu binden und zu internalisieren (Beispiele 1 bis 3).

Alle Mitglieder dieser Rezeptorfamilie können damit für die Bildung von funktionellen Derivaten mit Bindungseigenschaften für Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" herangezogen werden. Zum Beispiel kann für die Isolierung von in das Medium abgegebener löslicher LDL-Rezeptorderivate der in Beispiel 4 eingeschlagene Weg verfolgt werden. Hier wird die Reinigung eines in den Zellkulturüberstand abgegebenen Bindungsprotein beschrieben (Hofer et al. (1992) J. Gen. Virol. 73, 627-632). Überraschenderweise stellte sich bei der Sequenzanalyse heraus, daß es sich um ein LDL-Rezeptorderivat handelt (Beispiel 5). Zur Isolierung wird hier das Rezeptorderivat mittels Ionenaustauschchromatographie (anionisch), Affinitätschromatographie (Lens culinaris Lectin und Jacalinagarose) und Ammoniumsulfatfällung gereinigt. Die Bindungsaktivität wurde mittels des Filterbindungs- Assays überprüft (Mischak et al. (1988) 163, 19-25). Diese Herstellungsmethode ist auch auf die beiden anderen Proteine der LDL-Rezeptorfamilie anwendbar.

Die Isolierung der nativen Rezeptorproteine ist bekannt und durch Yamamoto et al. (1984) Cell 39, 27-38; Goldstein et al. (1985) Annu. Rev. Cell Biol. 1, 1-39; Mischak et al. (1988) Virology 163, 19-25; Kowal et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5810-5814 und Willnow et al. (1992) loc. cit.) beschrieben. Die nativen Proteine können dann mittels enzymatischer und chemischer Spaltungen in die funktionellen, löslichen Derivate überführt werden. Da die Aminosäuresequenz des LDL-Rezeptors (Fig. 1), des α₂MR/LRP (Fig. 2) und wenigstens teilweise für das gp330 (Fig. 3) bekannt sind, können proteolytisch wirkende Enzyme oder Chemikalien gezielt ausgewählt werden, um insbesondere den jeweiligen extrazellulären Rezeptorbereich freizusetzen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich deshalb auch auf Polypeptide, die aus den Aminosäuresequenzen des LDL-Rezeptors, α₂MR/LRP und des gp330 abgeleitet sind und insbesondere in ihrer löslichen Form in der Lage sind, Rhinoviren der "kleinen Rhinoviren-Rezeptorgruppe" zu binden. Bevorzugt werden diese Polypeptide aus den Aminosäuresequenzen abgeleitet, die den humanen Proteinen der LDL-Rezeptorfamilie entsprechen, obwohl, wie in den Beispielen 1-3 erwähnt, auch Rezeptoren aus Säugetieren, Vögeln oder Amphibien geeignet sind.

Besonders bevorzugt sind die Polypeptide, die den Domänen 1 und 2 (Fig. 4) der Rezeptorenproteine entsprechen. Polypeptide, die im wesentlichen aus diesen Domänen gebildet werden, können dabei aus dem Kulturüberstand eukaryontischer Zellen gewonnen werden. Ganz besonders bevorzugt sind Polypeptide, die im wesentlichen die Domäne 1 (Fig. 4) umfassen, insbesondere die Aminosäuren 1 bis 322.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können dabei als Dimer, Trimer, Tetramer oder Multimer vorliegen. Die Verfahren zur Herstellung der Rezeptorderivate, enzymatische oder chemische Behandlung der nativen Rezeptormoleküle, Isolierung der durch Zellen freigesetzten Derivate und Verfahren zur rekombinanten Herstellung sind ebenfalls Teil der Erfindung.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind DNA-Moleküle, die für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren. Die DNA-Moleküle sind dem Fachmann durch bekannte Methoden zugänglich. Die Klonierung der entsprechenden cDNA ist für alle drei Mitglieder beschrieben (Yamamoto et al. (1984) loc. cit.; Goldstein et al. (1985) loc. cit.; Pietromonaco et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1811-1815; Herz et al. (1988) loc. cit.). Außerdem können die DNA-Moleküle mit Kenntnis der Aminosäuresequenz auch synthetisch (z. B. nach Edge et al. (1981) 292, 756-762 oder mittels der PCR-Methode hergestellt werden (Sambrook et al., loc. cit.).

Die Erfindung bezieht sich auch auf DNA-Sequenzen, die Modifikationen umfassen, die einfach und durch dem Fachmann bekannte Methoden durch Mutation, Deletionen, Umlagerung oder Addition erhalten werden. Jede DNA- Sequenz, die für ein Polypeptid gemäß der Erfindung kodiert, und die entsprechend degenerierten Formen der DNA-Sequenzen sind eingeschlossen.

Zusätzlich beeinhaltet die Erfindung DNA-Vektoren, die die oben beschriebenen DNA-Sequenzen enthalten. Insbesondere kann es sich dabei um Vektoren handeln, in denen die beschriebenen DNA-Moleküle in funktioneller Weise mit einer Kontrollsequenz verknüpft sind, die die Expression der entsprechenden Polypeptide erlaubt. Dabei handelt es sich bevorzugt um Plasmide, die in Prokaryonten wie E. coli und/oder in eukaryontischen Systemen wie Hefen oder auch Säugetierzellinien replizierbar und/oder exprimierbar sind.

Die Erfindung umfaßt ebenfalls entsprechend transformierte Wirtsorganismen.

Für die Expression in Prokaryonten kommt neben anderen, aus dem Stand der Technik bekannten Organismen, insbesondere E. coli, in Frage. Dabei können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen als Fusionspolypeptide oder als intakte, native Polypeptide exprimiert werden.

Fusionsproteine können vorteilhafterweise in großen Mengen hergestellt werden. Sie sind im allgemeinen stabiler als die nativen Polypeptide und auf einfache Weise zu reinigen. Die Expression dieser Fusionsproteine kann durch normale E. coli DNA-Sequenzen gesteuert werden.

Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen als lacZ-Fusionsgene kloniert und zur Expression gebracht werden. Dem Fachmann stehen dazu eine Vielzahl von Vektorsystemen zur Verfügung, beispielsweise die pUR-Vektorserie (Rüther, U. und Müller-Hill, B. (1983), EMBO J. 2, 1791). Auch der Bakteriophagen Promotor λp_R in Form z. B. der Vektoren pEX-1 bis -3 kann für die Expression großer Mengen an Cro-β-Galaktosidase Fusionsprotein genutzt werden (Stanley, K. K. und Luzio, J. P. (1984) EMBO J. 3, 1429). In analoger Weise ist auch der mit IPTG induzierbare tac-Promotor anwendbar, zum Beispiel in Form der pROK-Vektorserie (CLONTECH Laboratories).

Voraussetzung für die Herstellung intakter, nativer Polypeptide durch E. coli ist die Verwendung eines starken regulierbaren Promotors und einer effektiven Ribosomenbindungsstelle. Als Promotoren können hier beispielsweise der temperatursensitive Bakteriophagen λp_L-Promotor, der mit IPTG induzierbare tac-Promotor oder der T7-Promotor dienen.

Zahlreiche Plasmide mit geeigneten Promotorstrukturen und effizienten Ribosomenbindungsstellen sind beschrieben, wie zum Beispiel pKC30 (λp_L; Shimatake und Rosenberg (1981) Nature 292, 128, pKK173-3 (tac, Amann und Brosius (1985) Gene 40, 183) oder pET-3 (T7-Promotor (Studier und Moffat (1986) J. Mol. Biol. 189, 113).

Eine Vielzahl weiterer Vektorsysteme für die Expression der erfindungsgemäßen DNA in E. coli sind aus dem Stand der Technik bekannt und werden zum Beispiel in Sambrook et al. (1989) "A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press beschrieben.

Geeignete E. coli-Stämme, die spezifisch auf den jeweiligen Expressionsvektor zugeschnitten sind, sind dem Fachmann bekannt (Sambrook et al. (1989), loc. cit.).

Die experimentelle Durchführung der Klonierungs­ experimente, die Expression der Polypeptide in E. coli sowie die Aufarbeitung und Reinigung der Polypeptide sind bekannt und zum Beispiel in Sambrook et al. (1989, loc. cit.) dargestellt.

Neben Prokaryonten können auch eukaryontische Mikroorganismen, wie z. B. Hefe verwendet werden.

Zur Expression in Saccharomyces wird beispielsweise das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al. Natur 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980)) und das Plasmid YEp13 (Bwach et al., Gene 8, 121-133 (1979)) verwendet. Das Plasmid YRp7 enthält das TRPI-Gen, das eine Selektionierungs­ markierung für eine Hefemutante (z. B. ATCC Nr. 44076), die unfähig ist, in tryptophanfreiem Medium zu wachsen, bereitstellt.

Das Vorhandensein des TRP1-Defekts als Charakteristikum des verwendeten Hefestammes stellt dann ein wirksames Hilfsmittel dar, um Transformation nachzuweisen, wenn ohne Tryptophan kultiviert wird. Ähnlich verhält es sich bei dem Plasmid YEp13, das das Hefe-Gen LEU 2, das zur Ergänzung einer LEU-2-minus-Mutante verwendet werden kann, enthält.

Weitere geeignete Markierungsgene für Hefe sind z. B. das URA3- und HIS3-Gen. Vorzugsweise enthalten Hefe-Hybridvektoren weiterhin einen Replikationsstart und ein Markierungsgen für einen bakteriellen Wirt, insbesondere E. coli, damit die Konstruktion und die Klonierung der Hybridvektoren und ihrer Vorstufen in einem bakteriellen Wirt erfolgen kann. Weitere für die Expression in Hefe geeignete Expressionskontroll­ sequenzen sind beispielsweise diejenigen des PHO3- oder PHO5-Gens.

Andere geeignete Promotor-Sequenzen für Hefe-Vektoren beinhalten die 5′-flankierende Region der Gene des ADH I (Ammerer, Methods of Enzymology 101, 192-201 (1983)), 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Kawaski und Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112 (1982)) wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion geeigneter Expressionsplasmide können die mit diesen Genen assoziierten Terminationssequenzen ebenfalls in den Expressions-Vektor am 3′-Ende der zu exprimierenden Sequenz eingesetzt werden, um Polyadenylierung und Termination der mRNA zu ermöglichen.

Andere Promotoren sind die Promotor-Regionen der Gene für Alkohol-Dehydrogenase-2, Isocytochrom C, saure-Phosphatase, und Enzyme, die für den Metabolismus von Maltose und Galaktose verantwortlich sind. Promotoren, die durch den Hefe Mating Typ Locus reguliert werden, beispielsweise Promotoren der Gene BARI, MFα1, STE2, STE3, STE5 können bei temperaturregulierten Systemen durch die Verwendung von temperaturabhängigen sir Mutationen eingesetzt werden (Rhine Ph. D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Generell ist jedoch jeder Vektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, originäre Replikations- und Terminationssequenzen enthält, geeignet. So können auch Hybridvektoren, die der Hefe-2µ-Plasmid-DNA homologe Sequenzen enthalten, verwendet werden. Solche Hybridvektoren werden durch Rekombination innerhalb der Zelle bereits vorhandenen 2µ-Plasmiden einverleibt oder replizieren autonom.

Neben Hefen können natürlich auch andere eukaryontische Systeme zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide dienen. Da für die Expression biologisch aktiver eukaryontischer Proteine mittels rekombinanter DNA oftmals posttranslationale Modifikationen wie Disulfidbrückenbildung, Glykosylierung, Phosphorylierung und/oder Oligomerisierung notwendig sind, bietet sich auch die Expression der erfindungsgemäßen DNA in Säugetierzellinien aber auch in Insektenzellinien an.

Funktionelle Voraussetzungen der entsprechenden Vektorsysteme umfassen vor allem geeignete Promotor-, Terminations- und Polyadenylierungssignale sowie Elemente, die die Replikation und Selektion in Säugetierzellinien ermöglichen. Für die Expression der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle kommen vor allem Vektoren in Frage, die sowohl in Säugetierzellen als auch in Prokaryonten wie E. coli replizierbar sind.

Vektoren, abgeleitet von viralen Systemen wie SV40, Epstein-Barr-Virus usw., sind zum Beispiel pTK2, pSV2-dhfv, pRSV-neo, pKO-neo, pHyg, p205, pHEBo etc. (Sambrook et al. 1989, loc. cit.).

Nach Transformation in geeignete Wirtszellen, z. B. CHO-Zellen, können mit Hilfe selektierbarer Marker (Thymidin-Kinase, Dehydrofolat-Reduktase usw.) entsprechend transformierte Zellen gewonnen und die entsprechenden Polypeptide nach Expression isoliert werden. Die für die Vektoren geeigneten Wirtszellen sind, wie die Techniken zur Transformation (Mikro­ injektion, Elektroparation, Calciumphosphatmethode usw.) bekannt (z. B. Sambrook et al., 1989).

Für die Klonierung entsprechender DNA-Fragmente in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen wird beispielsweise der ausgewählte Vektor mit einer Restriktionsendonuklease geschnitten und, gegebenenfalls nach Modifikation des so gebildeten linearisierten Vektors, eine mit entsprechenden Restriktionsenden versehene Expressionskontrollsequenz eingeführt. Die Expressionskontrollsequenz enthält am 3′-Ende (in Translationsrichtung) die Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuclease, so daß der die Expressionskontrollsequenz bereits enthaltende Vektor mit besagtem Restriktionsenzym verdaut und das mit passenden Enden versehene, erfindungsgemäße DNA-Molekül eingesetzt werden kann. Vorteilhaft ist es, den die Expressionskontrollsequenz bereits enthaltenden Vektor noch mit einer zweiten Restriktionsendonuclease innerhalb der Vektor-DNA zu spalten und in das entstandene Vektor-Fragment das mit den entsprechend richtigen Enden versehene DNA-Molekül einzusetzen. Die dazu notwendigen Arbeitstechniken werden z. B. durch Sambrook et al. (1989 loc. cit.) beschrieben.

Neben den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen umfaßt die Erfindung Verfahren zur Herstellung der beschriebenen Vektoren, insbesondere von Expressionsvektoren. Diese Vektoren sind dadurch gekennzeichnet, daß man in eine mit Restiktionsendonukleasen geschnittene Vektor-DNA, die die beispielhaft beschriebenen Expressions­ kontrollsequenzen enthält, eine mit entsprechenden Enden versehene DNA, die für ein funktionelles Derivat des Rezeptors der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" kodiert, so einfügt, daß die Expressionskontroll­ sequenzen die Expression der eingefügten DNA reguliert.

Neben den DNA-Molekülen umfaßt die Erfindung die Polypeptide, die die oben beschriebenen "funktionellen Derivate" des Rezeptors der "kleinen Rhinovirus- Rezeptorgruppe" darstellen bevorzugt, wenn es sich um lösliche Derivate handelt.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide, die durch Expression rekombinanter DNA oder aus dem nativen Rezeptormolekül erhalten werden, können natürlich auch durch chemische Verfahren derivatisiert werden.

Die Expression des LDL-Rezeptors wird in Beispiel 7 erläutert. Hier findet eine Expression in einem eukaryontischen System statt. Es wird eindeutig gezeigt, daß der zur Expression gebrachte LDL-Rezeptor eine Bindung von radioaktiv markiertem humanem Rhinovirus Serotyp 2 (HRV2) bewirkt (Fig. 5). Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind nun durch Deletion von DNA-Sequenzen im Expressionsplasmid erhältlich. Dazu kann zum Beispiel die Methode von Davis et al. (1987) Nature 326, 760-765, der die Deletion der gesamten EGF Domäne beschreibt, verwendet werden. Weiterhin können lösliche Formen des Rezeptors durch Einführung eines Stop-Codons vor die cytoplasmatische oder Transmembran-Domäne gebildet werden (Yokade et al. (1992) J. Cell. Biol. 117, 39).

Weiterhin umfaßt die Erfindung Hybridzellinien, die monoklonale Antikörper spezifisch gegen eines der erfindungsgemäßen Polypeptide bzw. funktionellen Derivate sezernieren. Diese monoklonalen Antikörper sind in der Lage, die Wirkung der Polypeptide ganz oder teilweise zu neutralisieren oder spezifisch an eines der besagten Polypeptide zu binden. Die monoklonalen Antikörper können dann zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung bzw. zur Reinigung der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden. Die Erfindung schließt natürlich auch Testsysteme ein, die die erwähnten monoklonalen Antikörper enthalten. Das Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper ist dadurch gekennzeichnet, daß Wirtstiere mit einem der Polypeptide immunisiert werden und B-Lymphozyten dieser Wirtstiere mit Myelomzellen fusioniert werden; die die entsprechenden monoklonalen Antikörper ausscheidenden Hybridzellinien können dann subkloniert und kultiviert werden (Harlow, G. und Lane, D.: "Antibodies. A Laboratory Manual" (1988) Cold Spring Harlor Laboratory Press, USA).

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung physiologischer Liganden der LDL-Rezeptorfamilie zur Herstellung von Arzneimitteln zur Inhibition der Bindung von Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe". Beispielsweise inhibiert der natürliche Ligand LDL die Bindung dieser Virusgruppe. (Beispiel 1). Andere natürliche Liganden der LDL-Rezeptorfamilie werden z. B. durch Willnow et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 26172-26180 beschrieben. Auch können natürlich die nativen Rezeptoren der LDL-Rezeptorfamilie, der LDL-Rezeptor, α₂MR/LRP und gp330 wie die erfindungsgemäßen Rezeptorderivate verwendet werden.

Die Erfindung schließt natürlich auch die pharmazeutisch tolerierbaren Salze der erfindungsgemäßen Polypeptide sowie die pharmazeutisch tolerierbaren Addukte und kovalenten Verbindungen zwischen den Polypeptiden und einem inerten Träger zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers ein. Die Addukte bzw. kovalenten Verbindungen können z. B. mit Polyethylenglykol gebildet werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide, natürlichen Liganden der LDL-Rezeptorfamilie, wie z. B. LDL sowie die nativen Rezeptorproteine, können zur Herstellung pharmazeutischer Präparate zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers verwendet werden. Insbesondere können die Polypeptide als kompetitiv wirkende Substanzen zur Inhibierung der Bindung von Viren, insbesondere von Rhinoviren an den nativen Rezeptor und/oder physiologischer LDL-Liganden dienen. Dabei können die Polypeptide und natürlichen Liganden, insbesondere die extrazelluläre, lösliche Form des Rezeptors, vor allem als antivirale, bevorzugt antirhinovirale Mittel eingesetzt werden.

Zur Behandlung viraler Infektionen können die beschriebenen Substanzen z. B. nasal verabreicht werden, wobei eine so große Menge zur Verfügung gestellt wird, die zur Unterdrückung oder kompetitiven Wechselwirkung oder zur Inhibition der Rhinovirusbindung an den natürlichen Rezeptor ausreichend ist. Die Dosis sollte, im allgemeinen, zwischen 0,01 pg/kg Patientengewicht bis 1 mg/kg Patientengewicht liegen, obwohl größere oder kleinere Mengen ebenfalls genügen könnten.

Natürlich kann auch Rhinovirusmaterial der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" zur Inhibition der Bindung physiologischer LDL-Liganden eingesetzt werden. Dieses Rhinovirusmaterial kann z. B. vom humanen Rhinovirus Serotyp 2 (HRV2) abgeleitet sein. Rhinoviren der "großen" und der "kleinen Rhinovirusrezeptorgruppe" sind über die "American Type Culture Collection" erhältlich.

Daneben umfaßt die Erfindung auch Verfahren zur Isolierung von Substanzen, die die Bindung von Liganden an den LDL-Rezeptor inhibieren. Diese Verfahren umfassen die Inkubation des LDL-Rezeptorproteins mit einer potentiell inhibitorisch wirkenden Substanz. Dieses Verfahren kann in Gegenwart von markiertem Rhinovirusmaterial erfolgen. Das Ausmaß der Bindung von markiertem Rhinovirusmaterial ergibt dann Aufschluß über die Wirkung der geprüften Substanz.

Weiterhin umfaßt die Erfindung Verfahren zur Bestimmung von LDL-Rezeptoren, in denen eine Substanz, abgeleitet von Virusmaterial der "kleinen Rhinovirus-Rezeptor­ gruppe" mit Bindungsaktivät zum LDL-Rezeptor markiert, mit einer entsprechenden Probe inkubiert und das Ausmaß der Bindung detektiert wird. Ein weiteres Verfahren dient der Zuführung von therapeutisch wirksamen Substanzen, in dem Virusmaterial der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" mit Bindungsaktivität zum LDL-Rezeptor mit der therapeutischen Substanz gekoppelt wird und das besagte Konjugat zu LDL-Rezeptor tragendem Zellmaterial gegeben wird und durch Bindung und Internalisation die therapeutisch wirksame Substanz in die Zelle eingeführt wird.

Legenden zu den Figuren

Fig. 1: Aminosäuresequenz des "Low Density Lipoprotein Receptors" (LDL, Yamamoto et al. (1984) Cell 31, 27-38).

Fig. 2: Aminosäuresequenz des "Low Density Lipoprotein Receptor Related Proteins" (LRP, Herz et al. (1988) EMBO J. 7, 4119-4127).

Fig. 3: Teil der Aminosäuresequenz des "Heymann Nephritis Antigens gp330 (Pietromonaco et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1811-1815).

Fig. 4: Schematische Darstellung eines Rezeptors der LDL-Rezeptor-Familie (nach Yamamoto et al. (loc. cit.). Der Rezeptor umfaßt fünf Domänen: Die Domäne 1 umfaßt den N-terminalen, cysteinreichen Rezeptorteil, der vermutlich für die Ligandenbindung verantwortlich ist. Die Domäne 2 mit Homologie zum EGF-Vorläuferprotein schließt sich an Domäne 3 an, Aminosäuren zum Teil O-glykosyliert sind. Die Domäne 4 bildet den membranständigen, Domäne 5 den cytoplasmatischen Teil des Rezeptors.

Fig. 5: A) Bindung und Internalisation von markiertem HRV2 an normale humane Fibroblastenzellen beziehungsweise an LDL-Rezeptor defiziente FH Zellen (Beispiel 1).
↑: angezogen ohne Zusatz von Cholesterin /25-Hydroxycholesterin
↓: angezogen mit Zusatz von Cholesterin/ 25-Hydroxycholesterin
B) Kompetition von HRV2 und LDL um die Rezeptorbindungsstelle
+: mit Zusatz von unmarkiertem HRV2 bzw. LDL
-: ohne Zusatz von unmarkiertem HRV2 bzw. LDL.

Fig. 6: Bindung von [³⁵S]- markiertem HRV2 durch α₂MR/LRP und gp330 durch Inkubation von Membranextrakten nach elektrophoretischer Auftrennung und Transfer auf Nitrocellulose (Beispiel 2).
Spur 1: Inkubation von LM-Extrakten mit markiertem HRV2
Spur 2: Inkubation von Rattennieren Mikrovilli-Extrakten mit [³⁵S]- markiertem HRV2
Spur 3: Proteinextrakte wie Spur 1; entwickelt mit einem ^a ₂MR/LRP-Antiserum
Spur 4: Proteinextrakte wie Spur 2; entwickelt mit einem gp330-Antiserum.

Fig. 7: Bindung von [³⁵S]- markiertem HRV2 an LDL-Rezeptor- und α₂MR/LRP-Homologe des Huhns (Beispiel 3).
Spur 1: Membranextrakte von Ovarienfollikeln aus Hühnern nach Elektrophorese, Blotting und Inkubation mit [³⁵S]- markiertem HRV2
Spur 2: Blot wie Spur 1, entwickelt mit einem Antiserum gegen das Hühner-Homologe des Säugetier-LDL-Rezeptors
Spur 3: Blot wie Spur 1, entwickelt mit [⁴⁵Ca]Cl₂.

Fig. 8 stellt die säulenchromatographische Auftrennung der tryptischen Peptide der aus dem HeLa-Zellüberstand gewonnenen, löslichen Form des Rezeptors der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" dar. Die Peptide wurden auf einer µBondapak C18, 250-4 Säule unter folgenden Bedingungen aufgetrennt:
Puffer A: dest. Wasser/0,06% TFA; Puffer B: 80% Acetonitril/0,052% TFA; Flußrate: 0,5 ml/min; Gradient: 2% B bis 37,5% B von 0 bis 60 min, 37,5% B bis 75% B von 60 bis 90 min, 75% B bis 98% B von 90 bis 105 min; Temperatur: Raumtemperatur; Detektion: photometrisch bei 214 nm, 0,08 AUFS (Papiervorschub: 0,25 cm/min).

Fig. 9: Chromatographische Auftrennung der Fraktionen 23 bis 27 unter folgenden Bedingungen:
Säule: Merck Superspher 4 µm, C18, 125-H; Puffer A: dest. Wasser/0,1% TFA; Puffer B: Acetonitril/0,1% TFA; Flußrate: 1 ml/min, linearer Gradient von 0% B auf 70% B in 70 min; Temperatur: 30° C; Detektion: photometrisch bei 214 nm, 0,1 AUFS, Papiervorschub 1 cm/min.

Fig. 10: Rechromatographie von Fraktion 29. Die experimentellen Bedingungen sind in der Legende zu Fig. 9 aufgeführt.

Fig. 11: Rechromatographie von Fraktion 38. Die experimentellen Bedingungen sind in der Legende zu Fig. 9 aufgeführt.

Fig. 12: Sequenzen der analysierten Peptide (siehe auch Fig. 13):
X = Aminosäure nicht identifizierbar;
tiefgestellt = Aminosäure nicht eindeutig identifizierbar.
*: Die Sequenzierung der Fraktion 33 (Abb. 1) ergab pro Abbauschritt 2 Aminosäuren; die Peptide B und E konnten aber aufgrund der unterschiedlichen Mengen zugeordnet werden.

Fig. 13: Sequenz des LDL-Rezeptors (Yamamoto et al. (1984) loc.cit.) und Position der Peptide A-F (siehe auch Fig. 12).

Fig. 14: Inhibition der Bindung von [³⁵S)-markiertem HRV2 an den an Immobilon gebundenen LDL- Rezeptor durch Jacalin.
A) Filterbindungstest in Abwesenheit von Jacalin
B) wie A, aber in Gegenwart von 0,1 mg/ml Jacalin.

Fig. 15: Expression des humanen LDL-Rezeptors in COS-7-Zellen (Beispiel 7).
Nachweis von gebundenem [³⁵S]-HRV2 an
u: untransfektierten COS-7 Zellen
+: transformiert mit dem "sense" (pSVL-LDLR+)- Vektor
-: transformiert mit dem "antisense" (pSVL-LDLR-)-Vektor.

Fig. 16: Sequenzvergleich zur Ermittlung der Positionen im oder am Rand des Canyons, die bei den Rhinoviren der kleinen Gruppe konserviert sind.

Fig. 17: Bindungsverhalten von HRV2_1148P:G und HRV2_3182R:T an HeLa-Zellen
▲HRV2_1148P:G
⚫HRV2-Wildtyp
HRV2_3182R:T

Fig. 18: Kompetition der Bindung von HRV2_1148P:G und HRV2_3182R:T durch HRV14 (∎) oder HRV2 (⚫).

Beispiele Beispiel 1 Bindung und Internalisation von [³⁵S]- markiertem HRV2 durch humane Fibroblasten­ zellen und Kompetition von HRV2 und LDL um die Rezeptorbindungsstelle a) Bindung und Internalisation von HRV2

Normale humane Fibroblastenzellen beziehungsweise LDL Rezeptor defiziente Zellen (FH Zellen; NIH Sammlung Nr. GM 00486A) wurden auf "6 well Platten" (Nunc) in MEM, das 10% delipidiertes fötales Kälberserum (Gibco), entweder mit (↓) oder ohne (↑) Zusatz von 10 µg/ml Cholesterin und 2 µg/ml 25-Hydroxycholesterin, für 24 h angezogen. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, 10 000 cpm [³⁵S]-markiertes HRV2 in 0,5 ml PBS, das 2% BSA und 30 mM MgCl₂ enthielt, zugegeben und für 60 min bei 34°C inkubiert (Mischak et al. (1988) Virology 163, 19-25). Nach Entfernung von oberflächlich gebundenem HRV2 mit 10 µg/ml Trypsin, 25 mM EDTA in PBS wurden die Zellen erneut gewaschen und anschließend die gebundene Radioaktivität bestimmt. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte aus jeweils vier Experimenten. Die Radioaktivitätswerte der Zellpellets aus normalen Fibroblasten (normalerweise etwa 1900 cpm), die ohne Steroide angezogen wurden, minus Hintergrundradioaktivität, wurden gleich 100% gesetzt. Die Hintergrundaktivität wurde entweder mit HRV2, das für 90 min auf 56°C erhitzt worden war (Mischak et al. (1988) loc. cit.) oder durch Inkubation mit einem 1000fachen Überschuß an unmarkiertem HRV2 bestimmt. Sie betrug für beide Methoden zwischen 40 und 50 cpm. Die erhaltenen Daten aus jeweils vier Einzelexperimenten zeigt Fig. 5a.

b) Kompetition von HRV2 und LDL um die Rezeptorbindungs­ stelle

Normale Fibroblastenzellen wurden wie unter a) beschrieben angezogen (ohne Zugabe von Cholesterin und 25-Hydroxy-cholesterin). Die Zellen wurden mit ungefähr 1,4×10⁶ cpm ¹²⁵I-markiertem LDL (250 cpm/ng; Huettinger et al. (1992) J. Biol. Chem., 267, 18551-7) mit (+) und ohne (-) Zugabe von 100 Pfu ("plaque forming units"; entspricht ca. 2400-24 000 Viruspartikel; Abraham & Colonno (1984) J. Virol. 51, 340-345) pro Zelle an gereinigtem, unmarkiertem HRV2 oder mit ca. 10 000 cpm [³⁵S]- markiertem HRV2 mit (+) oder ohne (-) 80 µg/ml unmarkiertem LDL für 60 min bei 37°C inkubiert. Die Zell-assoziierte Radioaktivität wurde mit einem γ- bzw. β-Zähler bestimmt. Die Radioaktivitätswerte für die hochaffine Bindung von ¹²⁵I-LDL wurden durch Substraktion der Radioaktivität, die in Gegenwart eines 20fachen Überschusses von unmarkiertem LDL erhalten wurde (ca. 40 000 cpm/mg an gesamtem Zellprotein), von der gesamten LDL-Bindung (150 000 cpm/mg) ermittelt. Ohne Kompetitor wurde für die HRV2-Bindung normalerweise ein Radioaktivitätswert von 1900 cpm ermittelt. Die maximalen Bindungswerte wurden in jedem Fall gleich 100% gesetzt. Die ermittelten Daten (Fig. 5b) zeigen das Ergebnis von jeweils zwei Einzelexperimenten.

Beispiel 2: Bindung von [³⁵S]-markiertem HRV2 durch α₂M-LRP und gp330

Zum Nachweis der Bindung von Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" an andere Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie wurden Plasma-Membran-Präparationen auf HRV2-Bindung überprüft.

Plasmamembranen wurden aus Maus LM Fibroblasten und Nieren-Epithel-Mikrovilli isoliert (Malathi et al. (1979) Biochem. Biophys. Acta, 554, 259-263; Fornistal et al. (1991) Infect. Immun. 59, 2880-2884, und Kerjaschki und Farquhar (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 5557-5561). Proteine aus den Membranextrakten wurden über eine SDS-Gradienten-Polyacrylamidelektrophorese aufgetrennt und auf Nitrocellulose transferiert.

Die Inkubation der aufgetrennten LM-Extrakte mit [³⁵S]-markiertem HRV2 zeigte eine Bindung an ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 500 kDa (Fig. 6, Spur 1). Diese Bande komigriert mit α₂MR/LRP. Dies konnte durch einen identischen Blot gezeigt werden, der mit α₂MR/LRP-Antiserum (Moestrup und Gliemann (1991) J. Biol. Chem. 266, 14011-14017) entwickelt wurde (Fig. 6; Spur 3).

In Extrakten aus Rattennieren Mikrovilli konnte ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ebenfalls etwa 500 kDa mit radioaktiv markiertem HRV2 nachgewiesen werden (Fig. 6; Spur 2). Nach Analyse mit einem gp330- Antiserum konnte die Bande als Heymann Nephritis Antigen gp330 identifiziert werden (Fig. 6, Spur 4).

Beispiel 3: Bindung von [³⁵S)-markiertem HRV2 an LDL-Rezeptor- und α₂MR/LRP- Homologe des Huhns

Membranextrakte von Ovarienfollikeln aus Hühnern wurden wie in Beispiel 2 beschrieben aufgearbeitet und geblottet (Fig. 7). Spur 1 zeigt das Ergebnis eines Ligandenblots, der mit [³⁵S]-markiertem HRV2 inkubiert wurde. Man beobachtet eine starke Bindung an ein Protein von 95 kDA und in weit geringerem Ausmaß an ein Protein mit etwa 500 kD. Ein identer Blot wurde mit Kaninchen Antiserum gegen das Hühner-Homology des Säugetier-LDL Rezeptors (Vitellogenin/VLDL Rezeptor (VTG/VLDLR), Stifani et al. (1989), J. Biol Chem. 266, 19079-19087) entwickelt (Spur 2). Dieses Antiserum reagiert nicht nur mit dem VTG/VLDLR, sondern auch mit dem Hühner-Homologen des α₂M-Rezeptor/LRPs mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 380 kDa. Ein weiterer Blot wurde mit 1 µCi/ml [⁴⁵Ca]Cl₂ inkubiert (Spur 3). Ca²⁺ bindet sowohl an den VTG/VLDLR als auch an das 380 kDa Protein; zusätzlich werden aber auch die jeweiligen somatischen homologen Proteine mit 120 kDa und 500 kDa erkannt (Stifani et al., loc. cit.). Wie aus Fig. 7 ersichtlich, bindet HRV2 an den VTG/VLDLR aus Ovarfollikeln und an den somatischen α₂;-Rezeptor/LRP des Huhns, der in der verwendeten Follikelmembran-Präparation als Kontamination in geringer Menge vorhanden war. Eine Bindung von Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus- Rezeptorgruppe" wird ebenfalls an amphibische Zellen beobachtet.

Beispiel 4: Reinigung eines Bindungsproteins für die Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus- Rezeptorgruppe"

200 l HeLa-Zellkulturüberstand (Fa. Computer Cell Culture Center, Mons, Belgien) wurde mittels Ultrafiltration auf 20 l konzentriert und gegen 250 l destilliertes Wasser (mit 0,02% NaN₃) dialysiert. Anschließend wurde die Pufferkonzentration auf 20 mM N-Methylpiperazin, pH 4,5, eingestellt, bei 4000 Upm in der Beckman J6B Zentrifuge abzentrifugiert, über ein 0,8 µm Vorfilter filtriert und das Filtrat auf eine Anionenaustauschersäule (0,5 l Makroprep 50 Q; Biorad) geladen. Gebundenes Material wurde mit 20 mM N-Methylpiperazin, pH 4,5, 0,5 M NaCl eluiert. Das Eluat wurde mit 1 M Tris-HCl, pH 8,0, auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt und auf eine Lens culinaris Lectin-Säule (100 ml; Pharmacia) geladen; gebundenes Protein wurde mit 0,5 M α-[D]-Methylglucose in PBS eluiert, das eluierte Protein bei 50% Sättigung mit Ammoniumsulfat, pH 7,2, gefällt, der Niederschlag mit 50% gesättigter Ammoniumsulfatlösung, pH 7,2, gewaschen und in 200 ml PBS aufgenommen. Die Proteinlösung wurde auf eine Jacalinagarosesäule (40 ml; Vector-Labs) geladen und mit 120 ml 100 mM α-[D]-Methyl-Galactopyranosid in PBS eluiert. Das eluierte Protein wurde mit Ammoniumsulfat wie oben beschrieben gefällt, gewaschen, in 20 mM Methylpiperazin, pH 4,5, aufgenommen und mittels einer PD10-Säule (Pharmacia) entsalzt. Das entsalzte Material wurde in 5 Aliquots zu je 1 ml auf eine Mono Q-Anionen­ austauschersäule (HR5/5; Pharmacia) geladen und mit einem Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl, 20 mM Methylpiperazin, pH 4,5, eluiert. 0,5 ml Fraktionen wurden gesammelt und mittels eines Filterbindungs-Assays auf Bindungsaktivität überprüft (Mischak et al., Virology (1988) 163, 19-25). Die aktiven Fraktionen aus allen 5 Chromatographien wurden in einem Centricon 30 (Amicon) auf 1,5 ml eingeengt und mittels präparativer Gelelektrophorese unter nicht reduzierenden Bedingungen auf einem 7.5% Polyacrylamidgel (Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685) aufgetrennt. Das Gel wurde mit Kupferchlorid gefärbt (Lee et al. (1987) Anal. Biochem. 166, 308-312), die dem aktiven Protein entsprechende Bande lokalisiert und ausgeschnitten. Die Gelstücke wurden in 0,25 M Tris-HCl, 0,25 M EDTA, pH 9,0, entfärbt und das Protein in 50 mM N-Ethylmorpholinacetat, pH 8,5, elektrophoretisch eluiert. Ein Aliquot wurde mittels des Filterbindungs-Assays wiederum auf Aktivität überprüft.

Das Protein wurde dann unter reduzierenden Bedingungen gelelektrophoretisch aufgetrennt, eluiert und lyophilisiert.

Beispiel 5: Tryptischer Verdau und Sequenzanalyse

Das gereinigte und lyophilisierte Protein (Beispiel 4) wurde in 30 µl 6 M Guanidin-HCl, 0,4 M Ammonium­ hydrogencarbonat, pH 7,6, aufgenommen und mit 3 µl 45 mM Dithiothreitol versetzt und 15 min bei 56°C inkubiert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 3 µl 100 mM Jodacetamid zugegeben und weitere 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 84 µl Wasser und 80 µl 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat, pH 7,6, zugegeben, die Proteinlösung mit 800 ng Trypsin (in 5 µl) unter den Bedingungen des Herstellers (Promega) versetzt und bei 37°C 18 h inkubiert. Die Lösung wurde mit 1/10 Volumen an 10% Trifluoressigsäure (TFA) angesäuert, 5 min zentrifugiert und die Peptide auf einer C-18 "reversed-phase"-Säule (Baker), die mit einer 0,06% wäßrigen TFA-Lösung äquilibriert worden war, mit einem Gradienten bis 80% Acetonitril, 20% Wasser, 0,052% TFA eluiert (Fig. 8).

Die Fraktionen 20 und 33 wurden direkt mit Hilfe eines Gasphasensequenators sequenziert, während die Fraktionen 23 bis 27 sowie Fraktion 29 und 38 unter den in den Abbildungen spezifizierten Bedingungen rechromatographiert wurden (C18 "reversed-phase"-Säule, Merck; Fig. 9, 10 und 11). Die in den Abbildungen mit "A", "D" und "F" bezeichneten Peptide bzw. die Fraktionen 33 und 20 wurden zur Sequenzierung im Gasphasensequenator ausgewählt. Das Ergebnis ist in Fig. 12 zusammengefaßt. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit den in der "SwissProt"- Datenbank vorhandenen Proteinsequenzen verglichen. Der Vergleich ergab eine völlige Übereinstimmung mit entsprechenden Peptidsequenzen des humanen LDL-Rezeptors (Fig. 13). Die Sequenzierung der Fraktion 33 lieferte pro Abbauschritt zwei Aminosäuren. Unter Zugrundelegung der LDL-Sequenz und dem Verhältnis der in jedem Abbauschritt vorhandenen Aminosäuremengen von etwa 40% zu 60% konnte die Fraktion 33 als Gemisch zweier Peptide identifiziert werden. Auch die Sequenzen dieser beiden Peptide entsprechen Sequenzen des humanen LDL-Rezeptors. Fig. 1 zeigt die Gesamtsequenz des humanen LDL-Rezeptors (Yamamoto et al. (1984) Cell 31, 27-38), wobei die Positionen der identifizierten Peptide angegeben sind.

Beispiel 6: Inhibition der Bindung von [³⁵S]-markiertem Rhinovirus Serotyp 2 (HRV2) durch Jacalin

Zwei Aliquots des bis zur Jacalinagarose-Chromatographie gereinigten Proteins (siehe Beispiel 1, jeweils entsprechend einer Ausgangsmenge Zellüberstands von etwa 50 ml) wurden auf ein 7.5% SDS Polyacrylamidgel (Laemmli, U. K. 1970, Nature 227, 680-685) unter nicht-reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und auf eine Immobilonmembran (Millipore) elektrophoretisch übertragen (Mischak et al., 1988, loc. cit., Hofer et al., 1992, loc. cit.). Eine Spur wurde in Abwesenheit (Fig. 14, Spur A) oder in Gegenwart (Spur B) von 0.1 mg/ml Jacalin (Vector Labs) mit radioaktiv markiertem Rhinovirus (Mischak et al., 1988, loc. cit) inkubiert, gewaschen, getrocknet und auf Röntgenfilm exponiert (Hofer et al., 1992, loc.cit.). Wie in Fig. 14 gezeigt, wird die Bindung des Virus an den LDL-Rezeptor unter den angegebenen Bedingungen vollständig inhibiert.

Beispiel 7: Expression des humanen LDL-Rezeptors in COS-7 Zellen

Das Plasmid pTZ1, welches die gesamte kodierende Sequenz des humanen LDL-Rezeptors aus dem Plasmid pLDLR2 enthält (Yamamoto et al., loc. cit.) wurde mit bekannten Methoden (Sambrook et al., loc. cit.) in kompetente E. coli 5K eingebracht und amplifiziert. Nach Extraktion und Reinigung der Plasmid DNA wurde diese mit dem Restriktionsenzym Hind 111 verdaut und die Fragmente in einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt. Nach Elution des für den LDL-Rezeptor kodierenden Fragmentes wurde dieses mit Ethanol gefällt, in TE-Puffer aufgenommen und mit Klenow-Fragment unter Verwendung von dATP und dGTP partiell aufgefüllt.

Der eukaryotische Expressionsvektor pSVL (Pharmacia) wurde in E. coli 5K vermehrt, gereinigt und mit XbaI geschnitten. Nach partiellem Auffüllen mit dCTP und dTTP, Phenol-Chloroform Extraktion und Ethanolfällung wurde das Plasmid mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.

Durch partielles Auffüllen sowohl der Vektor- als auch der LDL-Rezeptor-DNA wurden die Restriktionsschnitt­ stellen kompatibel gemacht und LDL-Rezeptor kodierende und Vektor-DNA wurden unter Verwendung von T4-Ligase ligiert. Die Transformation kompetenter E. coli Bakterien erfolgte wie beschrieben. Mehrere Kolonien wurden durch Restriktionsverdau mit XhoI auf Orientierung des Inserts bezüglich des SV40 "late promotors" untersucht. Jeweils eine Kolonie mit positiver (sense, pSVL-LDLR+) und negativer (antisense, pSVL-LDLR-) Orientierung des Inserts wurden angezüchtet und Plasmide in größerer Menge gewonnen.

Die Transfektion von COS-7 Zellen (ATCC CRL 1651) wurde mittels Lipofektion (Lipofektin-Reagens, BRL) in 9 cm Petrischalen nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Nach Transfektion wurden die Zellen in 6-well Schalen ausgesät und weitere 24 Stunden in RPMI/10% HiFCS und 12 µg/ml Cholesterin sowie 2 µg/ml 25-Hydroxycholesterin kultiviert. Die Zellen wurden mit PBS/2% BSA gewaschen und danach 1 Stunde bei 34°C mit ca. 10 000 cpm/well [³⁵S]-markiertem HRV2 in PBS/2% BSA inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen wurden die Zellen in PBS/2% SDS lysiert und die Menge an gebundenem [³⁵S]-HRV2 durch Auszählen in einem Liquid Szintillation Counter bestimmt. Der Zusatz von foetalem Kälberserum, Cholesterin sowie 25-Hydroxycholesterin bewirkt eine Unterdrückung der endogenen LDL-Rezeptoren (Davis et al., 1987, Nature 326, 760), so daß im anschließenden Bindungstest ausschließlich die durch Transfektion exprimierten LDL-Rezeptoren detektiert werden. Wie Fig. 15 zeigt, ist die Menge an gebundenem HRV2 im Vergleich zu untransfizierten Kontrollzellen doppelt so hoch, wenn die Zellen mit dem sense-Konstrukt pSVL-LDLR+ transfiziert wurden. Transfektion mit pSVL-LDLR- zeigt keinen Unterschied der Bindung im Vergleich zu Kontrollzellen.

Beispiel 8 Mutationen der HRV2-Rezeptorbindungs­ stelle

Unterschiedliche Rezeptorbindungsstellen der Rhinoviren der "kleinen" und der "großen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" sollten sich ebenfalls in der für die Wechselwirkung mit dem entsprechenden Rezeptor verantwortlichen "Canyon-Struktur" der viralen Kapside widerspiegeln. Als Canyon wird eine Vertiefung um die 5-zählige Symmetrieachse des viralen Kapsids mit einer Ausdehnung von ungefähr 30 A bezeichnet. Eine Hypothese zu der Canyon-Struktur besagt, daß die Aminosäureseitengruppen in dieser Region unzugänglich für Immunglobine und damit keinem immunologischen Druck ausgesetzt sind (Rossmann et al. (1985) Nature 317, 145-154). Die verschiedenen rhinoviralen Serotypen einer Rezeptorgruppe könnten auf diese Weise Strukturen, die für die Wechselwirkung mit dem entsprechenden Rezeptor wichtig sind, konservieren und gleichzeitig eine breite serotypische Diversität entwickeln (Rossmann (1989) Viral Immunology 2, 143-161). Weiterhin beinhaltet die Hypothese, daß Differenzen in der Canyon-Struktur zwischen "großer" und "kleiner Rhinovirus- Rezeptorgruppe" für die Verwendung von zwei unterschiedlichen Rezeptoren verantwortlich sind. Dies würde einen Satz von Aminosäureresten beinhalten, der in bestimmten Positionen der Rhinoviren der "großen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" und einen zweiten Satz, der in bestimmten Positionen der Rhinoviren der "kleinen Rhinoviren-Rezeptorgruppe" konserviert ist.

Fig. 16 zeigt einen Sequenzvergleich zur Ermittlung der Positionen im oder am Rand des Canyons, die bei den Rhinoviren der kleinen Gruppe im Gegensatz zu den Rhinoviren der großen Gruppe konserviert sind. Sie umfassen die basischen Reste an Position 1081 (HRV2-Nummerierung: Blaas et al. (1987) Proteins 2, 263-272) und 3182, Ile oder Leu an Position 3229 und die Sequenz Thr-Glu-Lys (TEK an Position 1222-1224).

Folgende HRV2-Mutanten wurden konstruiert: an Position 1081 (1081K:E) und an 1222-1224 (Ersatz von TEK durch die entsprechende Sequenz abgeleitet aus HRV14, HRV39, HRV89) in dem VP1-Protein sowie die Mutanten 3182R:T und 3229L:T in VP3. Eine weitere Mutante (1148P:G) wurde in Analogie zu HRVI4 (1155P:G) konstruiert (Colonno et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5449-5453).

Die Präparation der für die Mutagene benötigten cDNA, die in vitro Herstellung entsprechender infektiöser RNA sowie die Transfection entsprechender Zellen sind beschrieben (Duechler et al. (1989) Virology 168, 159-161; Maniatis et al. (1982) "Molecular Cloning: A laboratory manual". Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York; Taylor et al. (1989) Nucl. Acids. Res. 13, 8764-8785; Ho et al. (1989) Gene 77, 51-59 und Herlitze & Koenen (1990) Gene 91, 143-147.

Die Transfektion mit RNAs, die dem Wildtyp-HRV2 und den Mutanten HRV2_1148P:G und HRV2_3182R:T entsprachen, in Hela-Zellen ergaben Ausbeuten von ca. 300 Pfu/ml. Plaque-Größe und Morphologie des Wildtyps und der beiden Mutanten waren identisch. Fig. 17 zeigt außerdem, daß kein signifikanter Unterschied im Bindungsverhalten dieser Viren an Hela-Zellen auftrat (HRV2wt (⚫), HRV2_1148P:G (▲) und HRV2_3182R:T (); Neubauer et al. (1987) Virology 158, 255-258). Keine lebensfähigen Mutanten wurden von den 1081K:E, 3229L:T oder der Mutante mit dem ausgetauschten TEK-Motiv an Position 1222 erhalten.

Um zu zeigen, ob die Mutanten an den Rezeptor der kleinen Rhinovirusgruppe binden können, wurden Kompetitionsexperimente durchgeführt (Fig. 18). Sobald steigende Mengen von unmarkiertem HRV2 (⚫) bei der Inkubation von HeLa-Zellen anwesend waren, wurde die Bindung von [³⁵S]-markiertem Virusmaterial der Mutanten reduziert. Zugabe von HRV14 (∎) hatte keine Auswirkung auf die Bindung. Offensichtlich ändert sich die Affinität der Virusmutanten der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" nicht. Diese Daten zeigen, das Pro 148 von VP1 (äquivalent zu Pro 155 in HRV14) nicht an der Interaktion von HRV2 mit seinem Rezeptor beteiligt ist. - Im Gegensatz zu HRV14, was auf eine wichtige Funktion dieser Aminosäure bei der Wechselwirkung von HRV14 mit ICAM-1 hinweist (Colonno et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5449-5453).

Keine konservierte Oligopeptidsequenz entsprechend dem TEK-Element konnte in Rhinoviren der großen Gruppe detektiert werden.

Die Mutanten HRV2_1081K:E, HRV2_3229L:T und die TEK-Mutante waren nicht lebensfähig. Die Analyse der dreidimensionalen HRV1A Struktur - die nahe verwandt mit der von HRV2 ist - lieferte keine Anzeichen für sterische oder elektrostatische Störungen durch die ausgetauschten Aminosäureseitengruppen. Außerdem liegen alle Seitengruppen an der Oberfläche und sind nur für das Lösungsmittel zugänglich. Deshalb ist es durchaus möglich, daß sie an der Wechselwirkung mit dem Rezeptor der kleinen Gruppe beteiligt sind und daß ihre Veränderung zu einem Verlust des Bindevermögens und der Infektionsfähigkeit führt.

Die Veränderung von Pro₁₁₄₈ zu Gly in HRV2 war ohne Wirkung auf die Fähigkeit des Virus, an seinen Rezeptor zu binden. Bei HRV14 führt ein entsprechender Austausch zu einer beträchtlich festeren Bindung an den Rezeptor. Pro₁₁₅₅ bildet eine Art Sockel am Fuß des Canyons und scheint den Rezeptor daran zu hindern, weiter in das virale Kapsid einzudringen. Der Anstieg der Bindungsaffinität durch Ersatz von Pro durch Gly kann deshalb als Reduktion der sterischen Hinderung interpretiert werden. Da ein solcher Effekt bei HRV2 nicht beobachtet wurde, ist es wahrscheinlich, daß die Virus/Rezeptorwechselwirkung bei Rhinoviren der kleinen Gruppe an einer anderen Stelle stattfindet als die, die von den Rhinoviren der großen Gruppe benutzt wird.

Claims (44)

1. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein funktionelles Derivat eines Rezeptors für Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" ist.

2. Polypeptid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein lösliches Derivat ist.

3. Polypeptid gemäß Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die lösliche extrazelluläre Form eines Rezeptorproteins handelt.

4. Polypeptid gemäß Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß es durch enzymatische, bevorzugt proteolytische Behandlung eines nativen Rezeptormoleküls erhalten wird.

5. Polypeptid gemäß Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß es durch chemische, bevorzugt reduktive Behandlung eines nativen Rezeptormoleküls erhalten wird.

6. Polypeptid gemäß Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der LDL-Rezeptorfamilie abgeleitet ist.

7. Polypeptid gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Aminosäuresequenz des LDL-Rezeptors, des α₂MR/LRP oder des gp330 abgeleitet ist.

8. Polypeptid gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Aminosäuresequenz des humanen LDL-Rezeptors gemäß Fig. 1 oder aus der des α₂MR/LRP gemäß Fig. 2 oder aus der des gp330 gemäß Fig. 3 abgeleitet ist.

9. Polypeptid gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es die Domäne 1 und 2 des LDL-Rezeptors gemäß Fig. 4 umfaßt.

10. Polypeptid gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es die Domäne 1 gemäß Fig. 4 des LDL-Rezeptors umfaßt.

11. Polypeptid gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuren 1-322 umfaßt.

12. Polypeptid gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen aus Domäne 1 und 2 LDL-Rezeptors besteht, von eukaryotischen Zellen freigesetzt wird und ein Molekulargewicht von ca. 84 kDa aufweist.

13. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß es als Dimer, Trimer, Tetramer oder Multimer vorliegt.

14. DNA, codierend für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-13.

15. DNA gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es in einen Vektor eingefügt ist.

16. DNA gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA nach einem der vorhergehenden Ansprüche in einen Vektor in funktioneller Verbindung mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist und in Mikroorganismen und/oder Säugetierzellen replizierbar ist.

17. Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mit einer DNA nach einem der Ansprüche 15 oder 16 transformiert ist.

18. Wirtsorganismus gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Prokaryont, bevorzugt E. coli, oder ein Eukaryont, bevorzugt Hefe, eine Säugetierzellinie oder eine Insektenzellinie ist.

19. Verfahren zur Herstellung einer DNA gemäß einem der Ansprüche 14 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man in eine mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen geschnittene Vektor-DNA eine mit entsprechenden Enden versehene DNA einfügt, die für ein funktionelles Derivat des Rezeptors der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" gemäß Anspruch 15 kodiert.

20. Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man in eine mit Restriktionsendonukleasen geschnittene Vektor-DNA, die Expressionskontrollsequenzen enthält, eine mit entsprechenden Enden versehene DNA, die für ein funktionelles Derivat des Rezeptors der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" gemäß Anspruch 15 kodiert, so einfügt, daß die Expressionskontrollsequenzen die Expression der eingefügten DNA reguliert.

21. Verfahren zur Herstellung eines funktionellen Derivates eines Rezeptors der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe", dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid durch enzymatische, bevorzugt proteolytische, oder chemische, bevorzugt reduktive Behandlung aus dem nativem Rezeptormolekülen genommen wird.

22. Verfahren-zur Herstellung eines funktionellen Derivates eines Rezeptors der "kleinen Rhinoviren- Rezeptorgruppe", dadurch gekennzeichnet, daß es durch Expression einer DNA gemäß einem der Ansprüche 14-16 erhalten wird.

23. Hybrid-Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie monoklonale Antikörper gegen eines der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 13 sezerniert.

24. Monoklonale Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch die Wirkung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 13 neutralisieren oder spezifisch an eines der besagten Polypeptide binden.

25. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach Anspruch 24 zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung eines der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 13.

26. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach Anspruch 24 zur Reinigung eines der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 14.

27. Test Kit zur Bestimmung von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonale Antikörper nach Anspruch 24 enthält.

28. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß Wirtstiere mit einem der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 14 immunisiert, B-Lymphozyten dieser Wirtstiere mit Myelomzellen fusioniert, die die monoklonalen Antikörper ausscheidenden Hybrid-Zellinien subkloniert und kultiviert.

29. Pharmazeutisch tolerierbare Salze der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 13.

30. Pharmazeutisch tolerierbare Addukte und kovalente Verbindungen zwischen den Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 13 mit einem inerten Träger, zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des menschlichen Körpers.

31. Pharmazeutisch tolerierbare Addukte oder kovalente Verbindungen zwischen den Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 13 mit Polyethylenglykol, zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des menschlichen Körpers.

32. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 13 sowie der nativen Rezeptormoleküle der LDL Rezeptorfamilie zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung des menschlichen Körpers.

33. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 13 sowie der nativen Rezeptormoleküle der LDL Rezeptorfamilie zur Herstellung pharmazeutischer Präparate.

34. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 13 sowie der nativen Rezeptormoleküle der LDL Rezeptorfamilie als kompetitiv wirkende Substanzen zur Inhibierung der Bindung von Viren, insbesondere von Rhinoviren und/oder physiologischer Liganden von Rezeptoren der LDL-Rezeptorfamilie.

35. Verwendung der Polypeptide nach einem der Ansprüche 1 bis 13 sowie der nativen Rezeptormoleküle der LDL Rezeptorfamilie als antivirales, insbesondere antirhinovirales Mittel.

36. Verwendung von Rhinovirusmaterial der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" zur Inhibition der Bindung physiologischer LDL-Liganden.

37. Verwendung von Rhinovirusmaterial gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß es aus den Kapsidproteinen von Rhinoviren der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" abgeleitet ist.

38. Mittel zur therapeutischen Behandlung, dadurch gekennzeichnet, daß es neben pharmazeutisch inerten Trägerstoffen eine wirksame Menge eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder sowie der nativen Rezeptormoleküle der LDL Rezeptorfamilie enthält.

39. Verfahren zur Herstellung von Substanzen, die die Bindung von Liganden an "Rezeptoren der LDL-Rezeptorfamilie" inhibieren, dadurch gekennzeichnet, daß
a. der Rezeptor in Gegenwart einer potentiellen Inhibitorsubstanz mit
b. markiertem Rhinovirusmaterial der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" inkubiert und
c. das Ausmaß der Bindung bestimmt wird.

40. Verfahren gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß als Rhinovirusmaterial Rhinoviren, Rhinovirushüllmaterial oder Rhinoviruskapsidpeptide mit Bindungsaktivität zu einem Rezeptor der LDL-Rezeptorfamilie verwendet wird.

41. Verfahren gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß das Rhinovirusmaterial vom humanen Rhinovirus Serotyp 2 (HRV2) abgeleitet ist.

42. Verfahren gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß die lösliche Form eines Rezeptors aus Kulturüberständen eukaryontischer Zellen oder ein aus Membranen eukaryontischer Zellen isolierte Rezeptor aus der LDL-Rezeptor­ familie verwendet wird.

43. Verfahren zur Bestimmung von Rezeptoren aus der LDL-Rezeptorfamilie, dadurch gekennzeichnet, daß
a. eine Substanz, abgeleitet von Virusmaterial aus der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" mit Bindungsaktivität zum Rezeptor markiert wird,
b. mit der entsprechenden Probe inkubiert und
c. das Ausmaß der Bindung des markierten Virusmaterials detektiert wird.

44. Verfahren zur Zuführung einer therapeutisch wirksamen Substanz in eine tragende Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß
a. Virusmaterial der "kleinen Rhinovirus-Rezeptorgruppe" mit Bindungsaktivität zum LDL-Rezeptor mit der therapeutischen Substanz gekoppelt wird und
b. das besagte Material zu dem entsprechenden Zellmaterial gegeben, an den Rezeptor gebunden und so die therapeutisch wirksame Substanz in die Zelle eingeführt wird.