KR950000304B1 - 아세틸트란스페라제 유전자 함유 dna - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

아세틸트란스페라제 유전자 함유 DNA

제 1 도는 뉴클레오티드 서열 결정 방법과 함께 pCCSI상의 DCPC-ATF cDNA삽입물의 제한 지도를 나타낸다.

제 2(a) 도 및 제 2(b) 도는 본 발명에 따른 DCPC-ATF코딩 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 DCPC-ATF코딩 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩도는 아미노산 서열을 나타내며, 줄친 부분 ①은 후술되는 서브유니트 1의 N-말단 영역의 생화학적으로 결정된 아미노산 서열을 나타내고, 줄친 부분 ②은 후술되는 서브유니트 2의 N-말단 영역의 생화학적으로 결정된 아미노산 서열을 나타낸다.

제 3 도는 아크레모늄 크리소게늄(Acremonium chrysogenum)의 DCPC-ATF 유전자를 함유하는 DNA 단편의 제한 지도를 나타내며, ■부분은 DCPC-ATF유전자의 엑손(제 1 엑손의 5´-말단 및 제 3 엑손의 3´-말단은 미결정되었음)을 나타내고, │…│부분은 그의 뉴클레오티드 서열에 대한 결정된 영역을 나타내며, →부분의DCPC-ATF유전자의 방향을 나타낸다.

제 4 도는 제 3 도에서 │…│로 표시한 부분에 상응하는 1731bp의 뉴클레오티드 서열과 함께 그 뉴클레오티드 서열 밑에 DCPC-ATF단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

제 5 도는 플라스미드 pATATF1의 제작 방법을 나타내는 그림이다.

제 6 도는 아크레모늄 크리소게늄 PGK(포스포글리세레이트 키나제) 유전자를 함유하는 DNA단편의 제한 지도를 나타낸다.

제 7a 도 및 제 7b 도는 플라스미드 pTCATF1의 제작 방법을 나타내는 그림이다.

제 8 도는 내지 제 11 도는 DCPC-ATF에 대한 정제 처리의 각종 단계에 있어서의 정제도를 나타내는 그라프이다. 제 8 도는 약 염기성 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 DCPC-ATF함유 조효소 용액의 정제 결과(제 1 단계)를 나타내는 그라프이다.

제 9 도는 소수성 크로마토그래피에 의한 DCPC-ATF함유 용출액(제 1 단계에서 수득됨)의 정제 결과(제 2 단계)를 나타내는 그라프이다.

제 10 도는 세파크릴 S-200겔 여과에 의한 DCPC-ATF함유 용출액(제 2 단계에서 수득됨)의 정제 결과(제 3 단계)를 나타내는 그라프이다.

제 11 도는 약 염기성 음이온 교환 수지 고속 액체 크로마토그래피에 의한 DCPC-ATF함유 여액(제 3 단계에서 수득됨)의 정제 결과(제 4 단계)를 나타내는 그라프이다.

제 12 도는 플라스미드 pGKCS의 제작 방법을 나타내는 그림이다.

제 13 도는 아크레모늄 크리소게늄 함유 DNA단편의 제한 지도를 나타내는 그림이다.

제 14 도는 플라스미드 pACTHY83의 제작 방법을 나타내는 그림이다.

제 6 도 및 제 13 도에서 ■부분은 엑손을 나타내는데, 제 1 엑손의 5'-말단 및 최후 엑손 3'-말단은 아직 규명되지 않았다.

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

B : BamHI Bg : BglII

BㆍB : BamHI 및 BgIII사이의 연결부위, P : PvuII

Ps : PstI M : MIuI

K : KpnI S : Smal

Sa : SalI St : StuI

Sc : ScaI X : XhoI

Xb : XbaI N : NsiI

Nc : NcoI E : EcoRI

RV : EcoRV H : HindIII

Bs : BssHII

PsㆍNs :PstI 및 NsiI 사이의 연결부위, 2ч

ori : 효모 2ч플라스미스의 복제 기원

CYCP : 효모의 이소-1-시토크롬 C유전자의 프로모터

PGKP : 아크레모늄 크리소게눔 PGK유전자의 프로모터

PGKP : 아크레모늄 크리소게눔 PGK유전자의 프로모터

PGKT : 아크레모늄 크리소게눔 PGK유전자의 터미네이터

ATF : DCPC-ATF유전자

ACTP : 아크레모늄 크리소게눔 악틴 유전자의 프로모터

ACTT : 아크레모늄 크리소게눔 악틴 유전자의 터미네이터

HYB : 히그로마이신 B포스포트란스페라제 유전자

본 발명의 아세틸트란스페라제 유전자 함유 DNA에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 세팔로스포린 C생합성의 최종 단계를 촉매할 수 있는 효소인 데아세틸세팔로스포린 C아세틸 트란스페라제 코딩 유전자를 함유하는 DNA에 관한 것이다. 유전자 cDNA 또는 게놈 DNA일 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 유전자의 적어도 일부를 코딩하는 DNA가 삽입된 벡터를 함유하며 아크레모늄 크리소게눔에서 형질발현할 수 있는 재조합 DNA, 및 재조합 DNA에 의해 형질전환된 아크레모늄 크리소게눔에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 형질전환된 아크레모늄 크리소게눔을 배양하여 세팔로스포린 C를 재조하는 방법에 관한 것이다.

이 방법에 의해 세팔로스포린 C는 효율적으로 재조될 수 있다.

세팔로스포린 C의 생합성은 하기 반응 순서에 따라 진행된다.

단계 2의 반응을 촉매할 수 있는 효소, 즉 데아세톡시세팔로스포린 C 합성 효소 및 데아세틸세팔로포스포린 C 합성효소는 당 분야에서 아크레모늄 크리소게눔으로부터 단리되었다. 아크레모늄 크리소게눔에서 단일 폴리펩티드는 단계 3 및 4에 필수적인 두가지 효소활성을 모두 갖는다는 것은 공지이다. 또한, 이러한 효소를 코팅하는 유전자가 단리되었으며 유전자의 뉴클레오티드 서열이 확인되었다[Samson et al., Nat ure(1985) 318, 19] ; Dotzlaf et al., Journal of Bacteriology(1987) 169, 1611∼1618 ; Samson et al Bio/technology(1987) 5, 1207 ; 및 일본국 특허 공개 제 63-301790 호].

Skatrud등은 유효량의 페니실린 N, 즉 상기 세팔로스포린 C의 생합성의 중간체는 아크레모늄 크리소게눔이 발효되는 배지중에 존재하여, 데아세톡시세팔로스포린 C합성효소/데아세틸세팔로스포린 C 합성효소 (이하, DAOCS/DACS로 칭하기도 함, 페이실린 N이 그의 기질이 됨)를 코딩하는 유전자를 보유하는 DNA단편 함유 벡터를 아크레모늄 크리소게눔으로 도입시킴에 주목했다. 그결과, Skatrud등은 DAOCS/DA CS의 세포 중 농도를 증대시켜 세팔로스포린 C의 수율을 증대시키는데 성공했다.(Skatrud et al., Bio/technology(1989) 7, 477∼485].

한편, 아크레모늄 크리소게눔이 발효되는 상기 배지중에는 유효량의 데아세틸세팔로스포린 C, 즉 세팔로스포린 C의 생합성의 또하나의 중간체 역시 존재함은 당 분야에 공지이다[Huber et al., Applied Microbiology (1968) 16, 1011∼1014]. 따라서 상기 중합체의 세팔로스포린 C로의 전환(즉, 세팔로스포린 C의 생합성의 단계 6)을 촉매할 수 있는 효소(즉, 데아세틸세팔로스포린 C 아세틸트란스페라제)의 세포내 농도 증가 및 세팔로스포린 C재조에 보다 적합하도록 하기 위한 효소 변형은 세팔로스포린 C의 수율을 향상시킬 수 있다.

상기 이유로 인하여, 데아세틸세팔로스포린 C 아세틸트란스페라제의 정제 및 이 효소를 코딩하는 유전자의 단리에 대한 요망이 당분야에서 강력하다.

본 발명자들은 아크레모늄 크리소게눔에서 데아세틸세팔로스포린 C 아세틸트란스페라제를 단리하는데 성공하여, 이 효소는 적어도 2개의 서브유니트를 함유함을 확인했다. 여기서, SDS 폴리아크릴아미드겔 전기 영동으로 측정시, 분자량이 27,000±2000달톤인 서브유니트 1로 표시되고, 분자량이 14,000±2000달톤인 서브유니트는 서브유니트 2로 표시된다. 또한, 본 발명자들은 다음과 같이 서브유니트 1 및 2의 각 N-말단 부분의 아미노산 서열을 결정했다 :

(서브유니트 1)Leu-X-Ala-Gln-Asp-Ile-Ala-Arg-Ile-Ser-leu-Phe-Thr- Leu-Glu-Ser-Gly-Val-Ile-Leu-Arg(여기서 X는 아미노산이 확인되지 않은 부위이다)

(서브유니트 2)Asp-Ser-Gly-Asn-Ser-His-Arg-Ala-Gly-Gln-Pro-Ile-Glu -Ala-Val-Ser-Try-Leu-Arg-Tyr-Gln-Lys-Phe-Ala

상기 각종 연구 개발에도 불구하고, 데아세틸세팔로스포린 C 아세틸트란스페라제 유전자(게놈 DNA)는 당 분야에서 아직 단리되지 못했다.

세팔로스포린 C의 생합성에서 향상된 수율을 수득하기 위해 본 발명자들은 예의 검토하였다. 그 결과, 본 발명자들은 아크레모늄 크리소게눔의 cDNA라이브러리에서 데아세틸세팔로스포린 C 아세틸트란스페라제(이하, DCPC-ATF로 칭하기도 함) 코딩 cDNA 함유 DNA를 단리하고 그의 뉴클레오티드 서열을 결정했다. 또한, 본 발명자들은 아크레모늄 크리소게눔의 유전자 라이브러리에서 DCPC-ATF의 게놈 DNA함유 DNA를 단리하여 그의 뉴클레오티드 서열의 일부(코딩 영역의 전체 뉴클레오티드 서열 및 DCPC-ATF유전자의 비코딩 영역의 일부 뉴클레오티드 서열)를 결정했다. 더 연구한 결과, 상기 DNA들 중의 하나가 삽입된 벡터를 함유하는 재조합 DNA(아크레모늄 크리소게눔에서 DNA가 발현할 수 있는 형태)로 형질전환된 아크레모늄 크리소게눔은 비형질전환된 아크레모늄 크리소게눔에 비해 향상된 DCPC-ATF합성활성을 나타냄을 밝혔다. 본 발명은 이들 연구 및 발견에 의거한 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 순수 형태로 단리되며 데아세틸세팔로스포린 C 아세틸트란스페라제(DCPC-ATF) 코딩 유전자를 함유하는 신규 DNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 아크레모늄 크리소게눔에서 발현될 수 있으며 적어도 일부의 DCPC-ATF 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 재공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 재조합 DNA에 의해 형질전환되며 DCPC-ATF의 합성 활성이 개선된 아크레모늄 크리소게눔을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 형질전환된 아크레모늄 크리소게눔을 사용하여 세팔로스포린 C를 재조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 및 기타 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명, 특허청구의 범위 및 첨부된 도면에 의해 명백해질 것이다.

본 발명에 따라 단리된 DNA는 필수적으로 DCPC-ATF코딩 유전자를 함유하는 것으로 제공된다. 이 유전자는 아크레모늄 크리소게눔에서 수득될 수 있다. 이 유전자는 cDNA 또는 게놈 DNA이다.

상기 cDNA는 하기 식(Ⅰ)의 아미노산 서열 함유 단백질 또는 아세틸레이트 데아세틸세팔로스포린 C의 세팔로스포린 C로의 활성을 갖는 상기 단백질의 변종을 코딩하는 cDNA인 것이 바람직하다.

[식 1a]

[식 1b]

[상기 식중, Met는 메티오닌 잔기, Gln는 글루타민 잔기, Asp는 아스파르트산 잔기, Pro는 프롤린 잔기, Tyr는 티르신 잔기, Val는 발린 잔기, Lys는 리신 잔기, Glu는 글루탐산 잔기, Ale는 알라닌 잔기, Asn는 아스파라긴 잔기, Leu는 로이신 잔기, Phe는 페닐알라닌 잔기, Gly는 글리신 잔기, His는 히스티딘 잔기, Ser는 세린 잔기, Thr는 트레오닌 잔기, Ile는 이소로이신 잔기, Trp는 트립토판 잔기, Arg는 아르기닌 잔기, 및 Cys는 시스테인 잔기이고, 좌측 및 우측 말단은 각각 N-말단 및 C-말단을 나타낸다]

보는 바람직한 것은 상기 cDNA가 하기 식(Ⅱ)의 뉴클레오티드 서열을 함유하거나 유전 암호의 축퇴에 따라 식(Ⅱ)의 뉴클레오티드 서열 중 적어도 1개의 뉴클레오티드를 치환하여 수득한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것이다.

[식 2a]

[식 2b]

[식 2c]

[상기 식중, A는 데옥시아데닐산 잔기, G는 데옥시구아닐산 전기, C는 데옥시시티딜산 잔기 및 T는 티미딜산 잔기이고, 좌측 및 우측 말단은 각각 5'-말단 및 3'-말단을 나타낸다]

DCPC-ATF코딩 cDNA를 함유하는 본 발명의 DNA는 하기 공정에 따라 재조될 수 있다.

(1) 세팔로스포린 C재조 활성을 갖는 아크레모늄 크리소게눔에서 총 RNA를 추출한 후, m-RNA분획을 분리 농축하고 ; (2) 상기 m-RNA를 주형으로 사용하여 단일 가닥 cDNA 및 이중가닥 cDNA를 차례로 합성한 후, 이것을 적당한 파지 벡터에 삽입하여 아크레모늄 크리소게눔의 cDNA 라이브러리를 수득하고 ; (3) 본 발명자들에 의해 결정된 DCPC-ATF의 아미노산 서열의 일부에서 추정될 수 있는 유전적으로 실행가능한 DNA 뉴클레오티드 서열을 전부 함유하는 올리고뉴클레오티드 혼합물을 화학적으로 합성하거나 코돈 사용 횟수를 고려하여 추정한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드(“DNA탐침”으로 명시됨)를 화학적으로 합성하고 ; (4) DNA탐침을³²P로 표지화하고, 상기 (2)에서 수득한 cDNA라이브러리를 사용하여 플라크 하이브리드화한 후, 양성인 피지를 선택 및 분리하고 ; (5) 분리된 파지에서 DNA를 추출하고, 벡터에 삽입된 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 생성 cDNA의 뉴클레오티드 서열의 번역에 의해 수득된 단백질 아미노산 서열을 DCPC-ATF서브유니트의 생화학적으로 결정된 부분 아미노산 서열과 비교하여 수득된 cDNA가 DCPC-ATF를 코딩하는지의 여부를 확인한다.

상기 공정에서 RNA 및 DNA의 사용 및 취급에 대한 일반처리는 공지이다[T.Maniatis et ai., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982]. 상기 공정에 사용되는 cDNA 클로닝용 모든 효소, 시약 및 벡터로는 시판품을 사용할 수 있다. 이들 효소, 시약 및 벡터는 달리 지정되지 않는 한, 제품에 첨부된 프로토콜에 따라 성공적으로 사용될 수 있다.

상기 공정(1)에서 RNA추출원으로 사용될 수 있는 것은 아크레모늄 크리소게눔 ATCC 11550, 바람직하게는 아크레모늄 크리소게눔 ATCC 36225 및 아크레모늄 크리소게눔 IS-5이다. 상기 아크레모늄 크리소게눔 IS-5는 일본국 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업기술 연구소(FRT)에 1990.2.5자로 수탁번호 11232로 기탁되어 있다. 아크레모늄 크리소게눔에서 총 RNA의 추출은 문헌[Boel et al., EMBO Journal(1984) 3, 1097∼1102]의 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 공정(2)의 cDNA의 합성은 예컨데 문헌[Gubler-Hoff man et al., Gene(1983) 25, 263]의 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 공정(3)에서 정의된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 혼합물의 합성은 시판 DNA합성기를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 상기 공정(5)에서 DNA 뉴클레오티드 서열의 결정은 통상의 디데옥시 방법에 따라 수행될 수 있다[Sanger et al., Proc.Nati.Acad.Sci.USA(1977) 73, 5463]

게놈 DNA를 함유하는 본 발명의 DNA는 하기 공정에 의해 재조될 수 있다.

(ⅰ) 아크레모늄 크리소게눔에서 총 DNA를 추출한 후, MboI 등의 적당한 제한 효소로 DNA를 부분 절단하고 ; (ⅱ) 상기 공정(ⅰ)에서 수득한 DNA 단편을 적당한 파지벡터(예. EMBL 3, EMBL 4 등)에 삽입하여 아크레모늄 크리소게눔의 게놈 DNA 라이브러리를 생성하고 ; (ⅲ) DNA 탐침을 사용하는 플라크 하이브리드화에 의해 상기 공정(ⅱ)에서 수득한 라이브러리에서 목적 파지를 선택 및 단리하고 ; (ⅳ) 선택된 파지에서 총 DNA를 추출하고, 상기 탐침을 사용하여 서던 하이브리드화하여 적당한 크기의 제한효소-절단 단편상에 목적 유전자를 확인한 후 통상의 플라스미드 벡터로 서브클론화하고 ; (ⅴ) 수득되는 DNA 단 cDNA와 비교하여 DCPC-ATF게놈 DNA의 존재를 확인하여 그의 코딩영역을 결정한다.

상기 물질 및 처리 조작에 있어서, 이. 콜리(E.coli), 파지 및 DNA의 일반 처리는 당 분야에 공지이며 참고 문헌을 통해 용이하게 수행될 수 있다[T.Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, 1989]. 효소, 시약 및 벡터 DNA로는 달리 지정되지 않는 한 시판품을 사용할 수 있으며, 지시에 따라 사용시 목적은 충족될 수 있다. 상기 공정(ⅰ)에서 아크레모늄 크리소게눔 ATCC 11550 및 아크레모늄 크리소게눔 IS-5와 같은 균주가 DNA추출원으로 사용된다.

아크레모늄 크리소게눔에서 총 DNA의 추출원 문헌[Johnstone et al., EMBO Journal(1985) 4, 1307∼1311] 및 [Minuth et al., Current Genetics (1982) 5, 227∼231]과 같은 방법으로 수행될 수 있다.

상기 공정(ⅲ)에서, DCPC-ATF유전자를 함유하는 클론을 선택하는데 유용한 탐침에는 DCPC-ATF 코딩 cDNA단편, 예컨데 실시예 1에서 기재된 pCCS1의 cDNA삽입물이 포함된다. 적당한 DNA 올리고머른 상기 cDNA의 뉴클레오티드 서열에 의거하여 합성되어 탕침으로 사용할 수 있다. DNA올리고머의 합성은 시판 DNA합성기를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 수행가능하다. 상기 단계 (ⅴ)에서 DNA의 뉴클레오티드 서열은 통상의 디데옥시 방법[Sanger et al., Proc.Nati.Acad.Sci.USA(1977) 73, 3463]에 의해 결정된다.

본 발명의 또 하나의 국면에 의하면, 숙주 세포내에서 복제가능한 재조합 DNA가 제공되는데, 이 재조합 DNA는 cDNA 또는 게놈 DNA를 함유하는 상기 DNA의 적어도 일부(아세틸레이트 데아세틸세팔로스포린 C의 세팔로스포린 C로 활성을 갖는 단백질 코딩 부분)가 삽입된 백터를 함유하며, 이 부분이 아크레오늄 크리소게눔에서 발현가능한 형태인 것이다. 여기서, 용어 “이 부분이 아크레모늄 크리소게눔에서 발현가능한 형태”는 cDNA의 경우에는 아크레모늄 크리소게눔 유래의 프로모터, 터미네이터 등을 함유하는 벡터가 사용되어 생성 재조합 DNA를 발견가능하도록 하는 것을 의미하며, 코딩 영역만을 함유하는 게놈 DNA의 경우에는 cDNA에 대해 상기 프로모터, 터미네이트 등이 필수적으로 삽입되어 생성 재조합 DNA를 발견사능하도록 하는 반면, 상기 프로모터 및 터미네이터를 함유하고 있는 게놈 DNA의 경우에는 게놈 DNA를 함유하는 재조합 DNA 자체가 발현가능하다는 것을 의미한다.

상기 아크레모늄 크리소게눔 유래의 프로모터 및 터미네이터로는 아크레모늄 크리소게눔 PGK유전자(참고예 2에서 후술됨), 아크레모늄 크리소게눔 악틴 유전자(참고예 3에서 후술됨) 및 아크레모늄 크리소게눔 이소페니실린 N합성 효소 유전자 유래의 프로모터 및 터미네이터를 들 수 있다[Paul L.Skatrud et al,Curr.Genet.(1987) 12, 337∼348].

아크레모늄 크리소게눔의 형질전환용 벡터로는 pACTHY83(참고예 2 참조)이 있다. 아크레모늄 크리소게눔의 형질전환용 벡터에 대해서는 문헌[Skatrud et al., Bio/technology(1989)7, 477∼485]을 참조할 수 있다. 아크레모늄 크리소게눔의 형질전환은 문헌[Queener et al., Microbiology 1985, American Society for Microbiology(1985) pp.468∼472] 또는 [Isogai et al., Agric.Biol.Chem.(1987) 51, 2321∼2329]의 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 또 하나의 국면에 의하면, 상기 재조합 DNA에 의해 형질전환된 아크레모늄 크리소게눔이 제공된다.

수득되는 형질전환체의 DCPC-ATF활성은 증가되어 본 발명의 DNA도입 효과가 달성될 수 있다.

본 발명의 또 하나의 국면에 의하면, 상기 재조합 DNA에 의해 형질전환된 아크레모늄 크리소게눔을 배양하여 세팔로스포린 C를 생산하고 세팔로스포린 C를 단리함을 특징으로 하는 세팔로스포린 C의 생산방법이 제공된다.

배양은 25∼30℃에서 pH 6∼7의 세팔로스포린 C생합성용 배지 중에서 수행된다. 배지에 대해서는 문헌[Queener S.W.et al., In : Biotechnology of Industrial Antibiotics.E.J.Vandamme, Marcel Dekker Inc., New York, Basel, pp.141∼170]을 참조할 수 있다.

본 발명의 DNA가 아크레모늄 크리소게눔에서 발현가능한 형태로 벡터에 결찰되어 아크레모늄 크리소게눔에 도입시, 세포 중의 DCPC-ATF농도가 증가되어 세팔로스포린 C생산능이 향상될 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA를 탐침으로 사용함으로써 그의 발현 및 조절 기전 등에 관한 DCPC-ATF 유전자 분석을 분자 수준에서 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA는 DCPC-ATF 및 그의 전구체의 대량 생산용으로 바람직하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 게놈 DNA를 함유하는 DNA를 사용함으로써 아크레모늄 크리소게눔에 존재하는 DCPC-ATF 유전자는 공지 방법으로 파괴되어 신규 아크레모늄 크리소게눔을 생성하여 데아세틸세팔로스포린 C를 효율적으로 생성할 수 있다[Bruce L.Miller, et al., Molecular and Cellular Biology(1985), 1714∼1721 ; 및 David W.Holden et al., The EMBO Journal (1989), 1927∼1934]. 데아세틸팔로스포린 C는 세팔로스포린 C와 같이 세팔로스포린 항생물질 재조용으로 중요한 출발물질이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더 설명되나 이들 예로 한정되는 것은 아니다.

이하에 사용되는 약어는 다음과 같다 :

CM배지 : 수크로스 20g, 이수소인산 칼슘 0.5g, 수소인산 이칼륨 0.5g, 염화 칼륨 0.5g, 황산 그마네슘ㆍ7H₂O 0.5g, 황산 제 1철ㆍ7H₂O 0.01g, 질산 나트륨 3g, 효모 추출물 4g, 및 펩톤 10g/증류수 1l를 함유하는 배지

CM고체 배지 : 한천 1.5%를 함유하는 CM배지

GA배지 : 글루코스 40g, 아스파라긴 4g, 염화칼슘 0.1g, 염화나트륨 0.1g, 미량의 금속용액(황산 마그네슘ㆍ7H₂O 0.4g, 황산 제 1철, 황산 망간ㆍ4H₂O 0.16g, 황산 아연ㆍ7H₂O 0.4g, 및 무수 황산 구리 0.04g/증류수 1l용액을 함유함) 25ml, 및 0.1M 인산염 완충액(pH 7.0) 30ml/증류수 1l를 함유하는 배지

GAG배지 : 글리세롤이 글루코스로 사용되는 것을 제외하고는 GA배지와 동일

6XSSSC : 0.9M 염화나트륨/90mM 시트르산 나트륨

20XSSSPE : 염화 나트륨 210g, 이수소인산 나트륨ㆍ2H₂O 31.2g 및 0.5M EDTA(에틸랜디아민 테트라아제트산) 40ml/증류수 1의 용액

50XDenhardt's : 피콜 5g, 폴리비닐 피롤리돈 5g 및 소 혈청 알부민/증류수 500ml의 용액

20XSET : 3M 염화나트륨/0.4M 트리스 완충액(pH 7.8)/20mM EDTA

N-3종(seed)배지 : 콘스팁 리퀴 40g, 비트 20g, 아세트산 암모늄 2g, 스타치의 염산 가수분해물 40g 증류수 1l의 용액을 함유하는 배지

주배지 : 비트30g, 탈지 대두콩 40g, 콘스팁 리쿼 10g, 아세트산 암모늄 5g, 황산 암모륨 7g, 황산 칼륨 8g, 탄산칼슘 15g, 스타치의 염산 가수분해물 60g, 및 메타올레에이트 41.5g/증류수 1l의 용액을 함유하는 배지

p-완충액 : 염화 칼륨 0.6M, 염화 마그네슘 0.01M 및 염화 칼슘 0.025M

PEG용액 : 25% 폴리에틸렌 글리콜(약 4000), 0.01M 트리스 완충액(pH 8.0), 0.05M 염화 칼슘 및 0.6M 염화 칼슘

ATF안정화 완충액 : 15% 에틸렌 글리콜, 10mM 디티오트레이톨, 10mM 7-아미노세팔로스포란산, 1mM EDTA, 및 1mM p-아미디노페닐메탄술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드

[실시예 1]

DCPC-ATF cDNA함유 DNA의 재조

단계(1) : 아크레모늄 크리소게눔의 배양

CM고체 배지에서 30℃로 5일간 배양된 아크레모늄 크리소게눔 마이셀리아를 CM배지 50ml에 접종한 후 30℃에서 3일간 배양한다. 생성 배지를 GA배지 500ml에 접종한 후 30℃에서 20시간 동안 배양한다.

단계(2) : m-RNA의 추출

단계 1에서 수득한 마이셀리아 현탄액을 감압하에 여거하고, 수거한 마이셀리아(습윤상태에서 약 10g)를 액상 질소에서 동결시킨다. 생성 동결 마이셀리아를 유발 및 유봉을 사용하여 본말로 바꾼다. 이렇게 수득되는 분말을 100mM 아세트산 나트륨, EDTA 2.5mM 및 4% SDS(소듐 도데실술페이트)를 함유하는 용액 30ml에 현탁시킨 후, 동일 부피의 페놀, 클로로포름 및 이소아밀알콜을 함유하는 용액(50 : 50 : 1)으로 추출하고, 10,000rpm로 20분간 원심 분리하여 수층을 수거한다. 생성 액체상을 30,000rpm로 40분간 더 원심분리하여 불용물을 제거한다. 염화 세슘 10g을 생성 현탄액 25ml에 용해시켜 용액을 수득하고, 초원심분리관에 분산된, 5.7M 염화 세슘 및 0.1M EDTA를 함유하는 용액 7ml상에 포갠다. 이 관을 25℃에서 17시간 동안 20,000rpm 원심분리시켜 총 RNA를 침전물로 수거한다. RNA침전물을 95% 에탄올로 세척하고 건조시킨 후 증류수 1ml중에 용해시킨다. 클로로포름 및 부탄올의 용액(4 : 1)을 사용하여 추출함으로써 단백질성 이물질을 제거한다. RNA를 에탄올을 사용하여 침전시킴으로써 용액에서 제거한다. 생성 RNA를 1mM EDTA, 0.1% SDS 및 0.5M 염화 리튬을 함유하는 10mM 트리스-HCl완충액(pH 7.5)중에 용해시키고, 68℃에서 3분간 배양시킨 후, 급냉시키고, 올리고 dT셀룰로스 컬럼을 사용하여 크로마토그래피시킨다. 1mM EDTA 및 0.1% SDS를 함유하는 10mM 트리스 완충액을 사용하여 폴리 A를 갖는 흡착 m-RAN를 용출시키고, 에탄올로 침전시켜 m-RNA를 회수한다. 상기 공정에 의해 m-RNA 80㎍을 수득한다.

단계(3) : cDNA라이브러리의 재조

cDNA합성계(영국 Amersham Int.제 시판품)를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 단일 가닥 cDNA형성에 의해 단계(2)에 수득한 m-RNA(4㎍)로부터 이중가닥 cDNA를 합성한다. cDNA-클로닝계-λgt-10(영국 Amersham Int.제 시판품)을 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라, 생성 이중가닥 cDNA내부에 존재하는 EcoRI 제한 부위의 메틸화, DNA말단에 EcoRI링커의 연결, EcoRI에 의한 절단 및 겔 여과에 의한 유리 링커의 제거를 수행하여 말단에 EcoRI제한 부위를 갖는 이중가닥 cDNA 약 2000ng을 수득한다. 한편, λgt-10DNA(미국 Stratagene Co., Ltd.제 시판품)를 EcoRI로 분해하고 알칼리 포스파타제로 5´-포스페이트기를 제거한다. 생성 탈인산 λgt-10DNA 단편(1㎍)을 T4 리가제를 사용하여 이중가닥 cDNA 100g과 결찰한다. 생성결찰 단편을 기가팩 골드(Gigapack Gold, 미국 Stratagene Co., Ltd. 시판 포장 추출물)를 사용하여 λ-파지 입자로 삽입한다. 수득한 재조합 파지 현탄액을 적정 농도로 희석하고, 이. 콜리 NM514를 회석된 재조합 파지 현탄액으로 감염시킨다. 나타나는 플라크 수를 측정한다. 결과로, 현탄액 약 2X10⁵개의 재조합 파지를 함유함을 관찰한다. 이 파지 현탄액을 아크레모늄 크리소게눔의 cDNA 라이브러리로 명명하고 4℃에서 보관한다.

단계(4) : DNA탐침의 재조

본 발명가들은 이미 아크레모늄 크리소게눔 유래의 DCPC-ATF를 정제하고, 이 효소가 분자량이 상이한 2종의 서브유니트(이하, 분자량이 보다 큰 서브유니트를 서브유니트 1로 하고 분자량이 보다 작은 서브유니트를 서브유니트2로 한다)를 가짐을 입증했다. 이들 서브유니트의 각 말단의 아미노산 서열을 하기 식1(서브유니트 1의 서열) 및 식 2(서브유니트 2의 서열)에 나타낸 바와 같이 결정한다.

식 1 : Leu-X-Ala-Gln-Ile-Ala-Arg-

Ile-Ser-Leu-Phe-Thr-Leu-Ser-

Gly-Val-Ile-Leu-Arg

식 2 : Asp-Ser-Gly-Asn-Ser-His-Arg-Ala-Gly-

Gln-Pro-Ile-Glu-Ala-Val-Ser-Ser-Tyr-

Leu-Arg-Tyr-Gln-Ala-Gln-Lys-Phe-Als

식 1의 밀줄친 아미노산 서열에서 추정되는 모든 유전학적으로 실행가능한 DNA 뉴클레오티드 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 혼합물을 합성하고 LN1로 명명한다. LN1은 m-RNA에 상보적인 DNA사슬에 상응하는 48종의 14머 올리고뉴클레오티드 혼합물이며 하기 서열을 갖는다 ;

5'GC(GAT)AT(GA)TC(TC)TG(GATC)GC3'

괄호는 뉴클레오티드 혼합물이 사용되는 부위를 나타낸다.

이어서, 식 2의 밀줄친 아미노산 서열에서 추정되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하고 SN1로 명명한다. SN1은 아크레모늄 크리소게눔의 코돈 사용 횟수를 고려하여 추정 고안된 특정 59머 올리고뉴클레오티드이며 하기 서열을 갖는다 ;

5'GCCGGCCAGCCCATCGAGGCCGTCTCCTCCTACCTCCG

CTACCAGGCCCAGAAGTTCG3'

DNA합성기 모델 380-A(미국 Applied Biosystems제 시판품)를 사용하여 상기 LN1 및 Snl을 합성한다. 문헌[Maniatis, Laboratory Manual]의 방법에 따라 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 Γ-³²P-ATP를 사용하여 생성 LN1 및 SN1을³²P로 표지화하고, 표지된 LN1 및 SN1을 하기 하이브리드화 반응에 사용한다. 이하, 상기 수득된 표지된 탐침을³²P-LN1 및³²P-SN1로 명령한다.

단계(5) : 하이브리드화에 의한 스크리닝

이 콜리 NM514를 단계(3)에서 수득한 파지 현탄액의 일부로 감염시켜 4개 플레이트 상에 총 1.6X1⁴개 플라크를 형성한다. 이들 플라크를 문헌[Benton et al., Science(1977) 196, 180∼182]의 방법으로 니트로 세룰로스 필터로 전이한다. 전이된 DNA를 알칼리로 변형시키고 주화한 후 고정시킨다.

고정된 DNA를 단계(4)에서 수득한 탐침³²P-SNl로 하이브리드화한다. 30% 포름아미드, 5XDenhardt's, 5XSSPE, 0.1% SDS 및 5X10⁵cpm/ml³²P-SN1을 함유하는 용액을 사용하여 42℃에서 14기간 동안 하이브리드화한다. 이어서, 여액을 0.1% SDS를 함유하는 1XSSC로 실온에서 15분간 2회 세척하고, 0.1%SDS를 함유하는 0.2 XSSC로 50℃에서 20분간 더 세척한다.

이어서, 증감 스크린을 사용하여 -80℃에서 22시간 동안 자동 방사선사진술을 수행한다. 결과로, 10개의 양성 스폿을 발견한다. 4개의 양성 스폿에 상응하는 한천 배지에서 파지를 추출하고, 상기 방법에 따라 플라크 하이브리드화하여 4종의 정제파지 클론을 수득한다. 문헌[Grossberger et al., Nucleic Acids, Research(1987) 15, 6737]의 방법을 사용하여 상기 수득한 4개 파지 클론에서 재조합 λDNA를 추출한다. 생성 λDNA를 각각 λCCS1, λCCS2, λCCS3 및 λCCS4로 명명한다.

이어서, 상기 λDNA를 EcoRI로 분해한 후 아가로스 겔 전기 영동하고, 상기 탐침,³²P-SNl 및³²P-LN1을 사용하여 서던 하이브리드화한다[Southern et el., Journal Of Molecular Biology(1975) 98, 503∼517]. 결과는, 클론(λCCS1 내지 λCCS4)내의 cDNA삽입물, 즉 EcoRI로 절단된 cDNA단편은 탐침 SN1뿐 아니라 탐침 LN1과도 강력히 하이브리드화함을 나타낸다. 이것은 cDNA가 DCPC-ATF형성 2개 서브유니트를 코딩함, 즉 서브유니트 1 및 서브유니트 2 코딩 정보가 동일 m-RNA상에 존재함을 강력히 시사한다.

상기 플라크 하이브리드화와 실질상 동일한 방법으로³²P-SNl에 의한 하이브리드화 및 필터의 세척을 수행한다.³²P-SNl을 사용할 경우, 6XSET, 5 SDenhardt's, 0.1% SDS 및 10⁵∼10⁶cpm/ml³²P-LNl을 함유하는 용액을 사용하여 35℃에서 6시간 동안 하이브리드화한다. 생성 필터를 실온에서 3분간 6XSSC로 세척한 후 40℃에서 3분간 동일 용액으로 세척하고, 자동방사선사진술에 의한 측정을 수행한다.

단계 (6) : cDNA단편의 서브클로닝 및 부분 제한 단편의 지도 작성

상기 λCCS1를 EcoRI로 분해한 후, 분해된 λCCS1를 아가로스 겔 전기 영동시켜 SN1 및 LN1과 하이브리드화된 1.25kb의 cDNA단편을 재조하고, pUC19의 EcoRI부위로 서브클로닝한다. 이렇게 수득한 플라스미드 중의 하나를 PCCS1로 명명하고, 각종 제한 효소를 분해한 후 전기 영동시킨다. 결과로, 제 1 도에 나타낸 1.25kb의 cDNA삽입물의 제한 지도를 수득한다.

상기 공정에 있어서, 아가로스 게로부터 DNA단편의 재조는 Gene clean(일본국 Funakoshi Pharmaceutical Co.,Ltd 시판품)을 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 수행되는 것이다. DNA단편의 플라스미드로의 서브클로닝, 플라스미드의 DNA단편과의 결찰, 이 콜리의 형질전환 및 서브클로닝에 의해 수득되는 플라스미드의 재조 및 분석과 같은 기초 조작은 문헌[Maniat is, Ladoratory Manual]의 방법에 의거하여 수행된다.

단계 (7) : cDNA뉴클레오티드 서열의 결정

Sanger등의 방법으로 상기 1.25kb의 cDNA단편의 총 DNA뉴클레오티드 서열을 결정한다. 다까라 서열화 키드(일본국 TaKara Shuzo Co., Ltd제 시판품)를 사용하여 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 뉴클레오티드 서열의 결정법을 제 1 도의 제한 지도의 하부에 나타낸다. 지도에서 화살표는 서열 결정 방향 및 정도를 나타낸다. 이렇게 해서 결정된 DNA 뉴클레오티드 서열을 제 2(a) 도 및 제 2(b) 도에 나타낸다.

35번째 뉴클레오티드에서 시작하는 개시코돈(ATG)에서 1192번째 뉴클레오티드에서 끝나는 종결코돈(TGA)까지의 오픈 리딩 프레임은 385개 아미노산의 폴리팹티드를 코딩한다. 오픈 리딩 프레임에서 번역되는 아미노산 서열을 제 2 도의 뉴클레오티드 서열 밑에 나타낸다. 상기 아미노산 서열에서, 13번째 Leu에서 32번째 Leu까지의 아미노산 서열은 2번째 미확인 아미노산 서열을 제외하고는 생화학 기술에 의해 결정된 DCPC-ATF형성 서브유니트 1의 N-말단 아미노산 서열과 완전히 일치한다. 또한, 상기 아미노산 서열에서, 260번째 Asp에서 286번째 Ala까지의 아미노산 서열은 서브유니트 2의 N-말단의 아미노산 서열과 완전 일치한다. 13번째 leu에서 259번째 Thr까지의 단백질 및 260번째 Asp에서 385번째 Met까지의 단백질의 분량은 각각 27600 및 13894로 계산되며, 이들 분자량은 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 생화학적으로 결정된 서브유니트 1 및 서브유니트 2의 분자량과 잘 일치한다.

상기 결과에서, 본 발명에서 유도된 cDNA는 DCPC-ATF전구체를 코딩함을 명백히 알 수 있다.

Ⅱ. 아크레모늄 크리소게눔에서의 발현용 pTCATF1의 제작

제 8 도에 나타낸 공정에 따라 폴리스미드 pTCATF1을 아크레모늄 크리소게눔에서 DCPC-ATF cDNA 발현용으로 제작한다. 실시예 1에서 수득한 플라스미드 pCCS1을 EcoRI로 분해하고, 분해된 플라스미드의 말단을 DNA 폴리머라제 대단편 및 4종의 데옥시리보뉴클레오티드를 사용하여 무디게 만든다. 이어서, 생성 반응 혼합물을 아가로스 겔 전기영동시키고, DCPC-ATF의 전체 코딩 영역을 함유하는 약 1.25kb의 단편을 겔에서 수거하고 정제시킨다. 정제 단편을 T4 리가제를 사용하여 pGKCS(참고예 2 참조)(BglII로 분해하고, DNA 풀리머라제 대단편 및 4종의 데옥시리보뉴클레오티드를 사용하여 말단을 무디게 한 후, 알칼린 포스파타제로 처리한 것)에 결찰하여 pGKATF1을 수득한다.

이어서, pGKATF1을 XbaI 및 SmaI로 분해하고, 아가로스 겔 전기 영동시키고, DCPC-ATF cDNA 및 PGK 프로모터 및 터미네이터를 함유하는 약 3.4kb의 단편을 겔에서 수거하고 정제시킨다. 한편, 참고예 3에서 수득한 플라스미드 pACTHY83을 XbaI 및 SmaI로 분해하고, 아가로스 겔 전기 영동시키고, 약 5.8kb의 단편을 겔에서 수거하고 정제시킨다. 수득되는 pGKATF1 및 pACTHY83의 XbaI-SmaIeks편을 T4 리가제를 사용하여 서로 결찰하여 pTCATF1을 수득한다.

상기 공정에 있어서, 제한효소로 분해하여 수득한 DNA단편의 분리 및 정제 ; DNA단편들 사이의 결찰 반응에 의한 플라스미드의 형성 ; 수득된 플라스미드에 의한 이 콜리의 형질전환 ; 수득된 형질전환체에서 플라스미드의 재조 ; 및 재조된 플라스미드의 분석과 같은 조작은[Maniatis, Laborato ry Manual]의 방법에 따라 실질상 수행된다. 또한, 플라스미드 pACTHY83은 아크레모늄 크리소게눔 형질전환용 벡터이며 아크레모늄 크리소게눔에서 기능할 수 있는 히그로마이신 B 포스포트란스페라제 발현 단위(아크레모늄 크리소게눔 유래 악틴 유전자의 프로모터 및 터미네이터가 발현에 적합한 서열의 세균 유래 히그로마이신 B 포스포트란스페라제 유전자에 결합되어 있음)를 함유한다는 것에 유의해야 한다. 플라스미드 pACTHY83의 재조방법은 본 발명의 참고예 3에 기재되어 있다.

Ⅲ. pTCATF1에 의한 아크레모늄 크리소게눔의 형질전환

플라스미드 pTCATF1을 아크레모늄 크리소게눔에 도입하여 DCPC-ATF활성이 증강된 형질전환체를 수득한다. 이하에 상세히 설명한다.

단계(1) : 원형질체의 재조

아크레모늄 크리소게눔 IS-5을 CM 고체 배지상에 30℃에서 5일간 성장시켜 수득한 마이셀륨을 CM배지 50ml에 접종하고 회전 진탕기(250rpm)로 30℃에서 3일간 배양한다. 이어서, 생성 배양 현탄액 1ml을 GAG배지 50ml에 접종하고 30℃에서 20시간 동안 배양한다. 수득된 배양 현탄액 50ml을 3500rpm에서 10분간 원심분리하여 마이셀륨을 침전시킨다. 마이셀륨을 0.9% NaCl용액으로 세척하고, 0.01M 디티오트레이톨을 함유하는 McIlvaine완충액(0.1M시트르산, 0.2M인산 나트륨, pH 7.3) 20ml에 현탁시키고, 서서히 질탕하면서 30℃에서 1시간 동안 유지시킨다. 이어서, 현탄액을 3200rpm로 10분간 원심분리하여 마이셀륨을 침전시킨다. 마이셀륨을 p-완충액으로 세척하고, 농도 10mg/ml로 Novozyme234(덴마크 Novo Industry제 시판품)를 함유하는 p-완충액 10ml에 현탁시키고, 30℃에서 1시간 동안 서서히 진탕한다. 생성 반응 혼합물을 800rpm로 30초간 원심분리하여 상층액을 수득한다. 상층액을 필터 페이퍼(Toyo Filter Paper 5A)를 사용하여 여과하여 마이셀륨과 원형질체를 서로 분리한다. 여과액을 3000rpm로 5분간 원심분리하여 원형질체를 p-완충액으로 1회 세척하고 p-완충액에 현탁시켜 원형질체의 농도를 약 3X10⁸/ml로 한다.

단계(2) : pTCATF1에 의한 원형질체의 형질전환

상기 단계(1)에서 수득한 원형질체 0.1ml에 플라스미드 pTCATF1 10㎍을 함유하는 용액 10㎕를 먼저 가한후 PEG용액 0.05ml을 가하고 가볍게 교반한다. 생성 혼합물을 빙상에 25분간 방치한후 PEG용액 1ml을 가하고 나서 실온에서 30분간 방치한다.

수득되는 형질전환 원형질체 현탄액을 원형질체 재생 배지(문헌[Isogai et al, Argic.Biol.Chem.1987, 51, 2321∼2329]에 기재된 BRM배지) 25ml을 함유하는 플레이트 상에 0.2ml을 펴 바른후 15℃에서 20시간 동안 배양한다. 이어서, 히그로마이신 B 4.5mg을 함유하는 BRM배지 5ml을 가하고, 50℃에서 유지시킨 후, 상기 플레이트 상에 포개고, 28℃에서 14일간 배양한다. 결과로, 히그로마이신 B에 내성인 형질전환체(이하, “HYB형질전환체”로 칭함) 70균주가 나타난다.

단계(3) : DCPC-ATF활성의 측정

플라스미드 pTCATF1을 사용하여 상기 단계(2)에서 수득한 HYB형질전환체에서 4개 균주를 임의로 선택하여 각각 CAT1, CAT2, CAT3 및 CAT4로 명명한다. 플라스미드 pACTHY83을 사용하여 단계 (2)에서 수득한 HYB형질환체에서 2개 균주를 임의로 선택하여 각각 C1 및 C2로 명명한다. 상기 5개 균주를 각각 N₃종배지 50ml에 접종하고, 25℃에서 3일간 진탕(220rpm)한다. 이어서, 배양액 1ml을 주 배지 30ml을 함유하는 500ml플라스크에 옮기고, 25℃에서 3일간 진탕(220rpm)한다. 수득되는 배양액 1ml을 원심 분리하여 세포를 수거하고, 수거된 세포를 ATF안정화 완충액 1ml에 현탁시키고, 초음파 분쇄기로 처리하여 세포를 분쇄한다. 생성 분쇄 세포 함유액 원심분리하여 상층액을 조세포 추출물로 수거한다. 조세포 추출물 0.05ml을 8mM 황산 마그네슘, 10mM 아세틸 코엔자임 A 및 50mM 데아세틸세팔로스포린 C를 함유하는 0.2M 트리스-HCl 용액(pH 7.5)과 혼합하고, 30℃에서 30분간 반응시킨다. 이어서, 메탄올 0.1ml을 가하고 반응을 종결시킨다. 생성 반응 혼합물을 원심분리하여 상층액을 수득하고, 상층액을 고속 액체 크로마토그래피시켜 반응 생성물인 세팔로스포린 C를 정량 측정한 후, 이 측정치를 DCPC-ATF활성 평가용으로 사용한다. 여기서 컬럼은 ZORBAX-BPNH₂컬럼(미국 E.I.Du Pont De Nemours and Co. 제 시판품)이고, 이동상은 4% 아세트산, 4% 메탄올 및 8% 아세토니트릴을 용액이며, 유속은 2ml/분이고, 검출 파장은 245nm인 조건하에 크로마토그래피한다. 결과는 표 1에 나타낸다. 표 1에서 명백히 알 수 있듯이, 플라스미드 pTCATF1로 형질전환된 2개 HYB형질전환체는 대조용 플라스미드 pACTHY83로 형질전환된 HYB형질전환체에 비해 3∼4배 높다.

[표 1]

주 : 1nm/분의 비율로 세팔로스포린 C를 생성하는 효소의 양을 1단위로 하고, 조 세포 추출물에 함유된 단백질 mg당 단위 수를 DCPC-ATF활성으로 표시함.

상기 결과는 본 발명의 DNA단편을 사용하면 아크레모늄 크리소게눔의 DCPC-ATF활성이 상승될 수 있음을 나타낸다.

[실시예 2(DCPC-ATF 게놈 DNA함유 DNA의 재조)]

I. DCPC-ATF 게놈 DNA의 단리

단계(1) : 아크레모늄 크리소게눔의 유전자 라이브러리의 재조

문헌[I.L.Johnstone. EMBO J.(1985) 4, 1307∼1311]의 아스페라긴 스니둘란스(Aspergins nidulans) 단리법과 실질상 동일한 방법으로 아크레모늄 크리소게눔 IS-5(FRI에 수탁번호 FERM BP-11232로 기탁되어 있음)주의 총 DNA를 추출한다. 총 DNA의 약 60㎍을 MobI로 부분 분해한 후 알칼린 포스파타제로 처리한다. 한편, 벡터 EMBL3(미국 Promega Co.제 시판품) 10㎍을 BamHl 및 EcoRI로 완전 분해하고, 생성 분해 DNA를 이소프로판올로 침전시켜 보다 짧은 EcoRI-BamHIeks편을 제거한다. 이어서, 수득되는 부분 분해 DNA단편 약 1㎍ 및 BamHI에 의해 생성된 말단을 갖는 벡터 약2㎍을 T4리가제로 결찰하여 삽입 λ-파지 입자를 수득한다. 수득된 적당한 농도로 회석된 재조합 파지 현탄액을 사용하여 이 콜리 NM593(미국 Promega Co.제 시판품)을 감염시킨후 플라크수를 측정한다. 결과로, 3X10⁵개 재조합 파지가 현탄액에 존재함을 발견한다. 파지 현탄액을 아크레모늄 크리소게눔의 유전자 라이브러리로 4℃에서 보관하다.

상기 공여체 DNA 및 벡터의 재조 및 이들의 결합 방법은 문헌[Frischauf et ai., J.Mol.Biol(1983) 170, 827∼842]의 방법에 따른다. DNA의 λ입자로의 도입은 패키징 엑스트랙트(Packaging Extract, 미국 Promera Co.제 시판품)을 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 수행된다.

단계(2) : 탐침의 재조

pCCSI(DCPC-ATF코딩 cDNA삽입물 함유 상응 플라스미드의 재조는 실시예 1에 기재되어 있다) 10㎍을 EcoRI로 분해하고, 생성 분해 DNA를 1% 아가로스 겔 전기영동시킨다. DCPC-ATF의 전체 코딩 영역을 함유하는 1.25kb의 cDNA단편을 Gene Clean(Gene Clean^TM, 일본국 Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd.제 시판품)을 사용하여 아가로스 겔에서 회수하여 정제 cDNA편을 수득한다. 이어서, 수득한 단편 약 50ng을 멀티프라임 DNA표지계(영국 Amersham Int,제 시판품)를 사용하여(a-³²P) 데옥시티딘산 트리포스페이트 50u Ci로 표지화한다. 이어서, 반응 혼합물을 70℃에서 10분간 가열한 후 Nick-column^TM(스웨덴 Pharmacia Fine Chemicais, AB제 시판품)을 사용하여 정제함으로써 약 10⁷cpm의 방사성을 갖는 탐침을 수득한다. 이하, 생성 탐침을 ATF-탐침으로 명명한다.

단계(3) : 하이브리드화에 의한 스크리닝

(1)에서 수득한 피지 현탄액(DNA 라이브러리)의 부분표본으로 이 콜리 NM539를 감염시키고 4개 배지 플레이트상에 배양시켜 1.5X10⁴개의 플라크를 형성한다. 이들 플라크를 니트로셀룰로스 필터에 옮기고, 생성 필터를 알칼리로 변성시키고 중화시킨 후, 문헌[Benton W.D, Science(1977) 196, 180∼182]의 방법에 따라 DNA를 고정시킨다. 이어서, 이들 플라크를 상기 단계(2)에서 수득한 ATF-탐침으로 하이브리드화 한다. 하이브리드화는 50% 포름아미도, 5XDenhardt's 5XSSPE, 0.1% SDS 및 ATP-탐침으로 함유하는 용액을 4X10⁵cpm/ml농도로 사용하여 42℃에서 15시간동안 수행된다. 이어서, 필터를 0.1% SDS 함유 2XSSC용액으로 실온에서 10분간 2회 세척한후, 0.1% SDS함유 0.2% XSSC로 50℃에서 30분간 세척한다. 증감 스크린을 사용하여 -80℃에서 24시간동안 자동방사선사진술을 수행한다. 결과로, 6개 양성 스폿을 발견한다. 6개 양성 스폿 중 3개 스폿에 상응하는 한천 부분에서 파지를 추출하고, 상기 방법에 따라 플라크 하이브리드화하여 3개 정제 양성 파지 클론을 수득한다. 이들 클론을 각각 λ-ATF1, λ-ATF2 및 λ-ATF3로 명명한다.

단계(4) : DCPC-ATF 유전자의 서브클로닝 및 그의 위치 결정

문헌[Grossberger, Nucleic Acids Research(1987) 15, 6737]의 방법에 따라 상기 단계(3)에서 수득한 3종 파지 클론에서 DNA를 추출한다. 생성 λDNA를 BamHI로 분해하고, 아가로스 겔 전기영동시킨 후 ATM-탐침을 사용하여 서던 하이브리드화한다. [Southern, J.Mol.Biol.(1975), 98, 503∼517]. 하이브리드화 및 필터 세척은 상기 단계(3)의 방법으로 수행된다. 결과로, 모든 클론에 존재하는 약 7kb의 BamHI 단편만이 ATF-탐침과 하이브리드화될 수 있음을 밝힌다. 아가로스 겔에서 약 7kb의 BamHI단편을 수거하고 상기 단계(2)의 방법으로 정제한다. 한편, 벡터용 플라스미드를 PUC18을 BamHl로 절단한 후 알칼린 포스파타제로 처리한다. 이어서, 수득된 BamHI 단편 및 플라스미드를 T4 라가제를 사용하여 서로 결찰하고, 이 콜리 JM105에 도입하고, [Maniatis Labora tory Manual]의 방법에 따라 암피 실린 100㎍/ml 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-갈락토시드 0.004%를 함유하는 L-브로쓰 한천 배지 상에 바른다. 상기 공정에 따라 수득한 백색 콜로니에서 6개 콜로니를 선택하고, [Maniatis Laboratory Manual]의 급속 소규모 단리법에 의해 플라스미드 DNA를 추출하고, 수득된 플라스미드 DNA를 BamHI로 분해하여 분석한다. 결과로, 모든 클론의 플라스미드 DNA에는 원하는 길이의 단편이 삽입되어 있음을 발견한다. 또한, 상기 방법으로 플라스미드, DNA를 서던 하이브리드화로 분석하고, 클론내의 삽입물이 목적 단편임을 확인한다. 수득된 플라스미드 중의 하나를 pATF1로 명명한다. 플라스미드 pATF1을 각종 제한효소로 분해한 후 아가로스 겔 전기영동시켜 제 3 도에 나타낸 7kb삽입물의 제한지도롤 수득한다. 이어서, DCPC-ATF 코딩 영역 부위를 결정하기 위해, 각종 제한 효소를 사용하여 pATF1을 분해하여 수득한 각 단편 및 ATF 탐침 사이에서 하이브리드화한다. 결과로, 약 1.7kb의 Bg1II-StuIe단편은 DCPC-ATF 코딩 영역의 주 부분을 함유함을 발견한다.

단계(5) : DCPC-ATF 유전자의 뉴클레오티드 서열의 결정

상기 Bg1II-StuI단편의 전체 뉴클레오티드 서열을 Sanger 등의 방법으로 결정한다. 상세히 말하면, 이 조작은 서열화키트(일본국 Takara Shuzo Co.,Ltd.제 시판품)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 수행된다. 뉴클레오티드 서열결정후, 뉴클레오티드 서열을 이미 공지된 DCPC-ATFㆍcDNA의 뉴클레오티드 서열과 비교한다. (제 2(a) 도 및 제 2(b) 도 참조) 결과로, 상기 결정된 뉴클레오티드 서열은 DCPC-ATF cDNA의 뉴클레오티드 서열을 함유함을 발견한다. 이것은 BglII-StuI 단편이 DCPC-ATF 전체 코딩 영역을 함유함을 확증한다. 또한, DCPC-ATF 유전자는 2개 이상의 인트론 및 3개 이상의 엑손을 함유함을 밝힌다. 상기 결정된 1731bp의 뉴클레오티드 서열을 그의 번역 생성물의 아미노산 서열과 함께 제 4 도에 나타낸다.

Ⅱ. 플라스미드 pTATF1의 제작

제 5 도에 나타낸 공정에 따라, 플라스미드 pTATF1을 제작하여 DCPC- ATF유전자의 추가 복사의 아크레모늄 크리소게눔으로의 도입에 사용한다. 그 공정은 다음과 같다 ;

먼저 실시예 2의 단계(4)에서 수득한 플라스미드 pATF1을 BglII 및 BamHI로 동시 분해한 후, DNA폴리머라제 클레노우 단편 및 4종의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트와 반응시켜 분해에 의해 형성된 말단을 무디게 만든다. 생성 반응 혼합물을 아가로스 겔 전기영동시키고, DCPC-ATF 전체 코딩 영역을 함유하는 약 3.8kb의 단편을 겔에서 수거하고 전제한다. 수득된 단편을, SmaI로 절단되고 알칼린 포스파타제로 처리된 pACTHY83에서 T4 라가제를 사용하여 결찰함으로써 플라스미드 pTATF1을 수득한다. 상기 공정에 있어서, 제한 효소에 의한 분해로 수득된 DNA 단편의 분리 및 정제 : DNA 단편들 사이의 결찰에 의한 플라스미드의 형성 : 수득된 플라스미드에 의한 이 콜리의 형질전환 ; 수득된 형질전환체에서 플라스미드의 재조 ; 및 재조된 플라스미드 분석과 같은 조작은 실시예 1의 I의 방법으로 [Maniatis Laboratory Manual]의 방법에 따라 수행된다.

Ⅲ. pTATF1에 의한 아크레모늄 크리소게눔의 형질전환

플라스미드 pTCATF1을 아크레모늄 크리소게눔에 IS-5 주로 도입하여 DCPC-ATF 합성능이 증강된 형질전환체를 수득한다. 그 공정을 이하에 상세히 설명한다.

단계(1) : pTCATF1에 의한 원형질체의 형질전환

실시예 1의 방법으로 수득한 원형질체 현탄액 0.1ml에 플라스미드 pTATF1 5㎍(10ul)을 가한 후 PEG용액 0.05ml을 가하고 서서히 교반한다. 생성 혼합물을 빙상에 25분간 방치한 후, PEG용액 1ml을 가하고, 실온에서 30분간 방치한다. 수득되는 형질전환된 원형질체 현탄액을 원형질체 재생 배지(문헌[Isogai et al, Argic.Biol.C hem.1987, 51, 2321∼2329]에 기재된 BRM배지) 25ml을 함유하는 플레이트 상에 스폿 당 0.2ml의 양으로 스폿 형태로 뿌린 후 15℃에서 20분간 배양한다. 여기서, 히그로마이신 B 4.5mg을 함유하는 BRM배지 5ml을 가하고, 50℃에 유지시키고, 상기 플레이트 상에 포갠 후 28℃에서 14일간 배양한다. 결과로, 히그로마이신 B에 내성이 된 형질전환체(이하 “HYB 형질전환체”로 칭함) 60균주가 나타난다. 대조용으로 플라스미드 pACTHY83을 사용하여 상기와 실질상 동일하게 형질전환하여 HYB 형질전환체 75균주를 수득한다.

단계(2) : DCPC-ATF활성의 측정

상기 단계(1)에서 플라스미드 pTATF1을 사용하여 수득한 HYB 형질전환체에서 3개 군주를 임의로 선택하여 각각 AT1, AT2 및 AT3로 명명한다. 상기 단계(1)에서 플라스미드 pACTHY83을 사용하여 수득한 HYB형질전환체에서 2개 균주를 임의로 선택하여 각각 C1 및 C2로 명명한다. 상기 5개 균주를 각각 N3 종 배지 50ml에 접종하고, 25℃에서 3일간 진탕(220rpm)한다. 이어서, 배양액 1ml을 주배지 30ml을 함유하는 500ml들이 플라스크에 옮기고, 25℃에서 3일간 진탕(220rpm)한다. 수득된 배양액 1ml을 원심분리하여 세포를 수거하고, 수거한 세포를 ATF안정화 완충액 1ml에 현탁시킨후, 초음파 분쇄기로 세포를 분쇄한다. 분쇄 세포를 함유하는 생성액의 ATF 활성을 실시예 1의 방법으로 측정한다. 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2에서 명백히 알 수 있듯이, 플라스미드 pTATF1에 의해 형질전환된 HYB형 질전환체는 대조용 플라스미드 pACTHY 83에 의해 형질전환된 형질전환체에 비해 3~4배 높은 DCPC-ATF활성을 나타낸다.

[표 2]

주 : 1mm/분의 비율로 세팔로스포린 C를 생성하는 효소의 양을 1단위로 하고, 조 세포 추출물에 함유된 단백질의 mg당 단위 수를 DCPC-ATF활성으로 나타낸다.

상기 결과는 본 발명의 DNA단편을 사용하면 아크레모늄 크리소게눔의 DCPC-ATF활성을 상승시킬 수 있음을 나타낸다. 또한, 상기 결과는 본 발명의 DNA단편, 즉 3.8kb의 GglII-BamHI단편은 DCPC-ATF유전자의 프로모터 및 터미네이터를 함유함을 나타낸다.

[참고예 1]

데아세틸세팔로스포린 C 아세틸트란스페라제의 단리

참고예에서 사용되는 측정법은 다음과 같다.

방법 1 : 효소 활성 측정

기질로 데아세틸세팔로스포린 C 및 아세틸-코엔자임 A를 사용하여 세팔로스포린 C를 생성하는 반응을 수행하고, 고속액체 크로마토그래피로 세팔로스포린 C를 측정한 후, 세팔로스포린 C의 생성량을 기준으로 활성을 계산함으로써 DCPC-ATF의 활성을 측정한다. 활성 측정에 대해 이하의 상세히 설명한다.

4mM 황산 마그네슘, 2.5mM 데아세틸세팔로스포린 C 및 5mM 아세틸-코엔자임 A를 함유하는 1M 트리스-HCI(pH 7.5) 0.1ml에효소 0.0001~0.001U를 가하고, 생성 혼합물을 30℃에서 30분간 반응시킨후, 에탄올 0.1ml을 가하여 반응을 종결시킨다. 생성 반응 혼합물을 2분간 원심분리(10,000×g)하여 상층액을 수득한다. 상층액에 함유된 혀성 세팔로스포린 C를, 컬럼은 ZORBAX-BP NH2컬럼(미국 E.I.Du Pont De Nemou r s and Co. 제 시판품 : 4.5Mmm×25cm)이고, 이동상은 4% 아세트산, 4% 메탄올, 8%아세토니트릴 및 84% 물을 함유하는 용액이며, 유속은 1.5~2.2ml/분이고, 측정 파장은 254mm인 조건 하에 고속 액체 크로마토그래피로 측정한다. 외부 표준용으로 세팔로스포린 C의 표준 생성물을 사용한다.

방법 2 : 분자량 측정

TSK겔 G3000 SWXL(일본국 Toyo Soda Mfg.Co., Ltd.제 시판품 : 7.8mm×30cm)를 사용하여 겔 여과로 활성 DCPC-ATF의 분자량을 계산한다. 분자량 표준용으로, 소 혈청 알부민(분자량 67000), 오브알부민(분자량 43000), 키모트립시노겐 A(분자량 25000) 및 리보뉴클레아제 A(분자량 13700)를 사용한다.

각 서브유니트의 분자량을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한다. 분자량 표준용으로, 포스 포리파제 B(분자량 94000), 소 혈청 알부민(분자량 67000), 오브알부민(분자량 43000), 카르보닉 안히드라제(분자량 30000), 대두 트립신 억제제(분자량 20100) 및 a-락트알부민(분자량 14400)을 사용한다.

방법 3 : 단백질 농도 측정

문헌[Bradford, M.M., Analytical Biochemistry, 72, 248∼254(1976) ]의 방법에 따라 표준용으로 소혈청 알부민을 사용하여 단백질 농도를 측정한다.

방법 4 : 아미노산 서열 분석

SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 정제 DCPC-ATF가 2개 서브유니트로 분리되는 방법으로 아미노산 서열을 분석한 후, 겔에서 서브유니트를 추출하고, 서브유니트를 각각 통상의 조건하에 에드만 분해 반응시키고, 각 사이클에서 수득한 페닐티오히단토인 아미노산 유도체의 양을 측정한다.

페닐오히단토인 아미노산 유도체의 측정은 컬럼이 PTH-C18(미국 Applied Biosystems제 시판품)이고, 검출파장이 269mm인 조건하에 수행된다.

DCPC-ATF의 정제

사카로스 2%, 탄산 칼슘 0.5%, 아세트산 암모늄 0.8%, 스타치 3%, 당밀 5% 탈지 대두 6% 및 메틸올레에이트(pH 6.4) 3%를 함유하는 배지에 아크레모늄 크리소게눔을 배양한다. 생성 배양 브로쓰를 10분간 원심분리(600Xg)하여 세포를 수거하고, 세포를 염화나트륨 0.85%를 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 세척하여 세포의 수화제를 수득한다.

상기 수득된 세포 수화제 500g을 15% 에틸렌글리콜, 10mM 디티오트레이톨, 10mM 7-아미노세팔로스포란산, 1mM EDTA 및 1mM 파라아미노디페닐메탄술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드를 함유하는 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 현탁시켜 총 부피를 1l로 한다. 차후 조작은 5℃에서 수행한다. 상기 세포 현탄액을 초음파 처리한 후 15000Xg로 10분간 원심분리하여 상층분획을 조 효소액으로 수득한다. 조 효소액은 총 단백질 22.9g, 총 활성 25.7U 및 상대 활성 0.001U/mg을 가짐을 밝힌다.(1㎛/분의 비율로 세팔로스포린 C를 생성하는 효소의 양을 1단위로 하고, 조 세포 추출물에 함유된 단백질 mg당 단위 수를 DCPC-ATF비활성으로 한다]

ATF-BAES함유 인산염 완충액으로 평형화시킨 DEAE-세파로스 CL-6B컬럼(스웨덴 Pharmacia Fine Chemical AB제 시판품 : 4㎝X50㎝)상에 조 효소액 1/4부피양을 흡착시키고, ATF안정화 완충액 중의 0∼0.5M 염화나트륨의 선형 구배(총 부피 2500ml)를 사용하여 유속 200ml/시간으로 용출한다. 염화나트륨 농도가 0.17∼0.2M일 때 DCPC-ATF분획이 용출된다. 상기 공정을 4회반복하여 총 부피양의 조 효소액을 처리한다. 상기 약염기성 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 총 단백질 800mg, 총 활성 7.1U 몇 상대 활성 0.009U/mg을 갖는 DCPC-ATF분획을 수득한다.

상기 수득된 DCPC-ATF활성 분획에 포화도가 25% 달성될 수 있는 양으로 황산 암모늄을 가하고, 냉각하에 15분간 교반하여 황산 암모늄을 용해시킨다. ATF안정화 완충액으로 평형화시킨 페닐-세파로스CL-4B컬럼(스웨덴 Pharmacia Fine Chemicals AB제 시판품 : 3㎝X20㎝)상에 DCPC-ATF활성 분획을 흡착시킨다. ATF안정화 완충액 중의 황산 암모늄 25∼0% 및 에틸렌글리콜 10∼60% 선형구배를 사용하고, 유속이 150ml/시간이며, 총부피가 1000ml인 조건하에 용출된다. 황산 암모늄 농도가 8∼3%이고 에틸렌글리콜 농도가 40∼48%일때 DCPC-ATF활성 분획이 용출된다. 따라서, 수득되는 DCPC-ATF분획은 총 단백질 16mg, 총활성 1.9U 및 상대 활성 0.12U/mg을 갖는다. 센트리프랩 10(미국 Amicon Plastics Inc.제 시판품)을 사용하여 총부피가 6ml이 되도록 DCPC-ATF활성 분획을 농축한다. ATF-안정화 완충액으로 평행화시킨 세파크릴 S-200수퍼파인 컬럼(스웨덴 Pharmacia Fine Chemi cals AB제 시판품)으로 농축액의 1/3부피양을 패킹하고, 유속 40ml/시간으로 3회 겔 여과한다. 이렇게해서 총 단백질 2mg. 총활성 0.4U 및 상대 활성 0.2U/mg을 갖는 DCPC-ATF분획을 수득한다.

센트리프렙 10을 사용하여 총 부피가 2ml이 되도록 상기 수득된 DCPC -ATF분획을 농축한다. ATF안정화 완충액으로 평화시킨 TSK-겔 DEAE-5PW(단백질 정제용 고속 액체 크로마토그래피용 컬럼 : 일본국 Toyo Soda Mfg.Co., Ltd.제 시판품 : 2.1㎝X15㎝)상에 노축액을 흡착시킨다. ATF안정화 완충액중의 0∼0.5M 염화나트륨의 선형 구배를 사용하고, 유속이 3ml/분이며, 총 부피가 300ml인 조건하에 용출한다. 이렇게 해서 총 단백질 0.1㎎, 총 활성 0.13U, 상대 활성 1.3U/㎎ 및 순도 약 100%를 갖는 정제 DCPC-ATF효소를 수득한다. 상기 효소 정제 공정의 각단계의 결과를 하기 표 3에 요약한다.

[표 3]

주 : HPLC는 고속액체크로마토그래피를 의미한다. 각 단계에서 수득된 차트를 제 9 도∼제 12 도에 나타낸다.

상기 수득된 정제 효소를 그 특성에 대해 연구한 결과를 하기 a∼f항에 나타낸다.

a. 효소는 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 2개 서브유니트 1 및 2로 분리된다. 서브유니트 1은 분자량은 27,000 ±2,000달톤을 가지며, 서브유니트 2은 분자량 14,000 ±2,000달톤을 갖는다.

b. 효소는 겔 여과로 측정시 분자량 55,000 ±2,000달톤을 갖는다.

c. 효소는 pH 4.0 ±0.5에서 등전점을 갖는다.1

d. 서브유니트 1은 하기 N-말단 아미노산 서열을 갖는다 :

Len-X-Ala-Gln-Asp-Ile-Ala-Arg-Ile-Ser-Leu-Phe-Thr-Leu-Glu-

Ser-Gly-Val-Ile-Leu-Arg (식중, X는 미결정 부분이다)

e. 서브유니트 2은 하기 N-말단 아미노산 서열을 갖는다 :

Asp-Ser-Gly-Asn-Ser-His-Arg-Ala-Gly-Gln-Pro-Ile-Glu-Ala-

Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Arg-Tyr-Gln-Ala-Gln-Lys-Phe-Ala

참고예 2[pGKCS의 제작]

Ⅰ. 아크레모늄 크리소게눔 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 유전자의 단리

단계(1) : 아크레모늄 크리소게눔 유전자 라이브러리 재조

아스페르길루스 니둘란스에 대한 문헌[I.L.Johnstone et al., EMBOJ4, 1307∼1311, 1985]의 방법에 따라 아크레모늄 크리소게눔 IS-5주(FRI에 수탁번호 FERM BP-11232로 기탁되어 있음)의 총 DNA를 추출한다. 총 DNA의 약 60㎍을 제한 효소 MboI로 부분 분해하고, 알칼린 포스파타제로 처리한다. 한편, λ-벡터 EMBL3(미국 Promega Co.제 시판품) 10㎍을 BamHI 및 EcoRI로 완전 분해하고, 이소프로판을 침전시켜 짧은 링커 EcoRI-BamHIeks단편을 제거한다. 이어서, 상기 수득한 부분 분해 DNA단편 약 1㎍을 T4 리가제를 사용하여 BamHI 말단 함유 벡터 2㎍과 결찰한 후 λ-파지 입자로 패키징한다. 이렇게 수득된 재조합 파지 현탄액을 적당한 농도로 회석하여 이 콜리 NM539(미국 Promega Co.제 시판품) 감염용으로 사용함으로써 플라크를 형성하고, 형성된 플라크 수를 측정한다. 결과로, 파지 현탄액이 3X10⁵개 입자의 재조합 파지를 함유함을 밝힌다. 이 파지 현탁액을 아크레모늄 크리소게눔 유전자 라이브러리로 4℃에 보관한다. 상기 공정에 있어서, 공여체 DNA 및 벡터의 재조 및 이들 사이의 결찰 반응은 문헌[Frischauf et al., J.Mol .Biol. 170, 827∼842, 1983]의 방법에 따라 수행된다. 또한, DNA의 λ-입자로의 패키징은 패키징 엑스트랙트(미국 Promega Co.제 시판품)을 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 수행된다.

단계(2) : 탐침 재조

사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)의 총 DNA를 HindI II로 분해하고, pBR327(ATCC 37516)의 HindIII부위로 삽입하여 유전자 라이브러리를 수득한다. 문헌[Hitzeman et al., Nucleic Acids Res., 10, 7791∼7808, 1982]에 보고된 사카로미세스 PGK유전자의 뉴클레오티드 서열에 의거하여 고안된 서열 5'-CAGATCATCAAGAAGTAATTATCT-3'의 합성 올리고뉴클레오티드에 의해 유전자 라이브러리를 스크리닝하여, 사카로미세스 세레비시아에 유래 전체 PGK유전자 함유 HindIII단편(2.9kb)을 함유하는 플라스미드 pYPGK1을 수득한다. pYPGk1 20㎍을 HindIII 및 EcoRI로 분해하고, 1% 아가로스 겔 전기영동한 후, [Maniatis Laboratory Manual, p.164∼165]의 방법에 따라 2.9kb의 단편을 수거 및 정제한다. 수득된 단편 약 200ng을 닉(Nick) 번역 키트(일본국 Takara Shuzo Co., Ltd 제 시판품)를 사용하여 첨부된 프로토콜에 따라 [a-³²P] 데옥시시티딘트리포스페이트(dCTP)(50uCi)로 표지화한다. 반응 혼합물을 70℃에서 10분간 가열한 후, 표지 단편을 닉-컬럼(스웨덴 Pharmacia Fine Chemicals AB제 시판품)으로 정제하여 약 10⁷cpm의 방사성을 갖는 탐침(이하, “YP-탐침”으로 칭함)을 수득한다.

단계(3) : 하이브리드화에 의한 스크리닝

상기 단계(1)에서 수득한 파지 현탄액(유전자 라이브러리)의 부분 표본으로 이. 콜리 NM539를 감염시키고, 감염된 NM539를 4개 플레이트 상에 배양하여 총 2 X10⁴개의 플라크를 형성한다. 문헌 [W.D.Benton et al., Scie nce, 196, 180∼182, 1977]의 방법에 따라, 이들 플라크를 니트로 셀룰로스 필터 상에 옮긴 후 알칼리로 변성시키고 중화 처리하여 DNA를 고정시킨다. 이어서, 이들 플라크를 상기 단계 (2)에서 수득한 YP-탐침과 하이브리드화한다. 하이브리드화는 30% 포름아미드, 5 XDenhardt's, 5XSSPE, 0.1% SDS 및 YP-탐침을 함유하는 용액에서 최종 농도 5 X10⁵cpm/ml로 42℃에서 16시간동안 수행된다. 이어서, 0.1% SDS함유 6XSSC용액으로 실온에서 10분간 필터를 2회 세척한후, 0.1% SDS함유 1XSSC용액으로 42℃에서 30분간 세척한다. 증감 스크린을 사용하여 -80℃에서 16시간동안 자동방사선 사진술을 수행한다. 결과로, 7개 양성 스폿을 발견한다. 이들 7개 양성 스폿 중 4개의 상응하는 한천 부분에서 파지를 수거하고, 상기와 동일한 방법으로 플라크 하이브리드화하여 4개의 순수 양성 파지 클론을 수득한다. 이들 클론을 각각 λ-PGK1, λ-PGK2, λ-PGK3 및 λ-PGK4로 명명한다.

단계(4) : PGK유전자의 서브클로닝 및 위치 결정

상기 단계(3)에서 수득한 4개 파지 클론에서 문헌[Grossberger, Nucleic Acicls Research, 15, 6737]의 방법에 따라 DNA를 추출한다. λ-DNA를 BamHI로 분해한후 아가로스 겔 전기영동하고, YP-탐침을 사용하여 서던 하이브리드화한다. [Southern, J.Mol.Biol, 98, 503∼517, 1975]. 상기 공정에 있어서, 하이브리드화 및 필터의 세척은 단계 (3)의 방법으로 수행된다. 결과로, 모든 클론에 존재하는 약 5.5kb의 BamHI단편만이 상기 YP-탐침과 하이브리드화함을 발견한다. 아가로스 겔에서 단편을 수거하고 Gene Clean^TM(일본국 Funakoshi Pharmaceutical Co.,Ltd.제 시판품)을 사용하여 첨부된 프로토콜 따라 정제한다. 한편, 벡터용 PUC18(일본국 Takara Shuzo Co. Ltd제 시판품)을BamHI로 분해한 후 알칼린 포스파타제로 처리한다. 이어서, 상기 단편 및 벡터를 T4 리가제를 사용하여 서로 결찰하고, [Maniatis Laboratory Manual, p.225∼253]의 방법에 따라 이.콜리 JM105로 도입한다. 생성 형질전환체를 암피실린(Amp) 100㎍/ml 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-ß-갈락토시드(X-Gal) 0.004%를 함유하는 L-브로쓰 한천 배지 상에 배양하여 백색 콜로니를 수득한다. 여기서 6개 콜로니를 선택하고, 급속 소규모 단리 방법[Maniatis Laboratory Manual, p.368∼369]으로 플라스미드 DNA를 추출하여 수득한 플라스미드 DNA를 BamHI로 분해 분석한다. 결과로, 6개 클론 중 5개 클론의 플라스미드 DNA에 목적 단편이 삽입 되어 있음을 발견한다. 또한, 상기 방법으로 플라스미드 DNA를 서던 하이브리드화로 분석하여 클론내의 삽입물이 목적 단편임을 확인한다. 이렇게 해서 수득된 플라스미드 중의 하나를 pPGK5로 명명한다.

플라스미드 pPGK5를 각종 제한 효소로 분해한 후, 아가로스 겔 전기영동하여 제 6 도에 나타낸 5.5kb삽입물의 제한지도를 수득한다.

단계(5) : pGKBL재조

상기 단계(4)에서 수득한 플라스미드 pPGK5를 BglII로 분해하고, PGK유전자 함유 단편(3.6kb)을 단리 경제한다. 단편을 상기 단계(4)에서 재조한 pUC18의 BamHI부위에 삽입하여 pGKBL을 수득한다. 동시에, 상기와 동일한 단편을 pGKBL의 경우와 역방향으로 삽입한 또 하나의 플라스미드를 수득하고 pGKBL로 명명한다.

단계(6) : pGKCS재조

상기 단계(5)에서 수득한 플라스미드 pGKBL을 MluI 및 XhoI로 절단하고, 4.8kb의 단편을 단리 정제한다. 이 단편을 하기식의 합성 링커에 결합하여 pGKCS를 수득한다.

5'CGCGTCGATTCACAGTCAAAAGATC-3'

3'AGCTAAGTGTCAGTTTTCTAGAGCT-5'

또한, pGKBL대신에 pGKBL'을 사용하는 것이외는 상기와 실질상 동일한 조작을 수행한다. pGKCS 및 pGKCS'은 아크레모늄 크리소게눔 유래 PGK 프로모터 및 터미네이터를 함유하는 단편이 발현에 적합한 서열내의 특정 제한 부위(BglII 및 XhoI)를 통해 삽입된 구조를 갖는 플라스미드이며, 이들 플라스미드는 아크레모늄 크리소게눔에서 각종 외래 유전자 발현용 벡터 제작용 출발 물질로 유용하다. 상기 링커는 공지 방법에 따라 DNA합성기 모델 380-A(Applied Biosystems제 시판품)를 사용하여 2개 단일가닥으로 합성된다.

참고예 3[pACTHY83의 제작]

I. 악틴 유전자의 클로닝

단계(1) : 하이브리드화에 의한 악틴 유전자 함유 클론의 스크리닝

³²P로 표지된 인체 β-악틴 유전자의 제 3 엑손을 함유하는 HindI 400bp단편(일본국 Wako Pure Chemical Ind., Ltd.제 시판품)을 탐침(이하, "ACT탐침"으로 칭함)으로 사용하여 참고예 2의 단계(1)에서 재조한 아크레모늄 크리소게눔 유전자 라이브러리를 참고예 2의 단계(1)과 동일한 조건하에 스크리닝하여 상기 탐침과 하이브리드화할 수 있는 4개 파지를 수득한다.

단계(2) : 악틴 유전자의 서브클로닝 및 그의 위치 결정

상기 단계(1)에서 수득한 파지 중 하나에서 DNA를 추출하고 λACT5로 명명한다. 이어서, λACT5를 Xhol 및 SalI로 각각 분해하고, 아가로스 겔 전기영동한 후, 상기 ACT탐침을 사용하여 서던 하이브리드화한다. 결과로, 5.4kb의 XhoI단편 및 각 크기 1.3kb 및 1.5kb의 2종 Sall단편이 탐침과 하이브리드화됨을 발견한다. 이어서, 이들 3종 단편, 즉 XhoI-5.4kb단편, SalI-1.5kb단편 및 SalI-1.3kb단편을 각각 pUC18의 SalI부위로 서브클로닝하여 pACT5X, pACT5SS 및 pACT5SL을 수득한다. 이어서, 이들 플라스미드의 부분 제한 지도를 재조하고, 이들 지도를 서로 오버랩하고, 악틴 유전자를함유하는 것으로 생각되는 약 6kb의 DNA단편의 제한 지도를 재조하여 제 13 도에 나타낸다.

상기 서던 하이브리드화는 ACT탐침을 사용하는 것 이외는 참고예 2의 단계(4)의 방법으로 수행된다.

Ⅱ. pACTHY83제작

제 14 도에 나타낸 공정에 따라, 아크레모늄 크리소게눔 유래 악틴 프로모터의 조절하에 히그로마이신 B 포스포트란스페라제 유전자(이하, “HYB^R유전자"로 칭함) 발현용으로 플라스미드 pACTHY83을 제작한다. 각 단계를 이하에 설명한다.

단계(1) : pACT△NP재조

상기 Ⅰ의 단계(2)에서 수득한 플라스미드 pACT5X을 NsiI 및 PstI로 동시 분해하여 5.3kb의 단편을 재조한다. 이어서, T4 리가제를 사용하여 단편을 재결찰(자체 사이클화)시켜 pACT△NP를 수득한다.

단계(2) : pACTB1, pACTB2 및 pACTB3재조

상기 단계(1)에서 수득한 pACT△NP를 NcoI로 분해하고, 생성 점착 밀단을 DNA 풀리머라제 클레노우 단편(이하, “DNA pol"로 칭함) 및 4종의 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(데옥시아테노신 트리포스페이트, 데옥시구아노신 트리포스페이트, 데옥시시티딘 트리포스페이트 및 티미딘 트리포스페이트 : 이하, 4 dNTPs로 칭함)를 사용하여 무디게 만든다. 이어서, 5'-말단을 포스포릴화하고, 하기 서열을 갖는 BamHI링커(일본국 Takare Shuzo Co., Ltd제 시판품)를 T4 리가제를 사용하여 말단에 결찰한 후, BamHI로 분해한다.

5'CCCGGATCCGGG3'

3'GGGCCTAGGCCC5'

분해물을 아가로스 겔 전기영동하고, 4Kb의 DNA단편을 단리 정제한다. 또한 이 단편을 T4 라가제를 사용하여 자체 사이클화하여 pACTB1을 수득한다. 또, 상기 링커와는 상이한 서열 및 염기쌍 수를 갖는 하기 2종의 BamHI링커(일본국 Takara Shuzo Co., Ltd.제 시판품)를 각각 사용하여 상기와 동일하게 조작함으로써 각각 pACTB2 및 pACTB3를 수득한다.

5'CCGGATCCGG3'

3'GGCCTAGGCC5' 및

5'CGGATCCG3'

3'GCCTAGGC5'

단계(3) : pACTCS1, pACTCS2 및 pACTCS3재조

상기 Ⅰ의 단계(2)에서 수득한 플라스미드 pACTSS를 BamHI로 분해하고, 그의 말단을 DNA pol 및 4dNTPS를 사용하여 무디게 한후, T4 리가제를 사용하여 자체 사이클화함으로써 BamHI부위가 결여된 플라스미드 pACTSS△Bam을 수득한다. 이어서, 이 플라스미드를 ScaI 및 EcoRI로 분해하고, 악틴 유전자의 터미네이터를 함유하는 것으로 생각되는 0.9kb의 단편을 단리 정제한다. 이 단편을 pACTB1의 SmaI과 EcoRI 부위 사이에 삽입하여 pACTCS1을 수득한다. 또한, 상기와 동일한 0.9kb의 단편을 각각 pACTB2 및 pACTB3의 SmaI과 EcoRI부위 사이에 삽입하여 각각 pACTCS2 및 pACTCS3를 수득한다. 이들 3종의 플라스미드는 아크레모늄 크리소게눔 유래 악틴 프로모터 및 터미네이터를 각각 함유하는 단편이 발현에 적합한 서열내의 특정 제한 부위 BamHI(악틴 출발 코돈 ATG하류에 위치)을 통해 삽입된 구조를 가지며, 이들 플라스미드는 아크레모늄 크리소게눔에서 각종 목적 유전자 발현용 벡터 제작용출발 물질로 유용하여 융합 단백질을 생성한다. 이들 3개 플라스미드 중 1개를 사용하여 목적 유전자를 악틴 유전자와 동일한 리딩 프레임으로 결찰할 수 있다.

단계(4) : pACTHY83 재조

플라스미드 pLG83(파스퇴르 실험실의 Julian Davies교수로부터 수득됨)을 BamHI로 절단하고, HYB^R유전자를 함유하는 1.3kb의 단편을 단리 정제한다. 이 단편을 BamHI로 분해하고, pACTCS1에 결찰하고, 제 14 도에 나타낸 방향으로 알칼린 포스타제로 처리하여 pACTHY83을 수득한다. 상기 PLG83은 HYB^R유전자를 갖는 효모용 벡터이고, 그의 특징은 문헌[Gritz et al, Gene(1983) 25, 179∼188]에 기재되어 있다. 상기 단계 (1)∼(4)에서, 제한 효소-분해 단편의 단리 정제, 플라스미드의 단편으로의 결찰, 이. 콜리의 형질전환, 및 서브클로닝에 의해 수득된 플라스미드의 재조 및 분석과 같은 기본 조작은 참고예 2의 Ⅰ과 동일한 방법으로 수행 될 수 있다.

Claims (14)

1. 데아세틸세팔로스포린 C 아세틸트란스페라제 코딩 유전자를 함유하는 단리 DNA.
2. 제 1 항에 있어서, 유전자가 아크레모늄 크리소게눔 유래 유전자의 DNA.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유전자가 cDNA인 DNA.
4. 제 3 항에 있어서, cDNA가, 하기 식(Ⅰ)의 아미노산 서열을 함유하며 데아세틸세팔로스포린 C를 세팔로스포린 C로 아세틸화하는 것에 대한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 cDNA인 DNA.

   

   

   [상기 식중, Met는 메티오닌 잔기, Gln은 글루타민 잔기, Asp는 아스파르트산 잔기, Pro는 프롤린 잔기, Tyr는 티로신 잔기, Val는 발린 잔기, Lys는 리신 잔기, Glu는 글루탐산 잔기, Ala는 알라닌 잔기, Asn는 아스파라긴 잔기, Leu는 로이신 잔기, Phe는 페닐알라닌 잔기, Gly는 글리신 잔기, His는 히스티딘 잔기, Ser는 세린 잔기, Thr는 트레오닌 잔기, Ile는 이소로이신 잔기, Trp는 트립토판 잔기, Arg는 아르기닌 잔기 및 Cys는 시스테인 잔기이고 ; 식(Ⅰ)의 좌측 및 우측 말단은 각각 N-말단 및 C-말단을 나타낸다]
5. 제 4 항에 있어서, cDNA가 하기 식(Ⅱ)의 뉴클레오티드 서열을 함유하거나 유전 암호 축퇴에 따라 하기 식(Ⅱ)의 뉴클레오티드 서열중 적어도 1개의 뉴클레오티드를 치환함으로써 수득된 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA :

   

   

   

   [상기 식중, A는 데옥시아데닐산 잔기, G는 데옥시구아닐산 잔기, C는 데옥시시티딜산 잔기 및 T는 티미딜산 잔기이고 ; 식(Ⅱ)의 좌측 및 우측 말단은 각각 5'-말단 및 3'-말단을 나타낸다].
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 유전자가 게놈 DNA인 DNA
7. 제 6 항에 있어서, 게놈 DNA가 제 3 도의 제한 지도에 의해 정의되는 DNA.
8. 제 7 항에 있어서, 제 3 도에 나타낸 Bg1II과 StuI사이의 뉴클레오티드 서열이 제 4(a) 도 및 제 4(b)도에 나타낸 바와 같은 DNA.
9. 데아세틸세팔로스포린 C를 세팔로스포린 C로 아세틸화하는 것에 대한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 제 3 항 내지 제 5 항중 어느 한항의 DNA의 적어도 일부분이 삽입된 벡터를 함유하며, 이 일부분이 아크레모늄 크리소게눔에서 발현가능한 형태로 존재하는, 숙주 세포에서 복제가능한 재조합 DNA.
10. 제 9 항의 재조합 DNA에 의해 형질 전환된 아크레모늄 크리소게눔.
11. 데아세틸세팔로스포린 C를 세팔로스포린 C로 아세틸화하는 것에 대한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 제 6 항 내지 제 8 항중 어느 한항의 DNA의 일부분이상이 삽이된 벡터를 함유하며, 이 일부분이 아크레모늄 크리소게눔에서 발현가능한 형태로 존재하는, 숙주 세포에서 복제가능한 재조합 DNA.
12. 제 11 항의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 아크레모늄 크리소게눔.
13. 제 10 항 또는 제 12 항의 아크레모늄 크리소게눔을 배양하여 세팔로스포린 C를 생성하고, 이 세팔로스포린 C를 단리함을 특징으로 하는 세팔로스포린 C의 재조방법.
14. 제 13 항에 있어서, 배양이 25∼30℃에서 세팔로스포린 C의 생합성에 사용되는 pH 6∼7의 배지에서 수행되는 방법.

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