LV12000B - UREAXIDIDE ACTIVITY ACTIVITY AND ACQUISITION - Google Patents

Abstract

The invention concerns a new urate oxidase activity protein which has the sequence (I), possibly preceeded by a methionine, or in that it may present a degree of substantial homology with this sequence. The invention is also aimed at medicines containing this protein, as well as the genetic engineering implements to obtain it.

Description

1 LV 12000

Protein a activite urate oxydase, gene recombinant codant pour cell, vecteur d'expression, microorganisms and cell transients. L'Invention concerne uneuvetle protein a activite 05 urate oxydase / and medicament contenant cell de cie et les deils de genie pour proteire et notamment et gene recombinant and vecteur d'expression portant gene, les microorganisms procaryotes et les cellules eucaryotes transformees par ce vecteur d'expression. 10 L'urate oxydase (EC 1.7.3.3.), Egalement denommee uridase, est une enzyme de la voie de degradation des purines. Cette enzyme n'existe pas chez les primates (comme l'Homme), les oiseaux, quelques reptiles ni chez la plupart des insectes. Certains chiens (comme le dalmatien) en sont egalement depourvus. 15 Chez l'homme, les bases puriques, adenine et guanine, sont converties en xanthine. La xanthine est oxydee par la xanthine oxyda $ e pour former l'acide urique selon la reaction: xanthine + V ^ O + 0 ^ - > acide urique + 0 ^ · 20

Le radical (> £, substrate de la superoxyde dismutase, est transformed into cette derniere en peroxyde d * hydrogene. L'acide urique, metabolite present dans le sang, se trouve normalement essenceellus sous de de monosodique 25 soluble. Toutefois, il peut arriver que, chez certaines personnes, l'acide urique precipite et form des calculs l'hyperuricemie, augmentation de la quantite d'acide urique en circulation dans le sang, cause le depot d'acide urique cartilagineux, ce qui entraine la goutte.L'hyperuricemie peut egalement avoir des 30 consequences sur les reins: un exces d'acide urique dans l'urine et dans les reins peut conduire a une nephrolithiase a acide urique, c'est-à-dire à l '. accumulation de calculs renaux qui sont tres douloureux et peuvent endommager te rein Ces calculs sont composes d'acide urique eventuellement associe avec des sels phos-35 phates et oxalates 2

La surproduction d'acide urique peut avoir des origines diverses: defauts metaboliques congenitaux, syndrome de

Lesch-Nyhan, l'estestion en exces de purine oii de protins, traitement avec des drogues uricosuriques, traitement des 05 hemopathies, notamment cancereuses à L'aide des cytolytiques (chimiotherapie) ou par radiotherapie, etc. (Gutman, AB et al., T. F. (1968) Am. J. Med. 45-756-779). L'urate oxydase, enzyme qui catalysis La degration de l'acide urique en alLantoine (compose beaucoup plus soluble que 10 L'acide urique, non-cristaLLisant pas aux concentrations dans Les liquides bioLogiques), present donc and interte therapeutical. Utilizing en injection, eLLe presente and grand nombre d'avan-tages dans le traitement de L'hyperuricemie et des nephroLi-thiases: rapidite de L'effet hypo-uricemiant (diminution de 15 L'ordre de 50% de L'hyperuricemie en moins de 24 h), meiLLeure protection du rein contre Les Lithiases for rapport a d'autres comogues L'aLLopurinoL (inhibitur de la xanthine oxydase) / etc. Cette enzyme est actueLLement principalement utiLis4e comme adjuvant des cytoLytiques en chimiotherapie. 20 L'urate oxydase utilization actueLLement comme medicament est obtenue seLon and procedure comprenant La cuLture d'un mycelium d'AspergiLLus fLavus et l'isoLement de l'urate oxydase for extraction by miLieu de cuLture alone que pLusieurs steps. partieLLe de cette protein. Ce procedure, qui spray L'Obten- mentation of urate oxydase d'activite specific urea oxydase voisine de 8 U / mg, depourvue de contaminants toxiques, present toutefois des inconvenients. En effet, La physiologie et surtout La genetique d'A. fLavus ne sont pas aisement travaillables (UOLOSHUK et al., (1989) Applied Environ. microbioL. voL. 55, pp. 86-90). IL n'est 30 donc pas possible d'obtenir des souches qui produisent cette enzyme en quantites importantes. D'autre part, A. fLavus est susceptiblfe de produire des afLatoxines, LesqueLLes sont parfois difficiles. IL convient donc de verifier que Le produit purifie est exempt de ces toxins. 3 LV 12000 II existe donc and besoin pour une urate oxydase d'A. flavus plus pure ainsi que des outils and des techniques de genieque permettant de s'affranchir de ces inconvenients.

La demanderesse a purifie l'urate oxydase extraite d'A. flavus, appelee ci-apres urate oxydase extractive, a un degre de purete tres superieur à cellui dance connu de cette protein, determines the sequence of the cell-la and constructs deux pools de probes marquees susceptibles de s'hybrider avec Enter nucleotides codant pour deux portions de cette protein. Elle a ensuite construit and vecteur d'expression comprenant quintal ADNc, transforms une souche d'E. coli K12 avec ce dernier, cultured cell-ci and verifie que le lysat des cellules contenait une protein recombinant de la masse moleculaire attendant, qui possede une activite urate oxydase (capacité de degrader l'acide urique en allantoine).

La demanderesse a egalement construit plusieurs vecteurs d'expression dans Into cellular eucaryotes comprenant and gene recom-bant codant pour l'urate oxydase dont la sequence comporte des variations for rapport a l'ADNc isole, introduites dans le but de mettre en place des codons usuels dans Ies cellules eucaryotes /. transforms different cells into eucaryotes à l'aide de ces vecteurs, cultured cells-ci en faible volume ainsi qu'en volume plus important Cfermenteur) et constate que In lysats des cellules contenaient and taux important de proteinine recombinante la masse moleculaire attendue possedant une activite urate oxydase.

Elle purifies the cette protein recombinant and the cell particle cell, but the fagon comparative vis-a-vis de-urate oxydase extractive. L'Invention Concerne Donc Une Nouvelle Protein Caracase-rise Ce-Present Presence Une Activite-Oxidase Specification 16 U / mg, Ce-Apres Sequence:

Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr 6ly Lys Asp Asn Or Arg Or Tyr Lys Or His Lys Asp Glu Lys Thr 6ly Or Gln Thr Or Tyr Glu Met Thr Or Cys Or Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Or Ile Or Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala 4

Lys Gln Asn Pro Or Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala Ala His Or Asn Ile Or Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Or Gln Or Asp Or Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Or Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Or Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gln Glu Or Arg Ser His Or Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp Ala Thr Ala Arg Glu Or Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser Ala Ser Or Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Or Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly Lys Asn Ala Glu Or Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Or Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu, Precedent for the Illement d'une Methionine, ou en ce qu'el Lle presente and degre d'homologie substantiel avec cette sequence.

De preference, cette protein a une activite urate oxide-specifice d'environ 30 U / mg.

One protein type is appreciated in the cell qui, about ana-20 lye sur and geL bidimensionnel presente and spot molecule-enviroment 33.5 kDa and de point isoelectrique could 8.0 representant au moins 90% de la masse proteique.

De preference Le taux de purete de cette proteinine is determined by chromatography on liquid sur une colonne de silice 25 C8 est superieur a 80%.

Une protein interessante de ce type est celle qui a and point isoelectrique voisin de 8.0. It is appreciated that the serine amino-terminal porte and the groupement bloquant, the preference of the masse or the sine of 43 units, the tel que on the exemple le groupe 30 acetyle. L'invention a egalement trait au medicament qui contient, dans and vehicule pharmaceutiquement acceptable, la protée definie precedemment. Celle-peut remplacer avantageusement, dans ses different indications, urea oxydase extractive d'activite 35 urate oxydase specificis voisine de 8 U / mg vendue en preparation injectable sous la marque Uricozyme (Vidai 1990). 5 LV 12000 L '' invention concerne aussi and gene recombinant in ce qu '1 il comporte une sequence d'ADN < : odant pour la pro- second de sequence c-i-apres Met Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Vai Arg Vai Tyr Lys Vai Hi s Lys Asp Glu Lys Thr Gly Or Gln Thr Or Tyr Glu Met Thr Vai Cys Vai Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Vai Ile Or Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Or Thr Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala Ala His Or Asn Ile Vai Cys His Arg T rp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Or Gln Vai Asp Or Vai Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Or Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe T rp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Vai Asp Ala Thr T rp Gln Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gln Glu Or Arg Ser His Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp Ala Thr Ala Arg Glu Or Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Ser Ala Ser Or Gln Ala Th r Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp Hi s Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Is Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu A cause of the degeneracy of the code genome, il ex-i ste and grand sequences d'ADN codant pour une proteinine dont la 25 sequence repond a la formulates donnee ci-dessus. Parmi celles-ci une sequence preferee particuli ^ rement adapttee pour une expression dans In micro-organism procaryotes est la suivante:

ATGTCTGCGG TAAAAGCAGC GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA 30 CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC 35 AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG 6

ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGSCCTG

ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA

GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG

ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG

05 CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAA6ACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA

AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCT6ATCGA GACTGTCGAG

TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA

GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG 10 ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT AAATTG.

The sequence of ADN preferee qui convient notamment pour l1expression dans Ies cellules eucaryotes, telles que la 15 levure, est la suivante:

ATGTCTGCTG TTAAGGCTGC TAGATACGGT AAGGACAACG TTAGAGTCTA CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA 20 CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA 25 CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCT6 ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG 30 CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG 35 ACCCCAACGG AAATTG. TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 7 GB 12000

One of the following sequences is the adder prefix qui convient notamment pour une expression dans Ies cellules animaLes est.La suivante:

05 5'-ATGTC CGCAGTAAAA GCAGCCCGCT ACGGCAAGGA CAATGTCCGC GTCTACAAGG TTCACAAGGA CGAGAAGACC GGTGTCCAGA CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA GATTGAGACC TCTTACACCA AGGCCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG ACTCCATTAA GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT CCTCCCGAGC 10 TGTTCGGCTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA CAACCACATC CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC GGATGGACAT TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC GAGGAGAAGC GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA TATCAAGTCG TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC AGTTCTGGGG 15 CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG GACCGTATCC TGAGCACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCAGT GGAAGAATTT CAGTGGACTC CAGGAGGTCC GCTCGCACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT GGGCCACTGC TCGCGAGGTC ACTCTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT GCCAGCGTGC AGGCCACTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG CCAGCAGCTG 20 ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT TCGAAATCGA CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC GCCGAGGTCT TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA T CAAGTGTAC CGTCGGCCGG TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G 25 precedent d'une sequence 5 'non traduite favorabLe à l'expression dans Ies ceules animaLes. Une teLLe seqence 5 'non traduite pre-feree est ceLLe qui comprend La sequence: AGCTTGCCGCCACT, situee immedement en amont de La sequence expLicitee ci-dessus.

There is a notation que La protein protein codon for Les sequences d'ADNc 3Q donnees ci-dessus peut subir une maturation for La methionyl L-amino-peptidase, qui La cLive de son residu methionine amino-terminal. L'invention concerne or element and vecteur d'expression qui porte, avec les moyens necessaires à son βχρΓβεείοη, Le gene recombinant defini precedemment. δ

Pour une expression dans Involves the microorganisms proca-ryotes, en particulier dans Escherichia coLi, La sequence codante doit etere inseree dans and vecteur d'expression comportant notamment and promote efficacy, suivi d'un site de fixation des ribosomes en amont du gene exprimer, ainsi qu'une sequence d'arrete de trans-cription efficace en aval du gene exprimer. These plasmids do not exemplify the comporter and replication and selection. Toutes ces sequences doivent ether choisies en fonction de La ceLLuLe hte.

Pour une expression dans Les ceLLuLes eucaryotes, Le vecteur d'expression seLon L'Invention porté Le gene recombinant definition preceded by Les moyens necessaires à expression, a replication dans Les ceLLuLes eucaryotes et La seLection des ceLLuLes. De preference, ce vecteur porte and marqueur de seLection, choisi on exempLe pour compLementer une mutation des ceLLuLes eucaryotes receptors / qui pertnet La selection des ceLLuLes qui ont integrates le gene recombinant en and nombre de copies ele soit dans Leur genome, soit dans and veur multicopie.

Pour une expression dans Les ceLLuLes animaLes, notamment dans Les ceLLuLes d'ovaires de hamster chinois CHO, La sequence codante est inseree dans and plasmid (on exemple du pBR 322) comportant deux unites d'expression / une premiere unite dans LaqueLLe est. Le gene recombinant devant and promoter efficace (exempt Le promotur precoce de SV40). La sequence autour de L'ATG d'initiation est de preference choisie en fonction de La sequence consensus decrite on KOZAK CM. KOZAK (1978) CeLL-7 15 / 1109-1123). Une sequence intronique / par exemple L'intron de L'a-globine de souris / peut ether inseree en amont du gene recombinant ainsi qu'une sequence comportant and site de polyadenylation / par exemple une de poLyadenyLation du SV40 / en avaL du gene recombinant. La deuxieme unite d'expression comporte and marqueur de selection (for exempted une sequence d'ADN) codon pour La dihydro-folate reductase (enzyme ci-apres regression DHFR). Le pLasmide est transfecte dans Les ceLLuLes animaLes, par exemple Les ceLLuLes CH0 DHFR (incapables d'exprimer La DHFR). The lignee est selectionnee pour sa resistance au methotrexate: elLe a integrates the dans son genome 9 LV 12000 and the nombre ele de copies du gene recombinant et exprime ce dernier and niveau suffisant.

Pour une expression dans Goes to cellules eucaryotes telles que la levure, for exemple Saccharomyces cerevisiae, il convient d'inserre codè entre, d'une part, des séquences reconnues to promote efficacy, d'autre part, and terminateur de transcription. L'ensemble promoter-sequencing codante-terminateur, appellate cassette d'expression, est clone soit dans and vecteur plasmid (monocopie ou polycopie pour la levure, soit integrate en multicopie dans le génome de la levure). transforming aux cellules eucaryotes into a precursor of le vecteur d'expression Parmi celles-ci, on appreciate Souches de l'espece Saccharomyces cerevisiae, a particulate cell qui comportent of a mutant sur l'un des gene responsive to leucine ou de l'uracile, for the exemple le gene LEU2 ou le gene for URA3. L'Invention of the germline trait aux cellules animales contenant, avec Ies moyens nessessaires a son expression, ce gene recombinant .e dernier peut, for exemple, avoir etet introduit dans Ies cellules on transfection on le vecteur d1expression ci-dessus, on infection au moyen d'un virus ou d'un reto-virus le portant, ou on microinjection. d) urate oxydase recombinante qui comprend Etapes de: 1) mise en culture d'une souche telle que de cefessus: 2) lyse de cellules; 3) isolation and purification de l'urate oxydase recombinant contans dans le lysat. L'invention sera mieux form a l'aide des exemples ci outlets: une grande partie de l'ensemble des techniques ci outlines, bien connues de l'omom de l'art, est exposée en detail dans l'ouvrage de maniatis et al: " Molecular cloning: a laboratory manual ", published in 1984, in Proceedings of the Cold Spring Harbor Press, Neu York. 10 EXEMPLE 1: Isolation des ARN messagers d1Aspergillus flavus

La souche d'A. flavus productrice d'urate oxydase a ete cultivee dans des conditions de c'est-a-dire dans et milieu contenant de l'acide urique de composition suivante: glucose 15 g / l, MgS0., 7H ~ 0 1 g / l, ΚΗ-, ΡΟ. 0.75 g / l, CaC0_ ** LL k 3 1.2 g / l, acide urique 1.2 g / l, K0H 0.5 g / l, huile de soy 0.66 ml / l, FeSO 4 → 7H- > 0 10 mg / L, CuSO4,5H2O 1 mg / L, ZnSO4,7,7H2O 3 mg / L, MnSO4, H2O 1 mg / L.

Le milieu est at pH 7 avec H-SO. 1M et ester Stereo O 120 C pendant 80 min.

Dans un erlenmeyer de 5 l has ensemence 1.5 l de milieu avec environ 1 3- 3-10 ^ spores.

La culture est incubee pendant environments 40 h 30 30 ° C sous agitation (120 rpm). Le mycelium est recovers for filtration sur gas, lave avec de l'eau et congele dans l'azote liquide. 15 g of de mycelium (poids humide) in decontamination and resus-pendus dans in 45 ml de tampon de lyse male repris dans and meme volume de billes (0.45 pm de diameter). Le tampon de lyse ester thiocyanate de guanidine 4 M, Tris-HCl 10 mM pH 7.6, E0TA 10 mM, β-mercaptoethanol 50 ml / L. La suspension mycelienne est broyee au broyeur Zellmūhle (vibrogene) pendant 5 min.

Le broyat est recupere et Ies billes decantees. Le surna-geant ester (environment 45 ml) et ramene 3 H final and chlorine de lithium et conserve 0 ° C.

Apres deux jours, is a le centrifuge pendant for 60 min at 10,000 rpm. Le surnageant est ecarte et le culot est repris dans 40 ml de LiCl 3M et recentrifuge at 10,000 rpm pendant for 1 h 30.

Onion proteinase K (SIGMA), 40 pg / ml du SOS (0.1 7% w / v) and de l'EDTA? 20 mM. On incube - 37 ° C pendant for 3 h. On the basis of avec 2 volumes d'ethanol, the amount of effect and lavage a l'etbanol is 70%. 0.5 ml de tampon TE (Tris HCl 10 mM EDTA, 1 mM pH 7.5), replenishes 2 ml of chloroform, precipitates with ethanol. Les ARN sont conserves at -8Q ° C dans l'alcool. 11 LV 12000

EXEMPLE 2: Purification de la fraction poly A * des ARN

Environ 1 mg d'ARN ester precipitate for 20 min at -4 ° C (15,000 rpm) in 70% charcoal lave avec de l'ethanol.

Le culot est repris dans 1 ml de tampon TE et resuspendu par agitation au vortex. L'oligo dT-cellulose type 3 (commercialization by Collaborative Research Inc, Biomedicals Product Division) was prepared by recommending two fabricants. L'ARN est depose sur l'oligo dT, agitating pour remettre en suspension In a pot, chauffe pendant for 1 min at 65 ° C.

La suspension esterified with 0.5 M NaCl wood agitator pendant for 10 min. La suspension est alors centrifuge pendant for 1 min - 1000 rpm, le surnageant ester elute, le culot est lave 2 fois avec 1 ml de-swab TE contenant 0.5 M NaCl. Les surnageants sont eliminines. L'elution de la fraction polyadenylee des ARN (constituté des ARN messagers) ester for suspension 1 ml de tampon TE, chauffage de cette suspension at 60 ° C pendant for 1 min, suivi d'une agitation pendant for 10 min sur plaque basculante. There is a centrifuge ensuite for 1 min at 1000 rpm, a qui perm de recuperer d'une part le deadageant contenant des ARNm libres en solution et d'autre part le culot de billes de cellulose. L'ensemble des operations ci-dessus (â partir de l'elution) est repete. Les mereageants, the only obtenus sont rassem-bles, is the elimination of extracellular centrifugation that is a precursor to the use of lactageant-ethanol contenant du NaCl suivant les techniques habituelles. (Chania: Op. Prec.). EXEMPLE 3: Constitution de la bangue des ADNc A partir des ARN messagers isoles comme decrit dans l'exemple precedent, is a realization une banque d'AONc dans le vecteur pTZ19R (commercialize on PHARMACIA). Restriction of the vector and plasmid comprenant and polylinker contenant sites.

La technique de clonage utilization of cell defects by Caput et al., (Tech de l'Amorce-Adaptation (Primer Adapter): (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 1670 (1986)) 1674)). 12th

Elle consiste d'une part digerer le vecteur on Pst1 / ajouter une queue de polydC sur l'extreme 3 'protuberant, male a digerer Introduces the plasmid's sole obten into BamHI. The Le fragment corres-pondant au vecteur est purifies sur colonne de Sepharose CL4B (Pharmacia). II comprend donc une queue polydC à une exlemeit / l'autre extreme etant cohesive, du type BamHI. D'autre part / In ARN messagers sont soumisà la transcription inverse d'or amorce dont la sequence 5 '< GATCCGGGCCCT ^ 2) Ainsi / In ADNc Presenter-iIs a leur extremite 5' la séquence GATCC complemmentaire de l'extreme cohesive BamHI.

Les hybrides ARN-ADN obtenus par action de la transcriptase inverse sont soumis à une hydrolysis alcaline qui permet de se debarrasser de l'ARN. Les ADNc simple brin sont alors purifies about 2 cycles sur colonne de Sepharose CL4B et soumisà and traitement a la for transferase de fa? On ajouter des polydG en 3 '. Les ADNc sont inseres sous forms simple brin dans le vecteur prepares comme decrit plus haut. And second oligonucleotide " l'adapter " complementaire de l'amorce est necessaire pour generer un site BamHI " ouvert " a l'extremit 5 'des ADNc. Apron hybridization of two vectors, / de l'ADNc et de l, Madapter " / recombinant lesion molecules, for the l'action de la ligase du phage T4. Les region simple brin sont alors reparees gr a a'ADN polymerase du phage T4. Le pool de plasmids single-stranded transformer la souche MC 1061 pour la resisance l'ampicilline (Casabadan Chou et Cohen J. Bact. (1980) 143 pages 971-980). EXEMPLE 4: Purification de l'urate oxydase extractive d'A. flavus et caracterisation de celle-ci 1) Purification de l'urate oxydase extractive d'A. flavus.

Une preparation d'urate oxydase extractive d'A. flavus (uricozyme - Laboratoires Clin Midy) presentant une activitd urate oxydase specifics de 8 U / ml (l'activates urate oxydase est le rapport entre l'activates urate oxydase mesurele selon le feed dertrit a l'exemple 9 et la masse de proteines totales mesuree on la mothode de Bradford: Anal. Biochem ./72 / 248-254) a eteet repu- 13 LV 12000 rifiee on chromatographie sur une colonne d'agarose greffe Red " agarose 120 (SIGMA), concentration for ultrafiltration and filtration sur and gel polyacryLamide-agarose ULtrogeL ACA 44 (IBF), selon Le protocole ci: 05

Step 1: Chromatographie d'affinite sur agarose greffe

Temperature: 4 C

Colonne: PHARMACIA K50 / 30 - diameter = 50 mm 10 - longueur = 33 cm

Resine: Red 120 Agarose (3000 CL / R-0503 SIGMA) (volume de gel = 410 ml, hauteur de gel = 20 cm)

Tampon d'equilibrage: glycine / NaOH 20 mM pH 8.3

Tampon d'elution: glycine / Na0H 20 mM, NaCl 2M pH 8.3 15 Debit de condition: 250 ml.h ^ -1

Debit de fonctionnement: 160 ml.h

Debit d'elution: 60 ml.h ^ 1) Deposer en téte de colonne, à l'aide d'une pompe a debit cons- 20 tant la solution d'Uricozyme 2) Apres adsorption, laver la colonne par 2 fois son volume (3) Eluer par un gradient de force ionique ayant la composition sui-vante:

25 glycine, NaOH, 20 mM pH 8.3 / glycine, NaOH, 20 mM + NaCl 2M pH 8.3

Le volume total two gradient est egal a 10 fois le volume de la colonne, reparti pour moitie dans chacun des constituants. L'enregistrement chromatographique est operated at λ = 280 nm; le 30 pool urate oxydase est collecte regrouping des fractions presentant une activite urate oxydase specificie ou egale 16 U / mg.

Step 2: Concentration of two pool urate oxydase on ultrafiltration 35 l'aide d'un system Biopass comportant une membrane d'ultra filtration de 10 kDa. 14th

Step 3:

Temperature: 4 ° C

Colonne: PHARMACIA K 50/100 - diameter = 50 mm - longueur = 100 cm

Resine: Polyacrylamide agarose avec groupements amine and hydroxyl: l'UltrogeL ACA 44 CIBF)

- volume de gel = 1.6 L - hauteur de gel = 80 cm

Tampon d'equilibrage: glycine / NaOH 20 mM pH 8.3 -1

Debit de mise en conditionnement: 40 ml.h Debit de fonctionnement: 24 ml.h 1) Deposer en téte de colonne, à l'aide d'une pompe à debit cons-tant, le pool urate oxydase concentre. 2) Apply a depot de l'echantillon, a continuation of the alimenter colec avec du tampon glycine / NaOH 20 mM pH 8.3. 3) Apres chromatographie, laver avec du NaCl 2M jusqu'à une valeur d'absorbance U.V. (λ = 280 nm) < 0.05.

Stocker sous NaCl 2 M 4 ° C. L'enregistrement chromatographique est opere λ = 280 nm; le pool urate oxydase est collecte regresement des fraction presentant conjointement: - une activite urate oxydase specificique superieure ou egale a 20 u / mg. - 2 bandesulse en electrophoresis dans des conditions desaturants (presence de S.D.S) and revelation au nitrate d'argent (kit de coloration Biorad), avec :. une bande majeure de 33-34 kDa. une bande mineure de 70-71 kDa 2) Caracterization de l'urate oxydase extractive d'A. flavus purifiee: (a) sequen? age partiel

Afin d'Abtenir des informations sur la sequence des acides amines de l'urate oxydase extractive purifiee, permettant la 15000 12000 syntheses des probes au clonage de l'ADNc, and sequence amino terminal direct de la proteinine et et tente. . Ce dernier n'a pas abouti, the cause d'un blocage amino-terminal de la proteinine (Cf. f) ci-dessous).

La strategie ci-apres a donc ete developpee pour l'obtenation de la sequelle de l'urate oxydase: - couple de la proteinine des des enzymes (Cà l'aide des enzymes trypsine et protease V8 de Staphylococcus aureus) - separation des polypeptides obtenus on HPLC phase inverse - sequenpage des peptides purifies. a) Hydrolysis of L'urate Oxydase par la trypsine, purification and mixing page des peptides: l'urate Oxydase a 9 mg / ml and tampon de carbonate d'ammonium 100 mH pH 8/9 a ete digeree par la trypsine (Northington, TPCK) avec and rapport urate oxydase / trypsin de 30/1 en poids a 30 ° C pendant for 24 h. Apres l'hydrolysis tryptic / 60 pg d'urate oxydase digestion and direct injection of a colonne HPLC phase inverse de silice grapefruit Brounlee 618 (colonne 10 x 0.2 cm), equilibree en acetonitrile 17 (v / v), acide trifluoro-acetique 0.1% (v / v) dans l'eau. Les peptides on ete ensuite live on un gradient lineaire d1acetonitrile dans une solution d'acide trifluoroacetique (0.1% v / v) dans l'eau variant de 1% to 60% d'acetonitrile en 60 min, avec and debit de 150 μΐ / min. Les peptides a la sortie de la colonne ont ete detectable meshes de la densite optique a 218 nm.

Le profile d'elution est presente dans la figure 1, dans laquelle les numeros suivant la lettre T (Trypsine) correspondent aux pics identifies.

Chaque at a ete collect and conserve at -20 ° C sensory moment analysis and sequencing of proteins (model 470 A d'Applied Biosystems), equipe d'un chromatographe (model 430 A d'Applied Biosystems) qui analysis en continu les les deer in the form of phenyl-thiohydantoiques, apres chaque cycle de degradation.

Le tableau (1) identifies the ci-apres presente les sequences peptides of 9 pics. Β) Hydrolysis de l * urate oxydase par la protease V8, purification and mixing des peptides. L'urate oxydase, a une concentration of 2 mg / ml in dans and tampon acetate d'ammonium 100 mM pH 6.8, a ete was digested for la -05 strain V8 de Staphylococcus aureus (Boehringer-Mannheim) avec and rapport urate oxydase / protease V8 de 60/1 30 30 ° C pendant 72 h. 160 pg d'urate oxydase digest on enzyme injection injectable colonic HPLC phase inverse de silice grapefruit Brounlee G18 (colonne 10 x 0.2 cm); particules (7 x 0.03 pm) equilibree en acetonitrile 10 1%, acide trifluoroacetique 0.1% (v / v) dans l'eau. Les peptides ont enzyme et al live par and gradient lineaire d'acetonitrile dans une solution d'acide trifluoroacetics dans l'eau (0.1% (v / v)) de 1% to 60% d'acetonitrile en 60 min, avec and a flow rate of 150 pl / ml. Les peptides à la sortie de la colonne ont ete detectes 15 par mesure de la densite optique à 218 nm.

Le profile d'elution est presente dans la figure 2, dans laquelle les numeros suivant la lettre V (protease V8) identifies corres-pondent aux pics.

Chaque pie a ete collecte et conserve at -20 ° C jusqu'au 20 moment de l'analysis sur le sequenceur de proteinine dance mentionne.

Le tableau (1) identifies the cics of the present presentation of the pepti-diques des 5 pics. 17LV 12000 TABLEAU (1)

18 (b) Activated specifics: L'urate oxydase extractive purifiee une activates the specifics d'environ 30 U / mg. 05 c) Electrophoresis en Conditions Denaturants L'Electrophores de L'urate Oxydase Extractive Purifiee Sur GeL de PoLyacryLamide en Presence SDS (Sodium Dodecyl-10 Sulphate), Suivie d'une Revelation L'argent, Permet de Voir Une Bande de Forte intensite d'environ 33-34 kDa et une bande de tres faible intensite d'environ 70-71 kDa. d) Determination of two point isoelectricity: 15 mode operatoire: - Utilization des gel precursors L'empLoi, Les LKB AmphoLines Gel Plates de Pharmacia de gammes de pH: (3.5-9 / 5) et (5-8). 20 - Depot de 10 pL de proticines de temoins LKB (gamma des points iso- electriques des proteinines: 3.5-9.5) et d'urate oxydase purifiee 4 pg to 8 pg (sur deux pistes differentes). - Run 1 h 30, 12V, 6 ° C. - Wood coloration au bleu de Commassie (0,1%) dans (25% EthanoL, 25 8% Acide Acetique) de fa? On - colorer les proteines, suivie d'une decoloration a L'aide d'une soLution contenant 25% Ethanol and 8% Acide Acetique (pour eliminator Le bruit de fond). - Result: Observation sur chacune de deux pistes de deux bandes rapprochees (doublet) de points isoelectriques 8.1 et 7.9. 30 e) Analyzing Enzyme Bidimensional L'analyse Enzymatic Bidimensional Permeation of Protein Separators for Protein Dans and Primer Dosage Dosage Isoelectrics and Dans and Protein Density for Apparent Mass Molecules. 35 19 LV 12000

Protocol

Echantillon: solution d'urate oxydase extractive purifie dans and tampon glycine 20 mM de pH 8.3.

For preparations de l'echantiLlon - Deux echantilLons de 5 pg to 10 pg d'urate oxydase; - Sequence for centrifugation in a soaking medium, 5 pl with a tampon de lyse composition composition: uree 2.5 M, [3- (3-cholamidopropyl) dimethylammonium) 1-propane sulfonate CHAPS (Sigma) / 2% (v) / v), / Amphoteres Ampholines (LKB) de gamme de pH 5-8 et 3.5-9.5 / 0.4% et β mercaptoethanol 5%.

Gel d'isoelectrophocalisation - Preparation d'une solution contenant: uree 9.5 M, CHAPS 5%,

Ampholines LKB CpH (3.5-9.5) 17 ,; pH (5-8) 1%), Acrylamide / Bisacrylamide (28.4% / 1.7%) 3.5 Z final, H2O - Solution filtrate and degassed with addition of 0.075 Z de tetra-m4thylethylene diamine Temed (Pharmacia ) et de 0.015 Z persulfate d'ammonium. - Solution coulee dans des tubes (16 x 0.12 cm) - Polymerization temperature at 20 ° C. - Solution cathodique: NaOH 0.1 M degazee.

Solution anodique: H ^ PO ^ 25 mM. - Pre run 45 min 4 mA (voltage 300 V - > 1000 V). - Depot des echantilLons au niveau de la cathode. - Run 19 h h 1000 V at 20 ° C. - Gels demoules et equilibres for 10 min at 20 ° C in dans and tampon (Tris 0.375 M pH 8.8; SDS 3 Z, Dithiothreitol DTT 50 mM).

Gel denaturant PAGE / SDS - Preparation d'une solution contenant: Acrylamide / Bisacrylamide (30 Z / 0.8 Z) 15 Z final, Tris-HCl (pH 8.8) 0.375 M, HgO. 20 - Solution filtrate and degassed wood with addition of SDS (0/1%), de-sulfate d'ammonium 0.05% and Temed 0.05%. Polymerisation sleep at 4 ° C (gel 16 x 20 x 0.15 cm). - Le gel d'isoelectrophocalisation apres equilibration est depot 05 la surface du gel PAGE / SDS qui scelle par de l'agarose. - Tampon d'electrophoresis: (Tris-HCl 25 mM pH 8.3, glycine 0.192 M, SDS 0.1 X). - Run 100 mA - 6 h at 6 ° C. - Gel fixe dans 50% de methanol, 10% acide acetique puis colore 10 au nitrate d'argent (Meithode de Blum. H., Electrophoresis 1987, 8, pp. 93-99). - Gel scanne sur and analysur d'image visage 2000 / Kodak pour determiner la densite optique et la surface de chaque spot, donc permettre de calculator le rapport quantitatif entre Ies spots. 15 - La masse molaire de la protein est determinant en gelis et en de presence protein de Aminesham.

Results: 20 25 30

There are observe deux spots on the mass molecule voisine of 33.5 kDa, l'un majoritaire de point isoelectrique i could 8.0 d'intensite 5.2 (representant environments 93% de la masse proteique), l'autre minoritaire de point isoelectrique i could de 7.4 d'inten-site 0.41 (representant environ 7% de la masse proteique). (f) Determination of the amino terminus of the sequence and the amino terminus of the group: (a) the evidence of the amino terminus of the sequence:

The amino-terminal sequence of a sequence analysis of a l * aide d'un sequenceur Model 470A of Applied Biosystem, a couple of and analysis of phenylthiohydantoic models of Applied Biosystem 120A. L'urate oxydase purifiee (200 pmoles contrSleses for analyzing d'acides amines) a ete deposee sur le sequences en presence de 20 pmoles de β-lactoglobulin, proteine temoin. 35 21 LV 12000

Aucune sequence amino-terminal correspondant and un-sequenced oxydase n-ete dectectom (par contre la sequence-amino-terminal-tomeo ete detectable, donc le sequenceur fonctionne). L'urate oxydase d'A. flavus a donc l'extremite amino terminale bloquee. β) deletion of the amino-terminal blocker of the sequence d'un peptide amino acid de 32 acides amines and de-masse du groupement:

Method: Digestion of le bromure de cyanogene L'urate oxydase extractive purification and gel filtration sur and gel obesity on dextran avec de lichlorhydrine / le Sephadex 625 (PD10 - Pharmacia), equilibre avec une solution contenant 7% d '. acide formique, ce qui permet d'eliminer Ies sels et de changer le tampon. - For centrifugation sous vide, la concentration en acide formique est augmentee a 70%. It is acceptable to use a 0.2 M final cyanogen degenerate cyanogene for 20 h sous argon, absence of temperature and ambient temperature. - Separation of chromatographs of dechanges or peptides of isides for digestion of a cyanogen protein

Les peptides ont ete separes sur une colonne d'echanges d'ions-base de resine hydrophyle mono S (Pharmacia).

Tampon A: Acetate d'ammonium 10 mM pH 6.2 Tampon B: Acetate d'ammonium 1 M pH 6.2

Debit: 0.6 ml / min, detection des pics for mesure de la densite optique at 278 nm

Gradients: a 0% de B a 100% B en 30 min - collecte de fractions de 1 ml. 22nd

Les fractions issues de L'etape d'echanges d'ions ont έΐέ anaLysees par geL PAGE / SDS suivant La methode decrite par Schagger et Von Jagou < 1987) Anal. Biochem 166 - p. 368-379. 05 “Purification of Two Peptide Amino-Terminals on HPLC Phase Inverse and Analytical Parameters for Spectrometry

Le peptide issuer L'etape d'echanges d'ions and ayanth masse molaire voisine de 4000 Da (sur gel PAGE / SDS) a ete purifie sur 10 une coLonne d'HPLC phase inverse base C18 / La coLonne Beckman ALtex C18 (250 x 2.1 mm) Debit: 0.3 ml / min, detection des pics for mesh density at 218 nm

Tampon A: ^ 0 / 0.1 7. TFA < acide trifLuoroacetique)

Tampon B: Acetonitrile / 0.1% TFA

Gradient de 1? 50% de B en 60 min.

The peptide coLLecte apres une premiere step d'HPLC phase inverse and et repurifie sur La meme coLonne d'HPLC phase inverse maize avec and 20 gradient different.

Gradient de 1? 50% de B en 10 min.

Le at coLLecte a ete soumis à une anaLyse on spectrometry de masse a bombardement on atoms rapides (FAB / MS) avec une matrix gLycerL + thiogLyceroL. 25 - Digestion of La Chymotrypsine Two Peptide Amino-Terminals and Analysis of Acid Amines Des Peptides of Chymotrypses Separation for HPLC Phase Invert 30 Afin d'etablir La Sequence Two Peptide Purifie for HPLC Phase Invert, CeLui-ci a ete Digest for La Chymotrypsine . Les peptides chymotryptiques ont ete separates on HPLC phase inverse sur coLonne Beckman ALtex C18 (250 x 2.1 mm). D6bit 0.3 mL / min, detection des pics for mesh de-density at 218 nm, 35 23 LV 12000

Tampon A Η ^ Ο / Ο, 1% TFA Tampon B Acetonitrile / 0.08% TFA

Gradient de 1 7. de B â 50% B en 60 min - collecte des pics.

Les peptides chymotryptiques ont ete identify the para assay d'acides amines sur AnaLyseur Applied Biosystem (Model 420-130A).

Result:

Les resultats presentes ci-apres, etablis postérieurement de la sequence de l'ADNc de l'urate oxydase d'A. flavus et de la sequence d'acides amines deduite (Cf. exemple 6), not peuvent etre compris qu'a la lumiere de ceux-ci. - Analysis of the amino terminal of the spectrometry de masse du peptide.

There is a difference in the enumeration of the mass atoms of the mass molecule, 3684 et 3666, that of the masses is determined by the particle of the sequence suivante. (sequence d'acides amines deduite de l'ADNc de l'urate oxydase d'A. flavus avec clivage du groupe methionine amino terminal et coupure peptide dique par le bromure de cyanogene apres le premier residu methionine):

Ser Ala Or Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Or Arg Or Tyr Lys Or His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Or Gln Thr Or Tyr Gly (1) avec and reside methionine carboxyterminal modifie on action of the bromine de cyanogen soit en homoserine, 3642, soit en homoserine lactone, 3624. II ya donc and grouping blocking sur la serine amino terminale qui confere une masse supplementaire d'environ 42 unites 24 de masse atomique, correspondant probablement une acetylation de ce dernier (masse de CH ^ CO -masse H = 42 units de masse atomique). - Analyze des acides amines des peptides chymotryptiques:

Cette analyzes a permis de montrer dans ambiguite que la sequence du peptide amino-terminal obten for digestion au bromure de cyanogen comprend la sequence (1), explicitee ci-dessus.

La sequence complete d'acides amines de l'urate oxydase estiquee ci-apres:

Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Ty r Gly Lys Asp Asn Or Arg Or Tyr Lys Or His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Or Gln Thr Or Tyr Glu Met Thr Or Cys Or Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys Ala Asp Asn Ser Or Ile Or Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Or Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ale Ala His Vai Asn Ile Or Cys His Arg T rp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Or Gln Or Asp Or Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Or Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe T rp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Or Asp Ala Thr T rp Gln Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gln Glu Vai Arg Ser His Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr T rp Ala Thr Ala Arg Glu Vai Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser Ala Ser Vai Gln Ala Thr Met Ty r Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Vai Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 25 25LV 12000 EXEMPLE 5: Criblage des bacteries 1) Preparation des probes marquees

Deux pools de probes de sequences en aminoacides de la synthesises à l'aide d'un synthetiseur d'AON Biosearch 4600. Le premier pool correspond et la residues His-Tyr-Phe-Glu-Ile-Asp ( partie de la sequence de T 27), soit de 5 'bull 3':

A T G G G

TCGAT TC AA TA TG T C A A A 4

Ce pool est en fait constitue de 2 x 3 = 48 oligonucleotides differents representative toutes Ies combinaisons possibles.

Le deuxieme pool corresponds to the sequence amino acid residues Gln-Phe-Trp-Gly-Phe-Leu (partie de la sequence de V5), soit de 5 'ox 3':

GG A G T

AAGCCCCA AA TG AA C A C

T, 4

Ce pool est constitue de 2 x 4 = 64 combinaisons.

Les probes sont marquees terminal desoxynucleotide trans-ferase (TdT) (commercialized by IBI, Inc.).

La reaction s'effectue sur 100 ng d'un melange d'oligo-nucleotides en solution (100 mg / ml) dans du tampon de reaction "Cobalt" (fourni 10 fois concentre par IBI inc .: 1/4 M de coco-dylate de potassium pH 7.2, 300 mM de-dithiothreitol / 1 µl d'enzyme desoxynucleotidyl-terminal-transferase (IBI inc) et 50 pCi de-deoxycytidyItriphosphate dCTP marque au P32.

La reaction se fait a 37 ° C pendant for 10 min. Est arrētee en ajoutant 1 μΐ d'EDTA 0/5 M.

There is an extra phenol et dialyse sur colonne de polyacrylamide Biogel P 10 (Biorad: 150 ~ 1050). 2) Hybridization and detection of colonies contenant L'ADNc de L'urate oxydase:

Environ 40,000 colonies are contemplated by a technique d'hybridization in situ mise au point for Grunstein et Hogness (1975 / Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) / 72 3961). Environ 6,000 bacteries sont etalees sur boites de Petri de fa? On? Obtenir des colonies isolees. Apres incubation pendant 24 h at 37 ° C / chaque boite est repliquée sur 2 will filter / chaque filter etant destine a ether traite avec and des 2 pools de sondes, fagon que toutes Ies colonies obtenues soient testees avec.

Les will filter out the soma hybrider avec and des 2 pools de probes dans and tampon contenant 6 x SSC / 10 x Denhardt's and 100 pg / ml d'ADN de sperme sonique et denature (SIGMA). La temp. Hybridization ester at 42 ° C and la duree at 16 h. La solution 6 x SSC s'obtient par dilution d'une solution 20 x SSC. La preparation two tampons 20 x SSC est decrite dans Maniatis, Fritsch et Sambrook (op. Cit.). En résumé, tampon contient 175.3 g / l de NaCl; 88.2 g / l de citrate de sodium et este at pH 7 for quelques gouttes de NaOH 10N. La solution 10 x Denhardt's Contient 1 g de Ficoll, 1 g de polyvinylpyrrolidone / 1 g de serum-albuminized human pour 500 ml de volume final.

After washing with a solution of 6 x SSC at 42 ° C (3 h avec 5 changements de bain), the filtrate was filtered and dried. Les filter sont slats apres 16 h. II est apparu qu'une fraction d'environ 0.5% des colonies hybridait avec les 2 pools de sondes. 5 colonies parmi celle-ci ont ete reprises et purifiees. There is prepared a plasmid of l'ADN from chacune colonies, and an analysis of the ADN for digestion is performed by BamHI, by HindIII, by la fois by BamHI and HindIII.

Apres analyzes sur gel d'agarose, il est apparu que les 5 plasmids obtenus sont linearises par BamHI et par HindIII. Les doubles digestions permettent de liberer and fragment correspondant in a l'integralite de L'ADNc clone. La taille de ce fragment est d'environ 1.2 Kb dans 3 cas, d'environ 0.9 Kb dans les 2 autres cas. Pour la determination ci-apres on a selection and des 27 27LV 12000 fragments of 0.9 Kb et and des fragments of 1.2 Kb qui ont ete (voir exemple 6 ci-apres). ΕΧΕΜΡΙΕ 6: Determination of La Segence de L'ADNc-de l'urate oxydase 05 On a reclone and a fragment of 0.9 Kb d'une part (clone 9A) and a fragment of 1.2 Kb (clone 90 d 'autre part, dans l'ADN de la forms a replicative de phage simple-brin M13. L'ADN des clones M13 contenant d'une part de fragment 0.9 Kb et d'autre part le fragment de 1.2 Kb a ete soumis a une digestion exonu-10 cleasique de maniere-generator une serie de clones M13 chevauchants (procedure "Cyclone I Biosystem" de IBI) Ces derniers ont ete sequences for la method de dideoxyribonucleotides (Sanger et al, PNAS-USA- 1977, 14, 5463-5467).

The nucleotide sequence of clone 9C est representee sur 15 la figure 3 laquelle indique egalement on une fleche le debut du clone 9A et par and the nucleotide sequence of clone 9A non-identiques of the clone 9C (quand on fait correspondre Ies deux sequences et Ies sites de res-triction Accl et BamHI utilizes dans Ies constructions ulterieures 20 (Cf. exemple 10).

On the contextual que: - a sequence of nucleotides two fragments plus long (clone 90 recouvre cell two fragments plus court (clone 9A), deux differences pres (v in fig. 3). correspond a and changement d'un residu tryptophane en residu glycine Ces differences peuvent et dues, soit a des differences dans In ARN messagers isoles, (Cf. exemple 2 ci-dessus), soit a des referurs de la transcriptase inverse utilise lors de la constitution de la banque des ADNc (Cf. exemple 3 ci-30 dessus). le sequen? age de l'ADN genomeque de l'urate oxydase d'A. flavus a permis de Iever cette ambiguit: il s'agit d and residu tryptophane (et donc probablement d'uneéreur de la transcriptase inverse).

Dans le cas du fragment le plus long, and codon ATG (position 109 sur la fig. 3) ouvre une phase ouverte correspondant and polypeptide de 302 aminoacides, de masse moleculaire voisine 35 28 de 34240 Da, no sequence sequence a la sequence partielle de l'urate oxydase d'A. flavus purifiee (Cf. exemple 4).

On the basis of a representative sequence of the ATG et le polypeptide code, only the sequences of the ATC and the polypeptide code are visc-vis-vis avec le polypeptide code. 'urate oxydase d'A. flavus a l'aide de la trypsine et de la protease V8.

There is a sequence of sequences for the polypeptides in the terminal para-triplet Ser-Lys-Leu, typing des enzymes and peroxisation (Gould S.J. et al., J. Cell, Biology 108: 1657-1664 (1989)). EXEMPLE 7: Construction d'un vecteur d'expression de l'ADNc de l'urate oxydase

There is a preparation of plasmids p466, vecteur d'expression dans E. coli. This derivative consists of a fragment of pBR327 incluant l'origine de replication and a gene for resistance to l'ampicilline, il comprend egalement and a promoter of synthetics d'E. coli (R. R0DRIGUEZ et M. CHAMBERLIN " Promoters-Structure and Function (1982) Preager), une sequence de Shine-Dalgarno, suivie d'un polylinker presenting unique sites NdeI and KpnI, and terminateur de transcription (derive du phage fd) et le gene lac i.

Ce plasmids a ete construit à part plasmid d'expression de l'hGH dans E. coli (p462) for substitution d'un fragment portant gene de l'hGH par l'ADNc de l'urate oxydase.

The construction of plasmids p466 va maintenant etre decrite plus en detail dans l'expose ci-apres dans lequel il sera fait reference aux in figures 5, 6, 7, 8, 9.

The figure represents 5 represente une carte de restriction du plasmids p163.1. Les differents segments de restriction sont margues de maniere arbitrage selon la leegende ci-dessous: = segment d'ADN issuer plasmids pBR322

= Localization de l'origine de replication (ORI) 29 LV 12000

= Segment d'ADN contenant La sequence codant pour and precurseur naturel de L'hGH

Segment d'ADN du phage fd contenant and terminateur de transcription

Segment d'ADN contenant and promoteur-operateur / bride tryptophane-Lactose l) V5

Segment d'ADN codon pour la β-lactamase (ApR: resistance à l'ampicilline).

La Figures 6 represente La carte de restriction d'un plasmid p160 dont Les fragment PvuI-XhoI-BamHI (1) en

Provisional pvul-ORI-BamHI (2) respecting pLasmides p163,1 to pBR327 and not Le petit fragment BamHI (2) -BamHI (1) est Le fragment 3 decrites.

La is represented by 7 represente La carte de restriction du pLasmide p373.2. Les differents segments de restriction sont margues de maniere arbiterire seLon La Legende ci-dessous: -il --- l --- J- = Sequence Pvul-BamHI issue du plasmid pBR327 = Sequence PvuI-XhoI issue du plasmid p163,1 issue du plasmids p163 / 1

// Ļ // ////, ~ Sequence XhoI-HincII 30

XX X X X X ~ Fra9roent 3 decrit ci-apres = Segment d'AON du phage fd contenant and terminateur de transcription du ci-

In Fig. 8, represente une carte de restriction plasmid p462, le fragment synthetique BgLII-HindIII defines by calculating etant represente for: Zf / f //

Aili AlU

Fig. 9 represents the restriction fragment of plasmid p466, the le fragment Ndel-KpnI encoder of the gene encoding l-urate oxydase 1) Construction of plasmid p373.2

A strategic approach to the development of the fragments of the obtenus part of the plasmid is the access to the public domain and the preparation of the fragments for the synthesis of voie de syntheses. Les techniques for cloning employees in cellular decrites by T. MANIATIS EF, FRITSCH, and J. SAMBR00K, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). La synthesis des oligonucleotides est realizes a l'aide d'un synthetiseur d'ADN Biosearch 4,600.

On a soumis le plasmid p163.1 (Fig. 5), Decriters de demand de brevet EP-A-0245138 et depoze la CNCM sous la reference 1-530 le 17 Feb 1986, a une digestion of les enzymes Pvul et BamHI. The plasmid contient le gene codant pour l'hGH. Le fragment Pvul-BamHI - ci-apres fragment 1 - contenant le site 31 LV 12000 d'action de l'enzyme de restriction XhoI, represente sur La fig. 5 / a ete purifie.

De meme, there is a so-called Le pLasmide pBR327, bien connu de l'honme de l'art, (cf. SOBERON, X, et al., Gene, 9, 287-305 (1980)) a 05 une digestion for Les enzymes Pvul et al. BamHI. Le fragment Pvul-BamHI - ci-apres fragment 2 contenant l'origine de rplication, a ete purifie.

The guy is preparing the fragment 3 / qui est and the fragment synthetics BamHI (1) -BamHI (2) contenant Le gene Lac et et promo-10 teur dont la sequence est le suivante sur laquelle Les deux extrins du brin sere reperees on Les Nombres 1 et 2 pour preciser L'orientation du fragment dans Les plasmids dichroic aux 6 a 7. 15 FRAGMENT 3

BamHI (1)

5 'GATCC GCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT 20 GAGCTAACTT ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CCAGGGTGGT TTTTCTTTTC ACCAGTGAGA CGGGCAACAG CTGATTGCCC TTCACCGCCT GGCCCTGAGA GAGTTGCAGC AAGCGGTCCA CGCTGGTTTG CCCCACGACC CGAAAATCCT GTTTGATGGT 25 GGTTAACGGC GGGATATAAC ATGAGCTGTC TTCGGTATCG TCGTATCCCA CTACCGAGAT ATCCGCACCA ACGCGCAGCC CGGACTCGGT AATGGCGCGC ATTGCGCCCA GCGCCATCTG ATCGTTGGCA ACCAGCATCG CAGTGGGAAC GATGCCCTCA TTCAGCATTT GCATGGTTTG TTGAAAACCG GACATGGCAC TCCAGTCGCC TTCCCGTTCC GCTATCGGCT GAATTTGATT GCGAGTGAGA 30 TATTTATGCC AGCCAGCCAG ACGCAGACGC GCCGAGACAG AACTTAATGG GCCCGCTAAC AGCGCGATTT GCTGGTGACC CAATGCGACC AGATGCTCCA CGCCCAGTCG CGTACCGTCT TCATGGGAGA AAATAATACT GTTGATGGGT GTCTGGTCAG AGACATCAAG AAATAACGCC GGAACATTAG TGCAGGCAGC TTCCACAGCA ATGGCATCCT GGTCATCCAG CGGATAGTTA ATGATCAGCC 35 CACTGACGCG TTGCGCGAGA AGATTGTGCA CCGCCGCTTT ACAGGCTTCG ACGCCGCTTC GTTCTACCAT CGA CACCACC ACGCTGGCAC CCAGTTGATC 32

GGCGCGAGAT TTAATCGCCG CGACAATTTG CGACGGCGCG TGCAGGGCCA

GACTGGAGGT GGCAACGCCA ATCAGCAACG ACTGTTTGCC CGCCAGTTGT

TGTGCCACGC GGTTGGGAAT GTAATTCAGC TCCGCCATCG CCGCTTCCAC

TTTTTCCCGC GTTTTCGCAG AAACGTGGCT GGCCTGGTTC ACCACGCGGG

05 AAACGGTCTG ATAACAGACA CCGGCATACT CTGCGACATC GTATAACGTT

ACTGGTTTCA CATTCACCAC CCTGAATTGA CTCTCTTCCG GGCGCTATCA TGCCATACCG CGAAAGGTTT TGCGCCATTC GATGGTGTCC G 3 '

BamHI (2) 10 Les fragments 1, 2 and 3 on et alor Ligues de maniere obtenir le plasmids p160 represente sur la figuré 6.

Ce plasmids in soy and une digestion part for Les enzymes de restriction HincII et Pstl. Le grand fragment HincII-PstI, contiguous L'origine de replication and represente sur 15 La fig 6, a ete ensuite ligue au fragment 4, represente ci-apres, qui est and fragment synthetics d'ADN portant une sequence codant pour Les 44 premiers acides amines d'un precurseur naturel de L'hGH et en amont de cette sequence des signaux de reguLation. 20 FRAGMENT 4

C ^ aI

5 'TCGAGCTGACTGACCTGTTGCTTATATTACATCGA 25 30 35

AGCTCGACTGACTGGACAACGAATATAATGTAGJT

Nd ^ I

TAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGATAACAATTTCACACAGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT

ATCGATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCAAATTGAAATTCTTCCTCTATATGTA ATG GCT ACC GGA TCC CGG ACT AGT CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTG TCC TGC CTG TAC CGA TGG GCT AGG GCC

^ al CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGT GCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCT AGA CTT TTT

GGG ACC GAA GTT CTC CCG TCA CGG AAG GGT TGG TAA GGG AAT AGA TCT GAA AAA PWLQEGSAFPTIPLSf ^ “l_F -1 1 GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC

CTG TTG CGA TAC GAG GCG CGG GTA GCA GAC GTG GTC GAC CGG AAA CTG TGG ATC DNAMLRAHRLHQLAFLTY PstI CAG GAG ITT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CA GTC CTC AG T CT TTC ATA AGT AAG G QEFEEAYIPKEQKY $ F 44

Dans ce fragment, Les acides amines sont designes par des 20 Lettres selon le code suivant: 25 30 A = Alanine C - Cysteine D = Acide aspartique E = Acide glutamique F = PhenyLalanine G = Glycine H = Histidine I = Isoleucine K = Lysine L = Leucine M = Methionine N = Asparagine P = Proline Q = Glutamine R = Arginine S = Serine T = Threonine V = Valine W = Tryptophane Y = Tyrosine

Sont successivement soulignees dans ce fragment Les sequences -35 (TTGCTT) et -10 (TATAAT) de La sequence promoter, 35 et la sequence de Shine et Dalgarno bien connue de l'homme de L'art. 34

Le plasmids p380.1 a ete single target.

The enzyme de restriction enzyme de restriction enzyme enzyme de restriction enzyme enzyme de restriction enzyme enzyme de restriction enzyme enzyme de restriction enzyme enzyme de restriction enzyme enzyme de restriction enzyme enzyme de restriction enzyme enzyme de restriction enzyme:

Clal

5 'CGATAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA

TATCGCATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGT

NdeI ATTTCACACAGTTTTTCGCGAAGAAGSAGATATACA TAAAGTGTGTCAAAAAGCGCTTCTTCCTCTATATGTAT 5 ·

Le plasmids resultant est le plasmids p373.2 (Figure 7). 2) Construction of two plasmids p466:

The double digestion of Le plasmids p373.2 a in sleep and double digestion by Ies enzymes BgtII and HindIII. Le grand fragment issuer cette digestion et ete purifie et ligue avec and fragment d'AON synthesic-tique, dont la sequence donnee ci-apres est destinee a reconstituer la fin du gene de l'hGH suivie en 3 'des sites de clonage KpnI et SnaBI.

B g l

I

I

GATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGAT ---- + --------- + --------- + --------- + --------- +

AAGTTCGTCTGGATGTCGTTCAAGCTGTGTTTGAGTGTGTTGCTA

GACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTC --------- + --------- + --------- + --------- + -------— + --------- +

CTGCGTGATGAGTTCTTGATGCCCGACGAGATGACGAAGTCCTTCCTGTACCTGTTCCAG 35 GB 12000

F s

P

I 05

GAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGTAA --------- + --------- + --------- + --------- + --------- + -------- +

CTCTGTAAGGACGCGTAGCACGTCACGGCGAGACACCTCCCGTCGACACCGAAGATCATT 10 15

K P n I

S n a B I

H i n d I I I

GGTACCCTGCCCTACGTACCA --------- + --------- + -----

CCATGGGAČGGGATGCATGGTTCGA 20 Ce fragment composedend Extremes cohesives Bglll et

HindIII. The Le nouveau plasmid alone forms p462 (Cf. Fig. 8) consisting of the fragment KpnI et and the site NdeI qui vont servon au fragment cleavage port of the ADNc de l'urate oxydase le expression vector. 25 plasmids hybride derivative of pTZ19R port l'ADNc d'environ 1.2 Kb (clone 90, de l'urate oxydase (voir exemple 3) comprised un site KpnI unique) This site is a site-specific publication. de clonage de l'ADNc .D'autre part l'ADNc de l'urate oxydase contient and site Accl situe à proximite de 30 l'extremite 5 '.

There is a donc isole et purifie le fragment Accl-Kpnl companion la plus grande partie de cet ADNc. D'autre part is a synthesis of deux oligonucleotides complementaires without sequence sequence: 36

5'-TATGTCTGCGGTAAAAGCAGCGCGCTACGGCAAGGACAATGTTCGCGT ACAGACGCCATTTTCGTCGCGCGATGCCGTTCCTGTT ACAAGCGCAGA-5 'est destinee' reconstituer L'extremite 5 'de L'ADN. Ce fragment 05 synthetique single object possede une extremite NdeI et une autre AccII. Le fragment et La sequence synthetics ont ete Ligues avec Le vecteur d'expression coupe par KpnI et par NdeI. The fragment of Cette Ligation is permeable to the dermal and expression vector p466 / de L'urate oxydase pour E. coli (Cf. Figure 9). Ce pLasmide a 10 ete soumis a une serie d'hydroLyses enzymatiques de des enzymes de restriction, qui a permis de verifiers La presence des sites de restriction attendances en particuLier ceux portes for Le gene codant pour L'urate oxydase.

Le pLasmide p466 contient donc for construction and gene 15 coding pour L'urate oxydase de sequence ci-apres:

ATGTCTGCGG TAAAAGCAGC «_CGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA

CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA

CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC

20 GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT

CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC

TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC

AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA

CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG

25 ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG

ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA

GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG

ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG

CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT

30 GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA

AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG

TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA

GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG

ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 35 AAATTG. 37 LV 12000 (Les nucleotides differents des nucleotides de l'ADNc isole d'A. Flavus sont soulignes dans la sequence cis-dessus. Ces differences on ete introduites sur le fragment synthetics Acci-Kpnl de fa? On avoir en aval de l ATG une sequence nucleotidique plus conformation (cellular habituellement rencontrees dans and gene procaryote). EXEMPLE 8: Expression de l'ADNc de l'urate oxydase

La souche E. coli K12 RR1 CBethesda research lab. Inc.) Transforms pour la resistance into plasmid p466 et avec and plasmids. Negatif pBR322.

Des colonies resistantes à l'ampicilline ont ete obtenues dans les 2 cas. 1 colonie de chaque type a ete mise en culture dans du milieu (LB + ampicilline 100 pg / ml). After drying at 37 ° C for soaking agitation, les deux cultures are treated with 100 fois dans du milieu (LB + ampicilline 100 pg / ml). Apres for 1 h de culture on y l'IPTG (Isopropyl β-DThiogalactoside) 1 mM pendant for 3 h.

Immunodetection de l'urate oxydase on Uestern blot: 1) Mode operatoire:

The culture medium is diluted for 3 hrs with induction of a 1'IPTG une fraction aliquot of 0.2 ml D0 = 1. There is a centrifuge cette derniere that is eliminated. There is an ensuite le culot a un Western blot, technique bienhomme de l'art, qui comprend les stepes suivantes: - Solubilisation du culot for ebullition pendant 10 min dans and tampon denomme tampon de charge constitution Tris HCl 0.125 M pH 6.8 SDS 4 bleu de bromophenol 0.002%, glycerol 20 Z, β-mercaptoethanol 10% (selon le protocole decrit for LAEMMLI (UK LAEMMLI, Nature 227: 680-685 (1970))), - separation electrophoretique des diferentes Protein contigs dans le solubilisat selon le protocole decrit for LAEMMLI (UK LAEMMLI, Nature 227 (1970), 680-685), - transfert desdites protein sequences dans le gel sur and filtrate de nitrocellulose (H.T0WBIN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354 (1979), 38

Immunodetection, realizes selon La technique de BURNETTE (VI.W. BURNETTE Ana. Biochem. 112 (1951) 195-20?), Elle implique successi-vement :. Leinin age was filtered with de nitrocellulose pendant for 10 min with avec and tampon A (Tris-HCl 10 mM, NaCl 170 mM, KCl 1 mM). . After contacting, the de-nitrocellulose pendant is filtered for 30 min at 37 [deg.] C. and tampon B (tampon A addition to serum albumin 3 ml pour 100 ml). . After contacting, the nitrocellulose pendant is filtered for 1 h at 37 ° C with an avec and immunoserum (des anticorps polyclonaux reconnaissance l'urate oxydase d'A. Flavus). . The leinage is filtered through de nitrocellulose avec le tampon B.. The filtrate is contacted with de nitrocellulose pendant for 1 h at 37 ° C and a solution of protein 6 marquee at 125 micrograms / ml is used. . Le rin ^ age du is filtered by avec le tampon A.. Le sechage du filters the entre deux feuilles absorbants. . La mise en contact d'un film radiographiqu. . La revelation two film. 2) Results:

On the state que la souche transformee on le plasmids p466 surproduit une proteinine de poids moleculaire apparent d'environ 33 KDa qui est reconnue on Ies anticorps will conduct contre l'urate oxydase d'A. flavus et qui est absente dans la souche temoin. EXEMPLE 9: Dosage de l'activite urate oxydase

On preleve du milieu de culture obtenu apres 3 h d'inducation a l'IPTG dans In conditions de culture decrites à l'exemple precedent une fraction aliquote correspondent de 0.5 ml DO = 1. On centrifuge cette derniere that is a living le surnageant. On reprend Diluted 1 ml de tampon TEA (Triethaolamine) 0.05 M pH 8.9. La suspension cellulaire est soniquee 2 fois pendant 30 s dans la glace avec and sonic ultrasonic W10 (reg. A puissance 8 et intensite 4). Les extraits centrifuges a 10,000 g pendant for 10 min, les surnageants sont utilizes pour le dosage. 39 39LV 12000 0n effectue Les operations ci-dessus pour quatre colonies prises au hasard d'E. coli K12 is transformed into Le plasmid p466 (colonies B.j, et D) and une colonie transformed into le plasmid pBR322). 1) In principle

On suit la transformation de l'acide urique en allantoine par la diminution de l'absorbance a 292 nm. La reaction est la suivante:

h2o + o2 h2o + co2

Acide urigue AIlantoine (absorbent at 292 nm) 2) Reaction

(a) Tampon TEA 0,05 M pH 8,9 / EDTA - Dissoudre 7,5 g de TEA (refill pour analysis-ProLabo ref. 287.46.266) and 400 ml d'eau distillate - Dissoudre 0,372 g de Complexon III ( Merck-ref. 8418) dans 50 m (_ d'eau distillate, - 500 ml solution (solution 1), - auxiliary pH de cette solution - 8.9 per HCl 0.2N, - completer - 1000 ml of avec de l'eau distillate (solution 2) b) Acide urique Solution stock - dissoudre 100 mg d'acide urique (Carbiochem ref. 6671) and 50 ml of de la solution 1, - ajuster for HCl 0.2N pH 8.9, - completer a 100 ml par de l'eau distillee.

La solution obtenue peut se conserver une semaine a 4 ° rc) Acide urique Solution Substrat - Prelever 1,5 ml de solution stock d'acide urigue (carbiochem rf 40 6671) et diluer a 100 ml avec du tampon TEA / reactif pour analysis- Prolab ref. 287.46.Z66).

Cette sotution doit ether utilise dans La journee. 3) Mode operatoire 05 0n introduit dans quartz d'un spectrophotometer regimen at 292 nm and thermostate at 30 ° C Les volumes in solution: - 600 μΐ d'acide urique solution substrate (prechauffes at 30 ° C), - 100 μΐ des surnageants ci-dessus auxquels ont ete run 200 μΐ de TEA pH 8.9 (prechauffes at 30 ° C). 10 It is melange that there is a Lit le variation de densite optique toutes Les 30 s pendant 5 min. On en deduit ΔΕ, variation de la densite optique per minute. 4) ResuLtats: L'activated A enzymatic urate oxydase exprimee U / mL 15 D0 1 est caLcuLee a partir de la mesure de ΔΕà L'aide de La formuLe :. _ ΔΕ x Vr x d A = -

I x V

PE 20 dans LaquelLe Les Symbols Vr, d, I et Vp ^ representing respectful voLume reactionneL (0.9 ml), Le taux de dilution (2), Le coefficient d'extraction de l'acide urique at 292 nm ( 12.5) and Le voLume de La prise d'essai (0.3 ml).

Les resuLtats obtenus sont rassembles dans Le tableau (II) ci-apres: 25 41 LV 12000 05 TABLEAU (II) 10 Souche d'E. coli K12 transformee for Activite urate oxydase (U / ml D0 1) PBR322 < 0.001 colonie A ^ 0.086 p466 colonie B ^ 0.119 colonie Cl 0.135 colonie 0.118 II apparait clairement sur Le tableau ci-dessus que Ies cellules d'E. coli transforms on te plasmids p466 sont capables 20 en presence d'IPTG de produire une activite urate oxydase. EXEHPLE 10: Construction of Trois Vectors Expression 1 * ADNc de l'urate Oxydase Dans La Levure, Entered in PEMR469, pEMR473 and pEMR515

La strategie mise en oeuvre fait appelage des fragmentes 25 obtenus à partir de plasmes preexistants accessibles au public et a des fragments prepares for voie de synthese selon Ies techniques maintenant couramment utilises. Les techniques de clonage employees sont celles decrites par T. MANIATIS, EF. FRITSCH et J. SAMBR00K dans " Molecular Cloning, a laboratory manual " (Cold Spring 30 Harbor Laboratory, 1984). La synthesis des oligonucleotides est realizes a l'aide d'un synthetiseur d'ADN Biosearch 4,600.

The description ci-apres sera mieux comprises a la lecture des Figures 10, 11 and 12 representing the restriction of cartridges for restriction plasmids pEMR414 to des plasm 35 pEMR469. Les symboles utilises sur ces seront precises dans l'expose ci-apres. Dans le cas ou un site a 42 ete rendu franc on La polymerase de Kleenou, iL lui est affecte l'indice M ° "; lorsque Ies sites ont ete supprimes par ligation, i Ls sont indiques entre parentheses. 1) Construction of plasmids pEMR469: 05 Ce plasmids and constructs of particle vectors of E-coli-levure pEMR414, constructs for ligation successes des elements ci-calculations: - le fragment Pstl-HindIII0 - symbolize par ++++ sur la Figure 10 - Two plasmids pJDB207 (BEGGS, 1978: Gene cloning in 10 yeast-pp. 175-203 dans: Genetic Engineering vol 2 - MILLIAMSON -Academic Press - London UK) comprenant la partie amont du gene de

D resistance a l'ampicilline Amp de pBR322 (Sutcliffe 1979 Cold Spring Symp. Quart. Biol. 43, 779) and a fragment of 2 μ endogene forms the B portant le gene LEU2 de S. cerevisiae particle deletion (app. LEU2d ), le lous STB (REP3) et l'origine de replication two 2 μ (HARTLEY et DONELSON, 1980, Nature, 286, 860-865). L, extremite HindIII de ce fragment a.ete rendue franche on action de la polymerase de Kleenow. Elle est note HindIII0 sur la figure 10. 20-le fragment HindIII-Smael - represente par ΠΖ sur la figure 10 - two chromosome V de levure contingent le gene URA3 avec son promoter (R0SE et al., 1984, Gene, 29, p. 113-124). Ce fragment of HindIII-SmaI provient du plasmid pFL1 (CHEVALLIER et al., 1980, Gene 11, 11-19). L'extremite HindIII de ce plasmids a ete rendue franche for l'action polymerase de Kleenow. - and the fragment Saml-Bamhl - symbolize for " figure 10 - contenant une version synthetics du promoter du gene ADH2 not different de la version naturelle decrite on RUSSEL et SMITH (RUSSEL et al., 1983). J. Biol. Chem. 258, 2674-2682) que par 30 quelques paires de bases destinees an introduire des sites de restriction. (La sequence naturelle pourrait etre utilization avec des resultats peu differents). La sequence de ce fragment est donnee ci-apres: 4305 10 15 20 25 30 35 LV 12000 SM m L au II 7 ^ GGGACGCGTCTCCTCTGCCGGAACACCGGGCATCTCCAACTTATAAGTTGGAG ------ + --------- + ----- ---- + --------- + --------- + ------ CCCTGCGCAGAGGAGACGGCCTTGTGGCCCGTAGAGGTTGAATATTCAACCTC AAATAAGAGAATTTCAGATTGAGAGAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCAGAGGAGA --- + --------- + --- ------ + --------- + --------- + -------- + ------ TTTATTCTCTTAAAGTCTAACTCTCTTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCGTCTCCTCT SP h I GCATAGAAATGGGGTTCACTTTTTGGTAAAGCTATAGCATGCCTATCACATATAAATAGA --- + --------- + --------- + --------- + --------- + --------- + ------ CGTATCTTTACCCCAAGTGAAAAACCATTTCGATATCGTACGGAT AGTGTATATTTATCT GTGCCAGTAGCGACTTTTTTCACACTCGAGATACTCTT ACTACTGCTCTCTTGTTGTTTT --- + --------- + --------- + --------- + ----- ---- + ---------- + ------ CACGGTCATCGCTGAAAAAAGTGTGAGCTCTATGAGAATGATGACGAGAGAACAACAAAA TATCACTTCTTGTTTCTTCTTGGTAAATAGAATATCAAGCTACAAAAAGCATACAATCAA --- + --------- + --------- + - ------- + --------- + --------- + ------ ATAGTGAAGAACAAAGAAGAACCATTTATCTTATAGTTCGATGTTTTTCGTATGTTA GTT BC a I ma HIIV CTATCAACTATTAACTATATCGATACCATATGGATCCGTCGACTCTAGAGGATCGTC --- + --------- + --------- + --------- + --------- + --------- + ---

GATAGTTGATAATTGATATAGCTATGGTATACCTAGGCAGCTGAGATCTCCTAGCAG 44 Β a m Η GACTCTAGAG ^

CTGAGATCTCCTAG 'le fragment BglII-HindIII - syrobolis ^ par ^ EtBĒ sur La figura 10 - portant L'extremit 3' du gene PGK de Levure. Ce fragment provient de la digestion compLete L'aide de BglII du fragment HirtdIII de L'ADN chromosomalque de Levure, portant Le gene PGK de mer of HITZEMAN et al. (1982 NucLeic Acids Res., 10, 7791-7808) LequeL ne presente qu'un site Bgln. Cette digestion of permeate d'obtenir deux fragments HindII I-Bgin, not Le pLus petit d'environ 0.4 Kb, qui porte L'extremite 3 'du gene PGK de levure est retenu. The sequence de ce dernier fragment est decrite of HITZEMANN et al. (reference citee ci-dessus). Le site BglII est cLone dans Le site BamHI two fragment precedent (Les sites BamHI et BglII disparaissent donc) et Le site HindIIl, render fr action on La polymerase de Kleenou, est cLone dans Le site PvuII two fragment PvuII-Pstl de pBR322 decrit ci-apres. - Le fragment PvuII ~ PstI - SymboLise on xxx sur La fig 10 - de pBR322 contenant L'origine de repLication and La partie avaL gene de resistance a L'ampiciLLine Amp.

The le pLasmide pEMR414 single constitutor comporte donc Les elements suivants: - sleep origin repLication et un gene de resistance ß L'ampiciLLine Amp permettant La repLication et la selection du pLasmide dans Les ceLLuLes E. coLi. Ces eLements permettent La transformation dans Les ceLLuLes de E. coli. - the origin of the replication pour La Levure (ARS), Le Locus STB and Le gene LEU2 de S. cerevisiae side promoter and Le gene URA3 avec son promotur de S. cerevisiae. Ces eLements permettent La repLication and LaSection du pLasmide dans Les ceLLuLes de 45 LV 12000 S. cerevisiae ainsi qu'une efficacite de partition suffisante dans In cellular contenant le plasmid 2µ endogenous. 05

The enzyme de restriction NheI et Ctal of le plasmids pEMR414 a et soomei une destiestion complete. The le petit fragment is the Nhel-Clal contenant le gene URA3, the api ci-apres fragment A, a ete purifie. 10th

The enzyme enzyme NheI et BamHI of Le plasmids pEMR414 a so as to undergo complete degration. The Le grand fragment is a Nhel-BamHI contenant notation of the gene LEU2d and l'origine de replication of plasmids pBR322, the ci-apres fragment B, a ete purifie. 15th

There is a synthesis of the fragment d'autre synthesis of the Clal-Accl contingent of the debut d'un gene encoding a protein deduite de la sequence de l'ADNc de l'urate oxydase (clone 90. Ce fragment comporte des modifications par rapport au clone 9C, Introductions dans le but de place de codons usuel dans la levure (Cf. SHARP et al., 1986, Nucl. Ac. Res. Vol. 14, 13, pp. 5125-5143) side changement des acides amines codes . La sequence de ce fragment, denomme ci-apres fragment C, est la suivante (Ies nucleotides soulignes sont ceux modifies the rapport au clone 90. 20 C l A c

c I a

I 25 f

CGATATACACAATGTCUCTGnAAĢGC ^ GCTAGATACGGUAGGACAACGTTAGAGT --- + --------- + --------- + --------- + --------- + --- ------ + ----

TATATGTGTTACAGACGACAATTCCGACGATCTATGCCATTCCTGTTGCAATCTCAGA 30 A une diestion on the enzymes Accl et BamHI. Le fragment AccI-BamHI qui contient la fin de l'ADNc de l'urate oxydase, ci-apres appele fragment D, a ete purifie. Ce fragment a la sequence suivante: 4ό

Accl

Ύ CΤACAAGGTTCACAAGGACCAGAAC

(TGTTCCAAGTGTTCCTGCTCTTC ACCGG7G7CCAGACGG7G7ACCAGA7CACC GTCTGTGTGCTTCTGGAGGGTGAGATTGAG --------- + --------- + --------- +

TGGCCACAGGTCTGCCACATGCTCTACTGG CAGACACACGAAGACCTCCCACTCTAACTC

ACCTCTTACAC.CAAGGCCGACAACAGCGTC ATTGTCGCAACCCACTCCATTAAGAACACC --------- + --------- + --------- + --------- + ------ --- + --------- +

TGGAGAATGTGGTTCCGGCTGTTGTCGCAG TAACAGCGTTGGCTGAGGTAATTCTTGTGG

ATTTACATCACCGCCAAGCAGAACCCCGTT ACTCCTCCCGAGCTGTTCGGCTCCATCCTG --------- + --------- + --------- + -------- + --------- + --------- +

TAAATGTAGTGGCGGTTCGTCTTGGGGCAA TGAGGAGGGCTCGACAAGCCGAGGTAGGAC

GGCACACACTTCATTGAGAAGTACAACCAC ATCCATGCCGCTCACGTCAACATTGTCTGC --------- + --------- + --------- + --------- + -------- - + --------- +

CCG7G7G7GAAC7AAC7C77CA7G77GG7G TAGGTACGGCGAGTGCAGTTGTAACAGACG

CACCGC7GGACCCGGATGGACATTGACGGC AAGCCACACCCTCACTCCTTCATCCGCGAC --------- + --------- + --------- + --- - ---- + --------- + --------- +

GTGGCGACCTGGGCCTACCTGTAACTGCCG TTCCCTGTGGCAGTGAGGAAGTAGGCGCTG

AGCGAGGAGAAGCGGAATGTGCAGGTGGAC GTGGTCGAGGGCAAGGGCATCGATATCAAG --------- + --------- + --------- + --------- + - - ------ ---------- +

7CGC7CC7C77CGCC77ACACG7CCACC7G CACCAGCTCCCG7TCCCGTACCTATACTTC TCG7C7C7G7CCGGCC7GACCG7GC7GAAG AGCACCAAC7CGCAG77C7GGGGC77CC7G - + - - - - - - + -

AGCAGAGACAGGCCGGAC7GGCACGAC77C 7CG7GG77CAGCG7CAAGACCCCGAAGGAC CG7GACGAG7ACACCACAC77AAGGAGACC 7GGGACCG7A7CC7GAGCACCGACG7CGA7 --------- + --------- +----- --- + --------- +

GCAC7GC7CA7G7GG7G7GAA77CC7C7GG ACCC7GGCA7AGGAC7CG7GGC7GCAGC7A

GCCACT7GGCAG7GGAAGAA777CAG7GGA C7CCAGGAGG7CCGC7CGCACG7GCC7AAG

CGG7GAACCG7CACC77C77AAAG7CACC7 GAGG7CC7CCAGGCGAGCG7GCACGGA77C

77CGA7GC7ACC7GGGCCAC7GC7CGCGAG G7CACTC7GAAGAC7T77GČ7GAAGA7AAC --------- + --------- + --------- + --------- + -------- - + --------- +

AAGCTACGATGGACCCGG7GACGAGCGC7C CAGTGAGACT7CTGAAAACGAC77C7A7TG

AG7GCCAGCG7GCAGGCCAC7A7G7ACAAG A7GGCAGAGCAAA7CC7GGCGCGCCAGCAG --------- + --------- + --------- + --------- + -------- - + --------- +

TCACGG7CGCACG7CCGG7GA7ACA7G7TC TACCG7C7CG777AGGACCGCGCGG7CG7C

C7GA7CGAGAC7G7CGAG7AC7CGTTGCCT AACAAGCAC7ATTTCGAAA7CGACC7GAGC --------- + --------- + --------- + --------- + -------- - + --------- +

GAC7AGC7C7GACAGC7CA7GAGCAACGGA T7GT7CG7GA7AAAGC777AGC7GGAC7CG

TGGCACAAGGGCC7CCAAAACACCGGCAAG AACCCCGAGG7C77CGC7CC7CAG7CGGAC --------- + ------------------- + --------- + -------- - + --------- +

ACCG7G77CCCGGAGG777TG7GGCCGTTC TTGCGGC7CCAGAAGCGAGGAG7CAGCC7G

CCCAACGG7CTGA7CAAG7G7ACCG7CGGC CGGTCC7C7C7GAAG7C7AAA77G7AAACC --------- + --------- + --------- + --------- + -------- - + --------- +

GGG77GCCAGAC7AG77CACA7GGCAGCCG GCCAGGAGAGAC77CAGA777AACA777GG

AACA7GA77C7CACG77CCGGAG777CCAA GGCAAAC7G7A7A7AG7C7GGGA7AGGG7A --------- + --------- + --------- + --------- + -------- - + --------- +

T7G7AC7AAGAG7GCAAGGCCTCAAAGGTT CCG777GACATATATCAGACCCTA7CCCAT 7AGCA77CA77CAC77G777777AC77CCA · ΑΑΑΑΛΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ ATCGTAAGTAAGTGAACAAAAAATGAAGGT χχχχχχττχτχττΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCCCG · eamHI --------- 4 ------------------

TTTTTTTTTTTTTTTTT7TTTTTCCCGGGCCT AG 47 LV 12000

Les fragments A, B, C and D are ligands for the expression of the Le plasmids pEMR469 in Fig. 11, the symbols for on-la meme are que sur la in Fig. 10, the Claal-Accl and AccI-BamHI etan fragments. symbolises 05 par

2) Construction of two plasmids in pEMR473: 10

The digestion of Le plasmids pEMR469 a by digestion complete the lesions of Mluul et Sphl. Le grand fragment Mlul-Sphl contenant le gene de l'urate oxydase a ligand au fragment synthesis, de-sequence donnee ci-apres, correspondant a une partie (200 pb) de la sequence en am de l'element TATA du promotur GAL 7 de S. cerevisiae, laquelle comprised les sequences d'activation amont (upstream activation sequences: UAS). 15 Μ Ι u

I

CGCGTCTATACTTCGGflGCftCTGTTGAGCGAAGGCTCATTAGATATPTTTTCTGTCftT

AGATATGAAGCCTCGTGACAACTCGCTTCCGAGTAATCTATATAAAAGACAGTA 20

TTTCCTTAACCCAAAAATAAGGGAGAGGGTCCAAAAAGCGCTCGGACAACTGrTGACCGT

AAACGAATTGGGTTTTTATTCCCTCTCCCAGGTTTTTCGCGAGCCTGTTGACAACTGGCA

GATCCGAAGGACTGGCTATACAGTGTTCACAAAATAGCCAAGCTGAAAATAATGTGTAGC ---- ♦ ------- - ----— --------------------

CTAGGCTTCCTGACCGATATGTCACAAGTGT TTTATCGGTTCGACTTTTAT TACACATCG 25 sec

P h

I CTTTAGCTATGTTCAGTTAGTTTCGCATG. - - - > - · --- - * - · - - * - · - gaaatcgatacaagtcaatcaaacci 30

Le plasmid pEMR473 is exclusively representative of Figure 12, dans laquelle les symboles ont la meme signage que dans la figure 11, le nouveau fragment Mluul-Sphl introduit etant symbolise par 35 48 3) Construction du plasmids pEMR515:

Downstream of the plasmids pEMR473 for the sleep digestion part of the l'enzyme XbaI and the sleep digestion part for the l'enzyme Mlu. The Le1 grand fragment of Xbal-Mluul a ete purifie. Ce fragment 05 contient notamment In sequences de l'origine de replication et le locus STB du 2µ, le gene LEU2d, le gene de resistance a l'ampicil-p line Amp, l'origine de replication du pBR322 et la cassette d'expression de l'urate oxydase. II not contient en revanche ni le gene URA3, ni la partie du 2µ composed entre Ies sites Xbal et 10 Nhel.

Le grand fragment Xbal-Mlul a ete recircularize via L'adaptateur de sequence suiting comportant des extremites cohesive Xbal modifie et Mlul: 15 Xbal modifie

^ CTAGGCTAGCGGGCCCGCATGCA CGATCGCCCGGGCGTACGTGCGC ^

Mlul 20 Le plasmid pEMR515 single obten ne possede qu'un seul des trois elements du site FRT cible de la recombinase codee par le gene FLP du 2μ.

Les plasmids pEMR 469 / pEMR473 and pEMR513 possessed a gene coding sequence: 25

ATGTCTGCTG TTAAGGCTGC TAGATACGGT AAGGACAACG TTAGAGTCTA CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT 30 CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG 35 ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG 49 GB 12000

ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG

CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT

GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA

AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG

05 TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA

GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG

ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT AAATTG. EXEMPLE 11: Transformation de la souche de Levure ΕΜΥ761, par Les plasmides pEMR469, pEMR473 et pEMR515 - Transformation de levures de Levures GR500 et GRF18 for Le pLasmide PEMR515 - Transformation avec section pour La prototrophie de l'uraci. La 15 prototrophie de Leucine

There is a utility comme souches recepttrices trois souches de Saccharomyces cerevisiae non isogeniques: - La souche ΕΜΥ761 (Mata, leu2, ura3, his3, gal) - La souche ΕΜΥ500 (Mata, Leu2, ura3, pep4) 20 - La souche GRF18 (Mata, Leu2, his3);

La souche GRF18 est bien connue de l'homme de L'art (Gerry FINK, MIT, USA). Les souches ΕΜΥ761 to ΕΜΥ500 sont appa- rentees a La souche GRF18. ELLes ont et obtenues for croisements successfs de la souche GRF18 avec une souche ura3 derivee de La 25 souche FL100 (deposee a l'ATCC sous Le n ° 28 383) et avec La souche 20B12 (Mata, tsp1, pep4) for E.W. JONES (E.W. JONES et al. (1977) Genetics 85, 23).

On the side of La souche GRF18 for the curve du pLasmide pEMR515 de La souche GRF18 pEMR515 (Leu +) depot La CNCM sous La 30 reference n ° 1-920, Le 28 Dec 1989 et La souche ΕΜΥ500 for curage du pEMR515 de La souche ΕΜΥ500 pEMR515 (leu +) deposee a La CNCM sous La reference n ° 1-919, le 28 Dec 1989.

Ces souches contiennent des mutations (Leu2 et ura3), susceptibLes d'ether complementations for Le marqueur de seLection 35 defective LEU2d and Le marqueur de seLection URA3, presents dac chacun des pLasmides pEMR469 et pEMR473. 50 1) Transformation avec selection pour la prototrophie de L 'uraci le:

Une colonie de la souche ΕΜΥ761 a servé enemencer 100 ml d'un milieu appellate milieu YPG liquide (Cf. tableau III 05 ci-apes). Lors de l'obtention d'une densifies cellulaire de 107 cells per ml. Cellules ont ete trait a l'acetate de lithium 0.2 M pour la transformation selon une technique biene de l'homme de l'art, de la ITO et al. (ITO et al., 1983, J. Bacteriology 153, 163-168). 10 Les cellules ΕΜΥ761 ont ete transformed en parallel to avec environments 1 pg de chacun des plasmids pEMR469 and pEMR473. Les cellules transformes the selection of the leukacteria d'auxo-trophie d'uracile (ura +) sur and milieu in the appendage of the milieu solide side uracile, (Cf. tableau III ci-apres). The unique retene and trans-15 form ΕΜΥ761 pEMR469 (ura +) et and transform ΕΜΥ761 pEMR473 (ura +). 2) Transformation avec selection pour la prototrophie de leucine:

The technique of transforming utilise est une variante de celle de parite by Beggs et al. (Beggs et al. (1978) Nature 275: 104-09). Elle consiste a soumettre les levures a un traitement de 20 protoplastisation and preservative osmotique, le sorbitol en concentration 1 M.

Le protocole precursor de transformation ester ci-apres: (a) 200 ml du milieu YPG liquide (Cf. tableau III) sont ino-25 cules avec environments 5 x 10 ^ cell culture and phase culture inoculation est placebo une nuit sous agitation at 30 ° C. b) Lorsque la culture at ambient 107 cells per ml, centrifugation of les cells at 4000 rpm pendant for 5 min et le 30 culot ester with avec du sorbitol 1 M. c) Les cells with suspension 5 ml de solution de sorbitol 1 M contenant in 25 mM EDTA and 50 mM de dithiothreitol et incubated in pendant for 10 min at 30 ° C. (d) Les cellules sont lavave une fois avec 10 ml de sorbitol

35 1 M et suspendues in 20 ml de sorbitol. De la Zymolyase-100T (Preparation Obligation for Purification Particle Surface Colon 51 LV 12000 d'affinite du culture of Arthobacter luteus and contraant for La β-1,3-glucane-Laminaripentahydrolase, commercia-Lisee for SEYKAGAKU Υ06Υ0 Co. Ltd) ) est ajoutee? une concentration finale de 20 µg / ml et incube La suspension? ambient temperature pendant 15 min. e) Les ceLLuLes sont resuspendues for 20 mL d'un miLieu contenant two sorbitoL appele miLieu YPG sorbitoL (Cf. tabLeau III ci-apres) and incubates in pendant for 20 min at 30 ° C in a sous agitation douce. (f) Centrifuge at 2500 ppm for 3 min. g) On resuspension, 9 mL of de-swab de-transformation (sorbitoL 1M, tris-HCl de pH 7.5 10mH and CaCl 2 10mM).

h) Starting with 0.1 mL of solution and 5 μΐ of solution d'ADN (5 pgs of environment) is the ambient temperature of the Laisse La suspension 10 p 15 min. i) Starting with 1 mL of de Laolution: polyethylene glycol PEG 4000 20%, tris-HCL de pH 7.5 10 mM and CaCl 2 10 mM. j) On verse 0.1 ml of de La suspension obtenue en i) dans and tube contlant for two mlLieu soLide de regeneration side leucine (Cf. tabLeau III ci-apres) preaLablement foundation and change in Liquide a environments 45 ° C. On verse La suspension sur une boite de Petri contenant une couche soLidifiee de 15 ml de miLieu de regeneration soLide side Leucine. k) On repete l'etape j) avec le reste de La suspension ceLLu-laire obtenue en i).

Les will transform the commencent à apparaitre au bout de trois jours.

On a single retin Les is transformed by ΕΜΥ761 pEMR469 (Leu +), ΕΜΥ761 pEMR473 (Leu +), ΕΜΥ761 pEMR515 (Leu +), GRF18 pEMR515 (Leu +) and ΕΜΥ500 pEMR515 (leu +). 52

TABLEAU III

Principaux milieux utilises dans Exenipl.es 11, 12, 13 et 14 - milieu solide side uracile 6.7 g de base azotee de Levure side acides amines (Yeast nitrogen base uithout Amino Acids de DIFCO) 5.0 g d'hydrotysat de caseine (Casamino acids de DIFCO) 10 g de glucose 20 g d'agar melanger tous Ies ingredients dans de L'eau distillee, completer Le volume final à 1 l avec de L'eau distillee. AutocLaver 15 min at 120 ° C. - milieu Liguide side uracile

Utiliser la formulates du milieu solide side uracile en omettant l'agar - AutocLaver for 15 min at 120 ° C. - milieu solide side leucine 6.7 g de base azotee de levure side acides amines (Yeast nitrogen base without Amino Acids de DIFCO) 20 mg d'adenine 20 mg d'uracile 20 mg de l-tryptophan 20 mg de l-histidine 20 mg de l-arginine 20 mg de l-methionine 30 mg de l-tyrosine 30 mg de l-isoleucine 30 mg de l-lysine 50 mg de l-phenylalanine 100 mg de l-acide glutamique 150 mg de l-valine 400 mg de l-leucine 53 LV 12000 20 g de glucose 20 g d'agar melanger tous Ies ingredients dans l'eau distillee. Completer le volume final š 1 l avec de l'eau distillee - Autoclaver 15 min a 05 120 ° C. Apres autoclavage, ajouter 200 mg de l-threonine and 100 mg d'acide l-aspartique. - milieu solide de regeneration side leucine 10 utiliser la formulates du milieu solide side leucine en melangeant 30 g d'agar au lieu de 20 et en ajoutant au melange 182 g de sorbitol. 15 - milieu Liguide side leucine utiliser la formulates du milieu solide side leucine en omettant l'agar - Autoclaver 15 min at 120 ° C. Apres autoclavage, ajouter 200 mg de l-threonine and 100 mg d'acide l-aspartique. 20 - milieu YP Liguide 10 g d'extract de levure (Bacto-yeast extract de DIFC0) 20 g de peptone (Bacto-peptone de DIFC0) melanger Ies ingredients dans de l'eau distillee. Completer le 25 volume final a 1 l avec de l'eau distillee - Autoclaver 15 min at 120 ° C. 30 - milieu YPG Liguide Utiliser La formulates two milieu YP liquids auquel on an autoclavage, glucose and une concentration of 20 g / l. 54 mi Lieu YPG sorbitol uti User La formulates two milieu YPG liquide auquel on a run, apres autoclavage, sorbitol a une concentration de 1 M. 05 - milieu YP ethanol-glycerol utiliser la formulates two milieu YP liquide. Apres autoclavage, ajouter 10 ml d'ethanol 100% (1% final) and 30 g de glycerol. 10-milieu YP ethanol-glycerol-galactose utilizer La formulates du milieu YP liquide. Apres autoclavage, ajouter 10 ml d'ethanol 100%, 30 g de glycerol and 30 g de galactose. 20 EXEMPLE 12: Expression and Enhancement of Oxygenase for Lesions ΕΗΥ761 pEMR469 (ura +), ΕΜΥ761 PEMR473 (ura +), ΕΜΥ761 PEMR469 (leu +) and ΕΗΥ761 PEMR473 (leu +) - Western Blood, Immunodetection l'activates urate oxydase and des proteinines solubles 1) Expression de l'ADNc de l'urate oxydase: a) Souches selectionnees sur milieu side uracile 25 30

Une colonie de chacune des souches ΕΜΥ761 pEMR469 (ura +) et ΕΜΥ761 pEMR473 (ura +) a ete en culture dans 20 ml de milieu liquide flank uracile (Cf. tableau III, exemple 11). After sleeping at 30 ° C sous agitation, the cultures were centrifuged on pellet for 10 min at 7,000 rpm. Les blots ont ete repris dans 10 ml d'eau distillate sterile and de-neuveaux centrifuges pendant for 10 min and 7000 rpm. L'expression de l'urate oxydase a eteite repelant les cellules dans 20 ml de milieu YP ethanol-glycerol (Cf. tableau III, exemple 11) pour la souche ΕΜΥ761 pEMR469 (ura +) et 20 ml de milieu YP ethanol-glycerol -galactose (Cf. tableau III, exemple 11) pour la souche ΕΜΥ761 pEMR473 (ura). Les cultures were replaced at 30 ° C with a sous agitation pendant for 22 h. 35 55 55GB 12000 (b) Souches selectionnees sur milieu side leucine

Dan and premier pace, une colonie de chacu'ne des souches ΕΜΥ761 pEMR469 (leu +) et ΕΜΥ761 pEMR473 < leu +) a ete mise en culture dans 20 ml de milieu liquide flank leucine (Cf. tableau III, exemple 11). Ceci a permis d'obtenir et de maintenir and nombre de copies of plasmids are selected for complementation and la mutation of Leu2 on the leu gene LEU2d on the plasmid pEMR469 and pEMR473.

After sleeping at 30 ° C sous agitation, centrifugation of the deux cultures ont ete centrifuges for 10 min at 7,000 rpm. Les blots ont ete repris dans 10 ml d'eau distillate sterile et de nouveau centrifuge pendant for 10 min and 7000 rpm. L'expression de l'urate oxydase a eteite repelant les cellules dans 20 ml de milieu YP ethanol-glycerol pour la souche ΕΜΥ761 pEMR469 (leu +) et 20 ml de milieu YP ethanol-glycerol-galactose (Cf. tableau III, exemple 11) pour la souche ΕΜΥ761 pEMR473 (leu +). Les cultures were replaced at 30 ° C with a sous agitation pendant for 22 h. c) Souche by Themes

La souche ΕΜΥ761 non transformee, c'est-a-dire side plasmide, a ete cultivee comme ci-dessus. Elle a subi d'une part l'induction dans 10 ml de milieu liquide YP ethanol-glycerol et, d'autre part l'induction dans 10 ml de milieu YP ethanol-glycerol galactose. 2) Preparation des echantillons: a) Elution of Les cellules cultivates 1a, 1b) and 1c). Les blots ont ete repris dans 10 ml d'eau distillate and centrifuge pendant for 10 min at 7000 rpm. Les ulcerated single lenses ont ete repris dans environments 1 ml tampon de triethanolamine TEA de pH 8.9. Environ 300 pl de cellules alone reproduces on et alisees presence (bill 400 de 500 pm diameter) representative environ la moitie du volume final. Ce melange a ete vortexe vigoureusement pendant 1 min, 4 fois, les echantillons etant places pendant 30 s dans la glace entre chaque broyage. Le liquide a ete retire des tubes avec une pipette pasteur et transfere dans and microtube. Les billes de verre ont ete lavees 1 fois avec environ 200 pl de tampon TEA de 56 ρΗ 8,9. Les billes ont ete vortexees pendant 1 min, 1 fois to Le liquide a ete rarely a La pipette pasteur pour etère au lysat precedent. Enable a centrifuge dans and microtube pendant for 5 min at 7,000 rpm. Le surnageant a ete precautionneuse-05 was rarely re-conserved at -20 ° C in Le Western BLot, Le dosage de L'activite urate oxydase et Le dosage des proteinines. Le cuLot des ceLLuLes Lysees a ete conserve separement (-20 ° C pour Le Uestern Blot (Cf. 3) ci-dessous). D'autre part, preLevements des cuLtures réaliseses en 10 1a) et 1b) ete real comme su avant L'induction: 2 mL de cuLture ont ete centrifuges pendant 10 min 7000 r / min. Les cuLots ont repris dans 500 pL d'eau distillate et de nouveau centrifuges pendant for 5 min and 7000 rpm. Les cuLots ont ete repris dans environments 200 pl de tampon TEA de pH 8.9 et Lyses comme 15 ci-dessus en presence de bi LLes de verre. Les surnageants et Les cuLots des ceLLuLes Lysees ont ete conserves at -20 ° C. 3) Imrounodetection de L'urate oxydase for Mestern BLot: a) Mode operatoire

Les cuLots et Les deadageants des differents echantiLlons 20 ont et soumis a un Western BLot, technique bien l'homme de l'art, qui comprend Les stages suivantes: - soLubiLisation du cuLot on ebullition pendant 10 min dans and tampon denominate tampon de charge constitution de tris-HCL 0.125 M pH 6.8 SDS 4%, bLeu de bromophenoL 0.002 Z, gLyceroL 20 Z,

25-mercaptoethanoL 10 Z (seLon Le protocole decrit for LAEMMLI (UK LAEMMLI, Nature 227 (1970) 680-685)), (step mise en oeuvre uniquement pour Les cuLots), - eLectrophoretics for different protein contours dans Le. soLubiLisat seLon Le protocoLe decrit for LAEMML (UK 30 LAEMMLI, Nature, 227 (1970), 680-685), - transfert desdites protein pathways by le geL sur and fiLtre de nitroceLLuLose (seLon la technique de H. TWWIN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4354), L'immunodetection, realizes SeLon La technique de 35 BURNETTE (WW BURNETTE Ana. Biochem. 1-12 (1981) 195-203), implicit successivization: 57 LV 12000. The filtrate was filtered through de nitrocellulose pendant for 10 min with avec and tampon A (tris-HCl 10 mM / NaCl 170 mM, KI 1 mM). . After contacting, the de-nitrocellulose pendant is filtered for 30 min at 37 ° C with avec and tampon B (tampon A additionne de 05 serum-albumin bovine and raisin 3 ml pour 100 ml). . After contacting the filtrate, the nitrocellulose pendant is filtered for 1 h at 37 ° C avec and immuno-serum (des anticorps polyclonaux reconnaissant l'urate oxydase d'A. Flavus). . Le ringage du filtrate de nitrocellulose avec le tampon B. 10. After contacting the filtrate, the nitrocellulose pendant is filtered for 1 h at 37 ° C, and the solution is a protein marrow of 125 l 0/1 microcurie / ml. . The le rinfage du is filtered by avec le tampon A.. Le sechage du filters the entre deux feuilles absorbants. 15th La mise en contact d'un film radiographique. . La revelation two film. b) Results

On constate que Souches ΕΜΥ761 pEMR469 (ura) / ΕΜΥ761 PEMR473 (ura +), ΕΜΥ761 pEMR469 (leu +) et ΕΜΥ761 pEMR473 (leu +) 20 produisent une proteinine de poids molecule mare de enicre recreue on 'urate oxydase d'A. flavus et qui est absente de la souche temoin.

On constate egalement que Ies souches non induites not produisent pas ou tres peu de la proteine decrite ci-dessus. 25 La comparaison entre Ies quantites de cette proteine pour

80% de celle-ci est sous forms soluble dans le lysat. 4) Dosage de l'activite urate oxydase: L'activite urate oxydase a ete mesuree sur Ies surna-30 geants des cellules lyses selon le mode operatoire decrit l'exemple 9 ci-dessus.

Les resultats obtenus sont rassembles dans le tableau (IV) ci-apres. Celui-ci precise pour chaque souche induite au glycerol-ethanol, induite au glycerol-ethanol-galactose ou non induite / l'activite urate oxydase en U / ml. 35 58

TABLEAU IV

Souche / Inducteur Activite urate oxydase CU / mt) ΕΜΥ761 / ΥΡ ethanol-glycerol-galactose < 0.1 ΕΜΥ761 / ΥΡ ethanol-glycerol < 0.1 ΕΜΥ761 pEMR469 (ura +) / (non induit) 0.4 ΕΜΥ761 pEMR469 (ura +) / YP ethanot-glycerol 12 ΕΜΥ761 pEMR469 (leu +) / (non induit) 0.17 ΕΜΥ761 pEMR469 (leu +) / YP ethanol-glycerol 36 ΕΜΥ761 pEMR473 (ura +) / (non induit) < 0.1 ΕΜΥ761 pEMR473 (ura +) / YP ethanol-glycerol-galactose 12.5 ΕΜΥ761 pEMR473 (leu +) / (non induit) < 0.1 ΕΜΥ761 pEMR473 (leu +) / YP ethanol-glycerol-galactose 15.3 II Apparatus Clairement Sur Le Tableau Cid-Dessus Que Les Cellules Levure Transformations on Cells Plasmas pEMR469 and pEMR473 for Protein Depletion and Activation of Urate Oxydase. 5) Dosage des proteines totales solubles dans Les lysats:

The kit for protein assay de BIORAD is a disposable pour doser of Les proteinines total dans le mortageant des cellules lysees. II est base sur l'observation que l'absorbance maximum pour une solution acide de bleu brillant de coomassie g-250 passe de 465 nm to 595 nm lorsque des proteinine fixer (Cf. Reisner et al., Anal Biochem. 64, 509- (1975)). a) Mode operatoire

On introduit dans la cuve d'un spectrophotometer regle a 595 nm les volumes suivants: - 10 pl d'étecillon auxquels ont ete rajoutes 790 μΐ d'eau di st ilLee - 200 μΐ de " Dye reagent " concentre (Biorad). 59 LV 12000 0n Melange et on Lit Density Optique at 595 nm. One gamma reference avec des concentrations croissants de BSA (Bovine Serum Albumine) a ete realizée. There is a La Concentration inconnue des proteines et Les des lysats sur La courbe reference obtenue. b) Results

Les principaux resultats obtenus sont rassembles dans Le tableau V ci-apres. CeLui-ci Precise pour chaque souche induite au glyceroL-ethanol, induite au glycerol-ethanol-galactose ou non induite, La quantite (en mg / ml) de proteinine solesLes que le pourcentage d'urate oxydase dans Les proteinine totesLes ( is admet ici que l'activite specifice de La proteinine recombinante este celle de l'urate oxydase obtenue d'A. flavus: 30 U / mg).

TABLEAU V

Souche / Inducteur Protein Total Solubil mg / ml% d'urate Oxydase dans Les Protein Total Solar ΕΜΥ761 / g Lyce ro L-et hano L 5.3 < 0.05 ΕΜΥ761 / g Lycose ro L-ethaned with Hanol Lactose 5.8 < 0.05 ΕΜΥ761 pEMR469 (ura +) / non induit 8.5 0.25 ΕΜΥ761 pEHR469 (ura +) / gLycerL-ethanoL 5.3 4.7 ΕΜΥ761 pEMR469 (Leu +) / non induit 1.7 0.3 ΕΜΥ761 pEMR409 (Leu +) ) / gLyceroL-ēthanoL 5.9 20 ΕΜΥ761 pEMR473 (ura +) / non induit 10.3 < 0.05 ΕΜΥ761 pEMR473 (ura +) / gLyceroL-ethanoL-gaLactose 6.5 6.4 ΕΜΥ761 pEMR473 (Leu +) / non induit 0.5 < 0.05 ΕΜΥ761 pEMR473 (leu +) / glycerol-ethanol-galactose 3.9 13

The cone que le leux de production de L'urate oxydase varies from 5 to 20% selon les transformants and le mode de selection des transforms (leu +). 60 EXEMPLE 13: Expression en fermenteur de 2.5 L de L'ADNc de L * urate oxydase pour La souche ΕΜΥ761 pEMR473 (ura +) 1) ProtocoLe de fermentation: a) Mi li eux Milieu inoculum

Une colonie de la souche ΕΜΥ761 pEMR473 (ura +) a ete mise en culture dans 200 ml de milieu liquide flank uracile (Cf. tableau III, exemple 11). La culture est poursuivie pendant une nuit sous agitation jusqu'a une D0 d'environ 3.

Milieu de culture Pour 1 l d'eau purifiee sur and appareil de type Mi11i -q glucose 30 g glycerol 30 g hydrolyzate de caseine (Casino acids de DIFC0) 30 g base azotee de levure (Yeast Nitrogen Base de DIFC0) 15 g extrait de levure (Yeast extract de DIFC0) 2.5 g k2hpo4 3 g MgSO4,7H2O 0.5 g

Milieu additionnel B pour 100 ml d 'eau purifiee sur un appareil < de type Mi11i-Q glycerol 30 g hydrolyzate de peptone (le Primatone de G. Sheffield) 30 g base azotee de levure (Yeast Nitrogen Base de DIFC0) 15 g extrait de levure (Yeast extract de DIFC0) 5 g 61 GB 12000 K2HP04 3 g

MgSO 4 .7H 2 O 0.5 g b) Parameters for fermentation 05 Bioreactor de 2.5 L total volume equip de deux turbines temperature = 30 ° C pH = 5 compression partieLLe en oxygene = 30 mmHg debit d'air = 1 l / min. 10 Le bioreacteur est rempli avec 1.5 L du milieu A et est with avec 150 ml de l'inoculum.

Une fois que Le glucose est epuise â € œD0 2.5 â € “ D0 17, L'induction a lie for addition d'un volume de 150 mL de galactose â 20 X poids / volume. La croissance est poursuivie, puis Le raiLieu 15 additionnel B est ajoute aux environs de DO 30.

La croissance se proLonge un quinzaine d'heures et la recolte et ete effectu une D0 104. 2) Preparation et analyse des echantiLLons:

Les echantiLLons ont ete prepare comme decrit dans 20 l'exempLe 9 2) a) a partir de La cuLture en fermenteur. Deux preLe-vements ont ete reaLises: Le premier apres 7 h d'induction, Le second apres 22 h d'induction.

Surveillance of Lysats obtenus apres Lyse des cellules, Les tests for decrits dans L'exempLe 9 ont et reaLises: 25 - Immunodetection for Western Blot - Dosage de L'activite bioLogique - Dosage des protein.

Les resuLtats obtenus sont Les suivants. a) Immunodetection on Mestern BLot 30 On Constituent La Souche ΕΜΥ761 pEMR473 (ura +) Cultivated Enzyme 2L Protein Une Protein De Poids MoleculeLear apparent 33 KDa qui est reconnue for les anticorps conducted by contre L'urate oxydase d'A. fLavus: (Prepared by Chez Le Leaf of the Techniques of the L'Homme de L'art: Cf. WITCH SAID 35 et al. (1981) " Methods in Enzymology " Academic Press, New York, p. 73, p. 46 ) et qui est absente dans La souche temoin. • 62 b) Dosage de l'activite biologigue

Les resultats obtenus sont rassembles dans Le tableau VI ci-apres: 05

TABLEAU VI

Souche / Temps d'induction U / ml ΕΜΥ761 pEMR473 (ura +) / 7 h ΕΜΥ761 pEMR473 < ura +) / 22 h 9 12.5

On cone que La souche ΕΜΥ761 pEMR473 (ura +), cultivee en -fermenteur, est able, calc induction, de produire une activite urate oxydase. (c) Dosage des proteines totales solubles

Les resultats sont rassembles dans le tableau VII ci- apres:

TABLEAU VII

Protein% d'urate oxydase Souche / Temps d'induction total dans les proteinines total solubles mg / ml ΕΜΥ761 pE «R473 (ura +) / 7 h 5.2 5.7 ΕΜΥ761 pEMR473 (ura +) / 21 h 6.2 6 , 6

Ces resultates indiquent que le taux de synthesis en urate oxydase de la souche ΕΜΥ761 pEMR473 (ura) cultivare en fermenteur est d'env'iron 5 X de proteinines apres 7 h et 21 h d'induction. 63 63LV 12000 EXEMPLE 14: Expression en erLenmeyer de l'ADNc de L'urate Oxydase for Ies souches ΕΜΥ761 pEMR515 (leu *), ΕΜΥ500 pEMR515 (leu *) and GRF18 pEMR515 (leu *)

Une colonie de chacune des trois souches ci-dessus a ete mise en culture dans 20 ml de milieu liquide side leucine.

After sleeping at 30 ° C sous agitation, Les trois cuLtures ont ete centrifuged in pendant for 10 min and 7,000 rpm. Les ulcerated cellulaires ont et repris dans 10 ml d'eau distillate sterile and de pendant centrifuges for 10 min. L'expression de l'urate oxydase a ete induite en reprenant les cellules dans 20 ml de milieu YP ethanol-glycerol-galactose (Cf. tableau I, exemple 8). Les cultures ont ete replace at 30 ° C sous agitation pendant environments 20 h. En temoin, une culture de chaque souche hote, non transformee, a ete effectuee.

Les cellules de chacune des six cultures sont reculotees par centrifugation et le surnageant est elimis. Les blots ont ete repris dans 10 ml d'eau distillate and centrifuge pendant for 10 min at 7000 rpm. Les blistered monoclaves ont ete repris dans environments 1 ml de tampon TEA de pH 8.9 et le broyage singl que l'e.limation des particulates for centrifugation ont realization comme decrit dans l'exemple 9, 2). The culture of culture is a precedent for the dosing of protein and total protein. Les principaux resultats obtenus sont rassembles dans le tableau VIII ci-apres: 64

TABLEAU VIII

Souche / Conditions de culture Activite urate oxydase (U / mu Protein totales solubles (mg / ml)% d'urate oxydase dans Protein solubles GRF18 pEMR515 (leu +) / a) < 0.1 2.2 < 0.05 ΕΜΥ500 pEHR515 (leu +) / a) < 0.1 0.9 < 0.05 ΕΜΥ761 pEMR515 Cleu +) / a) < 0.1 1.8 < 0.05 GRF18 pEMR515 (leu +) / b) 38 5.4 23% ΕΜΥ500 pEMR515 (leu +) / b) 20 2.5 26% ΕΜΥ761 pEMR515 (leu +) / b) 33 4.2 26% a): Ies souches sont cultures en presence de glucose (conditions de non-induction) b): Souches sont cultures en glucose et presence de galactose (induction).

Ces resultats montrent que l'on peut obtenir and haut niveau d'expression d'urate oxydase avec trois souches recipes non isogenous transformes par le vecteur d'expression selon 1'invention. ΕΧΕΜΡ1 – Ε 15: Express1on en fermenteur de 2/5 l de l’ADNc de l’urate oxydase pour la souche ΕΜΥ500 pEWR515. Purification and Characterization Particle de L'urate Oxydase Recombinant 1) Culture Enzyme 2.5L de la souche ΕΜΥ500 pEMR515:

La culture de la souche ΕΜΥ500 pEMR515 se fait en fermenteur et seine de la maniere suivante: (a) Phase de preculture en erlenmeyer A partir de 1 ml de solution and milieu contenant 20% de glycerol de la souche ΕΜΥ500 pEMR515 avec un nombre de cellulose correspondant a une D0 de 2.35, is an enzyme and 500 ml contenant 500 ml de milieu de croissance phase autoclave MCPA complement 1.28 g de MES (2 / N-morpholino / -ethanesulfonic 65 EN 12000 acid: Sigma n ° M 8250) and 10 ml de milieu de croissance phase filtrate. MCPF. Les compositions des milieux MCPA et MCPF sont pre-cisees ci-aprčs. Apres 24 heures d'incubation, sous agitation at 30 ° C, ophthalmic culture option 7 (b) Phases de culture en fermenteur

La ci-dessus est utilisče pour ensemencer un fer-menteur 2/5 1 / contenant le milieu de culture de composition sui-vante:

900 ml de MCPAF + 200 ml de MCPF

Le pH de la culture est regulation par le fermenteur a la valeur de consigne qui est 5/5. After 6 hours and 7 hours at culture at 30 ° C, the solution is run for 9 hours, 72 ml of deune solution 500 g / l and 36 g de glucose. c) Phase d'expression

Au melange preconditioning decrit / on 100 ml de milieu d'expression phase autoclavable ΜΕΡΑ et 150 ml de milieu d'expression phase filtrate MEPF (dont les compositions s pre-cisees ci-apres). La culture est alors continuee pendant 5 h. Puis, is ajoute de fa? On linčai re, pendant for 20 h, 150 ml d'une solution contenant 30 g de galactose, 15 g de glycole and 36 g d'èthanol. On obtient alor sleep D.O. voisine de 160.

COMPOSITION CHIMIGtUE DES MILIEUX DE CROISSANCE ET D'EXPRESSION - Milieu de croissance phase autoclavable MCPA pour 900 ml final NTA (acide nitrilotriactic) extrait de levure (DIFCO) 1/2 g 6 g 1/2 g 0/6 g 1/2 g

NaCl

MgSO4 / 7H2O 66

CaCl2, 2H2O 840 mg FeClj 108 mg acide glutamique 4.44 g HYCASE SF (Sheffield Products) 30 g leucine 2.16 g hi stidine 600 mg methionine 1/2 9 oligoelements I (Cf. ci-apres) 5 ml uraci le 1 / 2 g 10

Liste des oligoelements I pour 1 l d'eau ultrapurifiee

CuSO ^, 5H20 O 00 mg HjBOj 5 9 ZuSO ^, 7H20 3 9 KI. 1 9 MnSO4, 2H2O 3.5 9 Na? M0A, r 2H20 2 9 FeCU, 6H-.0 4.8 9

Ajouter a la solution 100 ml d'acide chlorhydrique concentre. Completer a 1000 ml.

25 - Milieu de croissance phase filtrate MCPF pour 200 ml final d'eau ultrapurifiee KH2P04 4.8 g 30 tryptophan 420 mg Vitamin I (Cf. ci-apres) 5 ml glucose_ 36 g

Chauffer pour dissoudre, temperer, ajouter In Vitamin I et filtrer a 0,2 μ. 35 67 LV 12000

Liste des Vitamin I pour 100 ml final d'eau ultrapurifiee biotic 1.2 mg acide folique 1 mg niacine 144 mg (acide nicotinique pyridoxine. HCl 60 mg thiamine. HCl 240 mg pantothenate de calcium 1.2 g mesoinose at 2.4 g

Completer 100 ml apres dissolution.

Filter filter sterile element 0.2 μ. - Milieu d'expression phase autoclavable ΜΕΡΑ pour 100 ml d'eau ultrapurifiee 20 NTA 1.2 g K2S ° 4 2.08 g acide glutamique 6 g HICASE SF (Sheffield Products) 24 g leucine 2.16 g 25 histidine 600 mg methionine 1.2 g MgSO 4, 7H 2 O 720 g CaCl 2, 2H 2 O 840 mg FeCl 3, 6H 2 O 108 mg 30 oligoelements in 1 5 ml uracil 1.2 g

Ajuster le pH â 5.5 avec ^ SO ^ concentre ou K0H concentre. Autoclav / er 20 min at 120 ° C. 35 68 - Milieu d'expression phase filtrate MEPF pour 150 ml final d'eau ultrapurifiee kh2po4 2.4 g tryptophan 420 mg vitamins I 5 ml glycerol 36 g galactose 45 g 10

Chauffer pour dissoudre, temperer, ajouter Ies vitamines et fi Ltrer. 2) Broyage des cellules 15 Apres 20 heures d'induction, laurite optique, mesure 600 nm, de la culture est 98. 800 g de mout fermentation in centrifuges for 5 min at 10 000 g et le culot cellulaire est repris dans 80 ml de tampon de lyse (glycine 20 mM pH 8.5). Les cellules sont alors broiees at 4 ° C, 2 foam pendant 2.5 min dans and broyeur 20 (Vibrogen Zellmuhle V14) in presence of a volume of 0.5 mm in diameter, eg au volume de la solution de cellules à lyser. Apres broyage, le surnageant est repris et les billes sont lavees deux fois par 80 ml de tampon de lyse. There is a recuperation of 210 ml de lysat possedant and tax de proteinine totales d'environ 3 mg / ml et 25 une activite urate oxydase d'environ 7.7 ll / ml (soit un pourcentage d'urate oxydase for rapport aux proteinines totales d'environ 8.5 X en supposant une activite specifique de cette derniere de 30 U / mg). 3) Purification de l'urate oxydase recombinante 30 a) Protocole de purification

It is soumet le lysat precedent au protocole de purification a deux stages decrit ci-apres. 35 69 LV 12000 STEP 1:

Chromatographie anionique:

Support: DEAE (diethylaminosulfate) sepharose fast flou (Pharmacia ref. 17.07.09.91).

Le gel une fois tasse occupe and volume de 70 ml.

La separation est effectue temperature ambiante, Ies fractions recoltees, conservees 0 ° C.

Conditions de separation:

It is utilized and gradient de force ionic de chlorure entre un tampon 1 (borate de sodium 10 mM, pH 9.2) and un tampon 2 (borate de sodium 10 mM, chlorure de sodium 1 M). Les tampons are pretreated and degassed and preserved at 0 ° C. Dans chaque tampon il a ete ajoute l'equivalent de 0.02% d'azide. L'extrait brut est depose (10 ml) et elue avec le tampon 1 jusqu'a la collecte complete de l'urate oxydase (par fractions de 10 ml), qui n'est pas retenue sur la colonne.

Les pigments et les proteines contaminantes sont ensuite eliminates en eluant avec le tampon 2.

La purification est suivie par mesure de la densité optique de l'eluat a 214 nm. STEP 2:

Chromatographie Liquide haute pression sur phase inverse:

Support:

Colonne a base de silice greffee C8, l'Aquapore 0D-300 (100 x 2.1 mm) (Brounlee-Applied Biosystems) 70

Conditions operatoires:

Eluant 1: Eau ultrapurifiee (passe a travers and systfeme Millipore) avec 0.1 X d'acide trifLuoroacetique.

Eluant 2: Acetonitrile Cde qualite spectrophotometric (ou equi-valent) avec 0.08 X d'acide trifluoroacetique.

Debit: 0.3 ml / min.

Le gradient est de 35 X acetonitrile / TFA? 70% acetonitrile / TFA en 20 min, with a reference tent of 70 X pendant for 5 min. La quantite injectee est de 1 ml par run.

Collecte des fractions:

Le deroulement de la separation est suivi par mesure de la densite optique a 218 nm. L'acetonitrile est evapore lors de la centrifugation sous vide. (b) Result: L'echantillon avant et apres la premiere de purification et ete analysis for chromatographic liquid sur une colonne de silice grape C8, l'Aquapore 0D-300 decrite avec le meme gradient, avec une quantite injectee de 50 μΐ. It is a utility comme temoin externe l'urate oxydase d'A. flavus purifiee.

Dans le lysat de depart, l'urate oxydase represente 63 X des proteinines totales. 84% of the total protein content in the purification phase is purified by the purification of the oxydase.

La totalite de l'echantillon obtenu h l'issue de la seconde step, lequel contient certainement plus de 84% d'urate oxydase, a ete utilise pour la caracterisation partielle decrite ci-apres. 4) Caracterization partielle de l'urate oxydase recombinante. a) Analyze d'acides amines 71 LV 12000 L'anityse des acides amines de l'hydrolyzate acide de l'urate oxydase recombinant purifie et etu effectu.ee Sur and Analyzer d'Applied Biosystems Model 420-130A. La repartition des acides amines quantifies est compatible (pas de difference signifi cative) avec la sequence supposee. Le meme the resultat a ete observe pour l'urate oxydate d'A. ftavus extractive purifiee (obtenue à l'exemple 4). b) Carte peptidique tryptique

Une carte peptide tryptic et etie et l'urate oxydase recombinant purifiee et pour l'urate oxydase extractive purifiee (obtenue a l'exemple 4) dans Ies conditions suivantes:

There is prepared a concentration of the solution of urine oxydase at a concentration of 1 mg / ml and an extemporaneous solution of the solution of 1 mg / ml of trypsin.

Les deux Solutions sont mises en presence dans une pro-portion enzyme / substrat de 1/30 pendant 8 heures a température ambiante. L'hydrolyzate tryptic estuite soum à une chromato-graphie en phase liquidide un décolleté C18.5 pm, lichrosorb (250 x 4 ^ 6 mm) (Hichrom-ref.RP 18-5-250A), equipe d'un detecteur UV a 218 couple à en enregistreur. The gradient applique is de 1% acetonitrile / TFA% 60% acetonitrile / TFA en 120 min, the wood is on the ent 60 X pendant for 5 min.

Les cartes peptidiques obtenues ont and profil tres proche. (3) at the amino terminus of the demonstration of the mutation of the carcase:

The amino-terminal sequence of a sequence analysis of the aide d'un sequence of the Applied Biosystem Model 470A, of the pair and analysis of the phenylthioidant model of the Applied Biosystem 120A. L'urate oxydase recombinant purifiee (200 pmoles contraclees on 72 assays d'acides amines) a ete deposee sur le sequenceur en présence de 20 pmoles de β-lactoglobulin, a proteinaceous subject.

Aucune Sequence Amino-Terminal Correspondant a Une Sequence de l'urate Oxydase N'Ethe Ethetic Detector (for contre la sequence amino-terminale de la proteinine temoin a ete detectee). L'urate oxydase recombinant a donc, comme l'urate oxydase extractive, l'extremite amino-terminal block.

Exemple 16: Construction d'un vecteur d'expression de l'ADNc de l'urate oxydase dans Ies cellules animales, le plasmid PSV860.

Ce vecteur a ete obtenu par: - ligation du petit fragment AccI-SnaBI contenant une sequence codon pour l'urate oxydase à 16 premiers acides amines, issuer plasmid p466: vecteur d'expression de l'urate oxydase d '. A. flavus dans E. coli disponible au laboratoire et des ci-apres, à and a fragment synthetized by HindIII-AccI, a qui a permis d'obtenir, and a HindIII-SnaBI contenant une sequence complete codant pour l'urate oxydase d'A. flavus et une sequence 5 'non traduite favorable à l'expression dans Ies cellules animales. - Insertion du fragment HindIII-SnaBI entre Ies sites HindIII et SnaBI two polyse de clonage (egalement appelele polylinker) two vectors e d * expression pour Ies cellules animales, te plasmid pSE ^. L'expose ci-apres presentera successivement la construction du plasmids p466, celle du plasmids pSE ^ et l'assemblage du plasmids pSV860. 1) Construction of two plasmids p466

On plasmid p466 is prepared, the expression vector is l'ADNc de l'urate oxydase in E. coli. Ce dernier comprend and fragment de pBR327 incluant l'origine de rplication et le gene de 73 73LV 12000 resistance to l'ampicilline, il comprend ed element and promotur synthetized d * E. coli (R. RODRIGUEZ et M. CHAMBERLIN " Promoters-Structure and function (1982) Preager), une sequence de Shine-Dalgarno, suivie d'un polyLinker predecessor, Uniques NdeI et KpnI, and terminateur de transcription (diverge du phage) fd) et le gene Lac i.

Ce plasmids a ete construit à partir d'un plasmid d'expression de l'hGH dans E. coli Cp462) for substitution d'un fragment portant gene de l'hGH par l'ADNc de l'urate oxydase.

Construction of plasmids p466 a ete decrite en detail dans l'exemple 7 ci-dessus. 2) Construction d'un vecteur d'expression pour Ies cellules animales, le plasmide pSE ^

A strategy for the enhancement of the appendix fragment of the obtenus part of the plasmid preexistants accessibles au public etch fragment is prepared for the synthesis of voie de synthese selon. Les techniques de clonage employees sont celles decrites par T. MANIATIS, EF. FRITSCH et J. SAMBR00K dans " Molecular Cloning, a laboratory manual " (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984). La synthese des oligonucleotides est realizes â € “

La description ci-apres sera mieux form en reference à la figure 13, qui represente une carte d'assemblage du plasmid pSE ^, les sites ayant disparu on ligation etant notes entre parentheses. In les symboles utilises, dans cette exemplifies seront, and dans l'exposi ci-apres. 74

Ce plasmid a ete constructs for ligations in succession des elements in ci-circuits: 1) - and fragment PvuII-PvuII - symbolize for ++++++ sur la Figure 13 - de 2525 pb, obten for complete digestion of pTZ18R (Pharmacia) à l'aide de l'enzyme de restriction PvuII. This fragment contient l'origine de replication du phage F1 (note ORI F1 sur la figure 13), and gene (note Amp sur la figure 13) portant la resistance à l'ampicilline et l'origine de replication (note ORI pBR322 sur la) 13) permettant la replication de ce plasmide dans E. coli. Le premier site franc PvuII disparait for ligation avec le site franc EcoRV (qui disparait egalement) two fragment decrit en 7). 2) - Un fragment PvuII-Hpal - symbolize par flHf sur la figure 13 - de 1060 pb de l'ADN d'adenovirus type 5 entre Positions 11299 (site de restriction PvuII) and 10239 (site de restriction HpaI) (DEKKER * VAN 0RM0NDT, Gene _27, 1984, 115-120) contenant

l'information pour In ARN VA-I and VA-II. Le site franc HpaI disparait par ligation avec le site franc PvuII (qui disparait egalement) two fragment decrit en 3). 3) - Un Pvull-HindIII fragment - symbolize for T7TT, sur la fig. 13 - de 344 pb, issue de l'ADN du virus SV40 obesity for digestion complete restriction of pvuII and HindIII. The Ce fragment compacts l'origine de replication and promotes the precursor l'ADN du virus SV40 (ref. B.J. BYRNE et al. PNAS-USA (1983), 80, 721-725).

Le site HindIII disparait par ligation avec le site liant a HindIII two fragment decrit en 4).

4) - Un fragment synthetique "site liant a HindIII" -HindIII - symbolize par _ sur la figure 13 - de 419 pb dont la sequence donnee ci-apres est proche de la sequence 5 HTLV1 (ref. WEISS et al., " Molecular Biology of Tumor

Viruses - Part 2 ~ 2e ed - 1985 - Cold Spring Harbor Laboratory -p. 1057). 75 LV 12000

site liant a HindIII Ψ

w AGCTGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCC 1 --------- + --------- + -------- + --------- + -------- - + —------- + 60

CCGAGCGTAGAGAGGAAGTGCGCGGGCGGCGGGATGGACTCCGGCGGTAGGTGCGG

GGTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTA 61 --------- + --------- + --------- + --------- + -------- - + -------- + 120

CCACTCAGCGCAAGACGGCGGAGGGCGGACACCACGGAGGACTTGACGCAGGCGGCAGAT

GGTAGGCTCCAAGGGAGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTCTAAACTTACCTA 121 --------- + --------- + --------- + -------- + --------- + -------- + 180

CCATCCGAGGTTCCCTCGGCCTGTTTCCGGGCCAGAGCTGGACTCGAGATTTGAATGGAT

GACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTT 181 --------- + --------- + --------- + --------- + -------- - + --------- + 240

CTGAGTCGGCCGAGAGGTGCGAAACGGACTGGGACGAACGAGTTGAGATGCAGAAACAAA

CGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAACTTCAAGGTATGCGCTGGGACCTGGCAGGCGGCAT 241 --------- + --------- + --------- + --------- + -------- - +: --------- + 300

GCAAAAGACAAGACGCGGCAATGTTGAAGTTCCATACGCGACCCTGGACCGTCCGCCGTA

CTGGGACCCCTAGGAAGGGCTTGGGGGTCCTCGTGCCCAAGGCAGGGAACATAGTGGTCC 301 ——---— h ——— h ---------- i ---------- + 360

GACCCTGGGGATCCTTCCCGAACCCCCAGGAGCACGGGTTCCGTCCCTTGTATCACCAGG

CAGGAAGGGGAGCAGAGGCATCAGGGTGTCCACTTTGTCTCCGCAGCTCCTGAGCCTGCA 361 -------- + --------- + --------- + --------- + --------- + -------- + 420

GTCCTTCCCCTCGTCTCCGTAGTCCCACAGGTGAAACAGAGGCGTCGAGGACTCGGACGT

GA CTTCGA ^

HindIII 76 5) - Un fragment Synthetic HindIII "site liant a BarnHI *" - symbolize par yW \ sur la figure 13 - contraant le promotur de l'ARN-polymerase du phage T7 ainsi qu'un polylinker contenant le clonage Smal . 05

AGCTTGTCGACTAATACGACTCACTATAGGGCGGCCGCGGGCCCCTGCAGGAATTC

ACAGCTGATTATGCTGAGTGATATCCCGCCGGCGCCCGGGGACGTCCTTAAG

A

HindIII

Smal site liant - BamHI 10 GGATCCCCCGGGTGACTGACT ^

CCTAGGGGGCCCACTGACTGACTAG 6) - Un fragment BamHI-BcII de 240 pb - represent parJJJSur la 15 in Fig. 13 -, petit fragment fragment for digestion of the enzyme Bell and BamHI two viral sites of polyadenylation. (M. FITZGERALD et al. Celi, 24, 1981, 251-260). Les sites BamHI et Bell disparaissent par ligations avec respectivement le site liant a BamHI du fragment 20 decrit en 5) et le site BamHI (qui disparait egalement du fragment decrit en 7). 7) - Un fragment BamHI-EcoRV - symbolize para 13 - de 190 pb, digestion complete plasmid pBR322 digestion complete digestion enzymes EcoRV et BamHI. 3) Construction of two plasmids pSV860

The plasmid p466 (cf. Fig. 9) a ete so as to une digestion complete the enzymes Accl et SnaBI. Le petit 30 fragment AccI-SnaBI, qui contient une sequence d'ADN codant pour l'urate oxydase à l'exception des 16 premiers acides aminoter-minaux, et et purifie et ligue au fragment synthetics Hindlll-Accl de sequence suivante: 77 LV 12,000

HindIII Accl τ y

AGCTTGCCGCCACTATGTCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCTACGGCAAGGACAATGTCCGCGT --------- + --------- + --------- + --------- + -------'— + ------- +

ACGGCGGTGATACAGGCGTCATTTTCGTCGGGCGATGCCGTTCCTGTTACAGGCGCAGA

Cette ligation permeate d'obtenir le fragment HindIII-SnaBI, qui contient une sequence codon pour L'urate oxydase identity celle du clone 9C and une sequence 5 'non-favorable for l'expression of Les cellules animales (K0ZAK, M., Nuct. Acids Res., 12, 2, 857-872 (1984).

Le fragment HindIII-SnaBI contient La sequence:

5 '-AGCTTGCCG CCACTATGTC CGCAGTAAAA GCAGCCCGCT ACGGCAAGGA CAATGTCCGC GTCTACAAGG TTCACAAGGA CGAGAAGACC GGTGTCCAGA CGGTGTACGA GATGACCGTC TGTGTGCTTC TGGAGGGTGA GATTGAGACC TCTTACACCA AGGCCGACAA CAGCGTCATT GTCGCAACCG ACTCCATTAA GAACACCATT TACATCACCG CCAAGCAGAA CCCCGTTACT CCTCCCGAGC TGTTCGGCTC CATCCTGGGC ACACACTTCA TTGAGAAGTA CAACCACATC CATGCCGCTC ACGTCAACAT TGTCTGCCAC CGCTGGACCC GGATGGACAT TGACGGCAAG CCACACCCTC ACTCCTTCAT CCGCGACAGC GAGGAGAAGC GGAATGTGCA GGTGGACGTG GTCGAGGGCA AGGGCATCGA TATCAAGTCG TCTCTGTCCG GCCTGACCGT GCTGAAGAGC ACCAACTCGC AGTTCTGGGG CTTCCTGCGT GACGAGTACA CCACACTTAA GGAGACCTGG GACCGTATCC TGAGCACCGA CGTCGATGCC ACTTGGCAGT GGAAGAATTT CAGTGGACTC CAGGAGGTCC GCTCGCACGT GCCTAAGTTC GATGCTACCT GGGCCACTGC TCGCGAGGTC ACTCTGAAGA CTTTTGCTGA AGATAACAGT GCCAGCGTGC AGGCCACTAT GTACAAGATG GCAGAGCAAA TCCTGGCGCG CCAGCAGCTG ATCGAGACTG TCGAGTACTC GTTGCCTAAC AAGCACTATT TCGAAATCGA CCTGAGCTGG CACAAGGGCC TCCAAAACAC CGGCAAGAAC GCCGAGGTCT TCGCTCCTCA GTCGGACCCC AACGGTCTGA TCAAGTGTAC C GTCGGCCGG TCCTCTCTGA AGTCTAAATT G

The Le fragment of HindIII-SnaBI is an enzyme of interest in Le vecteur pSE ^ prealablement incubation of enzymes HindIII and SmaI. On a single site, plasmid pSV860, represente la Fig. 14, 78 dans laquelle et symbol.es ont La meme signage que dans la figure 13, Le nouveau fragment HindIII-SnaBI .etant symbolize par ^ (Les sites SnaBI and Smal ont disparu). for Ligation).

ExempLe 17: Expression transitoire de L'ADNc de l'urate oxydase dans les cellules COS. Dosage de l'activite urate oxydase-dans le lysat cellulaire.

Les cellules COS is an exprimant l'antigen antigen T40 virus SV40 (Gluzman, Y. Cell 23, 1981, 175-182). Ces cellules, qui permettent la replication des vecteurs contenant l'origine de l'ADN du virus SV40, constituent des hotes de choix pour l'etude de l'expression de genes dans les cellules animales. 1) Transfection des cellules COS et expression transitoire de l'ADNc de l'urate oxydase. 4.10 ^ cellules COS sont etalees dans une boite de Petri de 6 cm de diameter (Corning) dans 5 ml de milieu modifie d'Eagle selon Dulbecco ci-apres appele DMEM (le Dulbecco's modified Eagles medium de Gibco), lequel contient 0.6. g / l gluten, 3.7 g / l NaHCO3 et est complemente avec du serum de veau foetal (GIBCO) a raison de 5%. Dry the culture for 16 h at culture at 37 ° C and maintain the atmosphere contaminated with 5Z of dioxane, culture culture, and enlarge the aspiration and wash with 3 ml of PBS (Phosphate Buffer Saline de GIBCO). On y aliquot alors le melange suivant: 1000 μΐ de (DMEM + 10% serum de veau foetal (GIBCO)), 110 μΐ de diethylaminoethyl-dextrane de poids molecule moyen 500 000, h une concentration de 2 mg / ml (Pharmacia) , 1.1 μΐ de chloroquine 100mM (Sigma) et 3 pg d'ADN feeds on pSV860, feeds on pSE ^ (pour le temoin). After 5 h of incubation at 37 ° C dans une atmosphere contenant with 5% deoxyde de carbone, le melange est reti re cellul. On y aliquot, 2 ml of PBS contenant in 10% de dimethyl sulfoxide (qualite Spectroscopie, Merck). After 1 min of ambient temperature incubation, the melange is rarely re et les cellules de lavender deux fois avec du tampon in PBS. On y ajoute 5 ml de DMEM complemente avec du serum de 79 LV 12000 veau foetal a raison de 2%. L'incubation est poursuivie pendant 4 jours at 37 ° C sous atmosphere contenant 5% de dioxyde de carbone. 2) Preparation des echanti llons. 05 Le milieu de culture est aspire et Les celluLes COS sont rincees deux fois avec 3 ml de tampon in PBS. Les cellu lont alors recueillies for grattage avec une spatule en caoutchouc (un "Policeman") dans 1 ml de tampon in PBS. Apres grattage, la boite est rincee avec 1 ml de tampon in PBS. Les deux suspensions cellulates 10 mixes and centrifuged at 10 ppm for 1000 rpm. Leurageant enlarge et le culot cellulare ester remis en dans 1 ml de tampon de triethanolamine (TEA) 0.05 M de pH 8.9 / EDTA.

Les cellules sont lysees for sonication (sur de la glace) 15 for des pulsations de 10 s avec and sonicateur (le Vibra Cell de Sonics and Materials Inc. USA) regle une puissance de 12 W. Le lysat cellulaire est centrifuge pendant 10 min. a 10,000 rpm et le surnageant est recupere pour le dosage de l'urate oxydase. 3) Dosage de l'activite urate oxydase.

Le dosage de l'activite urate oxydase a ete effectue comme decrit a l'exemple 9. 25 Les resultats sont rassembles dans le tableau ci-apres:

Cellules COS transfectes for Activite urate oxydase U / ml pSV860 0.105 pSE1 < 0.01 δο Οη constate que Les ceLLuLes COS transfectates for le plasmid pSV860, porteur de L'ADNc de L'urate oxydase, expriment and niveau appreciable d'activate oxydase, alors qu'aucune activite urate oxydase n'est detectable sur Le temoin. IL y a donc 05 expression de L'ADNc de L'urate oxydase.

Revendications LV 12000 1. Proleneic recombinant, caracericide, queelle une activates urate oxydase potentiated by urine 16 U / mg et sequence ci-apres:

Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Or Arg Vai Tyr 1 5 10 15 Lys Vai His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Or Gln Thr Or Tyr Glu Met 20 25 30 Thr Or Cys Or Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser Tyr Thr Lys 35 40 45 Ala Asp Asn Ser Vai Ile Or Ala Thr Asp Ser Ile Lys Asn Thr Ile 50 55 60 Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Or Thr Pro Pro Glu Leu Phe Gly 65 70 75 80 Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His Ala 85 90 95 Ala His Vai Asn Ile Vai Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp 100 105 110 Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg U5 120 125 Asn Or Gln Or Asp Or Or Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Gly Leu Thr Or Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp 145 I50 155 160 Gly Phe Leu Ar g Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg 165 170 175 Ile Leu Ser Thr Asp Vai Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser 180 185 190 Gly Leu Gln Glu Vai Arg Ser His Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr Trp 195 200 205

Ala Thr Ala Arg Glu Vai Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn Ser 210 215 220 Ala Ser Vai Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala 225 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Vai Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys His 245 25O 255 Tyr Phe Glu 11 e Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr Gly 260 265 27O Lys Asn Ala Glu Vai Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu Ile 275 280 285 Lys Cys Thr Or Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 290 295 300 Pretreatment of the dementia of the dune. 2. Protein recombinante selon la revendication 1, carerase ene qu quelle une activates urate oxydase at a strength of 30 U / mg. 3. Protein recombinant selon l'une des revendations 1 et 2, caracterisation en ce que, analysis of gel bidimenion, elle predesente and spot de masse moleculaire d'environ 33.5 kDa, reproducing 90% de la masse prosthetic. 4. Proteine recombinante selon l'une quelconque des revendations 1 - 3, caracterae en ce qu'elle a and taux de purée, etherified for chromatographie liquide sur une coionne de silice greflee C8, supercurrency 80%. 5. Proteine recombinante selon l'une quelconque des revendations 1 to 4, caractaree en ce qu'elle a and point isoelectric voisin de 5.0. 6. Protein recombinante selon l'une quelconque des revendations 1 to 4, caracterae en ce qu'elle porte and grou pement bloquant, preference de masse moleculaire voisine de 43 units de masse atomique, sur la sulfur amino terminale. 7. Medicament, caracterisation en ce qu'il contient la protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 1 à 6. 8. Gene recombinant, caracterisation en ce qu'i! comporte une sequence d'ADN codant pour la protéine de sequence in ci-circles:

Met 1 Ser Ala Vai Lys 5 Ala Arg Tyr Gly 10 Lys Asp Asn Vai Arg 15 Vai Tyr Lys Vai His 20 Lys Asp Glu Lys Thr 25 Gly Or Gln Thr Or 30 Tyr Glu Met Thr Or 35 Cys Or Leu Leu Glu Gly 40 Glu Ile Glu Thr 45 Ser Tyr Thr Lys Ala 50 Asp Asn Ser Vai Ile 55 Vai Ala Thr Asp Ser 60 Ile Lys Asn Thr LV 12000

Ile Tyr Ile Thr Ala Lys Gln Asn Pro Or Thr Pro Pro Glu Leu Phe 65 70 75 80

Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys Tyr Asn His Ile His 85 90 95

Area Area His Vai Asn Ile Vai Cys His Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile 100 105 110

Asp Gly Lys Pro His Pro His Ser Phe Ile Arg Asp Ser Glu Glu Lys 115 120 125

Arg Asn Or Gln Or Asp Or Or Glu Gly Lys Gly Ile Asp Ile Lys 130 135 i4o

Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr Vai Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe 145 150 155 160

Trp Gly Phe Leu Arg Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp 165 170 175

Arg Ile Leu Ser Thr Asp Or Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe 180 185 190

Ser Gly Leu Gln Glu Vai Arg Ser His Vai Pro Lys Phe Asp Ala Thr 195 200 205

Trp Ala Thr Ala Arg Glu Or Thr Leu Lys Thr Phe Ala Glu Asp Asn 210 215 220

Ser Ala Ser Vai Gln Ala Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu 225 230 235 240

Area Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Or Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys 245 250 255

His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn Thr 260 265 270

Cly Lys Asn Lower Glu Or Phe Lower Pro Gln Ser Asp Pro Asn Gly Leu 275 280 285

Ile Lys Cys Thr Is Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys Leu 29O 295 300 9. The gene for recombinant selon la revendication 8, carries out the perm une expression dans in the microorganism procaryotes. 10 carrying the recombinant gene according to claim 9, caractērise en ce que d'ADN sequence caskets contient la sequence ci-après: ATGTCTGCGG TAAAAGCACC GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA CAAGGTTCAC 60 AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG 120 GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC l80 ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC 240 GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC 300 AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC 36 ° TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC 420 ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC 480 TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGACC 540 ACCGACGTCG ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG 600 CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT 660 GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG 720 GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG T ACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA 780 ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT 840 CCTCAGTCGG ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 900 906 11 AAATTG carrying the recombinant gene according to claim 8, caractērisē en ce qu'il Permet une expression dans Ies Cellule euca-Ryota. 12 carrying the recombinant gene according to claim 11 caractērisē en ce que d'ADN sequence caskets contient la sequence ci-après: ATGTCTGCTG TTAAGGCTGC TAGATACGGT AAGGACAACG TTAGAGTCTA CAAGGTTCAC 60 AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG 120 GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC 180 ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC 240 GGCTCCATCC TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC 300 AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA CCCTCACTCC 360 TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC 420 ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC 480 TGGGGCTTCC TGCGTGACGA GTAGACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC 540 ACCGACGTCG ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG 600 CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT 660 GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA AGATGGCAGA GCAAATCCTG 720 GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG TACTCGTTGC CTAACAAGCA CTATTTCGAA 780 ATCGACCTGA GCTGGCACAA GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT 840 CCTCAGTCGG ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 900 906 13 AAATTG carrying the recombinant gene according to claim 8 caractērisē en ce qu'il Permet une expression dans Ies Cellule ani-males. 14 carrying the recombinant gene according to claim 13 caractērisē en ce que d'ADN sequence caskets comprend la sequence ci-après: ATGTCCGCAG TAAAAGCAGC CCGCTACGGC AAGGACAATG TCCGCGTCTA CAAGGTTCAC 60 AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG 120 GGTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC l80 ATTAAGAACA CCATTTACAT CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC 240 LV 12000

GGCTCCATCC TGGGCACACA AACATTGTCT GCCACCGCTG TTCATCCGCG ACAGCGAGGA ATCGATATCA AGTCGTCTCT TGGGGCTTCC TGCGTGACGA ACCGACGTCG ATGCCACTTG CACGTGCCTA AGTTCGATGC GCTGAAGATA ACAGTGCCAG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA ATCGACCTGA GCTGGCACAA CCTCAGTCGG ACCCCAACGG AAATTG

CTTCATTGAG AAGTACAACC GACCCGGATG GACATTGACG GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG GTCCGGCCTG ACCGTGCTGA GTACACCACA CTTAAGGAGA GCAGTGGAAG AATTTCAGTG TACCTGGGCC ACTGCTCGCG CGTGCAGGCC ACTATGTACA GACTGTCGAG TACTCGTTGC GGGCCTCCAA AACACCGGCA TCTGATCAAG TGTACCGTCG

ACATCCATGC CGCTCACGTC GCAAGCCACA CCCTCACTCC ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC AGAGCACCAA CTCGCAGTTC CCTGGGACCG TATCCTGAGC GACTCCAGGA GGTCCGCTCG AGGTCACTCT GAAGACTTTT AGATGGCAGA GCAAATCCTG CTAACAAGCA CTATTTCGAA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 906 prēcēdēe d'une sequence 5 'non traduite favorable accordance l'expression dans Ies cellules animales. 15. Gene recombinant selon la revendication 14, caracticis en céque la sequence 5 'non traduite favorable à l'ex-pression dans In cellella animales comprised la sequence: AGCTTGCCGCCACT situé immédiatement en amont de la sequence de 1414. Vecteur d'expression, caretaker en ce qu'il porte, avec Ies moyens non-sense expression, and gene recombinant selon l'une quelconque des revendications 8 à 15. 17. Vecteur d'expression selon la revendication 16, caractérise en ce qu 'il porte au moins and marqueurde selection. 18. Vecteur d'expression Seion La Revendication 17, Caracterization en ce qu'il a Carrier Sterilizers de l'un des plasmids pEMR469, pEMR473 Diabetes Danes Figure 11 et 12 ou de pEMR515 carries de pEMR473 for the gene for gene URA3 et du Xbal -Nhel two 2 micron. 19. Microorganisms procaryotes, caracterisation en ce qu'ils sont transforms for and vecteur d'expression selon la revendication 16, portant and gene recombinant selon la revendication 9. 20. Cellules eucaryotes, caracterisation en ce qu'elles sont transforms for l 'and des vecteurs d'expression selon 1'une quelconque des revendications 16 â 18 portant le gene recombinant selon la revendication 11. 21. Souche de Saccharomvces cerevisiae. transacting the transcription of the lexicon of revolution 16 to 18. 22. transacting transcription 21, transacting the trans mutation of au moins l'un des gene responsables de la leucine ou de l'uracile. 23. Souche selon la revendication 22, caractaree en ce qu'elle porte une mutation sur au moins l'un des genes LEU2 et URA3. 24. In the process of pouring into obesity l'urate oxydase recombinant selon la revendication 1, caretaker en ce qu'il comprend et etiques ci-des: 1 / mise en culture d'une souche selon l'une quelconque des revendications 21 de cellules: 3 / isolation and purification de l'urate oxydase recombinante contans dans le lysat. 25. Cellules animales, caractersis en ce qu'elles contiennent. avec Ies moyens nessessaires à son excression. and the gene for recombinant selon la revendication 13. 26. Cellules animales, carcinomas, en ce qu'elles contiennent and vecteur d'expression selon la revendication 14. portant and the gene for recombinant selon la revendication 14. LV 12000

FIG

The profile of the mesure de la densifies the optique a 218 nm tryptic de l'urat oxydase EN 12000

FIG

Profil d'elution on mesure de la condensation optique â € “218 nm for two produtures de la protease V8 de l'urate oxydase LV 12000

1 AAACCCTCAC7GCC7C7C7CA77CC77CCG G7GCCCCCGA7CC7CAA7CCAAC77G7ACA 61 7AC77C7CCCAAC7C7C7GC7A7A7CC7TC ATA77CCCATAC7ACAAGA7G7CCGCAG7A 121 AAAGCAGCCCGCTACGGCAAGGACAA7G7C CGCG7C7ACAAGGT7CACAAGGACGAGAAG 181 accggtgtccagacggtgtacgagatgacc G7C7G7G7GC77C7GGAGGG7GAGAT7GAG 241 ACC7C77ACACCAAGGCCGACAACAGCG7C A77G7CGCAACCGAC7CCA7TAAGAACACC 301 ATTTACATCACCGCCAAGCAGAACCCCGTT ACTCCTCCCGAGCTGTTCGGCTCCATCCTG 361 GGCACACAC77 CAT TGAGAAGTACAACCAC ATCCATGCCGCTCACGTCAACATTGTCTGC 421 CACCGCTGGACCCGGATGGACATTGACGGC AAGCCACACCCTCACTCCTTCATCCGCGAC 481 AGCGAGGAGAAGCGGAATGTGCAGGTGGAC GTGGTCGAGGGCAAGGGCATCGATATCAAG 541 TCGTCTCTGTCCGGCCTGACCGTGCTGAAG AGCACCAACTCGCAGTTCTGGGGC77CC7G 601 CGTGACGAGTACACCACAC7TAAGGAGACC 7GGGACCG7A7CC7GAGCACCGACGTCGAT 661 GCCAC77GGCAG7GGAAGAA777CAG7GGA CTCCAGGAGGTCCGCTCGCACGTGCCTAAG 721 TTCGATGCTACCTGGGCCACTGCTCGCGAG G7CAC7C7GAAGAC7777GC7GAAGA7AAC 7 81 AGTGCCAGCGTGCAGGCCAC7ATG7ACAAG A7GGCAGAGCAAATCC7GGCGCGCCAGCAG 841 C7GA7CGAGAC7G7CGAGTAC7CG77GCC7 AACAAGCAC7A777CGAAA7CGACC7GAGC 901 TGGCAC AAGGGCC7CCAAAACACCGGCAAG AACGCCGAGG7C77CGC7CC7CAG7CGGAC 961 CCCAACGG7C7GA7CAAG7G7ACCG7CGGC CGG7CC7C7C7GAAG7C7AAA77G7AAACC 1021 AACATGATTCTCACG77CCGGAG777CCAA GGCAAAC7G7A7A7AG7C7GGGATAGGG7A 1081 7AGCAT7CA77CAC77G777777AC77CCA AAAAAAAAAAA. . . 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080

Sequence nucleotide du clone 9C and d'une partie du clone 9A

: Debut du clone 9A EN 12000 10 5 ATGTCCGCAGTAAAAGCAGCCCGCCACGGC 1 MetSerAlaVaH.yaAlAAlaArgTyrCIy 169 AAGGACGAGAAGACCGGTGTCCAGACGGTG 21 LyaA3pGluLyaTiirGlyValGlnThrVal 229 GGTGAGATTGAGACCTCTTACACCAAGGCC 41 GlyGluIleGluTiirSarTyrTī r-2 y3Ala a 9 ATTAAGAACACCATTTACATCACCGCCAAG $ 1 HeLysAanTiirIleTyrIleTī'.rAlaLys 3-49 GGCTCCATCCTGGGCACACAC? TCA77GAG 81 GlySarIleLeuGly7hrHi3PhaIleGlu -409 AACATTGTCTGCCACCGCTGGACCCGGATG 101 A3nIleValCy8HieArgTgp71igArgMet 4 6 9 TTCATCCCCCACAGCGACGAGAAGCCCAA7 121 PheIleArgAapSerGluGluI.yoAxgAan 529 A7CGA7A7CAAC7CG7C7C7CTCCGGCC7G 141 IleAapIleLyaSerSerLeuSerGlyLeu " 1 2 "vj / 7 (n 58 9 7GGGGC77CCTGCC7GACGAG7ACACCACA 161 TrpGlvPhaLauArgAapG1u? Y r7hr7hr 64 9 ACCGACG7CGA7GCCACT7GGCAG7GGAAG 181 ThrA-apValAapAlaThgTrpGlnTrpLya TJ4 '2709 CACGTGCC7AAGT7CGA7GCTACC7GGGCC 201 8iaValProLyaPheAapAlaThrTrpAla 2 T1J" 7 6 9 GCTGAAGATAACAGTGCCAGCGTGCAGGCC 221 AlaGluAapAanSerAlaSerValGlnAla • vi -r 82 9 GCGCGCCAGCAGCTGA7CGAGAC7GTCGAG 241 8 8 AlaArgGlnGlnLeuIleGluīfcgValGlu 9 ATCGACCTGAGCTGGCACAAGGGCCTCCAA 261 l. ^). 94 XleA3pLeuSerTrpHiaLyaGlyL6uGln 9 CC7CAG7CGGACCCCAACGG7C7GA7CAAG 281 ProGlnSezAapProAanGlyLeuXleLya 1009 AAATTG7AA 301 LysLeu £ nd AAGGACAA7G7CCGCG7C7ACAf \ ovjT7CAC 165 LyaAapAanValArgVal7yrLyaValHia 20 7ACGAGA7GACCG7C7G7G7GC77C7GSAG 220 7yrGluMet71irValCy3ValLauLeuGlu 40 GACAACAGCGTCATTGTCGCAACCGACTCC 288 AapAaaSerValIleValAlaTlirAspSer 60 CAGAACCCCG7TACTCCTCCCGAGC7GTTC 348 GlnAsnProValThrProProGluLauPha 80 .4

FIG Sequence d'ADN ouverte l'ATG en position 109 sur la Figure 3 et polypeptide encoded.

Les peptides sequences obtenus on hydrolysis de l'urate oxydase d'A. flavus a l'aide de la trypsine et de la protease V8 sont represent par des flèches en vis-à-vis du polypeptide encoded by selon -►: peptide tryptique ------ ►: peptide obtenu on hydrolysis à l'aide de la protease V8. 1 " Til / TJ "AAG7ACAACCACATCCATGCCGCTCACG7C 408 Lya7yrA3nHiaIleHieAlaAlaHiaVal 100 GACA77GACGGCAAGCCACACCCTCACTCC 463 A3pIleAapGlyI.y3ProHiaProHiaSer 120 C7GCACG7GGACC7GCTCGAGGGCAACGGC 528 ValGlnValAa pValVa lGluGlyI.yaGly 140 τι" --- ACCG7GC7GAAGAGCACCAACTCGCAGT7C 588 7hrValLeuI < ya5er7hrA3nSerGlnPhe 160 C77AAGGAGACCTGGGACCG7A7CC7GAGC 64 8 LeuLyaGlu7iir7rpAapArgIleLeuSer 180 AA777CAG7GGAC7CCAGGAGG7CCGC7CG 708 A3nPheSerGlyLeuGlnGluValAxgSer 200 2 RIE "ACTGCTCGCGAGGTCACTCTGAAGACTTTT 768 7iirAlaArgGluVal71irLeuLy3ThrPiie 220 AC7A7G7ACAAGATGGCAGAGCAAA7CCTG 828 7hrMetTyrLyaMetAlaGluGlnIleLeu 240 7AC7CG77GCC7AACAAGCAC7A777CGAA 888 7ygSegLauggoAanLyaHia? ygPheGlu 260 AACACCGGCAAGAACGCCGAGGTC77CGCT 94 8 Aar.7AgGlyLyaAanAlaGluValliheAla 230 TG7ACCG7CGGCCGG7CCTCTC7GAAGTC7 1008 Cy3ĪligValGlyAjrgSerSerLeuLysSer 300

LV 12000 Hinc H

FIG

Plasms p 163.1 LV 12000

Hmc E

FIG

Plasma p 160 LV 12000 (Hinc II)

FIG

Plasmid p 373.2 LV 12000 (Hinc H)

FIG

Plasmide p A62 LV 12000 (Chin II)

FIG

Plasma p 465

LV 12000 NheI

FIG

Plasrr.ids pEMR414

LV 12000 NheI

FIG

Plasmid pEMR 469 LV 12000

NheI

FIG

Plasmid pEMR A73 LV 12000

FIG

Plssmidg PS £ 1 LV 12000

FIG

Plasm \ de. p 5V860

Claims (26)

A protein characterized in that it has at least 16 units / mg of urate oxidase activity and is characterized by the following sequence: Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Or Arg Or 1 5 10 15 Tyr Lys Or His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Or Gln Thr Or Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Or Cys Or Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr Ser 35 40 45 Tyr Thr Lys Bottom Asp Asn Ser Or Ile Or Lower Thr Asp Ser Ile 50 55 60 Lys Asn Thr Wet Tyr Ile Thr Area Lys Gln Asn Pro Or Thr Pro 65 70 75 Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu Lys 80 85 90 Tyr Asn His Ile His Lower Ala His His Asn Ile Or Cys His Arg 95 100 105 Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Ser Phe 110 115 120 Eve Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Is Gln Or Asp Or Does 125 130 135 Glu Gly Lys Gly Ile Asp ILe Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu Thr 140 145 150 Or Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp Gly Phe Leu Arg Asp 155 160 165 Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser Thr 170 175 180 Asp Or Asp Lower Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu Gln 185 190 195 Glu Or Arg Ser His Can Pro Lys Phe Asp Lower Thr Trp Lower Thr 200 205 210 Lower Arg Glu Or Thr Leu Lys Thr Phe Lower Glu Asp Asn Ser Lower 215 220 225 Ser Or Gln Lower Thr Met Tyr Lys Met Ala Glu Gln Ile Leu Ala - 230 235 240 Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Or Glu Tyr Ser Leu Pro Asn Lys 245 250 255 His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln Asn 260 265 270 2 Thr Gly Lys Asn Ala Glu Or Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro Asn 275,280,285 Gly Leu Ile Lys Cys Thr Or Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser Lys 290 295 300 Leu, optionally optionally supplemented with an additional methionine residue. 2. A protein according to claim 1, characterized in that it has a urate oxidase activity of about 30 units / mg. 3. The protein of claim 1 or 2, wherein at least 90% of said protein in a two-dimensional gel electrophoresis analysis is a patch having a molecular weight of about 33.5 kDa. 4. Protein according to any one of claims 1 to 3, characterized in that its purity by liquid chromatography on a modified silica gel C8 column exceeds 80%. 5. The protein according to any one of claims 1 to 4, wherein the protein has an isoelectric point of about 8.0. 6. A protein according to any one of claims 1 to 4, wherein the amino-terminal end serine is protected by a group of about 43 parts by weight. 7. A medicament characterized in that it contains a protein according to any one of the preceding claims. 8. A recombinant gene, characterized in that it contains a DNA sequence encoding a protein with the following sequence: Met Ser Ala Vai Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Is Arg 1 5 10 15 Is Tyr Lys Or His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Or Gln Thr Or 20 25 30 Tyr Glu Met Thr Or Cys Or Leu Leu Glu Gly Glu Ile Glu Thr 35 40 45 Ser Tyr Thr Lys Bottom Asp Asn Ser Or Ile Or Lower Thr Asp Ser 50 55 60 Ile Lys Asn Thr Ile Tyr Ile Thr Field Lys Gln Asn Pro Or Thr 65 70 75 Pro Pro Glu Leu Phe Gly Ser Ile Leu Gly Thr His Phe Ile Glu 80 85 90 Lys Tyr Asn His Ile His Lower Lower His Vai Asn Ile Or Cys His 95 100 105 Arg Trp Thr Arg Met Asp Ile Asp Gly Lys Pro His Pro 110 115 120 3 EN 12000 Phe Egg Arg Asp Ser Glu Glu Lys Arg Asn Or Gln Or Asp Or 125 130 135 Or Glu Gly Lys Gly Ile Asp ILe Lys Ser Ser Leu Ser Gly Leu 140 145 150 Thr Or Leu Lys Ser Thr Asn Ser Gln Phe Trp Gly Phe Leu Arg 155 160 165 Asp Glu Tyr Thr Thr Leu Lys Glu Thr Trp Asp Arg Ile Leu Ser 170 175 180 Thr Asp Or Asp Ala Thr Trp Gln Trp Lys Asn Phe Ser Gly Leu 185 190 195 Gln Glu Vai Arg Ser His Is Pro Lys Phe Asp Lower Thr Trp Lower 200 205 210 Thr Lower Arg Glu Or Thr Leu Lys Thr Phe Lower Glu Asp Asn Ser 215 220 225 Lower Ser Or Gln Lower Thr Met Tyr Lys Met Lower Glu Gln Ile Leu 230 235 240 Ala Arg Gln Gln Leu Ile Glu Thr Or Glu Tyr Ser Leu Pro Asn 245 250 255 Lys His Tyr Phe Glu Ile Asp Leu Ser Trp His Lys Gly Leu Gln 260 265 270 Asn Thr Gly Lys Asn Ala Glu Or Phe Ala Pro Gln Ser Asp Pro 275 280 285 Asn Gly Leu Ile Lys Cys Thr Or Gly Arg Ser Ser Leu Lys Ser 290 295 300 Lys Leu 9. A recombinant gene according to claim 8, characterized in that it can be expressed in prokaryotic microorganisms. 10. Recombinant gene according to claim 9, characterized in that the DNA includes the following sequence: ATGTCTGCGG CAAGGTTCAC CCGTCTGTGT GACAACAGCG CACCGCCAAG TGGGCACACA AACATTGTCT CCCTCACTCC ACGTGGTCGA ACCGTGCTGA GTACACCACA ATGCCACTTG CACGTGCCTA GAAGACTTTT AGATGGCAGA TACTCGTTGC GGGCCTCCAA ACCCCAACGG AAATTG TAAAAGCAGC AAGGACGAGA GCTTCTGGAG TCATTGTCGC CAGAACCCCG CTTCATTGAG GCCACCGCTG TTCATCCGCG GGGCAAGGGC AGAGCACCAA CTTAAGGAGA GCAGTGGAAG AGTTCGATGC GCTGAAGATA GCAAATCCTG CTAACAAGCA AACACCGGCA TCTGATCAAG GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA 50 AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA 100 GTTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC 150 AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT 200 TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC 250 AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC 300 GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA 350 ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG 400 ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG 450 CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA 500 CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG 550 AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG 600 TACCTGGG CC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT 650 ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA 700 GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG 750 CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA 800 AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG 850 TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 900 906 4 A recombinant gene according to claim 8, characterized in that it can be expressed in eukaryotic cells. 12. Recombinant gene according to claim 11, characterized in that the DNA includes the following sequence: GCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA 50 AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA 100 GTTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC 150 AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT 200 TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC 250 AAGTACAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC 300 GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA 350 ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG 400 ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG 450 CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA 500 CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG 550 AATTTCAGTG GACTCCAGGA GGTCCGCTCG 600 TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT 650 ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA 700 GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG 750 CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA 800 AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG 850 TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 900906 ATGTCTGCGG CAAGGTTCAC CCGTCTGTGT GACAACAGCG CACCGCCAAG TGGGCACACA AACATTGTCT CCCTCACTCC ACGTGGTCGA ACCGTGCTGA GTACACCACA ATGCCACTTG CACGTGCCTA GAAGACTTTT AGATGGCAGA TACTCGTTGC GGGCCTCCAA ACCCCAACGG AAATTG TAAAA GCAGC AAGGACGAGA GCTTCTGGAG TCATTGTCGC CAGAACCCCG CTTCATTGAG GCCACCGCTG TTCATCCGCG GGGCAAGGGC AGAGCACCAA CTTAAGGAGA GCAGTGGAAG AGTTCGATGC GCTGAAGATA GCAAATCCTG CTAACAAGCA AACACCGGCA TCTGATCAAG 13. A recombinant gene according to claim 8, characterized in that it can be expressed in animal cells. 14.Rekombinantais gene according to claim 13, characterized in that the DNA includes the following sequence: ATGTCCGCAG TAAAAGCAGC CCGCTACGGC AAGGACAATG TTCGCGTCTA 50 CAAGGTTCAC AAGGACGAGA AGACCGGTGT CCAGACGGTG TACGAGATGA 100 CCGTCTGTGT GCTTCTGGAG GTTGAGATTG AGACCTCTTA CACCAAGGCC 150 GACAACAGCG TCATTGTCGC AACCGACTCC ATTAAGAACA CCATTTACAT 200 CACCGCCAAG CAGAACCCCG TTACTCCTCC CGAGCTGTTC GGCTCCATCC 250 TGGGCACACA CTTCATTGAG AAGTAAACC ACATCCATGC CGCTCACGTC 300 AACATTGTCT GCCACCGCTG GACCCGGATG GACATTGACG GCAAGCCACA 350 CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT GTGCAGGTGG 400 ACGTGGTCGA GGGCAAGGGC ATCGATATCA AGTCGTCTCT GTCCGGCCTG 450 ACCGTGCTGA AGAGCACCAA CTCGCAGTTC TGGGGCTTCC TGCGTGACGA 500 GTACACCACA CTTAAGGAGA CCTGGGACCG TATCCTGAGC ACCGACGTCG 550 ATGCCACTTG GCAGTGGAAG AATTTCAGTG GACTCGAGGA GGTCCGCTCG 600 CACGTGCCTA AGTTCGATGC TACCTGGGCC ACTGCTCGCG AGGTCACTCT 650 GAAGACTTTT GCTGAAGATA ACAGTGCCAG CGTGCAGGCC ACTATGTACA 700 AGATGGCAGA GCAAATCCTG GCGCGCCAGC AGCTGATCGA GACTGTCGAG 750 TACTCGTTGC CTAACAAGC A CTATTTCGAA ATCGACCTGA GCTGGCACAA 800 GGGCCTCCAA AACACCGGCA AGAACGCCGA GGTCTTCGCT CCTCAGTCGG 850 ACCCCAACGG TCTGATCAAG TGTACCGTCG GCCGGTCCTC TCTGAAGTCT 900 AAATTG 906 introduced by an unexpressed 5 'end sequence that promotes expression in animal cells. 5 LV 12000 15. The recombinant gene of claim 14, wherein the non-expressed 5 'end sequence promoting expression in animal cells comprises the sequence AGCTTGCCGCCACT, which is positioned just before the sequence in paragraph 14. 16. An expression vector, characterized in that it contains a recombinant gene according to any one of claims 8 to 15 and the means necessary for its expression. 17. The expression vector of claim 16, wherein the expression vector comprises at least one selection step. 18. The expression vector of claim 17, characterized in that it is characterized as one of the plasmids pEMR469 or pEMR473 shown in FIG. 12 or 13, or pEMR515 obtained from pEMR473, removing the URA3 gene and the 2 micron fragment Xbal-Nhel. 19. Prokaryotic microorganisms, characterized in that they are transformed by an expression vector according to claim 16, which comprises a recombinant gene according to claim 9. 20. Eikaryotic cells, characterized in that they are transformed by an expression vector according to any one of claims 16-18. containing a recombinant gene according to paragraph 11. A strain of Saccharomyces cerevisiae, characterized in that it is transformed by an expression vector according to any one of claims 16 to 18. 22. The strain of claim 21, wherein the strain comprises a mutation in at least one of the genes responsible for the production of leucine or uracil. 23. The strain of claim 22, wherein the strain comprises a mutation in at least one of the LEU2 and URA3 genes. A process for the production of a recombinant urate oxidase according to claim 1, comprising the steps of: 1) culturing the strain after any of claims 21 to 23; 2) cell lysis; 3) isolation and purification of the recombinant urate oxidase present in the lysate. 25. Animal cells, characterized in that they contain a recombinant gene according to claim 13, together with the means necessary for its expression. Animal cells, characterized in that they contain an expression vector according to claim 16, comprising the recombinant gene according to claim 14.