JPH0611239B2 - β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダ−ゼ活性測定試薬 - Google Patents

β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダ−ゼ活性測定試薬

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JPH0611239B2
JPH0611239B2 JP10996886A JP10996886A JPH0611239B2 JP H0611239 B2 JPH0611239 B2 JP H0611239B2 JP 10996886 A JP10996886 A JP 10996886A JP 10996886 A JP10996886 A JP 10996886A JP H0611239 B2 JPH0611239 B2 JP H0611239B2
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真一 手嶋
勇藏 林
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ活
性測定用試薬に関するものである。体液中のβ−Ｎ−ア
セチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ活性の測定は、腎移植
後の拒絶反応の早期診断、急性腎不全、糸球体腎炎等の
各種腎疾患の診断及び経過観察、薬物の腎毒性等に有用
な情報を与えるものとして臨床的意義が高い。
（従来の技術） 従来、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ（以
下ＮＡＧと称する）活性は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グリコ
サミンの還元末端にｐ−ニトロフェノールを結合させた
基質を用いてＮＡＧを作用させ、遊離してくるｐ−ニト
ロフェノールをアルカリ性下で比色する方法が一般的で
ある(MethodsEngymol.,28,702(1972)）。
ところがこの方法では目的とする酵素ＮＡＧの至適pH
（pH4〜5.5）と発色用であるｐ−ニトロフェノールの発
色pH（pH９以上）とが異なる為にＮＡＧ活性を測定する
為には酵素反応と発色反応を別々に行なう必要があり、
その為に試薬数及び操作ステップが多く必要となり、酵
素活性を求める場合に一番適当であるといわれている速
度分析（レートアッセイ）法が出来ない欠点がある。
その他、Ｎ−アセチルグルコサミンにフェノールを結合
させた基質を用いる方法（特開昭５４−60997号）、Ｎ
−アセチルグルコサミンにｍ−クレゾールスルホフタレ
インを結合させた基質を用いる方法（Clin.Chem.29,171
3(1983)）も上記ｐ−ニトロフェノールを用いる場合と
同様の欠点がある。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明の目的は定量性に優れたＮＡＧのレートアッセイ
が可能となるＮＡＧ活性測定試薬を提供することであ
る。
（問題点を解決する為の手段） 本発明者らは、上記目的を達成するために種々鋭意検討
したところ、一般式〔Ｉ〕で示される基質を用いること
により体液中のＮＡＧ活性を短時間に正確簡単にレート
アッセイ出来ることを見い出し本発明に到達した。
すなわち本発明は、基質として下記一般式〔Ｉ〕で示さ
れる化合物を含有することを特徴とするβ−Ｎ−アセチ
ル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ活性測定試薬である。
（式中、Ａは還元性末端でβ−結合しているＮ−アセチ
ルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン残基で
ある。Ｘはニトロ基を示す。R1〜R4のうち、少なくとも
１つはハロゲン原子を示し、かつR1〜R4のうち、少なく
とも１つは-(CH2)n-SO3H又は-(CH2)n-COOH又はこれらの
アルカリ金属塩基（ｎ＝１〜３）を示し、残りの基は水
素原子を示す。） 本発明に用いる基質としては一般式〔Ｉ〕で示される化
合物、すなわちＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセ
チルガラクトサミンがその還元性末端で置換芳香族基と
β−結合したものである。置換芳香族基とは解裂したア
グリコンとして基質とは異なったスペクトル吸収を示す
置換芳香族基である。
解裂したアグリコンとは具体的には次の一般式 例えば２−クロロ−４−ニトロ−６−スルホメチルフェ
ノール、２−ブロモ−４−ニトロ−６−スルホメチルフ
ェノール、２−ヨード−４−ニトロ−６−スルホメチル
フェノール、2,6−ジクロロ−３−スルホメチル−４−
ニトロフェノール、2,6−ジブロモ−３−スルホメチル
−４−ニトロフェノール、2,6−ジヨード−３−スルホ
メチル−４−ニトロフェノール、2,3,6−トリクロロ−
４−ニトロ−５−スルホメチルフェノール、2,3,6−ト
リブロモ−４−ニトロ−５−スルホメチルフェノール、
2,3,6−ドヨード−４−ニトロ−５−スルホメチルフェ
ノール、2,6−ジクロロ−3,5−ジスルホメチル−４−ニ
トロフェノール、2,6−ジブロモ−3,5−ジスルホメチル
−４−ニトロフェノール、2,6−ジヨード−3,5−ジスル
ホメチル−４−ニトロフェノール、２−クロロ−４−ニ
トロ−６−スルホエチルフェノール、2,6−ジクロロ−
３−スルホエチル−４−ニトロフェノール、2,3,6-トリ
クロロ−４−ニトロ−５−スルホエチルフェノールな
ど、２−クロロ−４−ニトロ−６−カルボキシメチルフ
ェノール、２−ブロモ−４−ニトロ−６−カルボキシメ
チルフェノール、２−ヨード−４−ニトロ−６−カルボ
キシメチルフェノール、2,6−ジクロロ−３−カルボキ
シメチル−４−ニトロフェノール、2,6−ジブロモ−３
−カルボキシメチル−４−ニトロフェノール、2,6−ジ
ヨード−３−カルボキシメチル−４−ニトロフェノー
ル、2,3,6−トリクロロ−４−ニトロ−５−カルボキシ
メチルフェノール、2,3,6−トリブロモ−４−ニトロ−
５−カルボキシメチルフェノール、2,3,6−トリヨード
−４−ニトロ−５−カルボキシメチルフェノール、2,6
−ジクロロ−3,5−カルボキシメチル−４−ニトロフェ
ノール、2,6−ジブロモ−3,5−カルボキシメチル−４−
ニトロフェノール、2,6−ジヨード−3,5−カルボキシメ
チル−４−ニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロ
−６−カルボキシエチルフェノール、2,6−ジクロロ−
３−カルボキシエチル−４−ニトロフェノール、2,3,6
−トリクロロ−４−ニトロ−５−カルボキシエチルフェ
ノールなどとこれらのＮａ塩またはＫ塩等があげられ
る。
これら基質の合成方法はＮ−アセチルヘキソサミンをア
セチル化し、このアセチル化されたＮ−アセチルヘキソ
サミンと置換芳香族化合物、アグリコンを結合させた
後、脱アセチルすることにより合成するか（実験化学講
座第２４巻第304頁、1958年）、又はアセチル化された
Ｎ−アセチルエキソサミンをハロゲン化し、次いでその
ハロゲン化物と置換芳香族化合物、アグリコンをエーテ
ル結合させたあと、脱アセチルすることにより合成する
ことが出来る（Methods in Carbohydrate Chemistry I
I,第334頁）。
基質の置換芳香族基においてR1〜R4がハロゲン原子のみ
で置換されている場合には、水に対する溶解性が悪く、
基質必要量の溶解が不可能である。
本発明のＮＡＧ活性測定試薬は、ハロゲン置換のニトロ
フェノールに-(CH2)n-SO3H,-(CH2)n-COOH又はこれらの
Ｎａ塩、Ｋ塩等のアルカリ金属原子を置換し、水溶性に
優れた基質を使用する。
該試薬のpHは体液中のＮＡＧの至適pHであるpH4.0〜6.0
を保つ緩衝液であれば、いかなるものでも良い。例えば
クエン酸緩衝液やその他有機酸緩衝液、例えば酢酸、コ
ハク酸、フタル酸等の緩衝液があげられる。
基質濃度としては特に制限がないが、好ましくは最大の
ＮＡＧの酵素活性を示す濃度が適当である。例えば１ｍ
Ｍ以上である。
本発明の試薬は必要により界面活性剤、防腐剤、塩化ナ
トリウム、シクロデキストリン、安定化剤等を含有して
もよい。
本発明のＮＡＧ活性測定試薬を用いて、ＮＡＧ活性を測
定する方法としては、試料を該試薬と反応させて生成す
るアグリコン、フェノール誘導体の吸光度変化を直接分
光光度計を用いて比色定量する方法である。
（発明の効果） 本発明のＮＡＧ活性測定試薬において、一般式〔Ｉ〕で
示される化合物を基質として用いることにより、体液中
のＮＡＧ活性を短時間に正確、かつ簡単にレートアッセ
イすることができる。基質に結合したフェノール誘導体
がハロゲン原子、ニトロ基の他に、-(CH2)n-SO3H,-(C
H2)n-COOH、又はこれらのアルカリ金属塩基を有するこ
とにより、基質自体の水溶性が向上する。
（実施例） 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例１ 被検液中のＮＡＧ活性量を下記試薬を用いて下記方法に
より測定した。
試薬 ２−クロロ−４−ニトロ−６−スルホメチルフェニル−
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミド２ｍＭ 塩化ナトリウム２００ｍＭ クエン酸緩衝液０．０５Ｍ pH４．５ ＮＡＧ含有被検液５０μに上記試薬２ｍを加えて３
７℃で反応させ、その吸光度を波長４００nmで測定して
発色速度を求めた。
反応曲線を第１図に示す。検量線を第２図に示す。第１
図および第２図から明らかなように、水溶性基質を用い
た本発明の試薬では、短時間に正確かつ簡単にレートア
ッセイすることができる。
実施例２ 被検液中のＮＡＧ活性量を下記試薬を用いて実施例１と
同じ方法により測定した。
試薬 2,6−ジクロロ−４−ニトロ−５−スルホメチルフェニ
ル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド２ｍＭ 塩化ナトリウム２００ｍＭ クエン酸緩衝液0.０５Ｍ pH4.5 反応曲線を第３図に示す。検量線を第４図に示す。第３
図および第４図から明らかなように、水溶性基質を用い
た本発明の試薬では、短時間に正確かつ簡単にレートア
ッセイすることができる。
実施例３ 被検液中のＮＡＧ活性量を下記試薬を用いて実施例１と
同じ方法により測定した。
試薬 ２−ブロモ−４−ニトロ−６−カルボキシメチルフェニ
ル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド２ｍＭ 塩化ナトリウム２００ｍＭ クエン酸緩衝液0.０５Ｍ pH4.5 反応曲線を第５図に示す。検量線を第６図に示す。第５
図および第６図から明らかなように、水溶性基質を用い
た本発明の試薬では、短時間に正確かつ簡単にレートア
ッセイすることができる。
実施例４ 被検液中のＮＡＧ活性量を下記試薬を用いて実施例１と
同じ方法により測定した。
試薬 2,6−ジブロモ−４−ニトロ−５−スルホメチルフェニ
ル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド２ｍＭ 塩化ナトリウム２００ｍＭ クエン酸緩衝液0.０５Ｍ pH4.5 反応曲線を第７図に示す。検量線を第８図に示す。第７
図および第８図から明らかなように、水溶性基質を用い
た本発明の試薬では、短時間に正確かつ簡単にレートア
ッセイすることができる。
実施例５ 被検液中のＮＡＧ活性量を下記試薬を用いて実施例１と
同じ方法により測定した。
試薬 2,3,6−トリクロロ−４−ニトロ−５−カルボキシメチ
ルフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド２
ｍＭ 塩化ナトリウム２００ｍＭ クエン酸緩衝液0.０５Ｍ pH4.5 反応曲線を第９図に示す。検量線を第１０図に示す。第
９図および第１０図から明らかなように、水溶性基質を
用いた本発明の試薬では、短時間に正確かつ簡単にレー
トアッセイすることができる。
実施例６ 被検液中のＮＡＧ活性量を下記試薬を用いて実施例１と
同じ方法により測定した。
試薬 2,6−ジブロモ−3,5−ジスルホメチル−４−ニトロフェ
ニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド２ｍＭ 塩化ナトリウム２００ｍＭ クエン酸緩衝液0.０５Ｍ pH4.5 反応曲線を第１１図に示す。検量線を第１２図に示す。
第１１図および第１２図から明らかなように、水溶性基
質を用いた本発明の試薬では、短時間に正確かつ簡単に
レートアッセイすることができる。
実施例７ 被検液中のＮＡＧ活性量を下記試薬を用いて下記方法に
より測定した。
試薬 Ａ．２−クロロ−４−ニトロ−６−スルホメチルフェニ
ル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドナトリウム
塩2.0ｍＭ 塩化ナトリウム２００ｍＭ クエン酸緩衝液0.1Ｍ pH4.5 Ｂ．４−ニトロ−フェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グ
ルコサミニドナトリウム塩２．０ｍＭ 塩化ナトリウム２００ｍＭ クエン酸緩衝液0.1Ｍ pH4.5 測定方法 ａ．ＮＡＧ含有被検液５０μに上記試薬Ａ，Ｂ２ｍ
加えて３７℃で３分間加温後、吸光度変化を波長４００
ｎｍで測定して１分間の吸光度変化を求めた（ブランク
はＮＡＧ含有被検液にかわり水を用いる）。
ｂ．ＮＡＧ含有被検液５０μに上記試薬Ａ，Ｂ２ｍ
を加えて３７℃で５分間反応後、0.1Ｍ炭酸ソーダ水を
添加し、アルカリ条件下にして反応を停止させ、波長４
００ｎｍの吸光度を測定した（ブランクはＮＡＧ含有被
検液にかわり水を用いる）。
第１表にその結果を示す。
【図面の簡単な説明】
第１図、第３図、第５図、第７図、第９図および第１１
図は本発明実施例の反応曲線を示す。 第２図、第４図、第６図、第８図、第１０図および第１
２図は本発明実施例の検量線を示す。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】基質として下記一般式〔I〕で示される化
    合物を含有することを特徴とするβ−Ｎ−アセチル−Ｄ
    −ヘキソサミニダーゼ活性測定試薬。 （式中、Ａは還元性末端でβ−結合しているＮ−アセチ
    ルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン残基で
    ある。Ｘはニトロ基を示す。R1〜R4のうち、少なくとも
    １つはハロゲン原子を示し、かつR1〜R4のうち少なくと
    も１つは-(CH2)n-SO3H又は-(CH2)n-COOH又はこれらのア
    ルカリ金属塩基（ｎ＝１〜３）を示し、残りの基は水素
    原子を示す。）
JP10996886A 1986-05-13 1986-05-13 β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダ−ゼ活性測定試薬 Expired - Lifetime JPH0611239B2 (ja)

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