JPH069520B2 - アリルスルフアタ−ゼ活性測定試薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はアリルスルファターゼ活性測定用の試薬に関す
るものである。体液中のアリルスルファターゼ活性の測
定は、異染性白質変性症の診断及び経過観察に有用な情
報を与えるものとして臨床意義が高い。

（従来の技術） 従来、アリルスルファターゼ活性はｐ−ニトロフェノー
ルの硫酸エステル（ｐ−ニトロフェニル硫酸）を基質と
してアリルスルファターゼを作用させ、遊離してくるｐ
−ニトロフェノールをアルカリ性下で比色する方法が用
いられていた。

ところが、ｐ−ニトロフェノールを用いた方法では目的
とする酵素、アリルスルファターゼＡ，Ｂの至適pH酸性
域に存在し、発色基であるｐ−ニトロフェノールの発色
（pH９以上）pHと異なる為にアリルスルファターゼＡ，
Ｂを測定する為には酸素反応と発色反応を別々に行なう
必要がある。その為に試薬数及び操作ステップが多く必
要となり、酵素活性を求める場合に一番適当であるとい
われている速度分析（レートアッセイ）法が出来ない欠
点がある。

（発明の解決しようとする問題点） 本発明の目的は定量性に優れたアリルスルファターゼの
レートアッセイが可能となる活性測定試薬を提供するこ
とである。

（問題点を解決する為の手段） 本発明者らは、上記目的を達成するために種々鋭意検討
したところ、一般式（Ｉ）で示される基質を用いること
により体液中のアリルスルファターゼ活性を短時間に正
確簡単にレートアッセイ出来ることを見い出し本発明に
到達した。

すなわち、本発明は基質として下記一般式(Ｉ)で示され
る化合物又はその塩を使用することを特徴とするアリル
スルファターゼ活性測定試薬である。

（式中、Ｘはハロゲン、Ｒは水酸基、カルボキシル基、
炭素原子数１〜３のアルキル基を示す。ｌは１〜４の
数、ｍは１〜４の数、ｎは０〜３の数を示し、ｌ＋ｍ＋
ｎ≦５である。） 本発明に用いる基質としては一般式(Ｉ)で示される化合
物、すなわち硫酸の１つの水酸基がハロゲンおよびニト
ロ基で置換されたフェニル基と結合したものである。ハ
ロゲンおよびニトロ基置換フェニル基としては解裂した
アグリコンが基質と異なったスペクトル吸収を示すもの
である。

解裂したアグリコンとは具体的には一般式： （Ｘ、ｌ，ｍおよびｎは前記のものと同じ） で示されるフェノール誘導体である。

例えば、２−クロロ−４−ニトロフェノール、２−プロ
モ−４−ニトロフェノール、２−ヨード−４−ニトロフ
ェノール、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェノール、
２，６−ジプロモ−４−ニトロフェノール、２，６−ジ
ヨード−４−ニトロフェノール、２，３，６−トリクロ
ロ−４−ニトロフェノール、２，３，６−トリプロモ−
４−ニトロフェノール、２，３，６−トリヨード−４−
ニトロフェノール、２，４−ジニトロ−６−クロロフェ
ノール、２−ヒドロキシ−３−クロロ−５−ニトロフェ
ノール、２−ヒドロキシ−３−ブロモ−５−ニトロフェ
ノール、２−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェ
ノール、２−ヒドロキシ−４−クロロ−５−ニトロフェ
ノール、２−ヒドロキシ−４−ブロモ−５−ニトロフェ
ノール、２−ヒドロキシ−４−ヨード−５−ニトロフェ
ノール、２−クロロ−３−ニトロ−６−ヒドロキシフェ
ノール、２−ブロモ−３−ニトロ−６−ヒドロキシ−フ
ェノール、２−ヨード−３−ニトロ−６−ヒドロキシ−
フェノール、２−クロロ−４−ニトロ−６−ヒドロキシ
−フェノール、２−ブロモ−４−ニトロ−６−ヒドロキ
シ−フェノール、２−ヨード−４−ニトロ−６−ヒドロ
キシ−フェノール、２−ヒドロキシ−４−ニトロ−５−
クロロフェノール、２−ヒドロキシ−４−ニトロ−５−
ブロモフェノール、２−ヒドロキシ−４−ニトロ−５−
ヨードフェノール、２−ヒドロキシ−３−クロロ−４−
ニトロフェノール、２−ヒドロキシ−３−ブロモ−４−
ニトロフェノール、２−ヒドロキシ−３−ヨード−４−
ニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロ−６−メチ
ルフェノール、２−ブロモ−４−ニトロ−６−メチルフ
ェノール、２−ヨード−４−ニトロ−６−メチルフェノ
ール等があげられる。

これらの基質の合成方法は、例えばハロゲン置換のｐ−
ニトロフェノールにクロスルホン酸を反応させて水酸化
カリウム水溶液を加えて中和して目的基質を得る方法が
ある（実験化学講座、２４、生物化学II，２６８）。

一般式(Ｉ)でされる化合物の塩としては、ナトリウム、
カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシ
ウムなどのアルカリ土類金属塩あるいはアンモニウム塩
などがある。

本発明の試薬のpHは体液中のアリルスルファターゼＡ，
Ｂの至適pHであるpH５．０〜６．０を保つ緩衝液であれ
ば、いかなるものでも良い。例えばクエン酸緩衝液やそ
の他有機酸緩衝液、例えば酢酸、コハク酸、フタル酸等
の緩衝液があげられる。

基質濃度としては特に制限がないが、好ましくは最大の
アリルスルファターゼの酵素活性を示す濃度が適当であ
る。例えば１ｍＭ以上である。

本発明の試薬には必要により、界面活性剤、防腐剤、塩
化ナトリウム、シクロデキストリン、安定化剤等を加え
てもよい。

本発明のアリルスルファターゼ活性測定試薬を用いて、
アリルスルファターゼ活性を測定する方法としては、試
薬を該試薬と反応させて生成するアグリコンの急光度の
変化を直接分光光度計を用いて比色定量する方法があ
る。

（発明の効果） 本発明のアリルスルファターゼ活性測定試薬において、
一般式(Ｉ)で示される化合物又はその塩を基質として用
いることにより、体液中のアリルスルファターゼ活性を
短時間に正確、かつ簡単にレートアッセイすることがで
きる。特にニトロフェノールを結合した基質に比べて酵
素反応と発色反応を１つの系で行なえるという優れた効
果を有する。

（実施例） 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１． 被検液中のアリルスルファターゼＡ活性量を下記試薬を
用いて下記方法により測定した。

１．試 薬 ２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル硫酸 ５．０ｍ
Ｍ クエン酸緩衝液 ０．１Ｍ pH５．２ ２．測定方法 アリルスルファターゼ含有被検液50μｌに上記試薬２ｍ
ｌを加えて３７℃で反応させ、その吸光度を波長４００
mmで測定して発色速度を求めた。反応曲線を第１図に示
し、検量線を第２図に示す。

第１図および第２図から明らかなように、水溶性基質を
用いた本発明の試薬では、短時間に正確かつ簡単にレー
トアッセイすることができる。

実施例２． 被検液中のアリルスルファターゼ活性量を下記試薬を用
いて下記方法により測定した。

１．試 薬 Ａ．２，６−ジブロモ−４−ニトロフェニル硫酸 カリウム ５．０ｍＭ クエン酸緩衝液 ０．１Ｍ pH５．２ Ｂ．４−ニトロフェニル硫酸カリウム ５．０ｍＭ クエン酸緩衝液 ０．１Ｍ pH５．２ ２．測定方法 a. アリルスルファターゼ含有被検液５０μｌに上記試
薬Ａ，Ｂ２ｍｌを加えて３７℃で３分間加温後、吸光度
変化を波長４００nmで測定して１分間の吸光度変化を求
めた（ブランクはアリルスルファターゼ含有被検液にか
わり水を用いる）。

b. アリルスルファターゼ含有被検液５０μｌに上記試
薬Ａ，Ｂ２ｍｌを加えて３７℃で５分間反応後、０．１
Ｍ炭酸ソーダ水２ｍｌを添加し、アルカリ条件下にして
反応を停止させ、波長４００nmの吸光度を測定した（ブ
ランクはアリルスルファターゼ含有被検液にかわり水を
用いる）。

第１表にその結果を示す。

本発明の試薬ＡはpH５．２において十分測定可能な感度
を有する試薬であるが、試薬ＢはpH5.2において全く測
定可能レベルになく、アルカリ条件においてのみ測定可
能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明実施例１の反応曲線を示す。 第２図は本発明実施例１の検量線を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】基質として下記一般式（Ｉ）で示される化
   合物又はその塩を使用することを特徴とするアリルスル
   ファターゼ活性測定試薬。 （式中、Ｘはハロゲン、Ｒは水酸基、カルボキシル基、
   炭素原子数１〜３のアルキル基を示す。ｌは１〜４の
   数、ｍは１〜４の数、ｎは０〜３の数を示し、ｌ＋ｍ＋
   ｎ≦５である。）