JPH08163998A - 尿素窒素の定量方法 - Google Patents
尿素窒素の定量方法Info
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- JPH08163998A JPH08163998A JP26278595A JP26278595A JPH08163998A JP H08163998 A JPH08163998 A JP H08163998A JP 26278595 A JP26278595 A JP 26278595A JP 26278595 A JP26278595 A JP 26278595A JP H08163998 A JPH08163998 A JP H08163998A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 保存安定性および定量値の再現性の優れた、
ウレアーゼを用いた尿素窒素の定量方法を提供する。 【解決手段】 有機ほう素化合物の存在下、試料中の尿
素窒素にウレアーゼを作用させた後、生じるアンモニア
量を測定することにより尿素窒素を定量する方法、ウレ
アーゼに有機ほう素化合物を共存させることを特徴とす
るウレアーゼの安定化方法およびウレアーゼと有機ほう
素化合物とが共存してなる定量試薬組成物に関する。
ウレアーゼを用いた尿素窒素の定量方法を提供する。 【解決手段】 有機ほう素化合物の存在下、試料中の尿
素窒素にウレアーゼを作用させた後、生じるアンモニア
量を測定することにより尿素窒素を定量する方法、ウレ
アーゼに有機ほう素化合物を共存させることを特徴とす
るウレアーゼの安定化方法およびウレアーゼと有機ほう
素化合物とが共存してなる定量試薬組成物に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は臨床診断に有用な尿
素窒素の定量方法に関する。また、本発明はウレアーゼ
の安定化方法および安定化されたウレアーゼを含有する
定量試薬組成物に関する。
素窒素の定量方法に関する。また、本発明はウレアーゼ
の安定化方法および安定化されたウレアーゼを含有する
定量試薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】尿素窒素の定量方法として、試料中の尿
素窒素を、ウレアーゼと反応させた後、生じるアンモニ
ア量を、インドフェノールを用いて測定する方法または
グルタミン酸脱水素酵素を用いて測定する方法が知られ
ている〔最新検査、１巻、１１〜１４頁、（１９８３
年）〕。しかし、これらの方法において使用するウレア
ーゼが不安定であるため、定量試薬組成物を長期間、安
定に保つことが困難である。
素窒素を、ウレアーゼと反応させた後、生じるアンモニ
ア量を、インドフェノールを用いて測定する方法または
グルタミン酸脱水素酵素を用いて測定する方法が知られ
ている〔最新検査、１巻、１１〜１４頁、（１９８３
年）〕。しかし、これらの方法において使用するウレア
ーゼが不安定であるため、定量試薬組成物を長期間、安
定に保つことが困難である。
【０００３】ウレアーゼの拮抗阻害剤であるほう酸を添
加することにより該酵素を安定化し、定量性を向上させ
る方法が知られている（特公平３─６５１６０号）。し
かし、ほう酸を添加することを特徴とするウレアーゼを
用いた尿素窒素の定量方法では、多量のほう酸を添加す
ることが必要である上、同時再現性（ＣＶ）値が悪いた
め、より優れた定量方法の開発が望まれている。
加することにより該酵素を安定化し、定量性を向上させ
る方法が知られている（特公平３─６５１６０号）。し
かし、ほう酸を添加することを特徴とするウレアーゼを
用いた尿素窒素の定量方法では、多量のほう酸を添加す
ることが必要である上、同時再現性（ＣＶ）値が悪いた
め、より優れた定量方法の開発が望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、保存
安定性および同時再現性の優れた、ウレアーゼを用いた
尿素窒素の定量方法を提供することにある。
安定性および同時再現性の優れた、ウレアーゼを用いた
尿素窒素の定量方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、有機ほう素化
合物の存在下、試料中の尿素窒素にウレアーゼを作用さ
せた後、生じるアンモニア量を測定することにより尿素
窒素を定量する方法、ウレアーゼに有機ほう素化合物を
共存させることを特徴とするウレアーゼの安定化方法、
およびウレアーゼと有機ほう素化合物とが共存してなる
定量試薬組成物に関する。
合物の存在下、試料中の尿素窒素にウレアーゼを作用さ
せた後、生じるアンモニア量を測定することにより尿素
窒素を定量する方法、ウレアーゼに有機ほう素化合物を
共存させることを特徴とするウレアーゼの安定化方法、
およびウレアーゼと有機ほう素化合物とが共存してなる
定量試薬組成物に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明によると、ウレアーゼに有
機ほう素化合物を共存させることにより、ウレーゼを安
定化させることができる。有機ほう素化合物としては、
ほう酸トリメチル、ほう酸トリエチル等のほう酸トリア
ルキル、ほう酸トリフェニル等のほう酸トリアリール、
ほう酸トリエタノールアミン等のほう酸トリアルカノー
ルアミン、ほう酸トリアリールアミン、ほう酸トリ−ｏ
−トリルエステル等があげられる。これらの中でほう酸
トリエタノールアミン、ほう酸トリフェニル、ほう酸ト
リ−ｏ−トリルエステル等を使用することが好ましい。
これらの化合物は、単独で用いてもよいし、組み合わせ
て用いてもよい。
機ほう素化合物を共存させることにより、ウレーゼを安
定化させることができる。有機ほう素化合物としては、
ほう酸トリメチル、ほう酸トリエチル等のほう酸トリア
ルキル、ほう酸トリフェニル等のほう酸トリアリール、
ほう酸トリエタノールアミン等のほう酸トリアルカノー
ルアミン、ほう酸トリアリールアミン、ほう酸トリ−ｏ
−トリルエステル等があげられる。これらの中でほう酸
トリエタノールアミン、ほう酸トリフェニル、ほう酸ト
リ−ｏ−トリルエステル等を使用することが好ましい。
これらの化合物は、単独で用いてもよいし、組み合わせ
て用いてもよい。
【０００７】ウレアーゼとしては、E.C. 3.5.1.5に分類
されるウレアーゼであればどのようなものでもよく、ナ
タマメ等、植物由来のウレアーゼ、細菌（Bacillus pa
steurii など）、酵母、カビ等、微生物由来のウレアー
ゼ、動物由来のウレアーゼ等があげられるが、好ましく
は微生物由来のウレアーゼが用いられる。また、上記の
ウレアーゼを遺伝子工学等で改変したものを用いてもよ
い。
されるウレアーゼであればどのようなものでもよく、ナ
タマメ等、植物由来のウレアーゼ、細菌（Bacillus pa
steurii など）、酵母、カビ等、微生物由来のウレアー
ゼ、動物由来のウレアーゼ等があげられるが、好ましく
は微生物由来のウレアーゼが用いられる。また、上記の
ウレアーゼを遺伝子工学等で改変したものを用いてもよ
い。
【０００８】ウレアーゼを安定化するためには、有機ほ
う素化合物の濃度が、ウレアーゼ１Ｕ（国際単位）当た
り１×１０-10 〜１ｍｏｌ、好ましくは１×１０-8〜１
×１０-1ｍｏｌとなるように有機ほう素化合物を添加す
ればよい。
う素化合物の濃度が、ウレアーゼ１Ｕ（国際単位）当た
り１×１０-10 〜１ｍｏｌ、好ましくは１×１０-8〜１
×１０-1ｍｏｌとなるように有機ほう素化合物を添加す
ればよい。
【０００９】本発明の定量試薬組成物は、使用時の濃度
として、水性媒体中にウレアーゼが１〜１００Ｕ／ｍ
ｌ、好ましくは５〜４５Ｕ／ｍｌ、有機ほう素が０．０
１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜５ｍＭとなるよう
にそれぞれを含有する。
として、水性媒体中にウレアーゼが１〜１００Ｕ／ｍ
ｌ、好ましくは５〜４５Ｕ／ｍｌ、有機ほう素が０．０
１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜５ｍＭとなるよう
にそれぞれを含有する。
【００１０】水性媒体としては、精製水、生理食塩水、
緩衝液等があげられ、緩衝液を用いることが好ましい。
緩衝液に用いる緩衝剤としては、塩酸、リン酸、炭酸、
フタル酸、トリス、シュウ酸、エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）、マレイン酸、グリシン、ピロリン酸、マ
ロン酸、フマル酸、DL- 酒石酸、クエン酸、フランカル
ボン酸、β−アラニン、β：β’−ジメチルグルタル
酸、DL- 乳酸、γ−アミノ酪酸、バルビツール酸、安息
香酸、コハク酸、ε−アミノカプロン酸、酢酸、プロピ
オン酸、DL- リンゴ酸、５（４）−ヒドロキシイミダゾ
ール、グリセロールリン酸、β−グリセロリン酸および
これらの塩、エチレンジアミン、イミダゾール、５
（４）−メチルイミダゾール、Ｎ−エチルモルホリン、
５，５−ジエチルバルビツール酸、２，５（４）−ジメ
チルイミダゾール、２−アミノ−２−メチル−１，３−
プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−
プロパンジオール、ジエタノールアミン、４−アミノピ
リジン、エタノールアミン、エフェドリン、２−アミノ
−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール
（ＨＥＰＰＳＯ）、２−アミノ−２−メチル−１−プロ
パノール、ｎ−ブチルアミン、トリエチルアミン、ヘキ
サメチレンジアミン、ピペリジン及びグッドバッファー
等があげられ、これら緩衝剤は単独または混合して緩衝
液に用いられる。緩衝剤は緩衝液の濃度が０．００５〜
２ｍｏｌ／ｌとなるように添加される。緩衝液として
は、トリス−塩酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝
液、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液等があげられる。緩衝液のｐＨ
は、ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜１０である。
緩衝液等があげられ、緩衝液を用いることが好ましい。
緩衝液に用いる緩衝剤としては、塩酸、リン酸、炭酸、
フタル酸、トリス、シュウ酸、エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）、マレイン酸、グリシン、ピロリン酸、マ
ロン酸、フマル酸、DL- 酒石酸、クエン酸、フランカル
ボン酸、β−アラニン、β：β’−ジメチルグルタル
酸、DL- 乳酸、γ−アミノ酪酸、バルビツール酸、安息
香酸、コハク酸、ε−アミノカプロン酸、酢酸、プロピ
オン酸、DL- リンゴ酸、５（４）−ヒドロキシイミダゾ
ール、グリセロールリン酸、β−グリセロリン酸および
これらの塩、エチレンジアミン、イミダゾール、５
（４）−メチルイミダゾール、Ｎ−エチルモルホリン、
５，５−ジエチルバルビツール酸、２，５（４）−ジメ
チルイミダゾール、２−アミノ−２−メチル−１，３−
プロパンジオール、２−アミノ−２−エチル−１，３−
プロパンジオール、ジエタノールアミン、４−アミノピ
リジン、エタノールアミン、エフェドリン、２−アミノ
−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール
（ＨＥＰＰＳＯ）、２−アミノ−２−メチル−１−プロ
パノール、ｎ−ブチルアミン、トリエチルアミン、ヘキ
サメチレンジアミン、ピペリジン及びグッドバッファー
等があげられ、これら緩衝剤は単独または混合して緩衝
液に用いられる。緩衝剤は緩衝液の濃度が０．００５〜
２ｍｏｌ／ｌとなるように添加される。緩衝液として
は、トリス−塩酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝
液、ＨＥＰＰＳＯ緩衝液等があげられる。緩衝液のｐＨ
は、ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜１０である。
【００１１】該定量試薬組成物には、他の成分として、
他の酵素、補酵素、発色剤、界面活性剤、キレート剤、
他の安定化剤、他の化合物等を含有してもよい。他の酵
素としては、例えばグルタミン酸脱水素酵素〔E.C. 1.
4.1.2、E.C. 1.4.1.3またはE.C. 1.4.1.4〕があげられ
る。補酵素としては、例えば還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨという）、還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、
ＮＡＤＰＨという）があげられる。
他の酵素、補酵素、発色剤、界面活性剤、キレート剤、
他の安定化剤、他の化合物等を含有してもよい。他の酵
素としては、例えばグルタミン酸脱水素酵素〔E.C. 1.
4.1.2、E.C. 1.4.1.3またはE.C. 1.4.1.4〕があげられ
る。補酵素としては、例えば還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨという）、還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、
ＮＡＤＰＨという）があげられる。
【００１２】発色剤としては、例えばバートレット反応
に用いられるフェノールおよび次亜塩素酸ナトリウム、
ジクロロイソシアヌル酸塩およびサリチル酸があげられ
る。界面活性剤としては、例えばポリエチレングリコー
ルモノ−ｐ−イソオクチルフェニエステルがあげられ
る。キレート剤としては、例えばＥＤＴＡがあげられ
る。
に用いられるフェノールおよび次亜塩素酸ナトリウム、
ジクロロイソシアヌル酸塩およびサリチル酸があげられ
る。界面活性剤としては、例えばポリエチレングリコー
ルモノ−ｐ−イソオクチルフェニエステルがあげられ
る。キレート剤としては、例えばＥＤＴＡがあげられ
る。
【００１３】他の安定化剤としては、例えばほう酸があ
げられる。他の物質としては、例えばα−ケトグルタル
酸（以下、α−ＫＧという）があげられる。
げられる。他の物質としては、例えばα−ケトグルタル
酸（以下、α−ＫＧという）があげられる。
【００１４】該定量試薬組成物は、あらかじめ全成分が
水性媒体中に溶解した液体として調製してこれを用いて
もよいし、全成分または一部成分が凍結乾燥品等の固体
として調製し、使用時に水性媒体で溶解して用いてもよ
い。
水性媒体中に溶解した液体として調製してこれを用いて
もよいし、全成分または一部成分が凍結乾燥品等の固体
として調製し、使用時に水性媒体で溶解して用いてもよ
い。
【００１５】本発明によると、水性媒体中、有機ほう素
化合物の存在下、試料中の尿素窒素にウレアーゼを作用
させた後、生じるアンモニア量を測定することにより尿
素窒素を定量する方法を提供することができる。
化合物の存在下、試料中の尿素窒素にウレアーゼを作用
させた後、生じるアンモニア量を測定することにより尿
素窒素を定量する方法を提供することができる。
【００１６】水性媒体としては、精製水、生理食塩水、
緩衝液等があげられ、緩衝液を用いることが好ましい。
緩衝液に用いる緩衝剤としては、上記のものが用いられ
る。緩衝液のｐＨはｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜
１０である。有機ほう素化合物の使用濃度としては、水
性媒体中０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜５
ｍＭである。
緩衝液等があげられ、緩衝液を用いることが好ましい。
緩衝液に用いる緩衝剤としては、上記のものが用いられ
る。緩衝液のｐＨはｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜
１０である。有機ほう素化合物の使用濃度としては、水
性媒体中０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜５
ｍＭである。
【００１７】アンモニアを定量する方法としては、例え
ばインドフェノールを用いて測定する方法、グルタミン
酸脱水素酵素を用いて測定する方法があげられる〔最新
検査、１巻、１１〜１４頁、（１９８３年）〕。
ばインドフェノールを用いて測定する方法、グルタミン
酸脱水素酵素を用いて測定する方法があげられる〔最新
検査、１巻、１１〜１４頁、（１９８３年）〕。
【００１８】グルタミン酸脱水素酵素を用いて測定する
方法とは、生成したアンモニアを、α−ＫＧとＮＡＤＨ
またはＮＡＤＰＨとの存在下、グルタミン酸脱水素酵素
で作用させ、該酵素活性を測定することによりアンモニ
ア量を定量する方法のことである。具体的には、基質で
あるアンモニアおよびα−ＫＧを、ＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨの補酵素の存在下、細菌、カビ、動物等由来のグ
ルタミン酸脱水素酵素（E.C.1.4.1.3.またはE.C.1.4.1.
4.）を作用させたとき、減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨ量を蛍光分析法または紫外可視吸光光度法により測
定することにより、アンモニア量を定量する方法のこと
である。
方法とは、生成したアンモニアを、α−ＫＧとＮＡＤＨ
またはＮＡＤＰＨとの存在下、グルタミン酸脱水素酵素
で作用させ、該酵素活性を測定することによりアンモニ
ア量を定量する方法のことである。具体的には、基質で
あるアンモニアおよびα−ＫＧを、ＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨの補酵素の存在下、細菌、カビ、動物等由来のグ
ルタミン酸脱水素酵素（E.C.1.4.1.3.またはE.C.1.4.1.
4.）を作用させたとき、減少するＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨ量を蛍光分析法または紫外可視吸光光度法により測
定することにより、アンモニア量を定量する方法のこと
である。
【００１９】以下に本発明の定量方法をより詳細に説明
する。 （１）インドフェノールを用いた方法 ｐＨを７〜１０、好ましくは７．５〜９．５に調整した
緩衝液に、１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５〜４５Ｕ
／ｍｌのウレアーゼ、０．０１〜１００ｍＭ、好ましく
は０．０１〜５ｍＭの有機ほう素化合物、０．１〜５０
ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭのα−ケトグルタル酸を
添加し、緩衝液の温度を１０〜５０℃、好ましくは２０
〜４０℃で３〜５分間プレインキュベーションした後、
試料を加え更に１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃
で３〜６０分間、好ましくは５〜３０分間反応させる。
反応終了後、反応液のアンモニア量をインドフェノール
で定量し、対応する尿素窒素を定量する。
する。 （１）インドフェノールを用いた方法 ｐＨを７〜１０、好ましくは７．５〜９．５に調整した
緩衝液に、１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは５〜４５Ｕ
／ｍｌのウレアーゼ、０．０１〜１００ｍＭ、好ましく
は０．０１〜５ｍＭの有機ほう素化合物、０．１〜５０
ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭのα−ケトグルタル酸を
添加し、緩衝液の温度を１０〜５０℃、好ましくは２０
〜４０℃で３〜５分間プレインキュベーションした後、
試料を加え更に１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃
で３〜６０分間、好ましくは５〜３０分間反応させる。
反応終了後、反応液のアンモニア量をインドフェノール
で定量し、対応する尿素窒素を定量する。
【００２０】（２）グルタミン脱水素酵素を用いた定量
方法 試料中のアンモニアを消去するためｐＨを８〜１０、好
ましくは９〜１０に調整した緩衝液に、１〜１０００Ｕ
／ｍｌ、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌのグルタミン酸脱
水素酵素、１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭのＮ
ＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ、０．１〜５０ｍＭ、好まし
くは１〜２０ｍＭのα−ＫＧを添加した第１試薬に、試
料を添加し、緩衝液の温度を１０〜５０℃、好ましくは
２０〜４０℃で３〜５分間プレインキュベーションす
る。
方法 試料中のアンモニアを消去するためｐＨを８〜１０、好
ましくは９〜１０に調整した緩衝液に、１〜１０００Ｕ
／ｍｌ、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍｌのグルタミン酸脱
水素酵素、１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０ｍＭのＮ
ＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨ、０．１〜５０ｍＭ、好まし
くは１〜２０ｍＭのα−ＫＧを添加した第１試薬に、試
料を添加し、緩衝液の温度を１０〜５０℃、好ましくは
２０〜４０℃で３〜５分間プレインキュベーションす
る。
【００２１】これとは別にｐＨを７〜１０、好ましくは
８〜９に調整した緩衝液に、１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ま
しくは５〜４５Ｕ／ｍｌのウレアーゼ、０．０１〜１０
０ｍＭ、好ましくは０．０１〜５ｍＭの有機ほう素化合
物、必要により０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０
ｍＭのα−ＫＧを添加し第２試薬とする。必要により緩
衝液の温度を１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃に
して１〜１０分間プレインキュベーションする。
８〜９に調整した緩衝液に、１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ま
しくは５〜４５Ｕ／ｍｌのウレアーゼ、０．０１〜１０
０ｍＭ、好ましくは０．０１〜５ｍＭの有機ほう素化合
物、必要により０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０
ｍＭのα−ＫＧを添加し第２試薬とする。必要により緩
衝液の温度を１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃に
して１〜１０分間プレインキュベーションする。
【００２２】試料を含有する第１試薬にｐＨが７．５〜
９．５、好ましくは８．５〜９．５になるように第２試
薬を加え、１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、
３〜６０分間、好ましくは５〜３０分間反応させる。な
お、このときの第２試薬と第１試薬との混合比は１：９
〜９：１、好ましくは１：３である。ウレアーゼ反応に
より生じたアンモニアは、グルタミン酸脱水素酵素反応
によりグルタミン酸へ付加されるが、同時に消費される
ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの単位時間当たりの減少量
を、蛍光分析法または紫外可視吸光光度法により測定し
てアンモニア量を定量することにより、対応する試料中
の尿素窒素量を定量する。
９．５、好ましくは８．５〜９．５になるように第２試
薬を加え、１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、
３〜６０分間、好ましくは５〜３０分間反応させる。な
お、このときの第２試薬と第１試薬との混合比は１：９
〜９：１、好ましくは１：３である。ウレアーゼ反応に
より生じたアンモニアは、グルタミン酸脱水素酵素反応
によりグルタミン酸へ付加されるが、同時に消費される
ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨの単位時間当たりの減少量
を、蛍光分析法または紫外可視吸光光度法により測定し
てアンモニア量を定量することにより、対応する試料中
の尿素窒素量を定量する。
【００２３】なお、上記方法に使用する緩衝液には検体
の可溶化剤を添加してもよい。可溶化剤の例としては、
ＨＳ−２１０〔商品名：日本油脂（株）製〕、ＰＧＭ−
５０〔商品名：和光純薬工業（株）製〕、トリトンＸ−
１００〔商品名：シグマ社製〕、ＤＦ−１６〔商品名：
シグマ社製〕、エマルゲンＡ−６０〔商品名：花王
（株）製〕、エマルゲンＡ−９０〔商品名：花王（株）
製〕、エマルゲン７０９〔商品名：花王（株）製〕等の
界面活性剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機
塩、ＥＤＴＡナトリウム等があげられる。
の可溶化剤を添加してもよい。可溶化剤の例としては、
ＨＳ−２１０〔商品名：日本油脂（株）製〕、ＰＧＭ−
５０〔商品名：和光純薬工業（株）製〕、トリトンＸ−
１００〔商品名：シグマ社製〕、ＤＦ−１６〔商品名：
シグマ社製〕、エマルゲンＡ−６０〔商品名：花王
（株）製〕、エマルゲンＡ−９０〔商品名：花王（株）
製〕、エマルゲン７０９〔商品名：花王（株）製〕等の
界面活性剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機
塩、ＥＤＴＡナトリウム等があげられる。
【００２４】本発明の定量方法は、尿素窒素を含有する
試料であれば、いずれの試料についても適用することが
できる。試料としては、例えば生体から採取した体液即
ち血液、血清、尿、髄液、腹腔液、透析液等があげられ
る。
試料であれば、いずれの試料についても適用することが
できる。試料としては、例えば生体から採取した体液即
ち血液、血清、尿、髄液、腹腔液、透析液等があげられ
る。
【００２５】以下に、本発明の実施例を示す。
【００２６】
実施例１（標準血清中の尿素窒素の定量）
【００２７】
【表１】
【００２８】第１表に示された量の、α−ＫＧ、ＮＡＤ
ＰＨ、グルタミン酸脱水素酵素を０．１Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ９．２）１００ｍｌに溶解し、第１試薬と
して調製した。一方、α−ＫＧ、ほう酸トリエタノール
アミン（ナカライテスク製）、コリネバクテリウム属菌
由来のウレアーゼをトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
１００ｍｌに溶解し、第２試薬として調製した。２．２
５ｍｌの第１試薬に３０μｌの標準血清を加え、３７℃
で５分間プレインキュベーションした後、３７℃で５分
間プレインキュベーションした０．７５ｍｌの第２試薬
を加え、３７℃で５分間反応させ、３４０ｎｍにおける
吸光度の単位時間当たりの減少量を測定することにより
ウレアーゼ活性を測定した。同様の操作を２０回行い、
ＣＶ値を求めた。
ＰＨ、グルタミン酸脱水素酵素を０．１Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ９．２）１００ｍｌに溶解し、第１試薬と
して調製した。一方、α−ＫＧ、ほう酸トリエタノール
アミン（ナカライテスク製）、コリネバクテリウム属菌
由来のウレアーゼをトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
１００ｍｌに溶解し、第２試薬として調製した。２．２
５ｍｌの第１試薬に３０μｌの標準血清を加え、３７℃
で５分間プレインキュベーションした後、３７℃で５分
間プレインキュベーションした０．７５ｍｌの第２試薬
を加え、３７℃で５分間反応させ、３４０ｎｍにおける
吸光度の単位時間当たりの減少量を測定することにより
ウレアーゼ活性を測定した。同様の操作を２０回行い、
ＣＶ値を求めた。
【００２９】また比較例として、ほう酸トリエタノール
アミンを第２試薬から除く以外は、実施例１と同様の組
成の試薬を用いた対照群を、実施例１と同様の操作を２
０回行い、そのＣＶ値を求めた。さらに、ほう酸トリエ
タノールアミンの代わりにほう酸を第２試薬に用いる以
外は、実施例１と同様の組成の試薬を用い、実施例１と
同様の操作を２０回行い、ＣＶ値を求めた。
アミンを第２試薬から除く以外は、実施例１と同様の組
成の試薬を用いた対照群を、実施例１と同様の操作を２
０回行い、そのＣＶ値を求めた。さらに、ほう酸トリエ
タノールアミンの代わりにほう酸を第２試薬に用いる以
外は、実施例１と同様の組成の試薬を用い、実施例１と
同様の操作を２０回行い、ＣＶ値を求めた。
【００３０】以上各群の結果を第２表に示した。
【００３１】
【表２】
【００３２】第２表に示されるとおり、各種濃度におい
て、有機ほう酸の添加群のほうがほう酸が添加群よりも
ＣＶ値が低く、定量方法として精度が高かった。
て、有機ほう酸の添加群のほうがほう酸が添加群よりも
ＣＶ値が低く、定量方法として精度が高かった。
【００３３】実施例２（ウレアーゼ活性の安定化） 実施例１の第１表に記載された組成の０．７５ｍｌの第
２試薬を試薬ａとし、試薬ａをさらに３０℃で１か月間
保存して試薬ｂを調製した。第１試薬２．２５ｍｌに３
０μｌの１６５ｍＭ尿素を加え、３７℃で５分間プレイ
ンキュベーションした後、３７℃で５分間プレインキュ
ベーションした０．７５ｍｌの試薬ａまたは試薬ｂを加
え、３７℃で５分間反応させ、３４０ｎｍにおける吸光
度の単位時間当たりの減少量を測定することによりウレ
アーゼ活性を測定した。この操作により得られた試薬ｂ
を添加したときのウレアーゼ活性および試薬ａを添加し
たときのウレアーゼ活性から、次式に従いウレアーゼ活
性の残存率を算出した。
２試薬を試薬ａとし、試薬ａをさらに３０℃で１か月間
保存して試薬ｂを調製した。第１試薬２．２５ｍｌに３
０μｌの１６５ｍＭ尿素を加え、３７℃で５分間プレイ
ンキュベーションした後、３７℃で５分間プレインキュ
ベーションした０．７５ｍｌの試薬ａまたは試薬ｂを加
え、３７℃で５分間反応させ、３４０ｎｍにおける吸光
度の単位時間当たりの減少量を測定することによりウレ
アーゼ活性を測定した。この操作により得られた試薬ｂ
を添加したときのウレアーゼ活性および試薬ａを添加し
たときのウレアーゼ活性から、次式に従いウレアーゼ活
性の残存率を算出した。
【００３４】
【数１】
【００３５】ほう酸エタノールアミンの代わりに、ほう
酸トリフェニル、ほう酸トリ−ｏ−トリルエステルおよ
びほう酸をそれぞれ用いて、同様の実験を行いウレアー
ゼ活性の残存率を算出した。なお、ほう酸トリフェニル
およびほう酸トリ−ｏ−トリルエステルについてＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミドに溶解した後、第２試薬に加え
た。
酸トリフェニル、ほう酸トリ−ｏ−トリルエステルおよ
びほう酸をそれぞれ用いて、同様の実験を行いウレアー
ゼ活性の残存率を算出した。なお、ほう酸トリフェニル
およびほう酸トリ−ｏ−トリルエステルについてＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミドに溶解した後、第２試薬に加え
た。
【００３６】結果を第３表に示す。
【００３７】
【表３】
【００３８】第３表に示されるとおり、各種濃度におい
て、有機ほう素化合物の添加群のほうがほう酸の添加群
よりもウレアーゼ活性の残存率が高かった。
て、有機ほう素化合物の添加群のほうがほう酸の添加群
よりもウレアーゼ活性の残存率が高かった。
【００３９】実施例３（定量試薬組成物１） 尿素窒素の定量に用いられる、第４表に示す組成からな
る定量試薬組成物を調製した。
る定量試薬組成物を調製した。
【００４０】
【表４】
【００４１】実施例４（定量試薬組成物２） 尿素窒素の定量に用いられる、第５表に示す組成からな
る定量試薬組成物を調製した。
る定量試薬組成物を調製した。
【００４２】
【表５】
【００４３】実施例５（定量試薬組成物３） 尿素窒素の定量に用いられる、第６表に示す組成からな
る定量試薬組成物を調製した。
る定量試薬組成物を調製した。
【００４４】
【表６】
【００４５】
【発明の効果】本発明により、保存安定性および定量時
の再現性の優れた、ウレアーゼを用いた尿素窒素の定量
方法を提供することができる。
の再現性の優れた、ウレアーゼを用いた尿素窒素の定量
方法を提供することができる。
Claims (9)
- 【請求項１】 有機ほう素化合物の存在下、試料中の尿
素窒素にウレアーゼを作用させた後、生じるアンモニア
量を測定することにより尿素窒素を定量する方法。 - 【請求項２】 有機ほう素化合物の濃度が、ウレアーゼ
１Ｕ当たり１×１０ -10 〜１ｍｏｌである請求項１記載
の方法。 - 【請求項３】 有機ほう素化合物が、ほう酸トリエタノ
ールアミン、ほう酸トリフェニルまたはほう酸トリ−ｏ
−トリルエステルである請求項１または２記載の方法。 - 【請求項４】 ウレアーゼに有機ほう素化合物を共存さ
せることを特徴とするウレアーゼの安定化方法。 - 【請求項５】 有機ほう素化合物の濃度が、ウレアーゼ
１Ｕ当たり１×１０ -10 〜１ｍｏｌである請求項４記載
の方法。 - 【請求項６】 有機ほう素化合物が、ほう酸トリエタノ
ールアミン、ほう酸トリフェニルまたはほう酸トリ−ｏ
−トリルエステルである請求項４または５記載の方法。 - 【請求項７】 ウレアーゼと有機ほう素化合物とが共存
してなる定量試薬組成物。 - 【請求項８】 有機ほう素化合物の濃度が、ウレアーゼ
１Ｕ当たり１×１０ -10 〜１ｍｏｌである請求項７記載
の定量試薬組成物。 - 【請求項９】 有機ほう素化合物が、ほう酸トリエタノ
ールアミン、ほう酸トリフェニルまたはほう酸トリ−ｏ
−トリルエステルである請求項７または８記載の定量試
薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26278595A JP3729900B2 (ja) | 1994-10-13 | 1995-10-11 | 尿素窒素の定量方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24805394 | 1994-10-13 | ||
| JP6-248053 | 1994-10-13 | ||
| JP26278595A JP3729900B2 (ja) | 1994-10-13 | 1995-10-11 | 尿素窒素の定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08163998A true JPH08163998A (ja) | 1996-06-25 |
| JP3729900B2 JP3729900B2 (ja) | 2005-12-21 |
Family
ID=26538558
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26278595A Expired - Lifetime JP3729900B2 (ja) | 1994-10-13 | 1995-10-11 | 尿素窒素の定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3729900B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002045198A (ja) * | 2000-08-02 | 2002-02-12 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 尿素窒素の測定方法及び測定用試薬 |
-
1995
- 1995-10-11 JP JP26278595A patent/JP3729900B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002045198A (ja) * | 2000-08-02 | 2002-02-12 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 尿素窒素の測定方法及び測定用試薬 |
| JP4503151B2 (ja) * | 2000-08-02 | 2010-07-14 | 積水メディカル株式会社 | 尿素窒素の測定方法及び測定用試薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3729900B2 (ja) | 2005-12-21 |
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