CN116083382B - 一种表达乳酸氧化酶的益生菌工程菌及其表达产品和应用 - Google Patents

一种表达乳酸氧化酶的益生菌工程菌及其表达产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达乳酸氧化酶的益生菌工程菌及其表达产品和应用，属于分子生物学和生物技术领域。本发明公开了乳酸氧化酶在制备降解反刍动物瘤胃中的乳酸产品中的应用。具体地，本发明按照大肠杆菌密码子偏爱性，对该乳酸氧化酶的编码基因进行了密码子优化后，分别构建表达模块pHCE‑lox1‑rrnBT1T2和pHCE‑lox7‑rrnBT1T2，将含乳酸氧化酶lox1和lox7的表达模块转化到大肠杆菌Nissle 1917中，成功构建得到了表达乳酸氧化酶的益生菌工程菌株。该工程菌株可用于乳酸氧化酶制剂的生产，该乳酸氧化酶制剂在模拟反刍动物瘤胃中急性酸中毒条件下，可以显著转化乳酸，降低乳酸浓度，改善酸中毒。

Description

一种表达乳酸氧化酶的益生菌工程菌及其表达产品和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物技术领域，特别是涉及一种表达乳酸氧化酶的益生菌工程菌及其表达产品和应用。
背景技术
在牛等反刍动物的饲料中添加青贮秸秆或者采食易发酵碳水化合物如淀粉和葡萄糖等，可以有效提高反刍动物的生长。然而，反刍动物的瘤胃是pH中性环境，采食过量青贮秸秆或淀粉后，瘤胃中能产生L-型乳酸的细菌——牛链球菌等，快速生长繁殖，同时乳酸利用菌来不及代谢产生的大量乳酸，因而造成酸中毒，会对反刍动物的健康造成不利影响。
乳酸氧化酶是一种能够利用氧气将乳酸氧化为丙酮酸的生物酶。如果在饲喂前添加乳酸氧化酶可以有效降低瘤胃中的乳酸含量，并且所产生的丙酮酸能为大多数瘤微生物进一步利用。同时这一反应过程消耗氧气，这将有利于瘤胃形成厌氧环境。
大肠杆菌Nissle1917，是唯一一种不致病的大肠杆菌，也是一种益生菌。Nissle1917在临床上主要用于治疗炎症性胃肠功能障碍，比如克罗恩病、溃疡性结肠炎等。Nissle1917的作用机制在于其能在人体肠道定殖，并阻止病原菌对肠道黏膜的侵袭，对肠道黏膜屏障具有保护和修护作用。Nissle1917还参与宿主机体的免疫调控，平衡免疫因子的分泌，增强宿主免疫能力，进而缓解和治疗炎症。而目前关于乳酸氧化酶的益生菌制剂在反刍动物方面的用途鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达乳酸氧化酶的益生菌工程菌及其表达产品和应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用构建的益生菌工程菌表达的乳酸氧化酶，可以降解反刍动物瘤胃中的乳酸，改善酸中毒。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供乳酸氧化酶在制备降解反刍动物瘤胃中的乳酸产品中的应用，所述乳酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供所述的乳酸氧化酶的编码基因在制备降解反刍动物瘤胃中的乳酸产品中的应用，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供包含所述的乳酸氧化酶编码基因的表达载体在制备降解反刍动物瘤胃中的乳酸产品中的应用。更优选的是，所述表达载体还包括在大肠杆菌中发挥功能的HCE启动子序列pHCE和终止子序列rrnBT1T2(Novel high-level constitutiveexpression system,pHCE vector,for a convenient and cost-effective solubleproduction of human tumor necrosis factor-α.Biotechnology Letters.2022,24:1185–1189.)。
本发明还提供包含所述的表达载体的益生菌在制备降解反刍动物瘤胃中的乳酸产品中的应用，所述益生菌包括肠杆菌Nissle 1917。
本发明还提供一种生产乳酸氧化酶的方法，利用益生菌工程菌发酵，获取菌体，所述菌体匀浆、分离获取上清液，经烘干，得到乳酸氧化酶；
其中，所述益生菌工程菌是将乳酸氧化酶的编码基因转入转化到大肠杆菌Nissle1917中获得。
优选的是，发酵条件为：所述益生菌工程菌接种于LB培养基中37℃培养48h。
优选的是，获得所述益生菌工程菌具体包括以下步骤：
(1)获取乳酸氧化酶的编码基因，并构建包含所述编码基因的表达载体；所述乳酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述编码基因如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示；
(2)将所述表达载体转入所述大肠杆菌Nissle1917，得到所述益生菌工程菌。
本发明还提供一种乳酸氧化酶制剂，所述乳酸氧化酶制剂利用所述的方法制备得到。
本发明还提供一种表达乳酸氧化酶的益生菌工程菌，所述益生菌工程菌是将乳酸氧化酶的编码基因转入转化到大肠杆菌Nissle 1917中获得；所述乳酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；所述编码基因如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供所述的乳酸氧化酶制剂或所述的益生菌工程菌在模拟反刍动物瘤胃中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明公开了两种乳酸氧化酶，并公开了其按照大肠杆菌密码子偏爱性进行优化后的编码基因，命名为lox1和lox7。本发明构建了表达模块pHCE-lox1-rrnBT1T2和pHCE-lox7-rrnBT1T2，并将这两个模块转化到益生菌——大肠杆菌Nissle 1917中，成功构建得到了表达乳酸氧化酶的益生菌工程菌株。该益生菌工程菌株可用于乳酸氧化酶制剂的生产，通过实验验证，该乳酸氧化酶制剂可以显著减少反刍动物瘤胃中乳酸。本发明为反刍动物饲养中改善酸中毒提供了新的酶制剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中丙酮酸的标准曲线；
图2为本发明中表达模块和表达质粒构建流程图；A：表达模块pHCE-lox1-rrnBT1T2；B：表达模块pHCE-lox7-rrnBT1T2；
图3为本发明中益生菌工程菌株表达乳酸氧化酶的活力水平。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例涉及到的部分试剂如下所示：
(1)Luria Bertani(LB)培养基配方：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，自来水定容到1L，自然pH。121℃，20min灭菌。
(2)0.2M磷酸二氢钠溶液：NaH2PO4·2H2O 15.6g，双蒸水定容到500mL。
(3)0.2M磷酸氢二钠溶液：Na2HPO4·12H2O 35.8g，双蒸水定容到500mL。
(4)PBS缓冲液(0.1M)：0.2M磷酸二氢钠溶液10mL，0.2M磷酸氢二钠溶液15mL，双蒸水定容到50mL。
(5)L-乳酸钠溶液(20mM)：60％乳酸钠0.374g，双蒸水定容到100mL。
(6)2,4-二硝基苯肼溶液(0.1％)：2,4-二硝基苯肼0.1g，1M稀盐酸100mL。
(7)NaOH溶液(4M)：NaOH 8g，双蒸水定容到50mL。
(8)质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司，胶回收试剂盒购自MAGEN公司，无缝克隆试剂盒选用全式金公司，DNA限制性内切酶与连接酶需用NEB公司。也可选用其他公司的同类产品代替。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。
以下实施例中的lox1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MEKIYQASTAEGAVDFINMRDLEEAAKEVIPKGGYGYIASGAGDTFTYRENERAFNHKLIIPHVLKDIELPDTRTTFSGDTLNAPIIMAPVAAHGLANVNAEKASAKGVARFGTIYTASSYASCTLEEIRAAGGEQAPQWFQFYMSKDDGINRDILSMAKRNGAKAIVLTADATVGGNRETDRRNGFTFPLAMPIVQAYQSGIGQTMDAVYGSSKQKLSPQDVAFIAKESDLPVYVKGVQSEEDVARALDAGAQGIWVSNHGGRQLDGGPAAFDSLQIVADAVAGRVPIVFDSGVRRGQHVFKAIASGADLVAIGRPVIYGLALGGSTGVQQVFDFFKKELEMVMQLAGTQTIADIRQAKLRDNHYM。
以下实施例中的lox7的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
MEFNNDPVCIKDLEKLAMKVMPGDAWGYYDSGANGEQTKRDNEASFSEYRLHPRMLRDVSQISTETTILGQKVKTPLGVAPCAMHKLAHPEGEAATSRAAVKNGSIMILSTYSTTSLEKVIAQGNGDTQYWMQLYVYQNRSVSEKLVRRAEKAGFKALVLTVDAPVLGRRLVDARNKFNPPPHLRLENFMEPEVVNDPAGYSSGLAQSTSETFGATFGANGDQSLSWANGISWLKSITSMPIIVKGILTAEDTRLAIEHGCAGVIVSNHGGRQLDGALATIDALPQVVEAAENKIEVYLDGGVRRGSDIFKALALGARAVFVARPVLWGLAYKGEHGAHLALDLLQKELELTMTLSGTTKVSEIDESYVYKPVNRWVRYAPGMNGNPKRLL AKL。
lox1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该序列是按照大肠杆菌密码子偏爱性进行优化后的核苷酸序列：
ATGGAAAAAATTTATCAGGCCTCAACCGCCGAAGGCGCCGTGGATTTTATTAATATGCGCGATCTGGAAGAAGCCGCCAAAGAAGTGATTCCGAAAGGTGGCTATGGCTATATTGCAAGCGGCGCCGGCGATACCTTTACCTATCGCGAAAATGAACGCGCATTTAATCATAAACTGATTATTCCGCATGTGCTGAAAGATATTGAACTGCCGGATACCCGTACCACCTTTTCTGGTGATACCCTGAATGCCCCGATTATTATGGCCCCGGTTGCAGCACATGGCTTAGCAAATGTGAATGCCGAAAAAGCCTCTGCCAAAGGTGTGGCACGCTTTGGCACGATTTATACCGCAAGTAGCTATGCCTCTTGTACCTTAGAAGAAATTCGCGCAGCCGGCGGTGAACAGGCCCCGCAGTGGTTTCAGTTTTATATGAGTAAAGATGATGGTATTAATCGCGATATTCTGTCAATGGCCAAACGTAATGGCGCCAAAGCAATTGTGCTGACCGCAGATGCCACCGTGGGCGGTAATCGTGAAACCGATCGTCGTAATGGCTTTACCTTTCCGTTAGCCATGCCGATTGTTCAGGCCTATCAGAGCGGCATTGGTCAGACAATGGATGCAGTGTATGGCTCTAGTAAACAGAAACTGAGTCCGCAGGATGTTGCATTTATTGCCAAAGAATCTGATCTGCCGGTGTATGTTAAAGGCGTTCAGAGCGAAGAAGATGTGGCACGTGCACTGGATGCAGGTGCACAGGGTATTTGGGTGTCTAATCATGGTGGTCGTCAGCTGGATGGCGGTCCGGCAGCCTTTGATAGCTTACAGATTGTTGCCGATGCAGTTGCCGGTCGCGTTCCGATTGTGTTTGATAGTGGCGTTCGTCGCGGTCAGCATGTGTTTAAAGCAATTGCCTCAGGTGCCGACCTGGTTGCAATTGGTCGTCCGGTTATTTATGGCTTAGCCCTGGGCGGCTCAACCGGCGTTCAGCAGGTGTTTGATTTTTTTAAAAAAGAACTGGAAATGGTTATGCAGTTAGCCGGCACCCAGACCATTGCAGATATTCGCCAGGCCAAATTACGTGATAATCATTATATGTAA。
lox7基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该序列是按照大肠杆菌密码子偏爱性进行优化后的核苷酸序列：
ATGGAATTTAATAACGATCCCGTATGTATAAAAGATTTAGAGAAGCTGGCTATGAAAGTGATGCCGGGTGACGCGTGGGGATACTACGATTCTGGTGCGAACGGCGAGCAGACCAAGCGCGACAACGAAGCGTCCTTCAGCGAGTATCGTCTGCATCCGCGTATGCTGCGTGATGTTTCTCAGATTAGCACCGAAACCACGATTCTGGGTCAGAAGGTGAAAACCCCGCTGGGCGTGGCACCGTGTGCAATGCACAAACTCGCGCACCCGGAAGGTGAAGCTGCAACGAGCCGCGCTGCGGTTAAGAACGGCTCCATCATGATTTTGAGCACGTACAGTACTACGAGCCTAGAGAAGGTGATCGCCCAAGGTAATGGCGACACCCAGTATTGGATGCAGCTGTATGTATACCAAAACCGTAGCGTTTCGGAGAA GCTGGTGCGCCGCGCTGAAAAGGCGGGCTTTAAAGCCTTGGTGTTAACCGTTGATGCCCCAGTCCTGGGGCGTCGTCTCGTGGACGCCCGTAATAAGTTCAACCCACCGCCTCATCTCCGCTTGGAGAATTTTATGGAACCGGAAGTTGTTAATGATCCGGCAGGTTACTCGAGCGGCCTGGCGCAAAGCACCTCCGAGACTTTCGGTGCGACCTTTGGTGCGAACGGTGACCAGAGCCTGTCTTGGGCAAACGGCATCAGCTGGCTGAAAAGCATCACCTCTATGCCGATTATTGTCAAGGGTATTCTGACCGCAGAAGATACCCGTCTGGCGATCGAGCACGGGTGCGCTGGCGTTATTGTTTCCAACCATGGTGGTCGTCAGCTGGACGGCGCGTTGGCGACGATCGACGCGCTGCCGCAAGTGGTGGAAGCCGCGGAGAACAAAATCGAGGTGTACCTGGACGGTGGTGTTCGCAGAGGCAGCGATATCTTCAAGGCTTTGGCGCTTGGCGCGCGTGCTGTTTTTGTTGCTCGTCCGGTTCTTTGGGGTCTGGCCTATAAAGGCGAACACGGCGCACACCTGGCGCTGGACTTGCTGCAAAAAGAACTGGAGCTGACCATGACCCTGTCAGGTACAACCAAGGTGTCCGAGATCGATGAAAGCTATGTGTACAAACCGGTAAATCGTTGGGTCCGCTATGCACCGGGTATGAACGGCAATCCGAAACGTCTGCTGGCTAAATTGTAA。
启动子pHCE的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：
GATCTCTCCTTCACAGATTCCCAATCTCTTGTTAAATAACGAAAAAGCATCAATCAAAACGGCGGCATGTCTTTCTATATTCCAGCAATGTTTTATAGGGGACATATTGATGAAGATGGGTATCACCTTAGTAAAAAAAGAATTGCTATAAGCTGCTCTTTTTTGTTCGTGATATACTGATAATAAATTGAATTTTCACACTTCTGGAAAAAGGAGATATACC。
终止子rrnBT1T2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：
ATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTT。
实施例1乳酸氧化酶活力测定
乳酸氧化酶氧化L-乳酸生成丙酮酸，检测产物丙酮酸的产率，即为乳酸氧化酶的活力。
检测样：50μL PBS缓冲液+40μL L-乳酸钠溶液+10μL酶液混匀，37℃水浴保温20min；加入50μL 2,4-二硝基苯肼溶液，水浴保温10min；加入50μL氢氧化钠溶液，水浴保温10min；510nm比色读值A1。
对照样：50μL PBS缓冲液+40μL L-乳酸钠溶液，37℃水浴保温20min；加入50μL 2,4-二硝基苯肼溶液+10μL酶液混匀，水浴保温10min；加入50μL氧化钠溶液，水浴保温10min；510nm比色读值A2。
(A1-A2)即为实际读数值，对照丙酮酸标准曲线(如图1所示)，计算酶活。
丙酮酸浓度(mM)：y＝0.2904x-0.0001；
酶活力单位定义：1分钟内生成1nmol丙酮酸所需的酶量；
酶活力(U/mL)＝y*0.1*1000/(20min*0.01mL)。
实施例2构建表达模块pHCE-lox1-rrnBT1T2
(1)利用引物pHCE-F和pHCE-R，以含SEQ ID NO.5所示启动子pHCE的核苷酸序列的人工合成DNA(委托上海捷瑞生物工程有限公司合成)为模板扩增pHCE，238bp。
pHCE-F(SEQ ID NO.7)：
5’-CAAACAAAGCTTGATCTCTCCTTCACAGATTCC-3’；
pHCE-R(SEQ ID NO.8)：
5’-CATGGTATATCTCCTTTTTCCAGAAGTGTGAAA-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；引物(10μM each)1.5μL；人工合成DNA模板(5ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃10sec，运行30个循环；68℃5min。
(2)利用引物lox1-1和lox1-2，以含SEQ ID NO.3所示lox1基因核苷酸序列的人工合成DNA(委托上海捷瑞生物工程有限公司合成)为模板扩增lox1，1146bp。
lox1-1(SEQ ID NO.9)：
5’-TTCTGGAAAAAGGAGATATACCATGGAAAAAATTTATCAGGCCTC-3’；
lox1-2(SEQ ID NO.10)：
5’-GACTGAGCCTTTCGTTTTATTTACATATAATGATTATCACGTAATTTG-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；引物(10μM each)1.5μL；人工合成DNA模板(5ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃35sec，运行30个循环；68℃5min。
(3)利用引物rrnBT1T2-1和rrnBT1T2-2，以含SEQ ID NO.6所示终止子rrnBT1T2的核苷酸序列的人工合成DNA(委托上海捷瑞生物工程有限公司合成)为模板扩增rrnBT1T2，218bp。
rrnBT1T2-1(SEQ ID NO.11)：
5’-TAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAG-3’；
rrnBT1T2-2(SEQ ID NO.12)：
5’-TAAATCAAGCTTAAAAGGCCATCCGTCAGGATGGC-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；引物(10μM each)1.5μL；人工合成DNA模板(5ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃10sec，运行30个循环；68℃5min。
(4)利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，将pHCE、lox1、rrnBT1T2三个序列连接起来，即为表达模块pHCE-lox1-rrnBT1T2(图2中A)，序列如SEQ ID NO.13所示：
CAAACAAAGCTTGATCTCTCCTTCACAGATTCCCAATCTCTTGTTAAATAACGAAAAAGCATCAATCAAAACGGCGGCATGTCTTTCTATATTCCAGCAATGTTTTATAGGGGACATATTGATGAAGATGGGTATCACCTTAGTAAAAAAAGAATTGCTATAAGCTGCTCTTTTTTGTTCGTGATATACTGATAATAAATTGAATTTTCACACTTCTGGAAAAAGGAGATATACCATGGAAAAAATTTATCAGGCCTCAACCGCCGAAGGCGCCGTGGATTTTATTAATATGCGCGATCTGGAAGAAGCCGCCAAAGAAGTGATTCCGAAAGGTGGCTATGGCTATATTGCAAGCGGCGCCGGCGATACCTTTACCTATCGCGAAAATGAACGCGCATTTAATCATAAACTGATTATTCCGCATGTGCTGAAAGATATTGAACTGCCGGATACCCGTACCACCTTTTCTGGTGATACCCTGAATGCCCCGATTATTATGGCCCCGGTTGCAGCACATGGCTTAGCAAATGTGAATGCCGAAAAAGCCTCTGCCAAAGGTGTGGCACGCTTTGGCACGATTTATACCGCAAGTAGCTATGCCTCTTGTACCTTAGAAGAAATTCGCGCAGCCGGCGGTGAACAGGCCCCGCAGTGGTTTCAGTTTTATATGAGTAAAGATGATGGTATTAATCGCGATATTCTGTCAATGGCCAAACGTAATGGCGCCAAAGCAATTGTGCTGACCGCAGATGCCACCGTGGGCGGTAATCGTGAAACCGATCGTCGTAATGGCTTTACCTTTCCGTTAGCCATGCCGATTGTTCAGGCCTATCAGAGCGGCATTGGTCAGACAATGGATGCAGTGTATGGCTCTAGTAAACAGAAACTGAGTCCGCAGGATGTTGCATTTATTGCCAAAGAATCTGATCTGCCGGTGTATGTTAAAGGCGTTCAGAGCGAAGAAGATGTGGCACGTGCACTGGATGCAGGTGCACAGGG TATTTGGGTGTCTAATCATGGTGGTCGTCAGCTGGATGGCGGTCCGGCAGCCTTTGATAGCTTACAGATTGTTGCCGATGCAGTTGCCGGTCGCGTTCCGATTGTGTTTGATAGTGGCGTTCGTCGCGGTCAGCATGTGTTTAAAGCAATTGCCTCAGGTGCCGACCTGGTTGCAATTGGTCGTCCGGTTATTTATGGCTTAGCCCTGGGCGGCTCAACCGGCGTTCAGCAGGTGTTTGATTTTTTTAAAAAAGAACTGGAAATGGTTATGCAGTTAGCCGGCACCCAGACCATTGCAGATATTCGCCAGGCCAAATTACGTGATAATCATTATATGTAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTAAGCTTGATTTA。
实施例3构建表达模块pHCE-lox7-rrnBT1T2
(1)利用引物lox7-1和lox7-2，以含SEQ ID NO.4所示lox7基因核苷酸序列的人工合成DNA(委托上海捷瑞生物工程有限公司合成)为模板扩增lox7，1227bp。
lox7-1(SEQ ID NO.14)：
5’-TTCTGGAAAAAGGAGATATACCATGGAATTTAATAACGATCC-3’；
lox7-2(SEQ ID NO.15)：
5’-GACTGAGCCTTTCGTTTTATTTACAATTTAGCCAGCAGACGTT-3’。
扩增反应体系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO4 3μL；引物(10μM each)1.5μL；人工合成DNA模板(5ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃35sec，运行30个循环；68℃5min。
(2)利用Vazyme One Step Clone Kit进行同源重组，将pHCE、lox7、rrnBT1T2三个序列连接起来，即为表达模块pHCE-lox7-rrnBT1T2(图2中B)，序列如SEQ ID NO.16所示：
CAAACAAAGCTTGATCTCTCCTTCACAGATTCCCAATCTCTTGTTAAATAACGAAAAAGCATCAATCAAAACGGCGGCATGTCTTTCTATATTCCAGCAATGTTTTATAGGGGACATATTGATGAAGATGGGTATCACCTTAGTAAAAAAAGAATTGCTATAAGCTGCTCTTTTTTGTTCGTGATATACTGATAATAAATTGAATTTTCACACTTCTGGAAAAAGGAGATATACCATGGAATTTAATAACGATCCCGTATGTATAAAAGATTTAGAGAAGCTGGCTATGAAAGTGATGCCGGGTGACGCGTGGGGATACTACGATTCTGGTGC GAACGGCGAGCAGACCAAGCGCGACAACGAAGCGTCCTTCAGCGAGTATCGTCTGCATCCGCGTATGCTGCGTGATGTTTCTCAGATTAGCACCGAAACCACGATTCTGGGTCAGAAGGTGAAAACCCCGCTGGGCGTGGCACCGTGTGCAATGCACAAACTCGCGCACCCGGAAGGTGAAGCTGCAACGAGCCGCGCTGCGGTTAAGAACGGCTCCATCATGATTTTGAGCACGTACAGTACTACGAGCCTAGAGAAGGTGATCGCCCAAGGTAATGGCGACACCCAGTATTGGATGCAGCTGTATGTATACCAAAACCGTAGCGTTTCGGAGAAGCTGGTGCGCCGCGCTGAAAAGGCGGGCTTTAAAGCCTTGGTGTTAACCGTTGATGCCCCAGTCCTGGGGCGTCGTCTCGTGGACGCCCGTAATAAGTTCAACCCACCGCCTCATCTCCGCTTGGAGAATTTTATGGAACCGGAAGTTGTTAATGATCCGGCAGGTTACTCGAGCGGCCTGGCGCAAAGCACCTCCGAGACTTTCGGTGCGACCTTTGGTGCGAACGGTGACCAGAGCCTGTCTTGGGCAAACGGCATCAGCTGGCTGAAAAGCATCACCTCTATGCCGATTATTGTCAAGGGTATTCTGACCGCAGAAGATACCCGTCTGGCGATCGAGCACGGGTGCGCTGGCGTTATTGTTTCCAACCATGGTGGTCGTCAGCTGGACGGCGCGTTGGCGACGATCGACGCGCTGCCGCAAGTGGTGGAAGCCGCGGAGAACAAAATCGAGGTGTACCTGGACGGTGGTGTTCGCAGAGGCAGCGATATCTTCAAGGCTTTGGCGCTTGGCGCGCGTGCTGTTTTTGTTGCTCGTCCGGTTCTTTGGGGTCTGGCCTATAAAGGCGAACACGGCGCACACCTGGCGCTGGACTTGCTGCAAAAAGAACTGGAGCTGACCATGACCCTGTCAGGTACAACCAAGGTGTCCGAGATCGATGAAAGCTATGTGTACAAACCGGTAAATCGTTGGGTCCGCTATGCACCGGGTATGAACGGCAATCCGAAACGTCTGCTGGCTAAATTGTAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTAAGCTTGATTTA。
实施例4将表达模块转化大肠杆菌Nissle 1917
用DNA限制性内切酶HindIII(AAGCTT)，消化大肠杆菌pUC19质粒，同时也消化表达模块pHCE-lox1-rrnBT1T2和pHCE-lox7-rrnBT1T2。用DNA连接酶将消化后的质粒与消化后的表达模块相连，构建乳酸氧化酶表达质粒(如图2)。这里所用的质粒主要可以在大肠杆菌中复制，所以，除了pUC19外，可以用以下任一种质粒：pUC18、pUC119、pBR322、pET22a、pET28a，但不仅仅限于这些质粒。
将乳酸氧化酶表达质粒转化大肠杆菌Nissle 1917，在37℃、200rpm的培养条件下获得表达乳酸氧化酶的益生菌工程菌株LOX1和LOX7。
实施例5工程菌株生产乳酸氧化酶
将获得的工程菌株接种于LB培养基中37℃培养48小时。发酵罐培养方法参照大肠杆菌培养方案。发酵结束后，收集菌体匀浆破碎，12500rpm转离心10min，取上清，即为乳酸氧化酶粗酶液。测量乳酸氧化酶粗酶液的酶活(图3)。与本发明未改造的大肠杆菌Nissle19170对照组相比，工程菌株产生出大量的乳酸氧化酶。
将所述工程菌株生产的乳酸氧化酶粗酶液进行烘干，加入通用的保护剂，制成固体乳酸氧化酶粉，酶粉活力达300000U/g。
实施例6模拟瘤胃亚急性酸中毒条件，乳酸氧化酶对L-乳酸转化率
(1)反应体系：配制10mM L-乳酸钠溶液(调节pH为5.0)。
(2)乳酸氧化酶灭活处理：2.5g酶加入双蒸水定容至100mL。分装至50mL离心管中，每管20mL，2管保存作为厌氧试验活酶溶液，其余3管100℃沸水浴中处理10min，使酶灭活后，2管作为空白组，1管作为起始反应体系溶液保存待测。
(3)厌氧试验组：20mL乳酸溶液，通入1min CO2，后加入活酶溶液20mL，再通入CO24min，迅速封盖，保证瓶中厌氧环境。
(4)厌氧对照组：20mL乳酸溶液，通入1min CO2，加入灭活酶溶液20mL，再通入CO24min，迅速封盖，保证瓶中厌氧环境。
(5)原始溶液：20mL乳酸溶液，加入灭活酶溶液20mL。
试验组和对照组通气完成后放入震荡摇床，37℃，220rpm反应1小时。原始溶液封存，用于测定起始反应体系乳酸溶液浓度。
(6)反应完成后，12000rpm离心10min，吸取上清液，进行乳酸浓度测定。
(7)乳酸转化率计算：
原始溶液乳酸浓度测定为4.96mM，厌氧空白组乳酸浓度为4.77mM，与反应体系设定5mM浓度基本一致，说明在该反应体系下酶灭活对照试验成功。在厌氧试验组条件下，乳酸氧化酶催化反应1h后测定剩余乳酸含量为：0.53mM(LOX1酶制剂处理)和0.72mM(LOX7酶制剂处理)通过公式计算L-乳酸转化率。
结果显示，乳酸转化率为：89％(LOX1酶制剂处理)和85％(LOX7酶制剂处理)。
综上所述，本发明公开了乳酸氧化酶制剂在反刍动物中的应用。本专利公开的两个乳酸氧化酶酶制剂可以在模拟反刍动物瘤胃中的急性酸中毒条件下，高效转化的乳酸，显著降低乳酸浓度，改善急性酸中毒。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.乳酸氧化酶在制备急性酸中毒条件下降解反刍动物瘤胃中的乳酸产品中的应用，其特征在于，所述乳酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.乳酸氧化酶的编码基因在制备急性酸中毒条件下降解反刍动物瘤胃中的乳酸产品中的应用，其特征在于，所述乳酸氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.包含权利要求2中所述的编码基因的表达载体在制备急性酸中毒条件下降解反刍动物瘤胃中的乳酸产品中的应用。
4.包含权利要求3中所述的表达载体的益生菌在制备急性酸中毒条件下降解反刍动物瘤胃中的乳酸产品中的应用，其特征在于，所述益生菌包括大肠杆菌Nissle 1917。
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