JPH04346789A

JPH04346789A - α−クルクメンの製造方法

Info

Publication number: JPH04346789A
Application number: JP14805391A
Authority: JP
Inventors: Hiromi Kubota; 浩美久保田; Hirobumi Takigawa; 博文滝川; Yoshiaki Fujikura; 芳明藤倉; Susumu Ito; 進伊藤
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1991-05-24
Filing date: 1991-05-24
Publication date: 1992-12-02

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、α−クルクメンの新規
な製造方法に関し、更に詳細には、ロドコッカス属に属
する微生物を利用するα−クルクメンの製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】次の構造式（Ｉ）

【化１】で表されるα−クルクメンは、天然には、ショウガ科植
物であるキョウオウ（Ｃｕｒｕｃｕｍａ　ａｒｏｍａｔ
ｉｃａ　Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ）などの根茎に精油成分と
して存在し、分留精製などの方法により製造されている
。　このα−クルクメンの化学合成法としては、グリニ
ャー試薬を用いて６−メチル−５−ヘプテン−２−オン
（　Ｓｔａｎ　ｅｔａｌ．，　Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅ
ｍ．，　４０（２２），　３３０６（１９７５））ある
いは５−トリメチルシリル−２−シクロヘキセノン（Ａ
ｓａｏｋａ　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　
４４（１５），４７５７（１９８８））より合成する方
法が知られているが、工業的に満足し得る手法とは言え
なかった。

【０００３】更に、酵素あるいは微生物菌体を利用して
α−クルクメンを生産する方法は、従来知られていなか
った。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来、化学合成法によ
っては種々の副反応が生じ、選択的に目的化合物が得ら
れない場合、酵素あるいは微生物菌体等の生体触媒を利
用した方法を用いると、選択的反応が可能である場合も
多いことが知られており、上記α−クルクメンについて
も、生体触媒を利用することにより、選択的に製造する
方法の開発が求められていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、次の構造
式（ＩＩ）

【化２】で表されるα−セドレンを選択的かつ高収率でα−クル
クメンに変換することのできる微生物について、鋭意探
索を続けていたところ、和歌山県内で採取した土壌中か
ら得られたロドコッカス属に属する微生物が、当該性質
を有するものであることを見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち本発明は、ロドコッカス（Ｒｈｏ
ｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物をα−セドレンに
作用させることを特徴とするα−クルクメンの製造方法
を提供するものである。

【０００７】本発明方法において用いられる、ロドコッ
カス属に属する微生物の代表的な菌株であるロドコッカ
ス・エスピー　ＫＳＭ−７３５８株は、以下に示すよう
な菌学的性質を有する。

【０００８】菌　　学　　的　　性　　質　　：（１）
形態的性質菌体の大きさが　０．８〜１．０×１．０〜
１２μｍの桿菌で、多形性を有する。すなわち、培養初
期には分枝した菌糸を作り、その後断裂し、短桿菌様と
なる。また、本株は非運動性で、鞭毛はない。　胞子は
認められず、グラム陽性で、抗酸性はない。

【０００９】（２）培養的性質（ａ）肉汁寒天平面培養；良好に生育し、乳白色不透明
の、表面粗造で円錐型隆起のある集落を形成し、培養後
期には、肌色ないしは淡いオレンジ色を呈する。　集落
の形状は円形縮毛状で周縁は波状である。（ｂ）肉汁寒天斜面培養；良好に生育し、乳白色を呈す
る。（ｃ）肉汁液体培養；生育は弱いが、培養液の表面上層
であっても下層であっても生育する。（ｄ）肉汁ゼラチン穿刺培養；良好に生育する。　液化
は認められない。（ｅ）リトマスミルク；上層のみ液化する。　リトマス
色素を紫色からピンク色に変化させ、一部脱色反応が認
められる。

【００１０】（３）生理学的性質（ａ）　硝酸塩の還元；　　　　　　　　　　　　　　
　　　陰性（硝酸塩肉汁培地）（ｂ）　脱窒反応；　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　陰性（ｃ）　ＭＲテスト；　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　陰性（ｄ）　ＶＰテスト；　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　陰性（ｅ）　イン
ドール生成；　　　　　　　　　　　　　　　陰性（ｆ
）　硫化水素の生成；　　　　　　　　　　　　　　　
弱い陽性（ｇ）　澱粉加水分解；　　　　　　　　　　
　　　　　　　陰性（ｈ）　クエン酸の利用；コーサー培地：　　　　　　　　　　　　　　　陽性ク
リステンセン培地：　　　　　　　　　陽性（ｉ）　硝
酸塩の利用；　　　　　　　　　　　　　　　　　陽性
（ｊ）　アンモニウム塩の利用；　　　　　　　　　陽
性（ｋ）　色素の生成；キングＡ培地：　　　　　　　　　　　　　　　陰性キ
ングＢ培地：　　　　　　　　　　　　　　　陰性（ｌ
）　ウレアーゼ；　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　陽性（ｍ）　オキシダーゼ；　　　　　　　　　　
　　　　　　　陰性（ｎ）　カタラーゼ；　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　陽性（ｏ）　生育ｐＨ範囲
；生　育　ｐ　Ｈ　　　　　　　　　　３〜　１０生育至
適ｐＨ　　　　　　　　　５〜９．０（ｐ）　生育温度
範囲；生　育　温　度　　　　　　　　１０〜３７℃至適生育
温度　　　　　　　２５〜３０℃（ｑ）　酸素に対する
態度；好気的であるが、静置条件下でも充分生育できる
。（ｒ）　ＯＦテスト；弱い酸化型（アンドレード指示薬
では判別できるが、ＢＴＢ指示薬を用いた場合は、７日
培養しても変化は認められない）（ｓ）　ＮａＣｌ含有培地における生育食塩濃度が、５
％および７％のいずれにおいても生育する。

【００１１】（ｔ）炭素源の利用性：Ｌ−アラビノース　　　　　　　　　　　−Ｄ−キシロ
ース　　　　　　　　　　　　　−Ｄ−グルコース　　
　　　　　　　　　　　＋Ｄ−マンノース　　　　　　
　　　　　　　＋（弱い）Ｄ−フラクトース　　　　　
　　　　　　＋Ｄ−ガラクトース　　　　　　　　　　
　−マルトース　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
（弱い）シュクロース　　　　　　　　　　　　　　　
＋ラクトース　　　　　　　　　　　　　　　　　−ト
レハロース　　　　　　　　　　　　　　　＋（弱い）
Ｄ−ソルビトール　　　　　　　　　　　＋Ｄ−マンニ
トール　　　　　　　　　　　＋イノシトール　　　　
　　　　　　　　　　　＋グリセロール　　　　　　　
　　　　　　　　＋（弱い）スターチ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　−Ｄ−リボース　　　　　　　
　　　　　　　　＋ただし、＋；利用する、−；利用し
ない。

【００１２】（４）化学分類学的性質（ａ）　グリコレートテストグリコリル型（ｂ）　細胞壁の架橋アミノ酸ｍｅｓｏ−２，６−ジアミノピメリン酸（ｃ）　細胞壁
構成糖アラビノース、ガラクトースが検出されるが、キシロー
スは検出されない。（ｄ）　メナキノンシステムＭＫ−８（Ｈ２）

【００１３】以上の菌学的性質を、バージーズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａ
ｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第２巻（１９８
６）に照らし、本菌株の分類学的位置を求めたところ、
ＫＳＭ−７３５８株はロドコッカス属に属する微生物で
あることが判明した。そして、ＫＳＭ−７３５８株の上
記菌学的性質は、公知のロドコッカス属微生物の何れと
も異なっているので、本発明者らはこれを新規な菌株と
判断し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した（
受託番号　微工研菌寄第１２０３９号；ＦＥＲＭＰ−１
２０３９）。

【００１４】上記のロドコッカス属に属する微生物を用
いて、α−セドレンをα−クルクメンに変換する方法と
しては、α−セドレンを含む培養培地中で当該微生物を
培養する方法が挙げられる。

【００１５】本発明微生物を培養させるために用いる培
養培地としては、炭素源として、フラクトース、マルト
ース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、グ
リセロール、グルコース、シュクロースなどの糖類、セ
ダー油、セドレンなどのセスキテルペンまたはｎ−アル
カンなど、窒素源としてペプトン、酵母エキス、尿素、
硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、アミノ酸などを、
無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化カルシウムなどや、また必要に応じてＭｎ２＋，Ｚ
ｎ２＋，　Ｎｉ２＋等の金属塩、ビオチン、チアミンな
どのビタミン類等を適宜加えた培地が挙げられる。

【００１６】本発明方法を実施するには、ロドコッカス
属に属する微生物が生育し得る培地にα−セドレンを添
加し、調製された培養培地にロドコッカス属に属する微
生物を接種し、目的物に応じた所定の期間培養すれば良
い。この培養においては、α−セドレンが減少するに伴
ってα−クルクメンが生産されるので実験的に、α−ク
ルクメンの生産量が最大となる時期を求め、この時点で
培養を中止し、目的物であるα−クルクメンを採取すれ
ばよい。

【００１７】本発明方法による培養の条件は、特に制限
はないが、一般には、２５〜３０℃程度の温度、５．０
〜９．０程度のｐＨで、振盪攪拌、通気撹拌または機械
攪拌を行ないつつ実施すればよい。　また、α−セドレ
ンに対する微生物の接種量も特に制約はないが、例えば
、α−セドレン０．５％を含む培地に、１白金耳接種す
れば十分である。

【００１８】叙上の如くして得られた培養物から目的物
であるα−クルクメンを分離、採取するには、公知の精
製手段、例えば、カラムクロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー、再結晶等を単独または組み合わせ
て用いれば良い。

【００１９】

【発明の効果】本発明方法によれば、従来の方法では副
生成物を含んだ状態でしか得られなかったα−クルクメ
ンを効率よく、製造することが可能となる。また、従来
生体触媒反応では得ることのできなかったα−クルクメ
ンを温和な条件下で製造することが可能となる。

【００２０】

【実施例】次に実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明す
る。実　施　例　　１和歌山県勝浦市の土壌を薬匙１杯（約０．５〜１ｇ）取
り、これを１０ｍｌの滅菌脱イオン水に懸濁後、適当に
希釈する。　後記培地Ａ、１０ｍｌを含む大型試験管に
この希釈物を添加し、３０℃で、５日間振盪培養するこ
とにより集積培養を行なった。　この培養物を、培地Ａ
に１．５％寒天を加えて調製した平板培地に塗布し、α
−セドレン資化能を有する菌株を分離した。分離したα
−セドレン資化性菌株を、再度培地Ａ　１０ｍｌを含む
大型試験管に接種し、３０℃で７日間振盪培養を行なっ
た。　得られた培養液をヘキサンで抽出した後、ヘキサ
ン可溶画分をガスクロマトグラフィーに付し、生産物の
定量を行なった。　その結果、α−セドレンを資化し、
α−クルクメンを生産する菌株としてＫＳＭ−７３５８
株を得た。

【００２１】［　培　　地　Ａ　］　　　　　　Ｎａ２ＳＯ４　　　　　　　　　　　　　
　　　０．７１ｇ　　　　　　ＮＨ４ＮＯ３　　　　　
　　　　　　　　　　　３．５　　ｇ　　　　　　Ｆｅ
Ｃｌ３・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　０．０１ｇ（別滅
菌）　　　　　　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　
　　０．１７ｇ（別滅菌）　　　　　　ＣａＣｌ２・２
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　Ｏ．１　　ｇ（別滅菌）　　
　　　　α−セ　ド　レ　ン　　　　　　　　　　　　
１０　　ｇ（無菌的に別添加）　　　　───────
──────────────────────　　　
　　　５０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７）で全量を１
ｌとする。

【００２２】実　施　例　　２実施例１で得たＫＳＭ−７３５８株を下記培地Ｂの斜面
培地で、３日間、３０℃で培養した。　これを５００ｍ
ｌ容坂口フラスコ中の、０．５％α−セドレンを含有す
る後記培地Ｃ　５０ｍｌに接種した。　３０℃で２日間
培養を行ない、これを前培養とした。　この前培養液　
０．５ｍｌを０．５％α−セドレンを含む培地Ｃ５０ｍ
ｌ（５００ｍｌ容坂口フラスコ中）に接種し、３０℃で
６日間振盪培養を行なった。得られた培養液をヘキサン
で抽出し（図１）、ヘキサン可溶画分を液体クロマトグ
ラフィーで精製した後、分析、同定を行い、これをα−
クルクメンであると決定した。　ＥＩ−ＭＳスペクトル
を図２に、ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）を図３に、１Ｈ−
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）を図４に、１３Ｃ
−ＮＭＲを図５にそれぞれ示す。

【００２３】［　培　　地　Ｂ　］　　　　　　ポリペプトン（カゼインペプトン）　　　
　　　１７ｇ　　　　　　ポリペプトン　Ｓ　（大豆ペ
プトン）　　　　　　　　３ｇ　　　　　　Ｋ２ＨＰＯ
４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２．５ｇ　　　　　　グルコース　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．５ｇ　
　　　　　ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ　　　　　　寒
　　　天　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１５ｇ　　　　────────
─────────────────────　　　　
　　精製水で全量を１ｌとする（滅菌後のｐＨは７．１
〜７．５）。

【００２４】［　培　　地　Ｃ　］　　　　　　Ｎａ２ＳＯ４　　　　　　　　　　　　　
　　　０．７１ｇ　　　　　　ＮＨ４ＮＯ３　　　　　
　　　　　　　　　　　３．５　　ｇ　　　　　　Ｆｅ
Ｃｌ３・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　０．０１ｇ（別滅
菌）　　　　　　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　
　　０．１７ｇ（別滅菌）　　　　　　ＣａＣｌ２・２
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　Ｏ．１　　ｇ（別滅菌）　　
　　───────────────────────
────　　　　　　５０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ　
７）で全量を１ｌとする。

【００２５】実　施　例　　３実施例２と同様の操作を行い、６日間振盪培養を行った
。得られた培養物をヘキサンで抽出し、ヘキサン可溶画
分をガスクロマトグラフィーで定量した結果α−クルク
メン３４ｍｇを得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　α−クルクメンのガスクロマトグラフ

【図
２】　　α−クルクメンのＥＩ−ＭＳスペクトル

【図３
】　　α−クルクメンのＩＲスペクトル

【図４】　　α
−クルクメンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル

【図５】　　α
−クルクメンの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル以上

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属に属する微生物をα−セドレンに作用させること
を特徴とするα−クルクメンの製造方法。
【請求項２】　　ロドコッカス属に属する微生物が、ロ
ドコッカス・エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ
．）ＫＳＭ−７３５８株である請求項第１項記載のα−
クルクメンの製造方法。