JPH07121223B2 - Ｄ−セレノシスチン分解酵素およびその製造方法 - Google Patents
Ｄ−セレノシスチン分解酵素およびその製造方法Info
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- JPH07121223B2 JPH07121223B2 JP3967287A JP3967287A JPH07121223B2 JP H07121223 B2 JPH07121223 B2 JP H07121223B2 JP 3967287 A JP3967287 A JP 3967287A JP 3967287 A JP3967287 A JP 3967287A JP H07121223 B2 JPH07121223 B2 JP H07121223B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＤ−セレノシスチンのＤ体に作用するＤ−セレ
ノシスチン分解酵素およびその製造方法に関するもので
ある。
ノシスチン分解酵素およびその製造方法に関するもので
ある。
（従来の技術） 近年，老化防止などとの関連から必須微量元素としての
セレンが注目されはじめ，グルタチオン・パーオキシダ
ーゼなどのセレンを必須構成成分とする酵素が数種発見
され，その機構や生合成機構が調べられている。しかし
ながらセレンを含有する生体物質については簡便で有効
な検出定量法がなかったため生理的意義に関する知見は
乏しいものであった。これら生体物質のうちセレノシス
テンの還元型は蛋白質アミノ酸として，また放射線防御
剤や抗癌ならびに抗炎症剤として注目を浴びているアミ
ノ酸である。セレノシスチンを定量する従来の方法とし
ては，アミノ酸分析機による方法が知られているが，装
置が高価であり，さらに試料の前処理が煩雑で分析に長
時間を要するため日常の操作としては使用し難いもので
あった。さらに，セレノシスチンにはＬ体,D体，メゾ体
という３種の光学異性体が存在するが，アミノ酸分析機
による方法ではこれらを区別なく全量として定量してし
まうという欠点も有している。また，従来知られている
セレノシスチンに作用する酵素はジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Journal of Biologica
l Chemistry）257巻,4386〜4391頁（1982年）に記載さ
れているように，還元型セレノシスチンのＬ体にのみ作
用し，その酸化型やメゾ体に作用しないものであった
が，この酵素法は試料の前処理も時に要せず，操作も比
較的簡単に行えるという利点を有している。
セレンが注目されはじめ，グルタチオン・パーオキシダ
ーゼなどのセレンを必須構成成分とする酵素が数種発見
され，その機構や生合成機構が調べられている。しかし
ながらセレンを含有する生体物質については簡便で有効
な検出定量法がなかったため生理的意義に関する知見は
乏しいものであった。これら生体物質のうちセレノシス
テンの還元型は蛋白質アミノ酸として，また放射線防御
剤や抗癌ならびに抗炎症剤として注目を浴びているアミ
ノ酸である。セレノシスチンを定量する従来の方法とし
ては，アミノ酸分析機による方法が知られているが，装
置が高価であり，さらに試料の前処理が煩雑で分析に長
時間を要するため日常の操作としては使用し難いもので
あった。さらに，セレノシスチンにはＬ体,D体，メゾ体
という３種の光学異性体が存在するが，アミノ酸分析機
による方法ではこれらを区別なく全量として定量してし
まうという欠点も有している。また，従来知られている
セレノシスチンに作用する酵素はジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Journal of Biologica
l Chemistry）257巻,4386〜4391頁（1982年）に記載さ
れているように，還元型セレノシスチンのＬ体にのみ作
用し，その酸化型やメゾ体に作用しないものであった
が，この酵素法は試料の前処理も時に要せず，操作も比
較的簡単に行えるという利点を有している。
（発明が解決しようとする問題点） このように，酵素を用いるセレノシスチンの定量では，
特別な分析装置を必要とせず，簡便な比色計で定量可能
であるという長所を有するが,L体のセレノシスチンを定
量するには，メルカプトエタノールなどの還元剤で還元
後公知のセレノシスチンβ−リアーゼという酵素で定量
することで可能であるものの，セレノシスチンのＤ体は
今まで知られている酵素を組み合わせても定量できない
という問題点があり，これまで,D体のセレノシスチンを
酵素法で定量することは知られていなかった。
特別な分析装置を必要とせず，簡便な比色計で定量可能
であるという長所を有するが,L体のセレノシスチンを定
量するには，メルカプトエタノールなどの還元剤で還元
後公知のセレノシスチンβ−リアーゼという酵素で定量
することで可能であるものの，セレノシスチンのＤ体は
今まで知られている酵素を組み合わせても定量できない
という問題点があり，これまで,D体のセレノシスチンを
酵素法で定量することは知られていなかった。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは，このような問題点を解決すべく鋭意研究
した結果，広く微生物を検索してクロストリジウム属に
属する細菌にセレノシスチンのＤ体に作用する性質を有
するＤ−セレノシスチン分解酵素（Ｄ−セレノシスチン
α，β−リアーゼ）が存在することを見い出し，本発明
を完成した。
した結果，広く微生物を検索してクロストリジウム属に
属する細菌にセレノシスチンのＤ体に作用する性質を有
するＤ−セレノシスチン分解酵素（Ｄ−セレノシスチン
α，β−リアーゼ）が存在することを見い出し，本発明
を完成した。
すなわち，本発明は，次の（イ）〜（ホ）の理化学的性
質を有するＤ−セレノシスチン分解酵素およびクロスト
リジウム属に属する細菌を培養し，培養物から次の
（イ）〜（ホ）の理化学的性質を有するＤ−セレノシス
チン分解酵素を採取することを特徴とするＤ−セレノシ
スチン分解酵素の製造方法を要旨とするものである。
質を有するＤ−セレノシスチン分解酵素およびクロスト
リジウム属に属する細菌を培養し，培養物から次の
（イ）〜（ホ）の理化学的性質を有するＤ−セレノシス
チン分解酵素を採取することを特徴とするＤ−セレノシ
スチン分解酵素の製造方法を要旨とするものである。
（イ）作用 下記反応を触媒する。
（ロ）基質特異性 Ｄ−セレノシスチンに高い特異性を有する。
（ハ）至適pH 約pH7.0〜8.5（30℃）である。
（ニ）作用適温の範囲 pH8.0で20℃から40℃までの温度上昇とともに活性は増
大する。
大する。
（ホ）分子量 TSKG3000SWゲルクロマトグラフィー（東洋曹達社製）に
よる測定で約7.2万である。
よる測定で約7.2万である。
次に本発明のＤ−セレノシスチン分解酵素の理化学的性
質を示す。
質を示す。
1.作用 前記したとおり。
2.基質特異性 Ｄ−セレノシスチンに対するミカエリス定数（Km値）は
約1.0mMである。Ｄ−セレノシスチン以外に次表のよう
な基質にも作用する。
約1.0mMである。Ｄ−セレノシスチン以外に次表のよう
な基質にも作用する。
3.至適pH 前記したとおり。
4.安定pH範囲 pH6.0〜8.5で30℃,90分間の処理でほとんど失活が起こ
らない。
らない。
5.作用適温の範囲 前記したとおり。また,45℃で15分間処理（pH7.2）して
も，活性は処理前とほとんど同じ値を示す。
も，活性は処理前とほとんど同じ値を示す。
6.分子量 前記したとおり。また，ラウリル硫酸ナトリウムを含む
12.5％アクリルアミドゲルスラブ電気泳動法によりサブ
ユニットの分子量は約3.5万と算出され，本発明の酵素
が２個の同一のサブユニットからなることが示された。
12.5％アクリルアミドゲルスラブ電気泳動法によりサブ
ユニットの分子量は約3.5万と算出され，本発明の酵素
が２個の同一のサブユニットからなることが示された。
7.補酵素要求性 本発明の酵素は，カルボニル試薬処理による失活，およ
びピリドキサール５′−リン酸による再賦活化により補
酵素としてピリドキサール５′−リン酸を要求すること
が示された。
びピリドキサール５′−リン酸による再賦活化により補
酵素としてピリドキサール５′−リン酸を要求すること
が示された。
8.力価の測定法 pH8.0,0.2Mトリシン−NaOH緩衝液中0.1mMピリドキサー
ル５′−リン酸,3.2mMD−セレノシスチンを含む混合溶
液を調製し，その混合溶液に適当量のＤ−セレノシスチ
ン分解酵素を加えて,37℃,5分間インキュベーション
後，生成するピルビン酸を2,4−ジニトロフェニルヒド
ラジン法にて計測し,1分間あたり１マイクロモルのピル
ビン酸生成を触媒せしめる酵素量を１単位とした。
ル５′−リン酸,3.2mMD−セレノシスチンを含む混合溶
液を調製し，その混合溶液に適当量のＤ−セレノシスチ
ン分解酵素を加えて,37℃,5分間インキュベーション
後，生成するピルビン酸を2,4−ジニトロフェニルヒド
ラジン法にて計測し,1分間あたり１マイクロモルのピル
ビン酸生成を触媒せしめる酵素量を１単位とした。
9.単一性 精製標品は,pH8.3の7.5％アクリルアミドゲルディスク
電気泳動法により陽極側に移動し，単一なバンドを与え
た。
電気泳動法により陽極側に移動し，単一なバンドを与え
た。
10.元素分析 元素分析値はまだ測定していない。
11.結晶構造 現在また結晶として得られていないため不明。
本発明のＤ−セレノシスチン分解酵素を製造するには，
次のごとき方法を採用することができる。すなわち，ク
ロストリジウム属に属する細菌を培養し，その培養物か
ら本発明のＤ−セレノシスチン分解酵素を採取すること
によって得ることができる。
次のごとき方法を採用することができる。すなわち，ク
ロストリジウム属に属する細菌を培養し，その培養物か
ら本発明のＤ−セレノシスチン分解酵素を採取すること
によって得ることができる。
本発明に使用する細菌は，本発明のＤ−セレノシスチン
分解酵素を産出しうるクロストリジウム属の細菌であ
り，そのような細菌であれば，いかなるものでも使用で
きる。好ましい細菌としては，たとえば，クロストリジ
ウム・スティックランディ（Clostridium sticklandi）
やクロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium spor
ogenes）があげられる。クロストリジウム・スティック
ランディとしての具体例としてはATCC 12662,クロスト
リジウム・スポロゲネスとしての具体例としてはATCC
11437,7655などがある。
分解酵素を産出しうるクロストリジウム属の細菌であ
り，そのような細菌であれば，いかなるものでも使用で
きる。好ましい細菌としては，たとえば，クロストリジ
ウム・スティックランディ（Clostridium sticklandi）
やクロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium spor
ogenes）があげられる。クロストリジウム・スティック
ランディとしての具体例としてはATCC 12662,クロスト
リジウム・スポロゲネスとしての具体例としてはATCC
11437,7655などがある。
その他に，エシェリア属に属する細菌（たとえばエシェ
リア・コリＫ−12 IFO 3208），バチルス属（たとえば
バチルス・セレウスIFO 3001），バクリウム属に属する
細菌（たとえばバクテリウム・マイコイデスIFO 304
0），およびエンテロバクター属に属する細菌（たとえ
ばエンテロバクター・クロアセイIFO 3302）などを用い
ることができる。
リア・コリＫ−12 IFO 3208），バチルス属（たとえば
バチルス・セレウスIFO 3001），バクリウム属に属する
細菌（たとえばバクテリウム・マイコイデスIFO 304
0），およびエンテロバクター属に属する細菌（たとえ
ばエンテロバクター・クロアセイIFO 3302）などを用い
ることができる。
本発明における細菌を培養するに際して用いられる栄養
培地において炭素源として，たとえば，グルコース，シ
ュークロース，フルクトース，乳糖．澱粉および加水分
解物，糖蜜，亜硫酸パルプ廃液の糖類，ギ酸，酢酸，乳
酸等の有機酸類，さらには使用する細菌が資化しうるア
ルコール類，油脂，脂肪酸およびグリセリン等も使用で
き，窒素源遠して，たとえば，硫酸アンモニウム，塩化
アンモニウム，リン酸アンモニウム，アンモニア，アミ
ノ酸，ペプトン，肉エキス，酵母エキス，肝臓エキス．
消化血清末，等の無機又は有機物が使用できる。さら
に，無機塩類として，たとえばカリウム，ナトリウム，
リン酸，亜鉛，鉄，マグネシウム，マンガン，銅，カル
シウム，コバルト等の各塩類，必要に応じて微量金属
塩，コーン・スティープ・リカー，チオグリコール酸ナ
トリウム，ビタミン類，アミノ酸，核酸等を使用しても
よく，細菌の一般的栄養培地が使用できる。
培地において炭素源として，たとえば，グルコース，シ
ュークロース，フルクトース，乳糖．澱粉および加水分
解物，糖蜜，亜硫酸パルプ廃液の糖類，ギ酸，酢酸，乳
酸等の有機酸類，さらには使用する細菌が資化しうるア
ルコール類，油脂，脂肪酸およびグリセリン等も使用で
き，窒素源遠して，たとえば，硫酸アンモニウム，塩化
アンモニウム，リン酸アンモニウム，アンモニア，アミ
ノ酸，ペプトン，肉エキス，酵母エキス，肝臓エキス．
消化血清末，等の無機又は有機物が使用できる。さら
に，無機塩類として，たとえばカリウム，ナトリウム，
リン酸，亜鉛，鉄，マグネシウム，マンガン，銅，カル
シウム，コバルト等の各塩類，必要に応じて微量金属
塩，コーン・スティープ・リカー，チオグリコール酸ナ
トリウム，ビタミン類，アミノ酸，核酸等を使用しても
よく，細菌の一般的栄養培地が使用できる。
これらの培地を用いて，クロストリジウム属に属する細
菌を好ましくは10℃〜45℃，さらに好ましくは20℃〜42
℃，最適には25℃〜40℃で，約５〜48時間，嫌気的に培
養すればよい。また，窒素封入下撹拌しながら培養する
方法も採用できる。
菌を好ましくは10℃〜45℃，さらに好ましくは20℃〜42
℃，最適には25℃〜40℃で，約５〜48時間，嫌気的に培
養すればよい。また，窒素封入下撹拌しながら培養する
方法も採用できる。
次に得られた培養物から本発明のＤ−セレノシスチン分
解酵素が採取されるが，培養物，分離正菌体，分離菌体
の処理物，粗製酵素，精製酵素等のあらゆる段階で採取
できる。精製法としては，通常の酵素精製法を用いるこ
とができる。すなわち，遠心分離等により菌体を得た
後，菌体をマントンゴーリン，ダイノミル，フレンチプ
レス，超音波処理，乳鉢磨砕等により細胞破砕後，遠心
分離により細胞片を除去し，細胞抽出液を得，これに硫
酸ストレプトマイシン又は硫酸プロタミン処理を行い，
次いでDEAE−トヨパールカラム（東洋曹達社製）等のイ
オン交換クロマトグラフィー，ブチルトヨパールカラム
（東洋曹達社製）等の疎水性クロマトグラフィー，ヒド
ロキシアパタイトカラム等の吸着クロマトグラフィー，
セファデックスカラム（ファルマシア社製）等のゲル濾
過クロマトグラフィー，ダイマートレックスブルーＡク
ロマトグラフィー（アミコン製）等のアフィニィティク
ロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーや
調製用電気泳動等を適宜組合わせて行うことができる。
解酵素が採取されるが，培養物，分離正菌体，分離菌体
の処理物，粗製酵素，精製酵素等のあらゆる段階で採取
できる。精製法としては，通常の酵素精製法を用いるこ
とができる。すなわち，遠心分離等により菌体を得た
後，菌体をマントンゴーリン，ダイノミル，フレンチプ
レス，超音波処理，乳鉢磨砕等により細胞破砕後，遠心
分離により細胞片を除去し，細胞抽出液を得，これに硫
酸ストレプトマイシン又は硫酸プロタミン処理を行い，
次いでDEAE−トヨパールカラム（東洋曹達社製）等のイ
オン交換クロマトグラフィー，ブチルトヨパールカラム
（東洋曹達社製）等の疎水性クロマトグラフィー，ヒド
ロキシアパタイトカラム等の吸着クロマトグラフィー，
セファデックスカラム（ファルマシア社製）等のゲル濾
過クロマトグラフィー，ダイマートレックスブルーＡク
ロマトグラフィー（アミコン製）等のアフィニィティク
ロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーや
調製用電気泳動等を適宜組合わせて行うことができる。
（実施例） 次に本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１ Ｌ−アルギニン塩酸塩2g/，酵母エキス5g/,L−リジ
ン塩酸塩2g/，ギ酸ナトリム2g/，塩化アンモニウム
2g/，リン酸二カリウム1.75g/，リン酸一カリウム2
g/，硫酸マグネシウム0.2g/，塩化カルシウム0.01g
/，硫酸第一鉄0.01g/，そしてpH7.2に調整した培地
700を,120℃,30分間加熱殺菌した後,1％硫化ナトリウ
ム21を添加して，次いでクロストリジウム・スティク
ランディATCC12662株を接種し,37℃で18時間，嫌気的に
培地した。培地後、遠心分離機で菌体を採取して1.0kg
の湿菌体を得た。得られた菌体を凍結応対で保存した。
ン塩酸塩2g/，ギ酸ナトリム2g/，塩化アンモニウム
2g/，リン酸二カリウム1.75g/，リン酸一カリウム2
g/，硫酸マグネシウム0.2g/，塩化カルシウム0.01g
/，硫酸第一鉄0.01g/，そしてpH7.2に調整した培地
700を,120℃,30分間加熱殺菌した後,1％硫化ナトリウ
ム21を添加して，次いでクロストリジウム・スティク
ランディATCC12662株を接種し,37℃で18時間，嫌気的に
培地した。培地後、遠心分離機で菌体を採取して1.0kg
の湿菌体を得た。得られた菌体を凍結応対で保存した。
次に凍結菌体680gを,2−メルカプトエタノールを0.01容
量％ならびにピリドキサール５′−リン酸20μＭを含む
20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）（標準緩衝液Ａ）
１に懸濁し，連続式超音波破砕機を用いて細胞を破壊
後，遠心分離機により細胞片を除去し,D−セレノシスチ
ン分解酵素を含む粗抽出液を得た。この粗抽出液に硫酸
プロタミンを徐々に加えて最終濃度を0.2％とした。生
成した沈澱を遠心分離により除去し，上清を0.1mMフェ
ニルメチルスルホニウムフルオライド,0.01mMトシルフ
ェニルアラニルクロロメチルケトン,1mM EDTAを含む10
00倍量の前記リン酸緩衝液（標準緩衝液Ｂ）に対して48
時間透析した（４℃）。この粗酵素液をあらかじめ標準
緩衝液Ｂで平衡化したDEAE−トヨパールカラム650M（東
洋曹達社製）に通じKClをその標準緩衝液Ｂに加えた溶
液で溶出せしめると,KCl濃度150mM付近で目的のＤ−セ
レノシスチン分解酵素が溶出した。この区分を集め，硫
酸アンモニウム（80％飽和）を加え，その沈澱を少量の
標準緩衝液Ｂで溶解し，硫酸アンモニウム25％飽和を含
む標準緩衝液Ｂで平衡化したブチル−トヨパールカラム
（東洋曹達社製）に通じ，硫酸アンモニウム濃度を連続
的に低下させたところ,10％飽和濃度近くに目的のＤ−
セレノシスチン分解酵素が溶出した。この溶出区分を80
％飽和硫酸アンモニウムで沈澱させ，その沈澱物を少量
の標準緩衝液Ａで溶解後，同一の緩衝液を溶出液に用い
たセルロファインGCL2000カラムクロマトグラフィー
（チッ素社製）を行ない，活性画分をアミコン200（ア
ミコン社製）で濃縮した。次いで、この濃縮物をFPLC
MonoQ HR 10/10カラムクロマトグラフィー（ファルマ
シア製）に通じ本酵素画分を吸着させた。このカラムを
0.01％２−メルカプトエタノールを含む10mMビス−トリ
ス緩衝液（pH8.2）で洗浄後,0.3〜0.5Mの食塩で直線グ
ラジェントを行い，活性画分を集め濃縮した。この濃縮
物を0.01％２−メルカプトエタノール,10μＭピリドキ
サール５′−リン酸,200mM食塩を含む50mMリン酸緩衝液
（pH6.8）で平衡化したTSKG3000SWカラム（東洋曹達社
製）に通じ，その活性画分を集めた。次いで,0.01％２
−メルカプトエタノールを含む20mMリン酸緩衝液（pH7.
5）で平衡化したウルトロン300Xカラム（LKB社製）に通
じ，食塩濃度０〜0.8Mのグラジェントにより精製された
Ｄ−セレノシスチン分解酵素を得ることができた。
量％ならびにピリドキサール５′−リン酸20μＭを含む
20mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.2）（標準緩衝液Ａ）
１に懸濁し，連続式超音波破砕機を用いて細胞を破壊
後，遠心分離機により細胞片を除去し,D−セレノシスチ
ン分解酵素を含む粗抽出液を得た。この粗抽出液に硫酸
プロタミンを徐々に加えて最終濃度を0.2％とした。生
成した沈澱を遠心分離により除去し，上清を0.1mMフェ
ニルメチルスルホニウムフルオライド,0.01mMトシルフ
ェニルアラニルクロロメチルケトン,1mM EDTAを含む10
00倍量の前記リン酸緩衝液（標準緩衝液Ｂ）に対して48
時間透析した（４℃）。この粗酵素液をあらかじめ標準
緩衝液Ｂで平衡化したDEAE−トヨパールカラム650M（東
洋曹達社製）に通じKClをその標準緩衝液Ｂに加えた溶
液で溶出せしめると,KCl濃度150mM付近で目的のＤ−セ
レノシスチン分解酵素が溶出した。この区分を集め，硫
酸アンモニウム（80％飽和）を加え，その沈澱を少量の
標準緩衝液Ｂで溶解し，硫酸アンモニウム25％飽和を含
む標準緩衝液Ｂで平衡化したブチル−トヨパールカラム
（東洋曹達社製）に通じ，硫酸アンモニウム濃度を連続
的に低下させたところ,10％飽和濃度近くに目的のＤ−
セレノシスチン分解酵素が溶出した。この溶出区分を80
％飽和硫酸アンモニウムで沈澱させ，その沈澱物を少量
の標準緩衝液Ａで溶解後，同一の緩衝液を溶出液に用い
たセルロファインGCL2000カラムクロマトグラフィー
（チッ素社製）を行ない，活性画分をアミコン200（ア
ミコン社製）で濃縮した。次いで、この濃縮物をFPLC
MonoQ HR 10/10カラムクロマトグラフィー（ファルマ
シア製）に通じ本酵素画分を吸着させた。このカラムを
0.01％２−メルカプトエタノールを含む10mMビス−トリ
ス緩衝液（pH8.2）で洗浄後,0.3〜0.5Mの食塩で直線グ
ラジェントを行い，活性画分を集め濃縮した。この濃縮
物を0.01％２−メルカプトエタノール,10μＭピリドキ
サール５′−リン酸,200mM食塩を含む50mMリン酸緩衝液
（pH6.8）で平衡化したTSKG3000SWカラム（東洋曹達社
製）に通じ，その活性画分を集めた。次いで,0.01％２
−メルカプトエタノールを含む20mMリン酸緩衝液（pH7.
5）で平衡化したウルトロン300Xカラム（LKB社製）に通
じ，食塩濃度０〜0.8Mのグラジェントにより精製された
Ｄ−セレノシスチン分解酵素を得ることができた。
このようにして得たＤ−セレノシスチン分解酵素は,pH
8.3の7.5％アクリルアミドディスク電気泳動で陽極側に
移動し，単一なバンドを与え,TSKG3000SWゲルクロマト
グラフィー（東洋曹達社製）より，分子量は約7.2万で
あった。また，ラウリル硫酸ナトリウムを含む12.5％ア
クリルアミドスラブ電気泳動において分子量約3.5万の
位置に単一のバンドを与えた。また，活性の収率は約７
％で，酵素1mgあたり約470単位の力価を示し，その精製
度は粗抽出液を１とすると約5800であった。
8.3の7.5％アクリルアミドディスク電気泳動で陽極側に
移動し，単一なバンドを与え,TSKG3000SWゲルクロマト
グラフィー（東洋曹達社製）より，分子量は約7.2万で
あった。また，ラウリル硫酸ナトリウムを含む12.5％ア
クリルアミドスラブ電気泳動において分子量約3.5万の
位置に単一のバンドを与えた。また，活性の収率は約７
％で，酵素1mgあたり約470単位の力価を示し，その精製
度は粗抽出液を１とすると約5800であった。
次に，このようにして得たＤ−セレノシスチン分解酵素
をフェニルヒドラジン塩酸塩や塩酸ヒドロキシルアミン
等のカルボニル試薬で処理すると，残存活性は各々０％
および３％となった。これにピリドキサール５′−リン
酸を添加すると各々90％と100％の活性が検出され，本
発明の酵素が補酵素としてピリドキサール５′−リン酸
を要求することが示された。
をフェニルヒドラジン塩酸塩や塩酸ヒドロキシルアミン
等のカルボニル試薬で処理すると，残存活性は各々０％
および３％となった。これにピリドキサール５′−リン
酸を添加すると各々90％と100％の活性が検出され，本
発明の酵素が補酵素としてピリドキサール５′−リン酸
を要求することが示された。
参考例１ 実施例１で得たＤ−セレノシスチン分解酵素を用いてＤ
−セレノシスチンを測定するに必要な検量線を作製し
た。
−セレノシスチンを測定するに必要な検量線を作製し
た。
その測定方法は,200μmoleのトリシン−NaOHに緩衝液
（pH8.0）,0.1μmoleのピリドキサール５′−リン酸,0.
25μmoleのＤ−セレノシスチンを含む1.0mlを反応溶液
とし，約５単位のＤ−セレノシスチン分解酵素を添加
し,30℃で30分間保温した後,2,4−ジニトロフェニルヒ
ドラジン試薬を添加し,420nmの吸光度変化量と添加した
Ｄ−セレノシスチンの量との間には，第１図に示すよう
に良好な比例関係が認められ，本発明のＤ−セレノシス
チン分解酵素を用いてＤ−セレノシスチンが精度良く測
定できることがわかった。
（pH8.0）,0.1μmoleのピリドキサール５′−リン酸,0.
25μmoleのＤ−セレノシスチンを含む1.0mlを反応溶液
とし，約５単位のＤ−セレノシスチン分解酵素を添加
し,30℃で30分間保温した後,2,4−ジニトロフェニルヒ
ドラジン試薬を添加し,420nmの吸光度変化量と添加した
Ｄ−セレノシスチンの量との間には，第１図に示すよう
に良好な比例関係が認められ，本発明のＤ−セレノシス
チン分解酵素を用いてＤ−セレノシスチンが精度良く測
定できることがわかった。
別に,2,4−ジニトロフェニルヒドラジン試薬の代わり
に,200μmoleのトリシン−NaOH緩衝液（pH8.5）,0.25μ
moleのNADH,300μmoleの塩化アンモニウム，約10単位の
アラニン脱水素酵素（シグマ社製）を含む1.0mlの反応
溶液を作成し,D−セレノシスチン分解酵素の反応で生成
したピルビン酸を定量した。同様に,200μmoleのリン酸
緩衝液（pH7.5）,0.25μmoleのNADH,約５単位の乳酸脱
水素酵素（ベーリンガー・マンハイム山ノ内社製）を含
む1.0mlの反応溶液を作成し,D−セレノシスチン分解酵
素の反応で生成したピルビン酸を定量した。その結果,
0.75μmoleのＤ−セレノシスチンに対し，各々1.58μmo
le1.53μmoleのピルビン酸が定量でき，化学量論的にＤ
−セレノシスチンが定量できることがわかった。
に,200μmoleのトリシン−NaOH緩衝液（pH8.5）,0.25μ
moleのNADH,300μmoleの塩化アンモニウム，約10単位の
アラニン脱水素酵素（シグマ社製）を含む1.0mlの反応
溶液を作成し,D−セレノシスチン分解酵素の反応で生成
したピルビン酸を定量した。同様に,200μmoleのリン酸
緩衝液（pH7.5）,0.25μmoleのNADH,約５単位の乳酸脱
水素酵素（ベーリンガー・マンハイム山ノ内社製）を含
む1.0mlの反応溶液を作成し,D−セレノシスチン分解酵
素の反応で生成したピルビン酸を定量した。その結果,
0.75μmoleのＤ−セレノシスチンに対し，各々1.58μmo
le1.53μmoleのピルビン酸が定量でき，化学量論的にＤ
−セレノシスチンが定量できることがわかった。
さらに,D−セレノシスチン分解酵素の反応で生成したア
ンモニアを市販グルタミン酸脱水素酵素（ベーリンガー
・マンハイム山ノ内社製）で定量できることもわかっ
た。すなわち,200μmoleのトリシン−NaOH緩衝液（pH8.
5）,0.25μmoleのNADPH,20μmoleのα−ケトグルタル酸
を含む1.0mlの反応溶液を作成し,D−セレノシスチン分
解酵素の反応で生成したアンモニアを定量したところ,D
−セレノシスチン0.75μmoleに対し,1.63μmoleのアン
モニアが定量できた。
ンモニアを市販グルタミン酸脱水素酵素（ベーリンガー
・マンハイム山ノ内社製）で定量できることもわかっ
た。すなわち,200μmoleのトリシン−NaOH緩衝液（pH8.
5）,0.25μmoleのNADPH,20μmoleのα−ケトグルタル酸
を含む1.0mlの反応溶液を作成し,D−セレノシスチン分
解酵素の反応で生成したアンモニアを定量したところ,D
−セレノシスチン0.75μmoleに対し,1.63μmoleのアン
モニアが定量できた。
このような共役酵素はＤ−セレノシスチン分解酵素の反
応と同時に行うこともできる。
応と同時に行うこともできる。
（発明の効果） 本発明のＤ−セレノシスチン分解酵素は，セレノシスチ
ンのＤ体に特異的に作用するという性質を有しているた
め，これまで酵素法では行うことができなかったＤ−セ
レノシスチンの量が簡便な分光器で定量可能となった。
また，ブタ肝臓からのＬ−セレノシスチンβ−リアーゼ
や高速液体クロマトグラフィー（あるいはアミノ酸分析
機）と組み合わせることにより，セレノシスチンのＤ
体,L体，およびメゾ体の３種の光学異性体を分別定量す
ることも可能となる。これにより，生体中でのセレノシ
スチンの動態を把握でき，実用面でのセレノシスチンの
利用が発展するものと考えられる。さらに，本発明のＤ
−セレノシスチン分解酵素を利用してＤ−セレノシスチ
ンの定量も可能であり，この方面でも有用性もある。
ンのＤ体に特異的に作用するという性質を有しているた
め，これまで酵素法では行うことができなかったＤ−セ
レノシスチンの量が簡便な分光器で定量可能となった。
また，ブタ肝臓からのＬ−セレノシスチンβ−リアーゼ
や高速液体クロマトグラフィー（あるいはアミノ酸分析
機）と組み合わせることにより，セレノシスチンのＤ
体,L体，およびメゾ体の３種の光学異性体を分別定量す
ることも可能となる。これにより，生体中でのセレノシ
スチンの動態を把握でき，実用面でのセレノシスチンの
利用が発展するものと考えられる。さらに，本発明のＤ
−セレノシスチン分解酵素を利用してＤ−セレノシスチ
ンの定量も可能であり，この方面でも有用性もある。
第１図は，本発明のＤ−セレノシスチン分解酵素を用い
て作製したＤ−セレノシスチンに対する検量線を示す図
である。
て作製したＤ−セレノシスチンに対する検量線を示す図
である。
Claims (3)
- 【請求項１】次の（イ）〜（ホ）の理化学的性質を有す
るＤ−セレノシスチン分解酵素。 （イ）作用 下記反応を触媒する。 （ロ）基質特異性 Ｄ−セレノシスチンに高い特異性を有する。 （ハ）至適pH 約pH7.0〜8.5（30℃）である。 （ニ）作用適温の範囲 pH8.0で20℃から40℃までの温度上昇とともに活性は増
大する。 （ホ）分子量 TSKG3000SWゲルクロマトグラフィー（東洋曹達社製）に
よる測定で約7.2万である。 - 【請求項２】クロストリジウム属に属する細菌から得ら
れる特許請求の範囲第１項記載のＤ−セレノシスチン分
解酵素。 - 【請求項３】クロストリジウム属に属する細菌を培養
し，培養物から次の（イ）〜（ホ）の理化学的性質を有
するＤ−セレノシスチン分解酵素を採取することを特徴
とするＤ−セレノシスチン分解酵素の製造方法。 （イ）作用 下記反応を触媒する。 （ロ）基質特異性 Ｄ−セレノシスチンに高い特異性を有する。 （ハ）至適pH 約pH7.0〜8.5（30℃）である。 （ニ）作用適温の範囲 pH8.0で20℃から40℃までの温度上昇とともに活性は増
大する。 （ホ）分子量 TSKG3000SWゲルクロマトグラフィー（東洋曹達社製）に
よる測定で約7.2万である。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3967287A JPH07121223B2 (ja) | 1987-02-23 | 1987-02-23 | Ｄ−セレノシスチン分解酵素およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3967287A JPH07121223B2 (ja) | 1987-02-23 | 1987-02-23 | Ｄ−セレノシスチン分解酵素およびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63207385A JPS63207385A (ja) | 1988-08-26 |
| JPH07121223B2 true JPH07121223B2 (ja) | 1995-12-25 |
Family
ID=12559586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3967287A Expired - Lifetime JPH07121223B2 (ja) | 1987-02-23 | 1987-02-23 | Ｄ−セレノシスチン分解酵素およびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07121223B2 (ja) |
-
1987
- 1987-02-23 JP JP3967287A patent/JPH07121223B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63207385A (ja) | 1988-08-26 |
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