JP3385386B2 - アルギン酸リアーゼ発現遺伝子及びアルギン酸リアーゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アルギン酸リアーゼ発
現遺伝子及びアルギン酸リアーゼの製造法に関する。

【０００２】本明細書において、アルギン酸には、アル
ギン酸の塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのア
ルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのア
ルカリ土類金属塩や、アルギン酸のプロピレングリコー
ル誘導体、アセチル誘導体などのエステルも含まれる。

【０００３】

【従来の技術】昆布、ワカメなどの褐藻類に２０〜５０
重量％程度（乾物換算）含まれる主要な構成多糖である
アルギン酸は、Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸とか
らなる、ヘテロポリマー又はブロックポリマーであると
されている。而して栄養学的には食物繊維としての機能
があり、特にアルギン酸のカリウム塩はＫ−Ｎａ交換能
を有し、体内のＮａを排泄する作用があると言われてい
る。この様な特性を有するアルギン酸を食品に適用でき
れば、食品の生理的機能を高め得ることは明らかであ
る。ところが、アルギン酸は水に溶解すると極めて高粘
性を示すため、一般の食品に適用することは著しく困難
である。アルギン酸水溶液の粘度を低下させるために
は、アルギン酸リアーゼによりアルギン酸を分解するこ
とが有効であると予想される。

【０００４】一方白色人種には、シュードモナス・エル
ジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ）の呼吸器感染により、該細菌が産生するアルギン酸
を主成分とする粘稠物が肺に蓄積して気管支を閉塞し、
死に至らしめる嚢胞性線維症（Ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒ
ｏｓｉｓ）という先天性疾患が１０００〜２０００人に
１人の割合で認められている。この疾患の治療には、抗
生物質や消化酵素が用いられているがその効果は不充分
であり、かかる細菌由来アルギン酸に対して高活性を有
するアルギン酸リアーゼの開発が望まれている。

【０００５】従来アルギン酸リアーゼは、細菌、褐藻、
貝などに存在し、細菌ではシュードモナス属、ビブリオ
属又はクレブシェラ属に属する細菌がアルギン酸リアー
ゼを産生することが知られている。しかしながら、これ
らの細菌のアルギン酸リアーゼ産生能は非常に低く且つ
産生されるアルギン酸リアーゼのアルギン酸分解能が非
常に低いため、工業的規模でアルギン酸を低分子化する
のに充分な量のアルギン酸リアーゼを得るには多大なコ
ストが必要になり、実質的には不可能である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、優れたア
ルギン酸分解能を有する新規なアルギン酸リアーゼを、
土壌から分離した特定種の細菌から得ることに成功し、
先に特許出願した（特開平５−１５３８７号、特願平４
−３４８４６５号）。

【０００７】而して前記細菌は、従来知られているアル
ギン酸リアーゼ産生菌に比し、高収量でアルギン酸リア
ーゼを産生し得るが、より一層の高収量化が望まれてい
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、前記アルギン酸リア
ーゼの遺伝子配列を解析して遺伝子を合成し、これを微
生物に導入することにより、アルギン酸リアーゼ産生能
が極めて高い微生物種を製することができ、よってアル
ギン酸リアーゼの収量を飛躍的に増加し得ることを見い
出し、ここに本発明を完成した。

【０００９】すなわち本発明は、配列番号：１で示され
る塩基配列を有するアルギン酸リアーゼ発現遺伝子を提
供するものである。

【００１０】更に本発明は、上記のアルギン酸リアーゼ
発現遺伝子の導入により形質転換された微生物を培養
し、得られる培養物からアルギン酸リアーゼを単離する
ことを特徴とするアルギン酸リアーゼの製造法をも提供
する。

【００１１】本発明のアルギン酸リアーゼ発現遺伝子
は、下記表１乃至表５記載の理化学的性質を有するアル
ギン酸リアーゼＡｌ−Ｉ、Ａｌ−II−２及びＡｌ−III
をコードするものである。アルギン酸リアーゼＡｌ−II
−２及びＡｌ−III は特願平４−３４８４６５号記載の
酵素であり、アルギン酸リアーゼＡｌ−Ｉは特開平５−
１５３８７号に「ＯＴＣ−６由来酵素Ａｌ−Ｉ」として
記載されている。

【００１２】以下各酵素を次の通り略記する。

【００１３】アルギン酸リアーゼＡｌ−Ｉ：「Ａｌ−
Ｉ」又は「Ａｌ−Ｉリアーゼ」 アルギン酸リアーゼＡｌ−II−２：「Ａｌ−II−２」又
は「Ａｌ−II−２リアーゼ」 アルギン酸リアーゼＡｌ−III ：「Ａｌ−III 」又は
「Ａｌ−III リアーゼ」

【００１４】

【表１】 分子量は、セファデックスＧ−１５０（ファルマシア社
製、スウェーデン）を用いたゲル濾過クロマトグラフィ
ーにより決定した。ゲル濾過の結果を図１（ａ）及び図
４（ｃ）に示す。蛋白質の溶出位置は、矢印により示さ
れる。マーカー蛋白質としては、ａ：牛血清アルブミン
（６７ｋＤａ）、ｂ：オブアルブミン（４３ｋＤａ）、
ｃ：キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋＤａ）及びｄ：リ
ボヌクレアーゼＡ（１３．７ＫＤａ）を用いた。

【００１５】具体的には、酵素液を、１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセファデックス
Ｇ−１５０を充填した目盛り付カラムに流してゲル濾過
し、酵素を４℃にて前記緩衝液で溶出し、４分毎に３．
０ｍｌずつ集めて分子量を測定した。

【００１６】

【表２】

【００１７】

【表３】 酵素のＮ末端のアミノ酸配列を、アミノ酸誘導体分析機
（商品名：バイオシステム １２０Ａ ＰＴＨ分析機、
バイオシステム社製、米国）を連結したプロテイン・シ
ークエンサー（商品名：バイオシステム４７７Ａ、バイ
オシステム社製、米国）を用いて決定した。

【００１８】

【表４】 Ｍ／Ｇ：マンヌロン酸残基／グルロン酸残基の比 ｎｄ：測定せず アルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ，ｎｄ）※：シグマケミ
カル社製 アルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ；０．４〜０．５）：大
日本製薬（株）製 アルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ；１．４〜１．５）：大
日本製薬（株）製 アルギン酸カリウム（Ｍ／Ｇ，ｎｄ）：君津化学（株）
製 アルギン酸プロピレングリコール（Ｍ／Ｇ，ｎｄ）：君
津化学（株）製 アルギン酸＃１：シュードモナス・エルジノーサＮｏ．
１０−９１−２５培養物から単離されたもの アルギン酸＃1a：アルギン酸＃１をｐＨ９．０にて１０
０℃で３０分間加熱処理したもの アルギン酸＃２：シュードモナス・エルジノーサＮｏ．
２−９１−１８の培養物から単離されたもの

【００１９】

【表５】 上記３種のアルギン酸リアーゼは、本発明者が土壌中か
ら分離したフラボバクテリウム・スピーシーズ（Ｆｌａ
ｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＯＴＣ−６（以下単
に「ＯＴＣ−６株」という）を培養することにより得ら
れたものである。ＯＴＣ−６株の培養の詳細は特開平５
−１５３８７号公報に記載されている。ＯＴＣ−６株の
培養条件を変化させると、Ａｌ−Ｉ、Ａｌ−II−２及び
Ａｌ−III を生産させることができる。

【００２０】本発明遺伝子は、通常の遺伝子組み換え技
術に従って製造できる。例えば、まずフラボバクテリウ
ム・スピーシーズＯＴＣ−６の細胞から染色体ＤＮＡを
抽出し、これをベクタープラスミドに挿入し、該プラス
ミドを適当な宿主に組み込んで染色体ＤＮＡライブラリ
ーを作製し、これにより目的とするクローンをスクリー
ニングし、該クローンが有するＤＮＡ塩基配列を解析す
ればよい。

【００２１】染色体ＤＮＡの抽出は、公知の方法に従っ
て実施できる。例えば、ＳＤＳで蛋白質を溶解・消化し
た後エタノールなどの適当な溶媒中に投入して染色体Ｄ
ＮＡを析出させればよい。この操作をアガロースゲル中
で行ってもよい。更に細胞懸濁液をフェノール抽出する
ことによっても染色体ＤＮＡを得ることができる〔サイ
トウ及びミウラの方法、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕ
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｐｈｅｎｏｌｔｒｅａｔ
ｍｅｎｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ，７２，６１９−６２９（１９６３）〕。

【００２２】上記で得られる染色体ＤＮＡをベクターに
組み込んだ後、宿主に導入して該宿主を形質転換させ、
染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。該ベクターとし
ては公知のものが使用でき、例えば、ｐＢＲ３２２プラ
スミド、ｐｋｋ２２３プラスミドなどを挙げることがで
きる。宿主としても公知の微生物などを使用でき、例え
ば、大腸菌、枯草菌などの細菌、酵母、放線菌などを挙
げることができる。染色体ＤＮＡをベクターに組み込む
には公知の方法が採用でき、例えば、ＤＮＡの切断、結
合、リン酸化などを目的とする手法、各種制限酵素処
理、ＤＮＡリガーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮ
Ａポリメラーゼなどによる酵素処理などを適宜組み合わ
せて行うことができる。用いられる酵素も市販品として
容易に入手できる。また形質転換法としても公知の方法
が採用でき、例えば、塩化カルシウム法〔Ｍａｎｄｅ
ｌ，Ｍ．及びＨｉｇａ，Ａ．、Ｃａｌｃｉｕｍ−ｄｅｐ
ｅｎｄｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＤＮＡ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，
１５９−１６２〕などを挙げることができる。また宿主
として酵母や放線菌などを用いる場合には、例えば、等
張液中でポリエチレングリコールの存在下に処理する方
法、Ｌｉ、Ｒｂなどのアルカリ金属で処理する方法など
を採用できる。

【００２３】染色体ＤＮＡライブラリーより目的クロー
ンをスクリーニングするには、例えば、合成オリゴヌク
レオチドプローブを用いる方法、セレクティブ・ハイブ
リダイゼイション・トランスレイション法、サザンハイ
ブリダイゼーション法〔Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｒｅｓｉｓ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５０３−６
２９（１９６３）〕などを採用できる。

【００２４】かくして得られる目的遺伝子の塩基配列の
解析及び決定は、マキサム−ギルバート法〔Ｍａｘａｍ
−Ｇｉｌｂｅｒｔ ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈ．Ｅｍｚｙ
ｍ．，６５，４９９−５６０（１９８０）〕、Ｍ１３フ
ァージを用いるジデオキシ法〔Ｍｅｓｓｉｎｇ Ｊ．
ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９
−２７６（１９８２）、Ｎｅｗ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒ
ｓ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．，１０１，２０−７８（１９８３）〕、サン
ガー法〔Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，
５４６３（１９７７）、Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａ
ｌ．，ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｃｈ
ａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８０，２４３２−２４３６（１９８３）〕などにより行
うことができる。

【００２５】上記各操作における遺伝子などの単離・精
製も、例えばアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動、パルスフィールドゲル電気泳動など
の通常の方法に従えばよい。

【００２６】かくして得られる本発明の遺伝子を用いて
Ａｌ−Ｉリアーゼ、Ａｌ−II−２リアーゼ及びＡｌ−II
I リアーゼを製造するには、該遺伝子を適当な微生物に
導入して形質転換し、かかる形質転換微生物を培養し、
得られる培養物から前記酵素種を分離すればよい。

【００２７】本発明遺伝子を宿主すなわち微生物に導入
するには上記した様な公知の方法を採用できるが、前記
酵素種を大量に得るために上流に強く発現するプロモー
ターをつけておくのが好ましい。大腸菌を例にとれば、
トリプトファン合成酵素遺伝子（ｔｒｐ）、β−ガラク
トシダーゼ遺伝子（ｌａｃ）、アルカリ性ホスファター
ゼ遺伝子（ｐｈｏＡ）などのプロモーターやλファージ
のＰ_L プロモーターなどを挙げることができる。更にｔ
ｒｐの前半とｌａｃの後半をつないだｔａｃプロモータ
ーなども利用できる。また枯草菌ではグルコン酸オペロ
ンやプロテアーゼ、α−アミラーゼ遺伝子のプロモータ
ー、酵母菌では解糖系の酵素やホスファターゼ遺伝子の
プロモーターなどを挙げることができる。

【００２８】得られる形質転換微生物の培養は、適当な
培地中にて該宿主の生育に適した条件で行えばよい。該
条件とは、例えば、培養温度、培養時間、好気的又は嫌
気的などである。培養により得られる酵素は、通常の分
離精製手段により培養物から単離できる。

【００２９】

【発明の効果】本発明によれば、アルギン酸リアーゼ遺
伝子を微生物に導入することにより、アルギン酸リアー
ゼ産生能が極めて高い微生物種を製することができ、よ
ってアルギン酸リアーゼの収量を飛躍的に増加し得る。

【００３０】

【実施例】以下に参考例及び実施例を挙げ、本発明を一
層明瞭なものとする。

【００３１】なおアルギン酸リアーゼの活性は、アルギ
ン酸リアーゼがアルギン酸を分解することにより生成す
る非還元末端のＣ₄ −Ｃ₅ 間に２重結合を有する糖が２
３５ｎｍに特異的な吸光度上昇を示すことを利用して測
定した。

【００３２】すなわち酵素活性の測定は、濃度０．２％
のアルギン酸水溶液１．０ｍｌ、２００ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌ及び酵素液０．１ｍ
ｌを混合し、水０．４ｍｌを加えて全量２．０ｍｌと
し、２５℃で５分間反応させた後反応を停止させ、２３
５ｎｍの吸光度を測定した。酵素活性は、１分間に２３
５ｎｍの吸光度を「１」上昇させる酵素量を１単位
（Ｕ）とし、酵素１ｍｇ当たりに換算して示す。

【００３３】基質としては、海草（Ｅｉｓｅｎｉａ ｂ
ｉｃｙｃｌｉｓ）から単離されたアルギン酸ナトリウム
（平均分子量２５７００、粘度１０００ｃｐｓ、シグマ
ケミカル社製、米国）及び嚢胞性線維症患者の肺から分
離された粘稠菌シュードモナス・エルジノーサＮｏ．１
０−９１−２５（米国、イリノイ大学、Ａ．Ｍ．Ｃｈａ
ｋｒａｂａｒｔｙ博士）の培養物から単離したアルギン
酸を用いた。この細菌由来のアルギン酸は、ｏ−アセチ
ル化 β（１−４）結合Ｄ−マンヌロン酸とそのＣ５エ
ピ異性体であるＬ−グルロン酸との鎖状共重合体である
が、アセチル化度が高く、この点で海草アルギン酸とは
区別される。

【００３４】上記細菌由来アルギン酸の単離は具体的に
は以下の様にして行った。すなわち上記粘稠菌をＴＳＢ
培地（ディフコ・ラボラトリー社製、米国）で３０℃の
温度下好気的に２４時間培養し、培養物を遠心分離して
菌体を除去し、上澄液に２倍量（ｖ／ｖ）の無水エタノ
ールを加え、４℃で２０時間放置した。析出したアルギ
ン酸を遠心分離により集め、室温下９５％エタノールで
２回洗浄した後、水に溶解させた。アルギン酸であるこ
との確認は、スタンダードとして上記シグマケミカル社
製海草アルギン酸ナトリウムを用い、カルバゾル法によ
って行った。 参考例１（Ａｌ−II−２リアーゼの製造）１． 培養及び菌体抽出物の調製 ０．２％アルギン酸ナトリウム、０．１％硫酸アンモニ
ウム、０．０５％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％
リン酸２水素１カリウム、０．４％リン酸１水素２ナト
リウム１２水和物及び０．０５％酵母エキスを含む培地
（ｐＨ７．２）１２リットル中にて、フラボバクテリウ
ム・スピーシーズＯＴＣ−６（以下「菌株Ａｌ」とい
う）を好気的に３０℃で２０時間培養した。菌体６０ｇ
を集め、一度０．８５％の冷食塩水で洗浄し、１００ｍ
ｌの５．０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸
濁し、０℃の温度下９キロヘルツで１０分間超音波処理
した。得られた均一物を４℃にて２５０００ｇで３０分
遠心分離し、上澄液（菌体抽出物）をＡｌ−II−２リア
ーゼ源として用いた。２． ＣＭセルロースカラムによる精製 菌体抽出物（１６０ｍｌ、４９７０ｍｇ蛋白質）を、１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
ＣＭセルロースカラム（４．６ｃｍ×４６ｃｍ）にかけ
て蛋白質を吸着させ、塩化ナトリウム濃度０〜０．６モ
ルの直線勾配を持った１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０、４０００ｍｌ）で溶出し、１０分毎に２０ｍ
ｌずつ集めた。塩化ナトリウム濃度が約０．１５モルの
ところで溶出した活性を有するフラクションを得た。３． ヒドロキシアパタイトカラムによる精製 上記で得られた活性を有するフラクション（１２３５ｍ
ｌ、６０８ｍｇ蛋白質）を直接、５．０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したヒドロキシアパ
タイトカラム（４．６ｃｍ×２６ｃｍ）に流し、吸着し
た蛋白質を０〜０．５モルの直線濃度勾配を持つリン酸
カリウム緩衝液で溶出し、１０分毎に１５ｍｌずつ集め
た。濃度が約０．３モルのところで溶出した、活性を有
するフラクションを得た。４． ブチルトヨパール６５０Ｍカラムによる精製 上記で得られた活性フラクション（２８４ｍｌ、３４．
８ｍｇ蛋白質）を３０％硫酸アンモニウムで飽和し、３
０％硫酸アンモニウム飽和−５．０ｍＭリン酸カリウム
緩衝液で前もって平衡化したブチルトヨパール ６５０
Ｍカラム（東ソー（株）製、１．５ｃｍ×１５ｃｍ）に
かけ、吸着した蛋白質を前記３０〜０％硫酸アンモニウ
ム飽和緩衝液で溶出し、５分毎に１０ｍｌずつ集めた。
非吸着フラクションを集め、アミコンＰＭ１０膜を用い
た限外濾過により約５ｍｌに濃縮し、Ａｌ−II−２リア
ーゼを主成分とする酵素液を得た。５． トヨパールＨＷ−５５カラムによる精製 得られた酵素液（５ｍｌ、１０ｍｇ蛋白質）を、５．０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した
トヨパールＨＷ−５５カラム（ビニルポリマー、東ソー
（株）製、２．６ｃｍ×７４ｃｍ）にかけ、酵素を前記
と同じ緩衝液で溶出し、３分毎に４ｍｌずつ集めた。活
性を有するフラクション（Ｎｏ．７９〜８３）を集め、
上記と同様に濃縮してＡｌ−II−２リアーゼを含む酵素
液を得た。これを、Ａｌ−II−２リアーゼの性質を調べ
る試料として用いた。 〔ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動〕上記試料
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
結果を図１（ｂ）に示す。図１（ｂ）から、Ａｌ−II−
２リアーゼは分子量２５０００の単一蛋白質バンドとし
て移動することが判る（レーン２）。なおマーカー蛋白
質としては、上からミオシン（Ｈ鎖）、ホスホリラーゼ
ｂ、牛血清アルブミン、オボアルブミン、α−キモトリ
プシノーゲン、β−ラクトグロブリン及びリゾチームを
用いた（レーン１）。 参考例２（Ａｌ−III リアーゼの調製）１． 培養及び菌体抽出物の調製 ２トン容醗酵タンクにて、フラボバクテリウム・スピー
シーズＯＴＣ−６を１４００リットルのＡＬＧ培地
〔１．０％アルギン酸ナトリウム（シグマケミカル社
製）、０．１％硫酸アンモニウム、０．０５％硫酸マグ
ネシウム７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、
０．４％リン酸水素二ナトリウム・１２水和物、０．０
５％酵母エキス（ディフコ・ラボラトリー社製、米
国）：ｐＨ７．２〕に１．２％接種し、３０℃で１７時
間培養した。培養は攪拌下（１７０ｒｐｍ）、２００リ
ットル／分の割合で空気を供給しながら行った。

【００３５】１００リットルの培養液から得た菌体３５
０ｇを一度０．８５％の冷食塩水で洗浄し、５リットル
の５．０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０、以下
「ＫＰＢ緩衝液」という）に懸濁し、続いてこの菌体懸
濁液を３リットル／時の割合で、径０．１ｍｍのガラス
ビーズを７０容量％含ませて菌体破砕機〔商品名：ダイ
ノーミル（ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ）−ＫＤＬ、シンマルエ
ンタープライズコーポレーション社製〕に通し、得られ
た液を４℃の温度下２５０００ｇで３０分間遠心分離
し、上澄液を得た。上澄液（菌体抽出物）をアルギン酸
リアーゼ源として用いた。２． ＤＥＡＥ−セルロファインカラムによる精製 菌体抽出物（５．５４リットル、５１．２ｇ蛋白質）
を、５．０ｍＭＫＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化し
たＤＥＡＥ−セルロファインカラム（４．６ｃｍ×１８
ｃｍ、生化学工業（株）製）に流して蛋白質を吸着し、
該蛋白質を食塩の濃度勾配（０〜０．５Ｍ）の５．０ｍ
ＭＫＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０、２０００ｍｌ）で溶出
し、５分毎に２５ｍｌずつ集めた。３． ヒドロキシアパタイトカラムによる精製 上記で得られたフラクションのうち、非吸着フラクショ
ン（６．０５リットル、１８．９ｇ）を、５．０ｍＭＫ
ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したヒドロキシアパ
タイトカラム（１２ｃｍ×１８ｃｍ）に通した。吸着し
た蛋白質を、順次２０ｍＭ（４リットル）、４０ｍＭ
（８リットル）及び１００ｍＭ（８リットル）のＫＰＢ
緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出し、９分毎に５００ｍｌず
つ集めた。

【００３６】各フラクションのアルギン酸リアーゼ活性
を図２に示す。アルギン酸リアーゼ活性は、基質とし
て、シグマケミカル社製の海草由来アルギン酸ナトリウ
ム（■）及びシュードモナス・エルジノーサＮｏ．１０
−９１−２５の培養物から単離された細菌由来アルギン
酸（□）を用いて測定した。図２から、ヒドロキシアパ
タイトカラムクロマトグラフィーにより、アルギン酸リ
アーゼは２つのピーク（ピークＩ及びII）に分離するこ
とが判る。ピークIIのフラクションは、電気泳動によ
り、Ａｌ−Ｉリアーゼ（分子量６０，０００）及びＡｌ
−II−２リアーゼ（分子量２５，０００）の２種を含ん
でいることが判る。細菌由来アルギン酸に対するピーク
Ｉの活性は、ピークIIのそれよりも高い。

【００３７】なお電気泳動は、ＳＤＳの存在下にポリア
クリルアミドゲルを用いて行った。具体的には、酵素液
４０μｌを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけ、染色液（エタノール４５％、酢酸１０％、
水４０％、コマジーブリリアントブルーＧ ０．２５
％）中にて、３７℃で３時間振盪し、脱色液（エタノー
ル２５％、酢酸７％）で数回脱色して蛋白質バンドを確
認した。４． ブチル−セファロースＦ．Ｆ．カラムによる精製 細菌由来アルギン酸に対して高活性を示す上記ピークＩ
について更に精製を行った。すなわち、ピークＩのフラ
クション（２．６４リットル、９８４ｍｇ蛋白）を４０
％硫酸アンモニウムで飽和し、これを４０％硫酸アンモ
ニウム飽和−５．０ｍＭＫＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で
平衡化したブチル−セファロースＦ．Ｆ．カラム（４．
６ｃｍ×１０ｃｍ、ファルマシア社製）に通した。カラ
ムに吸着した酵素を、硫酸アンモニウムの直線濃度勾
配：４０〜０％の５．０ｍＭＫＰＢ緩衝液（ｐＨ７．
０、３３００ｍｌ）で溶出し、４分毎に２５ｍｌずつ集
めた。５． セファクリルＳ−２００ＨＲカラムによる精製 上記で得られたフラクションのうち、硫酸アンモニウム
濃度が約３０％である、活性を示すフラクションを集
め、透析膜〔商品名：アミコンＰＭ１０、グレースジャ
パン（株）製〕を用いて６６ｍｌ（２１８ｍｇ蛋白質）
に濃縮し、その後５．０ｍＭＫＰＢ緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したセファクリルＳ−２００ＨＲカラム
（５．０ｃｍ×６０ｃｍ、ファルマシア社製）に通し
た。蛋白質を５．０ｍＭＫＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）で
溶出し、４分毎に１２ｍｌずつ集めた。６． Ｓ−セファロースＦ．Ｆ．カラムによる精製 上記で得られたフラクションのうち、活性を示すフラク
ション（フラクションＮｏ．５８〜７０）を集め（１７
６ｍｌ、１５３ｍｇ蛋白質）、５．０ｍＭＫＰＢ緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したＳ−セファロースＦ．Ｆ．
カラム（４．６ｃｍ×６．０ｃｍ、ファルマシア社製）
に通し、吸着した蛋白質を直線ｐＨ勾配〔５．０ｍＭＫ
ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０）−５．０ｍＭリン酸二カリウ
ム（ｐＨ８．６）、１０００ｍｌ〕で溶出し、５分毎に
１０ｍｌずつ集めた。

【００３８】各フラクションのｐＨとアルギン酸リアー
ゼ活性の関係を図３に示す。△；ｐＨ、●；アルギン酸
リアーゼ活性、▲；２８０ｎｍの吸収（Ａ₂₈₀ ）。アル
ギン酸リアーゼ活性は基質として細菌由来アルギン酸を
用いて測定した。図３から、Ａｌ−III リアーゼのリア
ーゼ活性がピークＩ′及びII′に分離することが判る。
ピークＩ′はｐＨ７．２、ピークII′はｐＨ７．３でそ
れぞれ溶出した。

【００３９】ピークＩ′及びII′のフラクション（Ｎ
ｏ．４０、５５、６０及び６５）を、ポリアクリルアミ
ドゲル−電気泳動で分析した。結果を図４（ａ）及び図
４（ｂ）に示す。図４（ａ）はＳＤＳの非存在下及び図
４（ｂ）は存在下に電気泳動を行った。図４（ａ）及び
図４（ｂ）のレーン１，２，３及び４は、それぞれフラ
クション４０、５５、６０及び６５を示す。更に図４
（ｂ）のレーン５はマーカー蛋白質であり、該蛋白質と
しては牛血清アルブミン（６６ＫＤａ）、卵オブアルブ
ミン（４５ＫＤａ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ（３６ＫＤａ）、炭酸脱水酵素
（２９ＫＤａ）及びトリプシノーゲン（２４ＫＤａ）を
用いた。図４（ａ）から、単一蛋白質である、ピーク
Ｉ′のフラクション（Ｎｏ．４０）とピークII′のフラ
クション（Ｎｏ．６０及び６５）の存在が示唆された。
フラクションＮｏ．５５は、ピークＩ′及びII′の蛋白
質と同一分子量の２種の蛋白質を含んでいた。

【００４０】ピークＩ′及びII′の蛋白質をそれぞれＡ
ｌ−III −１及びＡｌ−III −２リアーゼとした。しか
し、Ａｌ−III −１及びＡｌ−III −２リアーゼをＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけると、フラク
ションＮｏ．５５の蛋白質と同様に、全ての蛋白質（Ａ
ｌ−III −１及びＡｌ−III −２リアーゼ）が分子量３
８０００と３５０００の２種の蛋白質に分離した。更
に、Ａｌ−III −１とＡｌ−III −２リアーゼのＮ末端
アミノ酸配列は一致した。このことから、ピークＩ′及
びII′に分離したアルギン酸リアーゼは基本的に同一で
あり、還元剤の存在下でのＳＤＳ処理により２種の異な
る形態をとるものと考えられる。

【００４１】Ａｌ−III −１及びＡｌ−III −２蛋白質
の分子量は、セファデックスＧ−１５０カラムのゲル濾
過により測定した。結果を図４（ｃ）に示す。 実施例１ 菌株Ａｌを上記参考例１と同様に培養し、菌体を集め、
一度０．８５％の冷食塩水で洗浄し、１００ｍｌの５．
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、０
℃の温度下９キロヘルツで１０分間超音波処理した。得
られた細胞懸濁物にフェノールを加え、染色体ＤＮＡを
抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ〔宝酒造（株）製〕で処理
し、染色体ＤＮＡ断片を得た。一方、ｐｋｋ２２３−３
〔大腸菌由来ベクタープラスミド、ファルマシア社製〕
を前記制限酵素で処理し、アルカリホスファターゼで脱
リン酸化した。これと前記染色体ＤＮＡ断片をライゲー
ションし、該断片を挿入したハイブリッドプラスミドを
調製した。ライゲーションには、宝酒造（株）製のライ
ゲーション・キットを用いた。得られたハイブリッドプ
ラスミドを０．７％アガロースゲル電気泳動により単離
した。

【００４２】氷冷下、５０ｍＭ塩化カルシウム水溶液に
大腸菌ＤＨ１〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｄ
Ｈ１・Ｆ^- ，ｒｅｃＡ１，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，
ｔｈｉ１，ｈｓｄＲ１７（ｒ_k ^- ，ｍ_k ⁺ ） ｓｕｐＥ
４４，ｒｅｌＡ，λ^- 〕の細胞を入れ、更に上記ハイブ
リッドプラスミドを加えて大腸菌ＤＨ１に該プラスミド
を導入し、形質転換を行った。

【００４３】得られた形質転換体を、アンピシリン（６
０μｇ／ｍｌ）を含むＡＬＧ培地（０．５％肉エキス、
１．０％バクトペプトン、０．５％塩化ナトリウム、
１．５％アルギン酸ナトリウム、１．５％寒天、ｐＨ
７．２）のプレートで３０℃で５日間培養した後、プレ
ート表面に１．０モルＣａＣｌ₂ １０ｍｌを塗布し、ハ
ローを形成するコロニーを選別し、アルギン酸リアーゼ
をコードする遺伝子を持つ形質転換株ＡＬＹ１を得た。
該株に導入したハイブリッドプラスミドをハイブリッド
プラスミドｐＡＬＹ１という。試験例１（サザン・ブロ
ット・ハイブリダイゼイション）上記ハイブリッドプラ
スミドｐＡＬＹ１は、大腸菌由来ベクタープラスミドｐ
ＫＫ２２３−３に菌株ＡｌのＡｌ−Ｉリアーゼに相当す
る遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片（７．０ｋｂ）を含ま
せたものである。該染色体ＤＮＡ断片の起源を同定する
ために以下の試験を行った。

【００４４】すなわちフェノール処理により、菌株Ａｌ
及び大腸菌ＤＨ１から染色体ＤＮＡを単離した。この染
色体ＤＮＡを０．７％アガロースゲル電気泳動により分
離し、該ゲルとナイロン膜〔（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ ｆｉ
ｌｔｅｒ、アマーシャム−ジャパン（Ａｍｅｒｓｈａｍ
−Ｊａｐａｎ）社製〕を密着させ、ゲルの側に緩衝液を
染み込ませた吸い取り紙をあて、ナイロン膜の側には乾
燥した吸い取り紙をあてることにより、染色体ＤＮＡを
ナイロン膜に転写した。

【００４５】ハイブリダイゼーションプローブとして
は、上記ハイブリッドプラスミドｐＡＬＹ１の７．０ｋ
ｂの挿入物をランダム・プライマー・ＤＮＡ・ラベリン
グキット〔アマーシャム−ジャパン社製〕を用いて〔α
−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ〔３０００Ｃｉ／ミリモル、アマーシ
ャム−ジャパン社製〕でラベリングしたものを用いた。

【００４６】６８℃で２０時間ハイブリダイゼーション
した後、ナイロン膜を１×ＳＳＣ及び０．１×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム＋０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム）で洗浄し、背景を最小に絞って
富士Ｘ線フィルムを室温で２０時間露出し、該フィルタ
ーの放射能写真を撮影した。結果を図５に示す。

【００４７】図５から、上記ハイブリダイゼーションプ
ローブは菌株Ａｌから得られた染色体ＤＮＡとは雑種形
成するが、大腸菌ＤＨ１のそれとは雑種形成しないこと
が判った。よって、ハイブリッドプラスミドｐＡＬＹ１
の７．０ｋｂ挿入物は、菌株Ａｌ由来のものであること
が判った。

【００４８】なお図５において、レーン１：菌株Ａｌの
染色体ＤＮＡ、レーン２：大腸菌ＤＨ１の染色体、レー
ン１′：レーン１の染色体ＤＮＡとｐＡＬＹ１のラベリ
ング７ｋｂ断片のサザン・ハイブリダイゼーション、レ
ーン２′：レーン２の染色体ＤＮＡとｐＡＬＹ１のラベ
リング７ｋｂ断片のサザン・ハイブリダイゼーションを
示す。 試験例２（ＤＮＡ配列） ハイブリッドプラスミドｐＡＬＹ１におけるＡｌ−Ｉリ
アーゼのコード部位を決定するために、以下の試験を行
った。すなわちメシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法に従
って、ハイブリッドプラスミドｐＡＬＹ１から７種の断
片ＤＮＡを調製し、０．７％アガロースゲル電気泳動に
より分離回収した。得られた７種の断片ＤＮＡをベクタ
ープラスミドｐＫＫ２２３−３に挿入してハイブリッド
プラスミドを製し、これらを大腸菌ＤＨ１に導入して形
質転換させた。得られた７種の形質転換体のアルギン酸
リアーゼ活性を測定した。

【００４９】図６に７種の断片ＤＮＡの大きさ及び比活
性（ｕｎｉｔ／ｍｇ蛋白質）を示す。比活性とはＥ．ｂ
ｉｃｙｃｌｉｓから単離されたアルギン酸ナトリウム
（平均分子量２５７００、１．０Ｐａ・ｓ）を基質とし
て測定されたアルギン酸リアーゼ活性を言う。■はベク
タープラスミドｐＫＫ２２３−３を、また□は断片ＤＮ
Ａを示す。制限酵素としては、Ｂ：ＢａｌＩ、Ｅ：Ｅｃ
ｏＲＩ、Ｋ：ＫｐｎＩ、Ｐ：ＰｖｕＩＩ、Ｓ：Ｓｐｈ
Ｉ、及びＸ：ＸｈｏＩを用いた。

【００５０】図７のｐＡＬＹ１−１、−２及び−３を持
つ３種の形質転換体はアルギン酸リアーゼ活性を示し、
その活性のレベルは、ｐＡＬＹ１で形質転換された大腸
菌ＤＨ１の細胞と殆ど同じであった。ｐＡＬＹ１−３
は、Ａｌ−Ｉリアーゼ（分子量６００００）をコードす
るのに十分な最小の挿入物（２．２ｋｂ）を含んでい
た。

【００５１】該挿入物（ＸｈｏＩ−ＢａｌＩ断片）をＭ
１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９ファージベクター〔い
ずれも宝酒造（株）製〕にサブクローンし、単鎖ＤＮＡ
を得、その塩基配列をＤＮＡシークエンサー（商品名：
ＤＮＡＳＩＳ、日立（株）製）を用いて分析したとこ
ろ、該挿入物は長さ２１７６ｂｐで、配列番号：１で示
される塩基配列を有していることが判った。

【００５２】この結果は、２種の可能なオープンリーデ
ィングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍ
ｅ）すなわち＋１から始まり＋１８６６で終わるもの
（ＯＲＦ１）及び＋７０から始まり＋１８６６で終わる
もの（ＯＲＦ２）が存在することを示しているが、分子
量６７０００以上で弱いアルギン酸リアーゼ活性を示す
蛋白質が、ｐＡＬＹ１を有する大腸菌ＤＨ１の細胞抽出
物の部分的な精製サンプルから検出されたことから、Ｏ
ＲＦ１がＡｌ−Ｉリアーゼのオープンリーディングフレ
ームと考えられる。該ＯＲＦ１は１８６６ｂｐからな
り、６２２のアミノ酸を有するポリペプチドをコードで
きる。

【００５３】上記のＡｌ−ＩリアーゼのＮ末端アミノ酸
配列及びＡｌ−Ｉ′リアーゼのＮ末端アミノ酸配列は、
５５番のヒスチジン（Ｈｉｓ）から７４番アラニン（Ａ
ｌａ）までの推定配列と一致していた。それゆえ、まず
分子量６９１５３の前駆物質が合成され、該前駆物質の
５４番目のアラニンと５５番目のヒスチジンの結合を切
断して分子量５４７２のポリペプチド（すなわちMet Hi
s Ala Phe Gly Ile Leu Ala Thr Thr Arg Val Gly Ala
Ala Arg Glu Lys Ser Gly Asp Ser Ser Met Phe Asp Il
e Pro Phe Pro Gly His Gly Arg Arg Leu Ala Val Ala
Ala Leu Ala Phe Ala Gly Cys Ala Phe Ala Gly Ser Le
u Gln Ala ）を取り除くことにより、完全な形のＡｌ−
Ｉリアーゼが形成されるものと考えられる。

【００５４】菌株Ａｌは３種のアルギン酸リアーゼすな
わち分子量６００００のＡｌ−Ｉ、分子量２５０００の
Ａｌ−II−２及び分子量３８０００のＡｌ−III を生産
する。Ａｌ−II−２とＡｌ−III の分子量の和は、Ａｌ
−Ｉのそれとほぼ一致する。Ａｌ−ＩリアーゼのＮ末端
アミノ酸配列は、Ａｌ−III リアーゼのそれと一致する
（５５番目のヒスチジンから７４番目のアラニンまでの
アミノ酸配列）。更に、塩基配列中、４１４番目のアラ
ニンから４３３番目のバリンまでのアミノ酸配列は、Ａ
ｌ−II−２リアーゼのＮ末端の最初の２０個のアミノ酸
配列と一致している。 実施例２（アルギン酸リアーゼの製造） 実施例１で得られた形質転換大腸菌ＤＨ１を２０リット
ルの培地（２リットル容の坂口フラスコに１リットルず
つ入れる）中にて、好気的に３０℃で２４時間培養し
た。培地としては、ＡＬＧ培地〔０．５％肉エキス、
１．０％バクトペプトン、０．５％塩化ナトリウム、
０．１％アルギン酸ナトリウム（１．０Ｐａ・ｓ）、ｐ
Ｈ７．２〕にアンピシリンを２０μｇ／ｍｌの濃度で加
えたものを用いた。

【００５５】培養終了後、培養物から細胞（湿重量４９
ｇ）を分離し、０．８５％塩化ナトリウムで一度洗浄
し、６０ｍｌの１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に懸濁し、０℃で１０分間超音波処理した（９
ｋＨｚ）。細胞懸濁物を４℃で３０分間遠心分離し（２
５０００×ｇ）、細胞抽出物（上清）をＡｌ−Ｉ′リア
ーゼ精製出発物として用いた（大腸菌ＤＨ１の細胞から
得られたアルギン酸リアーゼを、菌株ＡｌのＡｌ−Ｉリ
アーゼと区別するために、以後「Ａｌ−Ｉ′」とい
う）。該細胞抽出物（２２０ｍｌ、蛋白質量４７５０ｍ
ｇ）を、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で
平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（４ｃｍ×４０
ｃｍ）に通し、塩化ナトリウムの濃度が０〜０．５Ｍの
直線勾配である前記緩衝液で蛋白質を溶出した。７分毎
に１３ｍｌずつ集めた。非吸着フラクションに含まれる
Ａｌ−Ｉ′リアーゼを集め（３９０ｍｇ、蛋白質量１９
８０ｍｇ）、５．０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（３
ｃｍ×３０ｃｍ）に通し、前記緩衝液の５．０〜５００
ｍＭの直線濃度勾配（８００ｍｌ）で蛋白質を溶出し、
５分毎に５ｍｌずつ集めた。前記緩衝液濃度が約０．１
５Ｍのところで溶出した活性フラクションを集め（８０
ｍｌ、蛋白質量１１９ｍｇ）、３０％硫酸アンモニウム
で飽和し、３０％硫酸アンモニウム飽和５．０ｍＭリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したブチルト
ヨパール６５０Ｍカラム（２ｃｍ×１５ｃｍ）に通し
た。蛋白質を、硫酸アンモニウムの直線濃度勾配が３０
〜０％飽和の５．０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）で溶出し、５分毎に２．５ｍｌずつ集めた。硫
酸アンモニウム濃度が約２０％飽和のところで溶出した
活性フラクションを集め、アミコンＰＭ１０膜を用いた
限外濾過により４ｍｌ（タンパク質量２２ｍｇ）に濃縮
し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡
化したセファデックスＧ−１５０カラム（１．５ｃｍ×
９０ｃｍ）に通した。前記トリス−塩酸緩衝液で酵素を
溶出させ、５分毎に２ｍｌずつ集めた。Ｖｅ／Ｖｏ＝
１．４（Ｖｅ：溶出した蛋白質の容量、Ｖｏ：カラムの
容量）のところに溶出した活性フラクションを集め、上
記と同様にして濃縮した。濃縮物（４ｍｌ、蛋白質量
４．２ｍｇ）を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
０）で平衡化したＱＡＥ−セファデックスＡ−２５カラ
ム（２ｃｍ×４０ｃｍ）に通した。前記トリス−塩酸緩
衝液で酵素を溶出し、３分毎に２．５ｍｌずつ集めた。
非吸着フラクションに溶出した活性フラクションを集
め、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、４
℃で一晩透析し、上記と同様にして約２ｍｌに濃縮し、
Ａｌ−Ｉ′リアーゼの特定に用いた。

【００５６】Ａｌ−Ｉ′リアーゼの各精製工程における
総蛋白質量、総活性、比活性、収率及び精製度を下記表
６に示す。

【００５７】

【表６】 ＱＡＥ−セファデックスＡ−２５による精製後のＡｌ−
Ｉ′リアーゼは、ＳＤＳの非存在下にポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動的に単一であったＡｌ−Ｉ′リアーゼの
分子量を、セファデックスＧ−１５０カラムを用いたゲ
ル濾過により約６００００と決定した（図７（ａ））。
またＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によれば、
該酵素は分子量６００００の単一蛋白質バンドとして移
動した（図７（ｂ））。Ａｌ−Ｉ′リアーゼの溶出位置
を矢印で示す。図７Ａのマーカー蛋白質としては、ａ：
牛血清アルブミン（６７ｋＤａ）、ｂ：卵白アルブミン
（４３ｋＤａ）、ｃ：キモトリプシノーゲンＡ（２５ｋ
Ｄａ）、ｄ：リボヌクレアーゼ（１３．７ｋＤａ）を用
いた。図７（ｂ）において、レーン１：Ａｌ−Ｉ′リア
ーゼ（３０μｇ）、レーン２：マーカー蛋白質（一番上
から）ミオシン（Ｈ鎖）、ホスホリラーゼｂ、牛血清ア
ルブミン、卵白アルブミン、α−キモトリプシノーゲ
ン、β−ラクトグロブリン及びリゾチームである。

【００５８】ｐＩ９．０のＡｌ−Ｉ′リアーゼはｐＨ
８．０、７０℃で最も強い活性を有し、海草由来（非ア
セチル化）アルギン酸及び細菌由来（アセチル化）アル
ギン酸を分解した。またＡｌ−Ｉ′リアーゼの最初の２
０個のアミノ酸配列は、His-Pro-Phe-Asp-Gln-Ala-Val-
Val-Lys-Asp-Pro-Thr-Ala-Ser-Tyr-Val-Asp-Val-Lys-Al
a-と決定された。これはＡｌ−Ｉリアーゼのそれと一致
した。

【００５９】ｐＡＬＹ１を導入した大腸菌ＤＨ１の細胞
から得られたＡｌ−Ｉ′リアーゼは、分子構造（モノマ
ー、分子量６００００）、ｐＩ（９．０）、基質特異性
（細菌由来アルギン酸よりも海草由来アルギン酸に対し
て高活性）及びＮ末端のアミノ酸配列の点で極めて類似
している。この結果から、菌株ＡｌのＡｌ−Ｉリアーゼ
遺伝子が大腸菌ＤＨ１の細胞中で修飾を受けないこと、
及び、該Ａｌの細胞が３種のアルギン酸リアーゼ、すな
わちＡｌ−Ｉ（分子量６００００）、Ａｌ−II−２（分
子量２５０００）及びＡｌ−III （分子量３８０００）
を合成し得ることが判る。

【配列表】

【００６０】配列番号：１ 配列の長さ：２１７６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：染色体ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２４４．．２１０９ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４５４．．５１３ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１５３１．．２１０９ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGATCCTCTA GAGTCCCAGC TTCGACGACC TGCCGCTGGC ACAGTTGTGC CGGCCGGCGC 60 TGACTTCGGT CGGTGTCGAT CGGCGCGCAC TTGGCCGCAT TGCTGTCGAG CGGTTGCTGT 120 CGCGTCTCGA ATCTGTCGAA GGCCCGACGT ACGCATCGAA GTCGGCGCAC GTCTGACCAT 180 CCGCGATAGT ACGCGCCCAG TCTGACGTGT CGCTCTCACC CAGCCCCGAA TGCCTCTATC 240 CGA ATG CAT GCC TTT GGC ATC CTT GCA ACG ACG CGC GTG GGG GCT GCG 288 Met His Ala Phe Gly Ile Leu Ala Thr Thr Arg Val Gly Ala Ala 1 5 10 15 CGC GAA AAA TCT GGA GAC AGT TCG ATG TTT GAC ATC CCG TTC CCG GGG 336 Arg Glu Lys Ser Gly Asp Ser Ser Met Phe Asp Ile Pro Phe Pro Gly 20 25 30 CAT GGC CGT CGT CTG GCC GTC GCC GCG CTT GCG TTC GCA GGT TGT GCC 384 His Gly Arg Arg Leu Ala Val Ala Ala Leu Ala Phe Ala Gly Cys Ala 35 40 45 TTC GCG GGC AGC CTG CAG GCA CAC CCC TTC GAC CAG GCC GTC GTG AAA 432 Phe Ala Gly Ser Leu Gln Ala His Pro Phe Asp Gln Ala Val Val Lys 50 55 60 GAC CCC ACG GCC TCG TAT GTC GAC GTC AAG GCG CGT CGT ACC TTC TTG 480 Asp Pro Thr Ala Ser Tyr Val Asp Val Lys Ala Arg Arg Thr Phe Leu 65 70 75 CAG AGC GGG CAG CTC GAT GAC CGC CTC AAG GCA GCG CTG CCC AAG GAG 528 Gln Ser Gly Gln Leu Asp Asp Arg Leu Lys Ala Ala Leu Pro Lys Glu 80 85 90 95 TAC GAC TGC ACG ACC GAG GCA ACG CCT AAC CCG CAG CAA GGC GAG ATG 576 Tyr Asp Cys Thr Thr Glu Ala Thr Pro Asn Pro Gln Gln Gly Glu Met 100 105 110 GTC ATT CCG CGC CGT TAT CTT TCC GGC AAT CAC GGC CCG GTG AAT CCG 624 Val Ile Pro Arg Arg Tyr Leu Ser Gly Asn His Gly Pro Val Asn Pro 115 120 125 GAC TAC GAA CCG GTG GTG ACG CTT TAT CGT GAT TTC GAG AAA ATT TCC 672 Asp Tyr Glu Pro Val Val Thr Leu Tyr Arg Asp Phe Glu Lys Ile Ser 130 135 140 GCC ACG CTT GGA AAT CTC TAC GTT GCG ACG GGC AAG CCG GTG TAC GCC 720 Ala Thr Leu Gly Asn Leu Tyr Val Ala Thr Gly Lys Pro Val Tyr Ala 145 150 155 ACT TGT CTG CTG AAC ATG CTG GAC AAG TGG GCC AAG GCC GAC GCG TTG 768 Thr Cys Leu Leu Asn Met Leu Asp Lys Trp Ala Lys Ala Asp Ala Leu 160 165 170 175 CTC AAC TAC GAC CCC AAG TCG CAG TCG TGG TAC CAA GTC GAA TGG TCG 816 Leu Asn Tyr Asp Pro Lys Ser Gln Ser Trp Tyr Gln Val Glu Trp Ser 180 185 190 GCG GCG ACC GCC GCC TTT GCC CTG TCG ACG ATG ATG GCC GAG CCG AAC 864 Ala Ala Thr Ala Ala Phe Ala Leu Ser Thr Met Met Ala Glu Pro Asn 195 200 205 GTC GAC ACA GCC CAG CGC GAG CGT GTG GTG AAG TGG CTC AAC CGT GTG 912 Val Asp Thr Ala Gln Arg Glu Arg Val Val Lys Trp Leu Asn Arg Val 210 215 220 GCG CGC CAT CAG ACG AGC TTT CCG GGG GGC GAC ACG AGT TGC TGC AAC 960 Ala Arg His Gln Thr Ser Phe Pro Gly Gly Asp Thr Ser Cys Cys Asn 225 230 235 AAT CAC TCG TAT TGG CGC GGT CAG GAA GCG ACC ATC ATC GGC GTG ATC 1008 Asn His Ser Tyr Trp Arg Gly Gln Glu Ala Thr Ile Ile Gly Val Ile 240 245 250 255 AGC AAG GAC GAT GAA CTC TTC CGT TGG GGG CTG GGC CGT TAT GTG CAG 1056 Ser Lys Asp Asp Glu Leu Phe Arg Trp Gly Leu Gly Arg Tyr Val Gln 260 265 270 GCG ATG GGG CTG ATC AAT GAA GAC GGC AGC TTC GTG CAT GAA ATG ACG 1104 Ala Met Gly Leu Ile Asn Glu Asp Gly Ser Phe Val His Glu Met Thr 275 280 285 CGT CAC GAA CAG TCC TTG CAC TAT CAG AAC TAC GCC ATG CTG CCG CTG 1152 Arg His Glu Gln Ser Leu His Tyr Gln Asn Tyr Ala Met Leu Pro Leu 290 295 300 ACG ATG ATT GCC GAA ACG GCA TCA CGT CAG GGT ATC GAT CTG TAC GCG 1200 Thr Met Ile Ala Glu Thr Ala Ser Arg Gln Gly Ile Asp Leu Tyr Ala 305 310 315 TAC AAA GAG AAC GGT CGC GAT ATT CAC TCA GCG CGC AAG TTT GTC TTT 1248 Tyr Lys Glu Asn Gly Arg Asp Ile His Ser Ala Arg Lys Phe Val Phe 320 325 330 335 GCT GCG GTG AAG AAC CCG GAC CTC ATC AAG AAG TAC GCT TCC GAG CCG 1296 Ala Ala Val Lys Asn Pro Asp Leu Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Glu Pro 340 345 350 CAG GAT ACG CGT GCC TTC AAG CCG GGG CGG GGC GAC CTG AAC TGG ATC 1344 Gln Asp Thr Arg Ala Phe Lys Pro Gly Arg Gly Asp Leu Asn Trp Ile 355 360 365 GAA TAC CAG CGC GCG CGC TTT GGT TTT GCC GAT GAG CTG GGC TTC ATG 1392 Glu Tyr Gln Arg Ala Arg Phe Gly Phe Ala Asp Glu Leu Gly Phe Met 370 375 380 ACG GTG CCG ATC TTC GAT CCG CGT ACC GGT GGT TCG GGC ACT TTG CTG 1440 Thr Val Pro Ile Phe Asp Pro Arg Thr Gly Gly Ser Gly Thr Leu Leu 385 390 395 GCG TAC AAA CCG CAA GGC GCG GCA GCG CAG GCG CCG GTG TCC GCC CCG 1488 Ala Tyr Lys Pro Gln Gly Ala Ala Ala Gln Ala Pro Val Ser Ala Pro 400 405 410 415 GCA GCG GCG CAT TCG TCG ATC GAC CTG TCG AAG TGG AAG CTG CAG ATT 1536 Ala Ala Ala His Ser Ser Ile Asp Leu Ser Lys Trp Lys Leu Gln Ile 420 425 430 CCG GTC GAC CCG ATC GAT GTC GCC ACG CGT GAT CTG CTC AAG GGT TAT 1584 Pro Val Asp Pro Ile Asp Val Ala Thr Arg Asp Leu Leu Lys Gly Tyr 435 440 445 CAG GAC AAG TAC TTC TAC GTC GAC AAG GAT GGC TCG CTT GCC TTC TGG 1632 Gln Asp Lys Tyr Phe Tyr Val Asp Lys Asp Gly Ser Leu Ala Phe Trp 450 455 460 TGT CCG GCC AGC GGT TTC AAG ACG ACG GCC AAC ACG AAG TAC CAC GCG 1680 Cys Pro Ala Ser Gly Phe Lys Thr Thr Ala Asn Thr Lys Tyr His Ala 465 470 475 CAG CGA GCT GCG CGA AAT GCT CGA TCC CGA CAA CCA CGC GGT GAA TTG 1728 Gln Arg Ala Ala Arg Asn Ala Arg Ser Arg Gln Pro Arg Gly Glu Leu 480 485 490 495 GGG CTG GCA AGG CAC CCA CGA AAT GAA TCT GCG CGG AGC GGT GAT GCA 1776 Gly Leu Ala Arg His Pro Arg Asn Glu Ser Ala Arg Ser Gly Asp Ala 500 505 510 CGT GTC GCC CAG TGG CAA GAC CAT TGT CAT GCA GAT TCA TGC CGT CAT 1824 Arg Val Ala Gln Trp Gln Asp His Cys His Ala Asp Ser Cys Arg His 515 520 525 GCC CGA TGG CTC GAA TGC GCC GCC GCT GGT CAA GGG GCA GTT CAT CAA 1872 Ala Arg Trp Leu Glu Cys Ala Ala Ala Gly Gln Gly Ala Val Leu Gln 530 535 540 GAA CAC GCT GGA TTT TCT TGT GAA GAA CTC GGC CGC TGG CGG CAA GGA 1920 Glu His Ala Gly Phe Ser Cys Glu Glu Leu Gly Arg Trp Arg Gln Gly 545 550 555 CAC GCA CTA CGT GTT CGA AGG CAT CGA ACT GGG CAA GCC GTA CGA TGC 1968 His Ala Leu Arg Val Arg Arg His Arg Thr Gly Gln Ala Val Arg Cys 560 565 570 575 GCA GAT CAA AGT GGT GGA CGG TGT GTT GTC GAT GAC GGT CAA CGG GCA 2016 Ala Asp Gln Ser Gly Gly Arg Cys Val Val Asp Asp Gly Gln Arg Ala 580 585 590 GAC CAA GAC CGT CGA TTT CGT CGC CAA GGA CGC CGG CTG GAA AGA CCT 2064 Asp Gln Asp Arg Arg Phe Arg Arg Gln Gly Arg Arg Leu Glu Arg Pro 595 600 605 GAA GTT CTA TTT CAA GGC GGG CAA TTA CTT GCA GGA CCG CCA GGC 2109 Glu Val Leu Phe Gln Gly Gly Gln Leu Leu Ala Gly Pro Pro Gly 610 615 620 TGACGGGTCG GACACCAGCG CGCTGGTCAA GTTGTACAAG CTCGACGTAA AGCACTCGAC 2169 CTGCAGG 2176

【図面の簡単な説明】

【図１】図１（ａ）は参考例１におけるＡｌ−II−２リ
アーゼのゲル濾過の結果を示す図面、及び図１（ｂ）は
実施例１におけるＡｌ−II−２リアーゼのポリアクリル
アミドゲル電気泳動の結果を示す図面である。

【図２】参考例２におけるヒドロキシアパタイトカラム
クロマトグラフィーによるアルギン酸リアーゼ活性の分
離を示す図面である。

【図３】参考例２におけるＳ−セファロースカラムクロ
マトグラフィー後のアルギン酸リアーゼ活性の分離を示
す図面である。

【図４】参考例２におけるＳ−セファロースカラムクロ
マトグラフィー後のＡｌ−IIIリアーゼのリアーゼ活性
の分離を示す図面である。図４（ａ）及び図４（ｂ）は
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面であ
り、図４（ｃ）はゲル濾過の結果を示す図面である。

【図５】試験例１におけるサザンハイブリダイゼーショ
ンの結果を示す図面である。

【図６】試験例２における７種の断片ＤＮＡの大きさ及
び特活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ蛋白質）を示す図面である。

【図７】実施例２におけるＡｌ−Ｉ′リアーゼのゲル濾
過の結果を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:20） (72)発明者 阿部 士朗 京都府綾部市井倉新町石風呂１番地 グ ンゼ株式会社京都研究所内 (72)発明者 久野 智弘 京都府綾部市井倉新町石風呂１番地 グ ンゼ株式会社京都研究所内 (72)発明者 西村 稔 京都府綾部市井倉新町石風呂１番地 グ ンゼ株式会社京都研究所内 (72)発明者 米本 善政 徳島県徳島市川内町加賀須野463 大塚 化学株式会社食品研究所内 (72)発明者 山下 哲男 徳島県徳島市川内町加賀須野463 大塚 化学株式会社食品研究所内 (56)参考文献 特開 平４−141090（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−15387（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−224484（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で示される塩基配列を有する
   アルギン酸リアーゼ発現遺伝子。
2. 【請求項２】請求項１のアルギン酸リアーゼ発現遺伝子
   の導入により形質転換された微生物を培養し、得られる
   培養物からアルギン酸リアーゼを単離することを特徴と
   するアルギン酸リアーゼの製造法。
3. 【請求項３】微生物が細菌である請求項２に記載の製造
   法。