JPH07163385A

JPH07163385A - オリゴ糖の製造方法

Info

Publication number: JPH07163385A
Application number: JP6179242A
Authority: JP
Inventors: Hideki Nagae; 英樹永江; Fumihide Yamaguchi; 文秀山口; Yasushi Sugano; 靖史菅野
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-29
Publication date: 1995-06-27

Abstract

(57)【要約】【構成】寒天もしくはアガロースもしくはそれから派
生するオリゴ糖を基質として、アガラーゼ活性を有する
酵素を作用させることによって、ネオアガロビオース、
またはそれを含む低分子のオリゴ糖の製造する方法。【効果】澱粉および澱粉含有製品の老化防止に最も効
果の高い２糖を中心とする重合度の低いオリゴ糖を効果
的に製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特定の２種のβ−アガ
ラーゼを少なくとも１種用いたオリゴ糖またはそれを含
む低分子のオリゴ糖の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】澱粉および澱粉含有製品は、食用の他に
接着剤等の用途がある。しかし、それらの製品中に水分
が含まれている場合、澱粉と水分の相互作用により製品
の柔軟性が低下し、老化現象が生じる。これは、食品で
は保湿性の低下による硬化、また接着剤等の非食用製品
においては乾燥によるひび割れ等の劣化現象の直接要因
となっている。この老化現象を抑制するために、従来多
くの試みがなされている。例えば、澱粉含有食品に対す
るデキストリン、ソルビット、脂肪酸モノグリセリド、
レシチン等の添加、非食用製品に対するグリセリン、ホ
ルムアミド等の添加が行われている。

【０００３】しかしながら、上記添加物による老化防止
は、完全ではなく、またホルムアミド等の使用は作業環
境上の危険をともなう。このため、より効果が大きく、
安全性の高い老化防止物質の開発が待望されてきた。

【０００４】これに対して、近年、寒天由来のオリゴ糖
の老化防止効果が強力であるという報告がなされている
（特開昭62-210955号公報）。その製造方法の特徴は、
従来のアガラーゼ、例えば、シュードモナス・エスピー
Ｎ−７（微工研菌寄第９８８４号）の生産するアガラ
ーゼを用い、寒天を原料としてオリゴ糖を製造するもの
であり、この方法で製造されたオリゴ糖液の60％以上が
６糖以上のオリゴ糖と難分解物で占められるというもの
である（特開平2-65788号公報、同2-65789号公報) 。

【０００５】これらのオリゴ糖は、その重合度により、
老化防止効果に顕著な差異がある。一般的にオリゴ糖の
重合度が大きくなるほど老化防止効果は弱くなり、重合
度が小さくなれば強くなるといわれている。すなわち20
糖以上のオリゴ糖では老化防止の効果はなく、十分な効
果を得るためには４糖以下、最大効果を得るためには２
糖が必要であるとされている。

【０００６】しかしながら、上述のごとく従来のオリゴ
糖の製造方法では、得られたオリゴ糖の内、４糖以下の
オリゴ糖は40％以下であり、特に、２糖に至っては、３
％にも満たないのが現状である。したがって、澱粉およ
び澱粉含有製品の老化防止に最も効果の高い２糖を効果
的かつ大量に製造することができる手段が望まれてい
た。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、２糖
を中心とした低分子のオリゴ糖を効果的かつ大量に製造
することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み鋭意研究を重ねた結果、海洋性細菌ビブリオ（Vi
brio）sp. JT0107-L4（FERM P-12092）の生産するβ−
アガラーゼを使用することにより老化防止効果の高い２
糖を製造することに成功した。さらには、同じく２糖を
製造することのできる同菌の生産するもう１種のβ−ア
ガラーゼを新たに見出し、これら両β−アガラーゼを用
いる以下の各方法により、前記課題を解決できる知見を
得、本発明を完成するに至った。

【０００９】本発明は、寒天もしくはアガロースもしく
はそれから派生するオリゴ糖を基質として、下記の理化
学的性質のβ−アガラーゼＡを作用させることによるネ
オアガロビオースの製造方法である。本発明はまた、寒
天もしくはアガロースもしくはそれから派生するオリゴ
糖を基質として、下記の理化学的性質のβ−アガラーゼ
Ａを作用させることによりネオアガロビオースを含む低
分子のオリゴ糖を製造することを特徴とするオリゴ糖の
製造方法である。

【００１０】作用少なくとも寒天およびアガロースのすべてのβ−１，４
結合をエンド型に分解して低分子化する反応を触媒す
る。基質特異性寒天、およびアガロースを加水分解するが、カラギーナ
ン、アルギン酸には作用しない。至適pH 7〜8.5(30℃) 至適温度 30℃ pH安定性 6.0〜9.0 熱安定性 50℃、15分間の加熱で最大活性の85％を保持する。等電点 6.3 分子量約 95,000（10-20％ SDS-ポリアクリルアミドゲル電気
泳動による）約 105,300（全塩基配列から推定されるアミノ酸配列に
よる）アミノ酸末端配列 Ala→Thr →Leu →Val →Thr →Ser →Phe

【００１１】本発明は、寒天もしくはアガロースもしく
はそれから派生するオリゴ糖を基質として、下記の理化
学的性質のβ−アガラーゼＢを作用させることによるネ
オアガロビオースの製造方法である。本発明はまた、寒
天もしくはアガロースもしくはそれから派生するオリゴ
糖を基質として、下記の理化学的性質のβ−アガラーゼ
Ｂを作用させることによりネオアガロビオースを含む低
分子のオリゴ糖を製造することを特徴とするオリゴ糖の
製造方法である。

【００１２】作用少なくとも寒天およびアガロ−スのβ−１，４結合を加
水分解して低分子化する反応を触媒する。基質特異性 β- １，４ガラクトシド結合を有するアガロース，寒天
などのガラクタン系の多糖ならびにネオアガロヘキサオ
ース以上のオリゴ糖に作用する。ネオアガロテトラオー
ス、ネオアガロビオース、アルギン酸には作用しにく
い。至適ｐＨ 8.0 ｐＨ安定性 5.0〜9.0 至適温度 30℃ 熱安定性 20分間加熱した場合、 30℃では初期活性の約100％を保
持し、35℃では約85％、40℃では約20％の残存活性を保
持する。分子量約72,000（7.5％ SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による）等電点約4.7 アミノ末端アミノ酸配列 Val →Thr →Val →Ser →Asn →Ala →Asp →Phe →Tr
p →Asn

【００１３】本発明は、寒天もしくはアガロースもしく
はそれから派生するオリゴ糖を基質として、β−アガラ
ーゼＡとβ−アガラーゼＢを作用させることによるネオ
アガロビオースの製造方法である。本発明はまた、寒天
もしくはアガロースもしくはそれから派生するオリゴ糖
を基質として、β−アガラーゼＡとβ−アガラーゼＢを
作用させることによりネオアガロビオースを含む低分子
のオリゴ糖を製造することを特徴とするオリゴ糖の製造
方法である。

【００１４】以下、本発明について詳しく説明する。本
発明において、「アガロース」は、寒天の主要な多糖成
分であり、Ｄ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ
−ガラクトースとが交互にα−１，３結合及びβ−１，
４結合を繰り返してなるものである。また、「寒天もし
くはアガロースから派生するオリゴ糖」とは、４糖以上
20糖以下、好ましくは４糖以上10糖以下の糖をいうが、
具体的には、ネオアガロテトラオース、ネオアガロヘキ
サオース、ネオアガロオクタオース、およびネオアガロ
デカオース等が挙げられる。

【００１５】β−アガラーゼＡを使用してネオアガロビ
オース、あるいはネオアガロビオースを含む低分子のオ
リゴ糖を製造する場合、上記に定義される寒天もしくは
アガロースもしくはそれから派生するオリゴ糖のいずれ
かを基質（原料）として使用すればよいが、特に２糖で
あるネオアガロビオースを製造する場合、ネオアガロテ
トラオースを使用するのが好ましい。

【００１６】β−アガラーゼＢを使用してネオアガロビ
オース、またはそれを含む低分子のオリゴ糖を製造する
場合、上記に定義される寒天もしくはアガロースもしく
はそれから派生するオリゴ糖のいずれかを基質（原料）
として使用すればよいが、特に２糖であるネオアガロビ
オースを製造する場合、ネオアガロヘキサオースを使用
するのが好ましい。

【００１７】β−アガラーゼＡとβ−アガラーゼＢを使
用してネオアガロビオース、またはそれを含む低分子の
オリゴ糖を製造する場合、上記に定義される寒天もしく
はアガロースもしくはそれから派生するオリゴ糖のいず
れかを基質（原料）として使用すればよいが、好ましく
はネオアガロヘキサオースを使用するのがよい。

【００１８】β−アガラーゼＡとβ−アガラーゼＢを作
用させる場合、まずβ−アガラーゼＢを作用させた後
に、β−アガラーゼＡを作用させるのが好ましいが、同
時に作用させてもよい。

【００１９】上記の各基質（原料）は必ずしも精製され
たものである必要はなく、また混合物であってもよい。

【００２０】本発明の上記のいずれかの方法において、
ネオアガロビオース、またはそれを含む低分子のオリゴ
糖が製造される。ここで「低分子のオリゴ糖」とは、４
糖以上６糖以下の糖をいい、例えば、ネオアガロテトラ
オース、ネオアガロヘキサオース、ならびにそれらの混
合物を言う。

【００２１】本発明に用いるβ−アガラーゼＡおよびβ
−アガラーゼＢの一例である後述の製造例１および製造
例２で得られる精製品（アガラーゼ0107およびアガラー
ゼ0072）の理化学性質をそれぞれ以下に示す。

【００２２】第一にアガラーゼ0107の理化学的性質を以
下に示す。尚、酵素活性の測定は、酵素反応によって生
じた還元糖の量をネルソン−ソモギ法により以下のよう
にして測定する。

【００２３】（酵素活性測定方法）20mMトリス塩酸緩衝
液(pH8.0) に溶解した0.2%の低温融解性アガロ−ス（シ
グマ社製）のゲルを作製し、この90μl を基質として、
アガラーゼ0107を含む溶液10μlと混合し、30℃にて、5
〜15分間、好ましくは５分間反応させる。反応終了
後、銅試薬100μlを加え沸騰水中で、10分間加熱する。
加熱後、水で急速冷却し、ネルソン試薬100μlを加え、
蒸留水で全容積を2.5mlにする。60分後に660nmの吸光度
を測定し、測定値をガラクト−ス量に換算し１分間当
り、１マイクロモルのガラクト−ス量に相当する還元糖
を与える酵素活性を１単位（１Ｕ）とする。

【００２４】(1) 作用少なくとも寒天およびアガロースのすべてのβ−１，４
結合をエンド型に分解して低分子化する反応を触媒す
る。

【００２５】(2) 基質特異性寒天、およびアガロースを加水分解するが、カラギーナ
ン、アルギン酸には作用しない。

【００２６】(3) 至適pH pHを４および５（酢酸緩衝液），６および７（リン酸緩
衝液），８（トリス塩酸緩衝液），９および10（グリシ
ン水酸化ナトリウム緩衝液）に調製した0.2%の低温融解
性アガロ−ス（シグマ社製）のゲル90μlにアガラーゼ0
107を含む溶液(0.2μg/μl)10μlを加え、30℃にて、5
分間反応させた。反応終了後、銅試薬100μlを加え沸騰
水中で、10分間加熱した。加熱後、水で急速冷却し、ネ
ルソン試薬100μlを加え、蒸留水で全容積を2.5mlにし
た。60分後に660nmの吸光度を測定した。その結果、図
１に示したように至適pHは、7.0〜8.5の中性から弱アル
カリ性であった。

【００２７】(4) 至適温度 20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に溶解した0.2%の低温融
解性アガロ−ス（シグマ社製）のゲル90μlに、アガラ
ーゼ0107を含む溶液(0.08μg/μl)10μlを加え25℃で、
2,5,10,20,30,40,50,60分間保温した後、それぞれ生成
した還元糖の量をネルソン−ソモギ法により測定した。
同様にして30,35,40℃での反応生成物の還元糖の量を測
定した。この結果、30℃での反応生成物の量が最も多く
なったので、オリゴ糖を得るための至適温度は30℃と決
定した。これを図２に示した。

【００２８】(5)pH 安定性 pHを3.6〜5.6（酢酸緩衝液）,5.5〜7.6（リン酸緩衝
液）,7.5〜9.0（トリス塩酸緩衝液）,9.0〜10（グリシ
ン水酸化ナトリウム緩衝液）で調製した酵素溶液の活性
を酵素活性測定法に従って測定し、各pHでの活性値を10
0とし、これを初期値とした。さらに各酵素溶液を４
℃、１週間保存した後、残存活性を測定し、初期値の80
％以上を保持するpH領域を求めたところ、6.0〜9.0であ
った。

【００２９】(6) 熱安定性該酵素溶液(0.1μg/μl)10μlを30℃、40℃、50℃、60
℃の水浴中で15分間加熱した後、酵素活性測定法に従っ
て酵素活性を測定した。該酵素溶液の非加熱時の活性を
100%として活性を比較したところ、図３に示したよう
に、30℃、40℃では100%、50℃で85%の残存活性を示し
た。なお60℃ではほぼ完全に失活した。

【００３０】(7) 等電点ファルマシア社製ファストゲルIEF4-6.5を用いて、同社
製ファストシステム等電点測定装置にて測定したところ
約6.3であった。

【００３１】(8) 分子量 SDSを含むポリアクリルアミドゲルの濃度が10〜20%のグ
ラジエントゲルで、分子量マーカー（分子量94,000のホ
スホリラーゼ、67,000の牛血清アルブミン、43,000の卵
白アルブミン）とともに電気泳動した結果、該酵素の分
子量は約95,000と求められた。また、当該酵素の全塩基
配列から推定されるアミノ酸配列から分子量を計算する
と約105,300と求められた。該酵素の全塩基配列は、特
願平5-96549に示されている。これにより、本酵素は公
知のアガラーゼと区別される。

【００３２】(9) アミノ末端アミノ酸配列の測定該酵素のアミノ末端アミノ酸配列を、エドマン分解法に
より決定した。該酵素溶液(0.4μg/μl)100μlを、0.1%
SDSを含む蒸留水を透析外液として透析し、その酵素溶
液をアミノ酸配列分析装置477Aプロテインシークエンサ
ー（アプライドバイオシステムズ社製）により、アミノ
末端側7 個のアミノ酸配列を決定した。その結果、配列
は、Ala →Thr →Leu →Val →Thr →Ser →Phe であっ
た。

【００３３】(10)その他の特性溶解性：水に可溶紫外部吸収：λmax=280nm

【００３４】第二にアガラーゼ0072の理化学的性質を以
下に示す。尚、酵素活性の測定は、酵素反応によって生
じた還元糖の量をネルソン−ソモギ法により以下のよう
にして測定する。

【００３５】（酵素活性測定方法）20mMトリス塩酸緩衝
液(pH8.0)に溶解した0.2%の低温融解性アガロ−ス（シ
グマ社製）のゲルを作製し、この180μlを基質として、
アガラーゼ0072を含む溶液20μlと混合し、30℃で５分
間反応させる。反応終了後、銅試薬200μlを加え沸騰水
中で、10分間加熱する。加熱後、水で急速冷却し、ネル
ソン試薬200μlを加え、蒸留水で全容積を5.0mlにす
る。60分後に660nmの吸光度を測定し、測定値をガラク
ト−ス量に換算し１分間当り、１マイクロモルのガラク
ト−ス量に相当する還元糖を与える酵素活性を１単位
（１Ｕ）とする。

【００３６】(1) 作用少なくとも寒天およびアガロ−スのβ−１，４結合を加
水分解して低分子化する反応を触媒する。

【００３７】(2) 基質特異性 β- １，４ガラクトシド結合を有するアガロース，寒天
などのガラクタン系の多糖ならびにネオアガロヘキサオ
ース以上のオリゴ糖に作用する。ネオアガロテトラオー
ス，ネオアガロビオース、アルギン酸には作用しにく
い。ここでオリゴ糖とは、構成単糖が２個以上10個以下
の糖をいい、多糖とは、単糖およびオリゴ糖以外の糖を
いう。

【００３８】(3) 至適ｐＨｐＨを４〜5.6（酢酸緩衝液）、5.6〜7.5（リン酸緩衝
液）、7.5〜8.8（トリス塩酸緩衝液）、並びに8.8〜9.5
（グリシン水酸化ナトリウム緩衝液）に調製した0.2％
の低温融解性アガロース（シグマ社製）のゲル180μl
に、アガラーゼ0072溶液（0.2μg／μl）20μlを加え、
30℃で５分間反応させた。反応後、銅試薬200μlを加え
て沸騰水中で10分間加熱した後、水で急速冷却し、ネル
ソン試薬200μlを添加して蒸留水で全容積を5.0mlにし
た。60分後に660nmにおける吸光度を測定し、前述の方
法で酵素活性を算出した。その結果を図４に示す。図４
において、横軸はｐＨ、縦軸は最大酵素活性値を100％
とした場合の相対値で表わした酵素活性をそれぞれ示
す。この図より明らかなように、アガラーゼ0072の至適
ｐＨは、8.0であった。

【００３９】(4) 至適温度 20ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解した0.2％の低
温融解性アガロース（シグマ社製）のゲルを調製し、こ
のゲル180μlに、アガラーゼ0072溶液（0.4μg／μl）2
0μlを加え、20,25,30,40,45℃において5 分間反応させ
た。反応後、銅試薬200μlを加えて沸騰水中で10分間加
熱した後、水で急速冷却し、ネルソン試薬200μlを添加
して蒸留水で全容積を5.0mlにした。60分後に660nmにお
ける吸光度を測定し、前述の方法で酵素活性を算出し
た。その結果を図５に示す。図５において、横軸は温
度、縦軸は最大酵素活性値を100％とした場合の相対値
で表わした酵素活性をそれぞれ示す。この図より明らか
なように、アガラーゼ0072の至適温度は、30℃であっ
た。

【００４０】(5) ｐＨ安定性本酵素を、前述の至適ｐＨを測定した場合の各緩衝液
（グリシン／水酸化ナトリウム緩衝液を除く）で酵素溶
液を調製し、これを30℃で30分間保温した後、活性を測
定した。結果を図６に示す。図６において、横軸はｐ
Ｈ、縦軸は保温前活性値を100％とした場合の相対値で
表わした酵素活性をそれぞれ示す。残存活性が80％を越
える範囲として安定性を定めると、ｐＨ５〜９の間で安
定であった。

【００４１】(6) 熱安定性アガラーゼ0072溶液（0.2μg／μl）20μlを、25℃、30
℃、35℃、40℃、45℃、50℃および55℃の水浴中で20分
間加熱した後、0.2％の低温融解性アガロース（シグマ
社製）のゲル180μlに、アガラーゼ0072溶液（0.2μg／
μl）20μlを加え、30℃で５分間反応させた。反応後、
銅試薬200μlを加えて沸騰水中で10分間加熱した後、水
で急速冷却し、ネルソン試薬200μlを添加して蒸留水で
全容積を5.0mlにした。60分後に660nmにおける吸光度を
測定し、前述の方法で酵素活性を算出した。その結果を
図７に示す。図７において、横軸は温度、縦軸は非加熱
時の活性を100％とした場合の相対値で表わした酵素活
性をそれぞれ示す。この図より明らかなように、アガラ
ーゼ0072の非加熱時の活性を100％としたとき、30℃で
は約100％、35℃では約85％、40℃では約20％の残存活
性を示し、55℃ではほぼ完全に失活した。

【００４２】(7) ミカエリス定数及び最大反応速度３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとＤ−ガラクト
ースが交互にβ−１，４、α−１，３結合してなるネオ
アガロヘキサオースを基質として、種々の濃度の基質溶
液を調製し、これにアガラーゼ0072溶液（0.2μg／μ
l）を加え、酵素活性測定方法に従い酵素活性を測定し
た。基質濃度の逆数と、それに対応する酵素活性の逆数
を二次元座標上にプロットし、ラインウェ−バーバルク
の式を求め、これよりミカエリス定数は、1.7±0.5mM、
最大反応速度は、9.3U/mg蛋白質であることがわかっ
た。

【００４３】(8) 分子量分子量はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及び
ゲル濾過法で測定した。SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動では、常法に従って、SDSを含むポリアクリル
アミドゲルの濃度が7.5％のゲルで、分子量マーカー
（分子量200,000のミオシン、116,000のβ−ガラクトシ
ダーゼ、66,000の牛血清アルブミン、42,000のアルドラ
ーゼ）とともに電気泳動を行い、移動度から分子量を求
めたところ、約72,000であった。ゲル濾過法では、ファ
ルマシア社製のSuperdex 200なるゲル濾過カラムを用い
て、分子量マーカー（分子量160,000のイムノグロブリ
ンＧ、67,000のヒト血清アルブミン、35,000のβ−ラク
トグロブリン）のゲル濾過を行い、各マーカー蛋白質の
溶出容量を測定した後、アガラーゼ0072のゲル濾過を行
い、その溶出容量とマーカー蛋白質の溶出容量を比較し
分子量を計算したところ、約72,000であった。

【００４４】(9) アミノ末端アミノ酸配列の決定アガラーゼ0072のアミノ末端アミノ酸配列をエドマン分
解法により決定した。アガラーゼ0072溶液（0.4μg／μ
l）32μlを、7.5％ SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を常法に従って行なった後、該酵素をウェスタンブ
ロッティング法によりプロブロット（アプライドバイオ
システムズ社製）なる膜に吸着させ、これをアミノ酸配
列分析装置477A及び120Aプロテインシークエンサー（ア
プライドバイオシステムズ社製）により、アミノ末端側
10個のアミノ酸配列を決定した。その結果、配列は Val
→Thr →Val →Ser →Asn →Ala →Asp →Phe →Trp →
Asn であった。

【００４５】(10)その他の特性溶解性：水に可溶紫外線吸収スペクトル：λmax=280nm

【００４６】上記の２種類のβ−アガラーゼは、ビブリ
オ(Vibrio)属に属し、該β−アガラーゼを生産する能力
を有する微生物を培養し、該培養中に該β−アガラーゼ
を生成、蓄積させ、これを採取することにより得ること
ができる。ここで用いる微生物としては、ビブリオ属に
属し、該アガラーゼを生産する能力を有する微生物であ
ればいずれでも用いることができる。その例としては、
ビブリオ(Vibrio)sp. が挙げられ、具体的にはビブリオ
（Vibrio）sp. JT0107-L4が挙げられる。ビブリオ（Vib
rio）sp. JT0107-L4 は、以下のような菌学的性質を有
するものである。

【００４７】菌学的性質：１）形態マリンブロス2216培地に生育した細胞について、（イ）桿菌であり、細胞の大きさは0.25〜1.2μm×0.5
〜2.5μm （ロ）運動性を有し、鞭毛を有する（ハ）グラム染色性は陰性（ニ）胞子は形成しない

【００４８】２）生育状態マリンブロス2216平板培地での培養において、（イ）18℃〜25℃で良好に生育する（ロ）淡黄色の色素沈着を有する（ハ）菌体の生育に従って、寒天ゲルは液化されるマリンブロス2216の液体培地において、（ニ）pH７〜９において旺盛に生育する

【００４９】３）生理学的性質（イ）Ｏ−ＦテストＦ（ロ）カタラーゼテスト陽性（ハ）オキシダーゼテスト陽性（ニ）グルコースからのガスの生成無（ホ）フォゲスープロスカウェル反応陰性（ヘ）メチルレッド反応陽性（ト）ゼラチン分解能有（チ）エスクリン分解能有（リ）硝酸還元能有（ヌ）通性嫌気性

【００５０】尚、このビブリオ（Vibrio）sp. JT0107-L
4 は、平成３年３月６日付けで、通商産業商工業技術院
生命工学技術研究所にFERM BP-4541として寄託されてい
る。

【００５１】培養に用いる培地は、前記微生物が利用し
得る窒素源、無機物等を含み、寒天または、アガロース
等を炭素源として含むものを用いる。

【００５２】寒天、アガロースは、市販のものを用いる
ことができる。寒天、アガロース以外の炭素源として
は、肉エキス、カゼイン分解物、トリプトン、ペプトン
等が挙げられ、好ましくは、ペプトンを用いる。

【００５３】窒素源としては、酵母エキスを用いる。

【００５４】さらに、塩類としては、塩化ナトリウム、
クエン酸鉄、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、塩化
カルシウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナ
トリウム、臭化カリウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸
ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硝
酸アンモニウム、リン酸水素二ナトリウム等を組み合わ
せて用いられる。

【００５５】寒天、アガロース以外の上記成分をすべて
含んだマリンブロス2216なる培地（ディフコ社製）に、
寒天、あるいはアガロースを加えて用いることもでき
る。また、上記塩類を適度に含む人工海水を用い、これ
にペプトン、酵母エキス、寒天等を加えた培地を用いる
こともできる。寒天、あるいはアガロースの濃度は、0.
1〜1.5％が好ましく、この際、寒天あるいは、アガロー
スの濃度を任意に変えることにより固体培地、液体培地
を作り分けることが可能であるが、酵素生産を目的とす
る場合は、濃度0.1〜0.4％の液体培養が好ましく、菌体
の保存を目的とするときは、濃度1.2〜1.5％の固体培養
が好ましい。

【００５６】なお、アガラーゼ0107を得る場合は、上記
塩類を適度に含む人工海水を用い、これに酵母エキス濃
度0.1%、寒天またはアガロース濃度0.3%を加えた培地を
用いる。アガラーゼ0072を得る場合は、上記塩類を適度
に含む人工海水を用い、これにペプトン0.5〜2.0%、好
ましくは2.0%、酵母エキス濃度0.1〜0.4%、好ましくは
0.4%、寒天またはアガロース濃度0.1 〜0.4%、好ましく
は0.4%を加えた培地を用いる。

【００５７】アガラーゼ0107の場合、培養温度は、該酵
素を生産する範囲内で変更し得るが、通常18℃〜25℃程
度の回転振とう培養、好ましくは20℃、150回転の振と
う培養で、培養時間は３〜８日間程度、好ましくは５〜
７日間程度とする。培養終了後、培養液から遠心分離に
より固形物を除去して、培養上清を回収する。培養上清
に、80〜90％飽和になるように硫酸アンモニウムを加
え、分泌生産されたタンパク質を塩析させる。塩析物は
遠心分離により集め、20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0)を
透析外液として透析をおこない、透析サンプルをQAE-To
yopearlおよびMono-Qなる強陰イオン交換カラムに供
し、塩化ナトリウムを用いた直線濃度勾配法によりタン
パク質を順次溶出させ、アガラーゼ0107のみを分離す
る。

【００５８】アガラーゼ0072の場合、培養条件は、培地
の組成によって多少異なるが、培養温度は、15〜30℃、
好ましくは20〜25℃、pHは、7.0〜8.5、好ましくは7.8
〜8.2、培養時間は、15〜48時間、好ましくは、18〜24
時間である。なお、培養は通気攪拌培養が好ましい。培
養中に産生されたアガラーゼ0072は、菌体外に蓄積され
るので、培養終了後、菌体を遠心分離，菌体濾過等の方
法を用いて除去して培養濾液を得る。得られた酵素を含
有する溶液を、真空濃縮または限外濾過膜を用いて濃縮
して液状酵素として、あるいは凍結乾燥法，噴霧乾燥法
等により粉状酵素として用いることができる。その他の
方法としては通常用いられる精製方法、例えば硫安塩
析、溶媒沈澱法によりアガラーゼ0072を分離精製するこ
とができる。あるいは陰イオン交換性カラム、ゲル濾過
カラム等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせて電
気泳動的に単一バンドになるまで精製することができ
る。

【００５９】次に上記二種のアガラーゼを用いて２糖を
大量に得る原理を示す。アガロースは、Ｄ−ガラクトー
スと3, 6−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが、交互にα
−1, 3結合、β−1, 4結合を繰り返してなる多糖であ
り、従来知られているアガラーゼは、このアガロースの
β−1, 4結合を加水分解し、４糖であるネオアガロテト
ラオースと六糖であるネオアガロヘキサオースをおもに
製造するものである。ネオアガロヘキサオース分子内に
はβ−1, 4結合が二ヶ所残されるが、この二ヶ所は全く
切断されないか、どちらか一ヶ所のみが僅かに切断され
る可能性を持っているに過ぎない。さらに、ネオアガロ
テトラオース分子内には、一ヶ所のβ−1, 4結合が残さ
れているが、この結合部位は、従来の酵素では切断され
ない。従って、２糖であるネオアガロビオースは副生成
物としてしか製造されていなかった。つまり、従来のア
ガラーゼはネオアガロオクタオースより高分子のオリゴ
糖及びアガロースを基質とすることはできても、４糖で
あるネオアガロテトラオースを基質とすることはできな
いと考えられる。

【００６０】これに対してアガラーゼ0107は、上記理化
学的性質から明らかなようにアガロースの全てのβ−1,
4結合を切断することを特徴とする酵素であるため、ネ
オアガロヘキサオースの二ヶ所のβ−1, 4結合、および
ネオアガロテトラオースの一ヶ所のβ−1, 4結合を切断
することが可能であり、このことによって、２糖である
ネオアガロビオースを大量に得ることが可能となる。

【００６１】一方、アガラーゼ0072は、上記理化学的性
質から明らかなようにネオアガロヘキサオース以上の少
糖類に作用する酵素であるため、ネオアガロヘキサオー
スの一ヶ所のβ−１，４結合を切断することが可能であ
り、このことによって、従来の方法では殆ど生成されな
かった２糖であるネオアガロビオースを大量に得ること
が可能となる。

【００６２】ビブリオ（Vibrio）sp. JT0107-L4（FERM
BP-4541）によるアガラーゼ0107およびアガラーゼ0072
の酵素生産量は、アガラーゼ0107が80〜120Ｕ／ｌであ
るのに対し、アガラーゼ0072ではアガラーゼ0107の約10
倍である800〜1,100Ｕ／ｌが得られる。したがって、さ
らに２糖を大量に製造するためには、アガラーゼ0072を
用いて２糖および４糖中心のオリゴ糖を製造させた後、
アガラーゼ0072を添加することにより２糖中心のオリゴ
糖を製造する方法を用いることができる。

【００６３】従来方法による生成物を図８に、アガラー
ゼ0107を用いた本発明方法による生成物を図９に、アガ
ラーゼ0072を用いた本発明方法による生成物を図10に示
す。

【００６４】本発明によって製造されるオリゴ糖は、上
述のように２糖を中心とするが、反応条件等により重合
度の異なるオリゴ糖を自由に製造することも可能であ
る。このようにして得られたオリゴ糖を分離精製するこ
とにより、ネオアガロビオース、ネオアガロテトラオー
ス、及びネオアガロヘキサオースを単独で得ることも可
能である。さらに、一度使用した酵素を回収し、オリゴ
糖の製造の際に、再使用することも可能である。

【００６５】

【実施例】以下、この発明の実施例を具体的に説明する
が、この発明はこれらに限定されるものではなく、種々
応用することができる。

【００６６】〔参考例〕（菌体の培養）（前培養）500mlの人工海水（商品名シーライフ、マリ
ンテック社製）を調製し、これに、ペプトン５ｇ（日本
製薬社製）、酵母エキス１ｇ（ディフコ社製）を加え、
ｐＨを8.0に調整後、3000ml容の三角フラスコに移し、
寒天１ｇ（極東社製）を加え、オートクレーブを用いて
滅菌操作を行なった。これに-80℃で40％グリセロール
中に保存したビブリオ（Vibrio）sp. JT0107-L4 （FERM
BP-4541）を室温に融解後、その１mlを接種し、25℃、
150回転で24時間培養した。得られた培養液を前培養液
とした。

【００６７】（本培養） (i)アガラーゼ0107を得る場合本培養は、以下の手順で実施した。5,000ml容のジャー
ファーメンター容器を用いて人工海水シーライフ3,000m
l（マリンテック社製）を調製し、これに、酵母エキス
３ｇ（ディフコ社製）を加えｐＨを8.0に調整後、寒天
９ｇ（極東社製）を加え、オートクレーブを用いて滅菌
操作を行なった。これに、前培養で得られた培養液の30
mlを接種し、25℃、毎分600回転で５〜７日間培養し
た。 (ii) アガラーゼ0072を得る場合本培養は、以下の手順で実施した。5,000ml容のジャー
ファーメンター容器を用いて人工海水シーライフ3,000m
l（マリンテック社製）を調製し、これに、ペプトン60
ｇ（日本製薬社製）、酵母エキス12ｇ（ディフコ社製）
を加えｐＨを8.0に調整後、寒天12ｇ（極東社製）を加
え、オートクレーブを用いて滅菌操作を行なった。これ
に、前培養で得られた培養液の30mlを接種し、25℃、毎
分600回転で20時間培養した。

【００６８】〔製造例１〕（アガラーゼ0107の製造）上記参考例で得た培養液1000mlを遠心分離し、約900ml
の培養上清と固形物とに分離した。蛋白質を塩析するた
めに、この培養上清に硫酸アンモニウムを90％飽和とな
るように攪拌しながら徐々に添加し、５℃で一晩放置し
た。生じた塩析物を遠心分離により回収し、セロファン
チューブを透析膜として、20ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ8.0）3,000mlに対して透析した。透析は５℃で18
時間行い、その間透析外液を２回交換した。得られたサ
ンプルを、予め20mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）で
平衡化したQAE-Toyopearl（東ソー社製の強陰イオン交
換樹脂）を担体としたカラム（１cm×2.5cm）に吸着さ
せた。このサンプルを、20ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ8.0）から0.5Ｍ塩化ナトリウムを含有する20ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）への直線濃度勾配法（総溶
出量４ml）により溶出させ、塩化ナトリウム濃度0.5Ｍ
以降に溶出してくる画分６mlを回収した。得られた画分
に20mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を加えて24mlと
し、前出の緩衝液で予め平衡化したMono-Q（ファルマシ
ア製の強陰イオン交換樹脂）を担体としたカラム（0.5c
m×５cm) に吸着させ、前述の直線濃度勾配法（総溶出
量15ml）により溶出させた。アガラーゼ0107は、0.5Mの
塩化ナトリウム濃度で溶出し、分離することが出来た。
酵素活性を測定した結果、酵素１mg当たり約6.3Ｕの力
価を示した。比活性は、培養上清の比活性に比べて48倍
に上昇した。さらに得られた酵素をドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）を含むポリアクリルアミドゲルで電気泳
動したところ、目的酵素は約95,000の分子量を示した。

【００６９】〔製造例２〕（アガラーゼ0072の製造）上記参考例で得られた培養液を遠心分離して固形物を粗
分離し、さらに0.2μmの精密濾過膜を用いて濾過して培
養濾液2,800mlを得た。培養濾液中の酵素活性は0.9Ｕ／
mlであった。つぎに、培養濾液を分画分子量10,000の限
外濾過膜を用いて約８倍に濃縮し、得られた濃縮液に対
して５倍量の20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を添
加して再濃縮する工程を繰り返して初濃度の1/25塩濃度
まで脱塩したところ、4.8Ｕ／mlの粗酵素液350mlを得
た。

【００７０】得られた粗酵素液を、予め20ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ8.0）で平衡化したQAE-Toyopearl（東ソ
ー社製の強陰イオン交換樹脂）を担体としたカラム（2.
6cm×10cm）に吸着させた後、20ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ8.0）から 0.5Ｍ塩化ナトリウムを含有する20ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）への直線濃度勾配法
（総溶出量150ml）により溶出させ、0.35Ｍ〜0.45Ｍの
塩化ナトリウム濃度で溶出してくる画分30mlを回収し
た。この画分を同緩衝液を加えて180mlに希釈し、前述
の緩衝液で予め平衡化したMono-Q（ファルマシア製）な
る強陰イオン交換樹脂を担体としたカラム（1.0cm×10c
m) に吸着させ、前述の直線濃度勾配法（総溶出量120m
l）により溶出させ、0.4Mから0.45Mの塩化ナトリウム濃
度で溶出する画分16mlを得た。これを、グレースジャパ
ン社製遠心限外濾過膜セントリコン10を用いて２mlに濃
縮し、Superdex 200（ファルマシア社製）なるゲル濾過
担体を用いたカラム（2.6cm×60cm）に供し、0.1Ｍの塩
化ナトリウムを含む20ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.
0）で溶出させほぼ純品に近い精製酵素を得た（４Ｕ／m
g蛋白質）。比活性は、培養上清の比活性に比べて40倍
に上昇し、活性収率は約10％であった。得られた酵素を
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むポリアクリル
アミドゲルで電気泳動したところ、目的酵素は約72,000
の分子量を示した。

【００７１】〔実施例１〕（アガラーゼ0107のみを用い
た２糖の製造方法）９mlの20mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）に溶解した９m
gのネオアガロテトラオースに、ビブリオ（Vibrio）sp.
JT0107-L4 培養液から単離精製した１mlのトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ8.0）に溶解したアガラーゼ0107（５Ｕ）
を加え、30℃、６時間反応させ、反応溶液をファルマシ
ア社製のＰＤ−10カラムを用いて高分子画分と低分子画
分を分離し、高分子画分から酵素を回収し、低分子画分
に反応生成物であるネオアガロビオース8.2mgを得た。

【００７２】〔実施例２〕（アガラーゼ0107のみを用い
たオリゴ糖の製造方法）実施例１で得られた高分子画分にはアガラーゼ0107が含
まれており、これをアミコン社製の遠心式限外濾過フィ
ルターセントリコンによって1.5倍に濃縮した。この濃
縮液を用いて0.1％低温融解性アガロースを基質として
酵素反応を行ったところ、アガラーゼ活性を有してお
り、反応生成物であるオリゴ糖が得られた。

【００７３】〔実施例３〕（アガラーゼ0107のみを用い
た２糖，４糖の製造方法）２mgの低温融解性アガロース（シグマ社製）を溶解した
１mlの20mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）に、ビブリオ
（Vibrio）sp. JT0107-L4 培養液から単離精製したアガ
ラーゼ0107（0.15Ｕ）を含む50μlの20mMトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ8.0）を添加し、30℃で24時間反応させた。
反応液に含まれるオリゴ糖を高速液体クロマトグラフィ
ー（カラム：Shim Pack KS-802，移動相：水，流速：1
ml／min，温度：70℃）で分析したところ、固形物の74
％が６糖以下のオリゴ糖からなっており、820μgのネオ
アガロビオース，470μgのネオアガロテトラオースが得
られた。

【００７４】〔実施例４〕（アガラーゼ0072のみを用い
たオリゴ糖の製造方法）２mgの低温融解性アガロース（シグマ社製）を溶解した
１mlの20mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）に、ビブリオ
（Vibrio）sp. JT0107-L4 培養液から単離精製したアガ
ラーゼ0072（0.01Ｕ）を含む７μlの20mMトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ8.0）を添加し、30℃で24時間反応させた。
反応液に含まれるオリゴ糖を実施例３に示した方法を用
いて分析したところ、固形物の73％が６糖以下のオリゴ
糖からなっており、310μgのネオアガロビオース，820
μgのネオアガロテトラオースが得られた。

【００７５】〔実施例５〕（アガラーゼ0072のみを用い
た２糖，４糖の製造方法）２mgの低温融解性アガロース（シグマ社製）を溶解した
１mlの20mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）に、ビブリオ
（Vibrio）sp. JT0107-L4 培養液から単離精製したアガ
ラーゼ0072（0.09Ｕ）を含む50μlの20mMトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ8.0）を添加し、30℃で24時間反応させた。
反応液に含まれるオリゴ糖を実施例３に示した方法を用
いて分析したところ、固形物の82％が６糖以下のオリゴ
糖からなっており、460μgのネオアガロビオース，860
μgのネオアガロテトラオースが得られた。

【００７６】〔実施例６〕（アガラーゼ0107およびアガ
ラーゼ0072を用いたオリゴ糖の製造方法）２mgの低温融解性アガロース（シグマ社製）を溶解した
１mlの20mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）に、ビブリオ
（Vibrio）sp. JT0107-L4 培養液から単離精製したアガ
ラーゼ0072（0.09Ｕ）を含む50μlの20mMトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ8.0）を添加し、30℃で24時間反応させた。
反応液に含まれるオリゴ糖を実施例３に示した方法を用
いて分析したところ、固形物の82％が６糖以下のオリゴ
糖からなっており、460μgのネオアガロビオース，860
μgのネオアガロテトラオースが得られた。得られた反
応液にVibrio sp. JT0107-L4培養液から単離精製したア
ガラーゼ0107（0.07Ｕ）を含む20μlの20mMトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ8.0）を添加し、30℃で24時間反応させ
た。反応液に含まれるオリゴ糖を分析したところ、固形
物の88％が６糖以下のオリゴ糖からなっており750μgの
ネオアガロビオース，680μgのネオアガロテトラオー
ス，400μgのネオアガロヘキサオースが得られた。

【００７７】〔実施例７〕（アガラーゼ0107およびアガ
ラーゼ0072を用いた２，４糖の製造方法）２mgの低温融解性アガロース（シグマ社製）を溶解した
１mlの20mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）に、ビブリオ
（Vibrio）sp. JT0107-L4 培養液から単離精製したアガ
ラーゼ0072（0.09Ｕ）を含む50μlの20mMトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ8.0）を添加し、30℃で24時間反応させた。
反応液に含まれるオリゴ糖を実施例３に示した方法を用
いて分析したところ、固形物の82％が６糖以下のオリゴ
糖からなっており、460μgのネオアガロビオース，860
μgのネオアガロテトラオースが得られた。得られた反
応液にビブリオ（Vibrio）sp. JT0107-L4 培養液から単
離精製したアガラーゼ0107（0.15Ｕ）を含む20μlの20m
Mトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0）を添加し、30℃で24時間
反応させた。反応液に含まれるオリゴ糖を分析したとこ
ろ、固形物の92％が６糖以下のオリゴ糖からなっており
1,020μgのネオアガロビオース，520μgのネオアガロテ
トラオースが得られた。

【００７８】〔試験例１〕（澱粉老化防止効果）餅粉50ｇ，砂糖35ｇ，水50ｇにアガラーゼ0072により得
られたオリゴ糖（ネオアガロビオース:28％，ネオアガ
ロテトラオース:37％，ネオアガロヘキサオース:15％，
ネオアガロオクタオース:8％の組成からなる）15ｇ、お
よび餅粉50ｇ，砂糖40ｇ，水50ｇにアガラーゼ0072によ
り得られたオリゴ糖7.5ｇ、を混合して求肥を調製し
た。なお、対照としてシグマ社より市販されているPseu
domonas atlantica由来のアガラーゼにより得られたオ
リゴ糖（ネオアガロビオース:0％，ネオアガロテトラオ
ース:34％，ネオアガロヘキサオース:27％，ネオアガロ
オクタオース:30％の組成からなる）および市販のオリ
ゴ糖の中で澱粉老化防止効果の強かったマルトトリオー
ス主体のオリゴ糖15ｇを含有させた求肥も調製し対照と
して比較した。また、コントロールとしてオリゴ糖を含
まない求肥も調製した。

【００７９】調製した求肥は４℃で保存し、物性の測定
はクリープメーターを用いた圧縮試験により22℃、湿度
60%の環境下で行なった。圧縮幅は２mm（圧縮後にも変
形なく回復できる幅）とし、２kgのロードセルで１mm／
secの速度で圧縮した際の負荷を測定することによって
求肥の硬さとした。保存4 日目には、コントロールで92
0g重，市販のオリゴ糖の中で最も効果が強かったマルト
トリオース主体のオリゴ糖を15ｇ添加した求肥の硬さが
358g重であるのに対し、Pseudomonas atlantica由来の
アガラーゼにより得られたオリゴ糖で159g重であった。
一方、アガラーゼ0072により得られたオリゴ糖では15ｇ
では53g 重，５ｇでも146g重であり、４日経過後も硬さ
に殆ど変化が認められず、極めて強い老化防止効果が認
められた。

【００８０】

【発明の効果】本発明によれば、澱粉および澱粉含有製
品の老化防止に最も効果の高い二糖を中心とする重合度
の低いオリゴ糖を効果的に製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】アガラーゼ0107の至適ｐＨを示す。

【図２】アガラーゼ0107の至適温度を示す。

【符号の説明】

○ 25℃での酵素反応 ● 30℃での酵素反応 □ 35℃での酵素反応 ■ 40℃での酵素反応

【図３】アガラーゼ0107の熱安定性を示す。

【図４】アガラーゼ0072の至適ｐＨを示す。

【符号の説明】

○ 酢酸緩衝液 ▲ リン酸緩衝液 ● トリス塩酸緩衝液 ■ グリシン水酸化ナトリウム緩衝液

【図５】アガラーゼ0072の至適温度を示す。

【図６】アガラーゼ0072のｐＨ安定性を示す。

【符号の説明】

○ 酢酸緩衝液 ▲ リン酸緩衝液 ● トリス塩酸緩衝液

【図７】アガラーゼ0072の熱安定性を示す。

【図８】従来方法による生成物を示す。

【図９】アガラーゼ0107を用いた本発明方法による生成
物を示す。

【図１０】アガラーゼ0072を用いた本発明方法による生
成物を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:63）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】寒天もしくはアガロースもしくはそれか
ら派生するオリゴ糖を基質として、下記の理化学的性質
のβ−アガラーゼＡを作用させることによるネオアガロ
ビオースの製造方法。作用少なくとも寒天およびアガロースのすべてのβ−１，４
結合をエンド型に分解して低分子化する反応を触媒す
る。基質特異性寒天、およびアガロースを加水分解するが、カラギーナ
ン、アルギン酸には作用しない。至適pH 7〜8.5(30℃) 至適温度 30℃ pH安定性 6.0〜9.0 熱安定性 50 ℃、15分間の加熱で最大活性の85％を保持する。等電点 6.3 分子量約 95,000 （10-20 ％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気
泳動による）約 105,300（全塩基配列から推定されるアミノ酸配列に
よる）アミノ酸末端配列 Ala→Thr →Leu →Val →Thr →Ser →Phe
【請求項２】寒天もしくはアガロースもしくはそれか
ら派生するオリゴ糖を基質として、請求項１に記載のβ
−アガラーゼＡを作用させることによりネオアガロビオ
ースを含む低分子のオリゴ糖を製造することを特徴とす
るオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】寒天もしくはアガロースもしくはそれか
ら派生するオリゴ糖を基質として、下記の理化学的性質
のβ−アガラーゼＢを作用させることによるネオアガロ
ビオースの製造方法。作用少なくとも寒天およびアガロ−スのβ−１，４結合を加
水分解して低分子化する反応を触媒する。基質特異性 β- １，４ガラクトシド結合を有するアガロース，寒天
などのガラクタン系の多糖ならびにネオアガロヘキサオ
ース以上のオリゴ糖）に作用する。ネオアガロテトラオ
ース、ネオアガロビオース、アルギン酸には作用しにく
い。至適ｐＨ 8.0 ｐＨ安定性 5.0〜9.0 至適温度 30℃ 熱安定性 20分間加熱した場合、30℃では初期活性の約100％を保
持し、35℃では約85％、40℃では約20％の残存活性を保
持する。分子量約72,000（7.5％ SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による）等電点約4.7 アミノ末端アミノ酸配列 Val →Thr →Val →Ser →Asn →Ala →Asp →Phe →Tr
p →Asn
【請求項４】寒天もしくはアガロースもしくはそれか
ら派生するオリゴ糖を基質として、請求項３に記載のβ
−アガラーゼＢを作用させることによりネオアガロビオ
ースを含む低分子のオリゴ糖を製造することを特徴とす
るオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】寒天もしくはアガロースもしくはそれか
ら派生するオリゴ糖を基質として、請求項１に記載のβ
−アガラーゼＡと請求項３に記載のβ−アガラーゼＢを
作用させることによるネオアガロビオースの製造方法。
【請求項６】寒天もしくはアガロースもしくはそれか
ら派生するオリゴ糖を基質として、請求項１に記載のβ
−アガラーゼＡと請求項３に記載のβ−アガラーゼＢを
作用させることによりネオアガロビオースを含む低分子
のオリゴ糖を製造することを特徴とするオリゴ糖の製造
方法。