JPH0257182A - 新規ケラタン硫酸分解酵素並びにそれを生産する微生物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は、新規なケラタン硫酸分解酵素並びにそれを生
産する微生物及び方法に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする課題）従来微
生物由来のケラタン硫酸（以下ｒＫ　ＳＪという）を分
解する酵素（以下ｒＫｓａｓｅＪという）としてはエシ
ェリヒア・フロインデイ、フラボバクテリウム・ケラト
リティカス、及びバクテロイド・フラギリス等の産生ず
るエンド−β−ガラクトシダーゼ類とシュードモナス属
の産生するケラタン硫酸があり、これらの酵素は、いず
れもＫＳ糖鎖骨格中のβｌ−４ガラクトシド結合に作用
することが知られている。

ＫＳには動物の角膜中に存在するＫＳＩと軟骨などの組
織に含まれているＫ　Ｓ　ＩＩ及びケラタンポリ硫酸が
あり、いずれもガラクトースとＮ−アセチルグルコサミ
ンを構成単位２糖とするコポリマーであるが、前者がＮ
−アセチルグルコサミンの６位の炭素の水酸基が硫酸化
されている場合が多いのに対し、後者はＮ−アセチルグ
ルコサミンの６位及びガラクトースの６位の両方の水酸
基が硫酸化されたジ硫酸２糖の成分の占める割合が高い
。

ＫＳはムコ多糖代謝異常症で生体内に蓄積したり、ある
いは加令変化により軟骨中の含量が増加することが知ら
れているが、その糖鎖構造についてはまだ十分解明され
ておらず構造解析に役立つ酵素の開発が望まれている。

従来のＫＳａｓｅ類はいずれもガラクトシド結合に作用
するタイプであるが、ガラクトースが硫酸化されている
場合には分解されないため実際にはほとんどのＫ　Ｓ　
ＩＩを分解できなかった。

本発明者らはＫ　Ｓ　ＩＩタイプの骨格にも作用するＫ
Ｓａｓｅを得るため広く土壌菌を検索し、ＫＳＩＩ資化
性菌を捜した結果、埼玉県下の土壌よりＫ　Ｓ　１１分
解能を有する酵素を産生ずる菌Ｋｓ３６株を単離するこ
とに成功した。

この菌の産生ずるＫＳａｓｅは分子量約２０万で、従来
のエンド−β−ガラクトシダーゼ類がいずれも３万前後
であるのに比べ、はるかに大きく、また、ＫＳを分解し
た後に生じる２糖の還元糖がＮ−アセチルグルコサミン
であることから、Ｎ−アセチルグルコサミニド結合を分
解すること、更にこれらの２糖中にはモノ硫酸、ジ硫酸
が存在することから、従来の酵素とは全く異なる性質を
有する極めて特徴的な酵素であることが確認され、本発
明を完成するに至った。

［発明の構成］ （課題を解決するための手段及び作用）本発明は、ケラ
タン硫酸Ｉ、ケラタン硫酸ＩＩ及びケラタンポリ硫酸の
分解能を有する新規なケラタン分解酵素並びにそれを生
産する微生物及び方法に関するものである。

本発明の新規なＫＳａｓｅ生産菌Ｋｓ３６株は、次のよ
うな菌学的性質を有する。

Ａ、形態 （１）肉汁寒天培地に生育し、菌の形態は桿状であり、
０．５〜０．９Ｘ１．６Ｘ２．５μの大きさで単独ない
しは２連であるが、まれに数連をなす。

（２）細胞の多形性はない （３）運動性あり （４）ダラム染色性は陰性 Ｂ、生育状態 （１）肉汁寒天平板培養 周辺は淡いゾーゲ色で中心部が明るい灰黄色（ＪＩＳ　
　２８１０２°°色名°゛準拠、工業用色名帳による判
定）の半透明、円形、レンズ状のコロニーを生ずる。

周縁は不規則な波形状で、拡散性色素は生産しない。

（２）肉汁寒天斜面培養 生育はあまり良くなく、接種線にそって均一に生育する
。生育部分は淡いゾーゲ色を呈し、半透明である。

（３）肉汁液体培養 振盪培養でわずかに生育するが、静置培養ではほとんど
生育が認められない。

（４）肉汁ゼラチン平板培養 生育はあまり良（なく、接種線にそって均一に生育する
。生育部分は淡いゾーゲ色を呈する。ゼラチンを液化し
ない。

（５）リドマス・ミルク リドマスが桃色に変化する。　（酸の生成）Ｃ０生理学
的性質及びその他の性質 （１）インドールの生成：陰性 （２）硫化水素の生成：陰性 （３）デンプンの加水分解：陽性 （４）クエン酸の利用：陰性 （５）色素の生成 キングＡ培地、キングＢ培地での生育は悪く、色素を生
成しない。

（６）ウレアーゼ：陽性 （７）オキシダーゼ：陽性 （８）カタラーゼ：陽性 （９）酸素に対する態度：好気性 （ｌＯ）生育ｐＨ：５〜９．５、特に７〜８が最適 （１１）生育温度＝１５〜４２℃、特に３７〜４０℃が
最適 （１２）炭素源の利用： 酵母エキスを添加したヒューレイフソンの培地を用いて
炭素源の利用を調べた。酸の生成は以下の通り（＋：陽
性、−二陰性） Ｌ−アラビノース　−　セロビオース　　　＋Ｄ−キシ
ロース　　−　ラフィノース　　　＋Ｄ−グルコース　
　＋　Ｄ−ソルビトールローマンノース　　＋　Ｄ−マ
ンニトールＤ−フラクトース　＋　イノシトール ローガラクトース　＋　グリセリン　　　　＋麦芽糖　
　　　　　＋　サリシン　　　　　＋ショ糖　　　　　
　　＋　エタノール 乳糖　　　　　　　＋　可溶性デンプン　　＋トレハロ
ース　　　＋ （１３）エスクリンの分解：陽性 （１４）β−ガラクトシダーゼ産生：陽性（１５）マロ
ン酸の利用：陰性 （１６）アルギニンの分解：陰性 （１７）　ＩＪリジン脱炭酸反応：陰性（１８）オルニ
チンの脱炭酸反応：陰性（■９）デオキシリボヌクレア
ーゼ産生：陰性（２０）アセトアミドの分解：陰性 （２１）ツイーン８０の分解：陽性 （２２）グルコン酸の酸化：陰性 なお、本菌株Ｋｓ３６株は工業技術院微生物工業技術研
究所に微生物受託番号第１０２０４号（以下「微工研菌
寄第１０２０４号」という）として寄託されている。

本発明の新規なケラタン硫酸分解酵素は、Ｋｓ３６株を
通常、微生物の培養に用いられる栄養培地、好ましくは
酵素産生能を高めるためにケラタン硫酸又はそれを含む
物質を添加した培地で培養することにより培地中あるい
は菌体中に生産蓄積されるので、公知の方法で抽出、精
製することによって精製酵素を得ることができる。

更に具体的に説明すると、Ｋｓ３６株を適当な栄養培地
、例えば適当な炭素源、窒素源、無機塩類と酵素生産能
を高めるためにケラタン硫酸又はそれを含む物質などの
誘導物質を含む培地で菌を培養し、該酵素を培地中ある
いは菌体中に生産蓄積せしめるのであるが、炭素源とし
てはグルコース、ガラクトース、マンノース、フラクト
ース、マルトース、シュクロース、ラクトース、セロビ
オース、ラフィノース、澱粉及びその加水分解物、糖蜜
、グリセリンなどが利用できる。窒素源としては、酵母
エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、大豆粉、脱
脂大豆粉、コーンステイープリカー、尿素、アンモニウ
ム塩など有機、無機の窒素化合物又はこれを含有するも
のが用いられる。無機塩としては、各種リン酸塩、マグ
ネシウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムなどの塩
類が使用される。そして、更に必要に応じて菌の生育あ
るいは酵素生産に必要な各種の無機物や有機物、例えば
シリコーン油、ゴマ油、各種界面活性剤などの消泡剤や
ビタミン類を培地に添加することができる。

本発明においては、特に酵素の誘導物質としてケラタン
硫酸又はそれを含有する物質を添加すれば大量の該酵素
を生成せしめることができる。これらの添加物の添加は
培養当初からでも培養途中に行なってもよい。添加量と
してはケラタン硫酸として通常０．２％〜２％添加すれ
ば良い結果が得られる。

培養の形態は液体培養でも固体培養でもよいが、通常は
液体培養が好適であり、工業的には深部通気撹拌培養を
行なうのが有利である。

本発明における培養条件は使用する菌株、培地組成等に
より多少異なるが、該酵素の生産に最も有利な条件を適
当に選択、調節して行なう。培養温度は１５〜４２℃の
範囲内で適宜変更することができるが、特に好ましいの
は３７〜４０°Ｃである。培養時間は条件によって異な
るが、１〜２日程度であって該酵素が最高蓄積量に達す
る時期に培養を終了すればよい。培地のｐｉ（は培地調
製時に中性付近にあればよく、通常の場合、特に調節の
必要はない。

得られた菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波又は機械
的磨砕法によって菌体を破壊して酵素を抽出した後、そ
の遠心上清液を集め、硫安塩析により粗分側を得る。粗
酵素液は脱塩後、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハ
イドロフォビッククロマトグラフィー及びゲルクロマト
グラフィーなどの方法を用いることにより精製すること
ができる。

菌体外液の酵素についても硫安塩析後、同様の方法によ
り精製することができる。

本酵素の活性は、粗酵素段階においては、ゲルクロマト
用のカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーを用い
、基質ＫＳの低分子化の程度を示差屈折検出器を用いて
確認できる。精製の進んだ段階においては、ＫＳ分解に
よって生じる還元端の増加をパーク−ジョンソン法［Ｊ
、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　１８１．１４９　（１９４９１］により
測定することができる。

即ち、ケラタンポリ硫酸（サメ軟骨）基質（ｌ　Ｏｍｇ
／ｍｌ）　　１０　ｕ　１に対し、酵素液１０μｍ、１
０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ６，２１８０ｕｌを加え、３７℃
で１５分間反応させる。これにパークージョンソン法の
試薬カルボネート−シアナイド液２００μｍを加え、反
応を停止し以後フェリシアナイド液２００μｌ、鉄門パ
ン液１ｍｌを加えて混合し、パーク−ジョンソン法に従
って６９０ｎｍの吸光度を測定する。この吸光度をＡと
し、同反応液のゼロ時間における吸光度をＡｏ、更に標
準試薬として反応液の代わりにガラクトース１０μｇ／
ｍｌ溶液を２００μｌ用いて同様に処理した場合の吸光
度をＡｓｔとする。上記条件下で１分間に１μモルのガ
ラクトース換算の還元力を生成せしめる酵素量を１単位
とすると ｘｏ、０７４ Ａｓｔ 本発明の新規のケラタン硫酸（ＫＳａｓｅｌｌ）の理化
学的性質を示す。

本酵素はケラタン硫酸に作用し、そのＮ−アセチルグル
コサミニド結合を加水分解する。

（２）五！特異皿 本酵素は、ＫＳＩ、Ｋ　Ｓ　ＩＩ及びケラタンポリ硫酸
に作用し、分解産物として２糖モノ硫酸及び２糖ジ硫酸
を生ずる（図１）。本酵素は脱硫酸化したケラタンには
作用せず、作用部位の糖鎖には硫酸基が必須である。

（３）至適Ｈび　　Ｈ範 本酵素の至適ｐＨは、１０ｍＭ酢酸緩衝液及び１０ｍＭ
１−リス−酢酸緩衝液中、３７℃で測定した結果、ｐＨ
５，５〜６．０である（図２）。

本酵素を１０ｍＭトリス−酢酸緩衝液中で３７°Ｃ１１
時間放置した場合、ｐｌ（７〜８付近で安定である（図
３）。

（４）生皿主産１１ 本酵素を２４〜６０℃の温度範囲、１０ｍＭ酢酸緩衝液
ｐＨ６，２で１０分間反応後の活性を測定した結果、至
適温度は約３０〜４０℃であった（図４）。

（５）支定貫度Ｉ訓 本酵素を２４〜６０℃の温度範囲、１０ｍＭ酢酸緩衝液
ｐＨ６，２で３０分間放置した後、その活性を測定した
結果、３５℃以上では活性は１／２以下になった（図５
）。

（６）分ヱｌ ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（５％濃度）
で本酵素を還元下及び非還元下で泳動した場合、いずれ
も同じ移動度の単一バンドを示し、標準物質Ａ、ミオシ
ン（分子量２００．０００）、Ｂ、フォスフォリラーゼ
Ｂ（分子量９７．４００）、Ｃ，牛血清アルブミン（分
子量６８．０００）、Ｄ、卵白アルブミン（分子量４３
．０００）の検量曲線から分子量は２００，０００±１
０．０００と算出された（図６）。

（７）１久薬囲Ω彫１ 本酵素を各種薬剤１ｍＭ存在下で活性を測定した結果、
Ｚｎ　２　＋、Ｍｎ”、ＥＤＴＡ、ＰＣＭＢで阻害され
、Ｍｇ２“でやや賦活された（表）。

（発明の実施例） 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。

実施例１ ペプトン（極東槽）０．５％、酵母エキス（極東槽）０
．２％、サメ軟骨より調製したケラタン硫酸０．２％、
Ｋ２ＨＰＯ４０，１％、Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ２００，０２
％、ＮａＣ１０，１％（ｐＨ７，０）の組成からなる培
地５００ｍ１を２１２容肩付フラスコに仕込み、１２０
℃で２０分間蒸気滅菌後、Ｋｓ３６株（微工研菌寄第１
０２０４号）を数白金耳無菌的に植菌し、３０℃で２４
時間振盪培養した（１２５往復／分、振幅７ｃｍ）。り
°ラタン硫酸分解の酵素力価は培養液１ｍｌ当り０．８
ミリ単位であった。

実施例２ ペプトン（極東槽）０．５％、酵母エキス（極東槽）０
．２％、サメ軟骨より調製したケラタン硫酸０．５％、
Ｋ２ＨＰＯ，０，１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０２
％、ＮａＣｌ　０．　１％、消泡剤アデカノールＬＧ１
０９（旭電化製）０．００５％（ｐＨ７，０）の組成か
らなる培地２０Ｉ２を３０１２客のジャーファーメンタ
−に仕込み、１２０℃で２０分間蒸気滅菌後、予め実施
例１に示した培地で３０℃で２０時間振盪培養しておい
たＫｓ３６株（微工研菌寄第１０２０４号）１２（５％
）を無菌的に植菌し、３０℃で２４時間通気（Ｉ　Ｖ、
Ｖ、ｍ　）撹拌（２０Ｏｒｐｍ）培養した。培養液２０
Ｉ；！、を連続遠心分離機にて処理して菌体な集め、湿
重量で１２０ｇの菌体を得た。この菌体中に含まれるケ
ラタン硫酸分解酵素の力価は湿重量Ｉｇ当り０．８単位
であった。

実施例３ 培養液１０Ｉ２に硫酸アンモニウムを０．６飽和になる
ように加え、生じた沈殿を遠心分離し、５０ｍＭトＩＪ
ス塩酸緩衝液ｐＨ７，４に透析した。

この液を予め同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロフ
ァイン（生化学工業製）カラム（２，４Ｘ２７ｃｍ）に
通して酵素を吸着させ、食塩濃度を直線的に０か６０．
７５Ｍに上昇させ、酵素を溶出させた。活性画分を５ｍ
ｌまで濃縮しセファクリルＳ−３００（ファルマシア製
、スエーデン）のカラム（３，５Ｘ　１１０ｃｍ）に通
し、０．５Ｍ食塩、０．０１Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７
，４の溶媒を用いてゲルろ過を行なった。この活性画分
を集め、限外ろ過膜（イマージプル、ミリボア）を用い
て脱塩濃縮し、濃縮酵素液２＋ｎｌを得た。このものの
比活性は０．３６単位／ｍｇ（ウシ血清アルブミン換算
重量）であり、培養液からの回収率は４６％、比活性は
１０６０倍上昇した。

実施例４ 実施例２で得られた菌体３０ｇを５０１１ＩＭトリス塩
酸緩衝液ｐＨ７，４，１２０ｍ１に懸濁し、冷却しなか
ら磨砕機にかけ菌体を破壊した。磨砕後、不溶物を遠心
（１Ｍ回転、３０分）除去し、上清に硫酸アンモニウム
を加え、５５％飽和とした。生じた沈殿を遠心分離して
集め、５０ＩＩＩＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７，４に対し
、透析脱塩し、この内液を実施例３に示した方法と同様
の方法でＤＥＡＥ−セルロファイン、セファクリルＳ−
３００を用いてカラムクロマトグラフィーを行なった後
、得られた活性画分２０ｍ１に対し食塩を加え４モル濃
度とした。この液を予め４Ｍ食塩、５ｍＭリン酸緩衝液
ｐＨ７，０で平衡化したフェニル−セファロースＣＬ−
４Ｂ　（１，６ｘ　１５ｃｍ）に負荷し食塩濃度を４Ｍ
からＯＭまで下げて酵素を溶出した。得られた酵素は５
．２単位、比活性は牛血清アルブミン重量換算で３．１
単位／ｍｇ、硫安塩析後からの回収率は１４．８％であ
った。

［発明の効果］ 本発明によれば、新規ケラタン硫酸分解酵素を提供する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

図１は、本発明の酵素の基質特異性を示す図であり、図
２は、本発明の酵素の至適ｐＨを示す図であり、図３は
、本発明の酵素の安定ｐＨ範囲を示す図であり、図４は
、本発明の酵素の至適温度を示す図であり、図５は、本
発明の酵素の安定温度範囲を示す図であり、図６は、本
発明の酵素の分子量を示す図である。 イＸ埼ロ青閉　　　（〈々゛ン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の理化学的性質を有することを特徴とする新
   規ケラタン硫酸分解酵素。 ［１］作用：ケラタン硫酸に作用し、そのＮ−アセチル
   グルコサミニド結合を加水分解する。 ［２］基質特異性：ケラタン硫酸 I 、ケラタン硫酸II
   及びケラタンポリ硫酸に作用し、分解産物として２糖モ
   ノ硫酸及び２糖ジ硫酸を生じる。脱硫酸化したケラタン
   には作用せず、作用部位の糖鎖には硫酸基が必須である
   。 ［３］至適ｐＨ（１０ｍＭ酢酸緩衝液及び１０ｍＭトリ
   ス−酢酸緩衝液、３７℃） ５．５〜６．０ ［４］安定ｐＨ範囲（１０ｍＭトリス−酢酸緩衝液、３
   ７℃、１時間放置） ７〜８ ［５］至適温度（１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．２、１
   ０分反応） 約３０〜４０℃ ［６］安定温度範囲（１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．２
   、３０分装置） ３０℃以下 ［７］分子量（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
   動法） ２００，０００±１０，０００ （２）ケラタン硫酸 I 、ケラタン硫酸II及びケラタン
   ポリ硫酸の分解能を有するケラタン硫酸分解酵素生産能
   を有する細菌Ｋｓ３６株微工研菌寄第１０２０４号。 （３）Ｋｓ３６株微工研菌寄第１０２０４号の属する属
   に属するケラタン硫酸 I 、ケラタン硫酸II及びケラタ
   ンポリ硫酸の分解能を有するケラタン硫酸分解酵素生産
   能を有する細菌を培養し、その培養液又は菌体内抽出液
   から請求項１記載のケラタン硫酸分解酵素を分離、採取
   することを特徴とするケラタン硫酸分解酵素の製造法。