JPH07184647A - α−Ｌ−フコシダーゼ、その製造方法およびアルカリジェネス・デニトリフィカンス サブｓｐ． デニトリフィカンス ＫＳＦ−０９０１菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なα−Ｌ−フコシダーゼおよびその製造
法を確立する。 【構成】 アルカリジェネス デニトリフィカンス サ
ブｓｐ． デニトリフィカンス（Alcaligenes denitrif
icans subsp. denitrificans） ＫＳＦ−０９０１菌株
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９９３）を液体培地で培養し、液
体培地中にα−Ｌ−フコシダーゼを生産させた後、精製
する。 【効果】 上記方法では活性画分を菌体内から抽出する
操作を必要とせず、酵素を工業的に安価に製造すること
が可能である。また得られたα−Ｌ−フコシダーゼは中
性付近に至適ｐＨを有し、合成基質および天然基質に作
用するので、糖鎖の構造解析や機能の研究に極めて有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アルカリジェネス属に
属する細菌により生産される新規なα−Ｌ−フコシダー
ゼ、その製造方法および新規なアルカリジェネス・デニ
トリフィカンス サブｓｐ． デニトリフィカンス（Al
caligenes denitrificans subsp. denitrificans）ＫＳ
Ｆ−０９０１菌株に関する。

【０００２】

【従来の技術】α−Ｌ−フコシダーゼは合成基質、オリ
ゴ糖、天然高分子などのα−Ｌ−フコシル結合に作用し
て、Ｌ−フコースを遊離する酵素であり、細菌、放線
菌、糸状菌、植物、軟体動物、哺乳類等に見出されてい
る。ところで、高等動物由来の糖タンパク質や糖脂質中
に含まれる複合糖質の糖鎖の非還元末端または枝分れ部
分には、α−Ｌ−フコシル基を含むものが多く見出され
ており、近年、α−Ｌ−フコシル基の代謝と細胞のガン
化との間に深い関係があることが示唆されている。α−
Ｌ−フコシダーゼはこれらのα−Ｌ−フコシル結合を分
解する酵素であり、複合糖質中の糖鎖の構造解析や、構
造と機能との関連を研究する上でＬ−フコースが重要な
役割を果たす。

【０００３】α−Ｌ−フコシダーゼのうち、サザエやホ
ラガイなどの動物由来のα−Ｌ−フコシダーゼ（J.Bioc
hem., 75, 509, 1974）は広い基質特異性を有してお
り、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド等の合成基
質およびブタ顎下腺ムチン等の天然高分子基質に作用す
るが、これらの酵素は特定のフコシル結合のみを分解さ
せることはできず、また大量供給が困難であり工業化に
は不利である。

【０００４】一方、微生物由来の酵素は厳密な基質特異
性を有しているが、合成基質や天然高分子基質にはあま
り作用しないために、酵素活性を簡便に測定できないと
いう問題点を有している。合成基質および天然基質に作
用する酵素として、フラボバクテリウム・ファルギニュ
ーム ＩＡＭ１４９３またはコリネバクテリウム ｓ
ｐ． ＦＳ−００７７から得られるα−Ｌ−フコシダー
ゼ（特開昭６２−１５５０８６号公報）が知られている
が、この酵素は培養物中の菌体内に生産されるため、酵
素を得るには菌体を破壊する必要があり、工業的生産に
は適さないという問題点がある。また、フザリウム・オ
キシスポラム ＳＡ２５２から生産される酵素（特開昭
６１−５８５８７号公報）は至適ｐＨが４．５〜５．５
であるため、細胞表面の糖類の機能を検査するには適さ
ないという問題点がある。従って、中性付近に至適ｐＨ
を有し、合成基質および天然基質のα−Ｌ−フコシル結
合に特異的に作用し、培養物中の菌体外に生産される微
生物由来のα−Ｌ−フコシダーゼの開発が望まれてい
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
問題点を解決するため、中性付近に至適ｐＨを有し、合
成基質、オリゴ糖および天然高分子基質の特定のフコシ
ル結合に作用し、しかも培養物中の菌体外に生産される
新規なα−Ｌ−フコシダーゼを提供することである。本
発明の他の目的は、上記α−Ｌ−フコシダーゼを容易に
製造することができるα−Ｌ−フコシダーゼの製造方法
を提案することである。本発明の別の目的は、上記α−
Ｌ−フコシダーゼを生産する新規なアルカリジェネス・
デニトリフィカンス サブｓｐ． デニトリフィカンス
（Alcaligenesdenitrificans subsp. denitrificans）
ＫＳＦ−０９０１菌株を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、中性付近
に至適ｐＨを有し、活性画分を菌体内から抽出する操作
を必要とせず、熱に安定でｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ
−フコシド等の合成基質、オリゴ糖、ムチン等の天然高
分子基質に作用するα−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有
し、培養液中にこの酵素を生産する微生物を広く自然界
より検索した結果、アルカリジェネス・デニトリフィカ
ンス サブｓｐ． デニトリフィカンス（Alcaligenes
denitrificans subsp. denitrificans） ＫＳＦ−０９
０１菌株が合成基質、オリゴ糖、およびムチン等天然高
分子基質のα−１→２結合、およびオリゴ糖中のα−１
→６結合に作用するα−Ｌ−フコシダーゼを培養液中に
生産することを見出し、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は次のα−Ｌ−フコシダ
ーゼ、その製造方法およびアルカリジェネス・デニトリ
フィカンス サブｓｐ． デニトリフィカンス（Alcali
genes denitrificans subsp. denitrificans） ＫＳＦ
−０９０１菌株である。 （１）次の酵素学的性質を有することを特徴とするα−
Ｌ−フコシダーゼ。 作用 天然高分子基質、オリゴ糖および合成基質中のα−Ｌ−
フコシル結合に作用して、Ｌ−フコースを遊離する。 基質特異性 合成基質および天然基質中のα−１→２またはα−１→
６フコシル結合に作用する。一方、天然基質中のα−１
→３またはα−１→４フコシル結合には作用しない。 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０である。４５℃で１時間
保持した場合、安定ｐＨ範囲は６．０〜９．０である。 反応至適温度および安定温度範囲 反応の至適温度は５５℃である。ｐＨ７．０で１０分間
保持した場合、５０℃までは安定であり、６５℃以上で
失活する。 阻害剤の影響 銅、水銀、パラクロロメルクリ安息香酸により著しく阻
害される。Ｌ−フコースにはほとんど影響を受けない。 分子量 ＰＡＧＥにより測定した分子量は約１０２０００であ
る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は約５１０
００である。 （２）アルカリジェネス・デニトリフィカンス サブｓ
ｐ． デニトリフィカンス（Alcaligenes denitrifican
s subsp. denitrificans） ＫＳＦ−０９０１菌株由来
であることを特徴とする上記（１）記載のα−Ｌ−フコ
シダーゼ。 （３）上記（１）のα−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有す
ることを特徴とするアルカリジェネス・デニトリフィカ
ンス サブｓｐ． デニトリフィカンス（Alcaligenes
denitrificans subsp. denitrificans） ＫＳＦ−０９
０１菌株。 （４）アルカリジェネス属に属し、α−Ｌ−フコシダー
ゼを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から
α−Ｌ−フコシダーゼを分離することを特徴とするα−
Ｌ−フコシダーゼの製造方法。 （５）α−Ｌ−フコシダーゼを生産する能力を有する微
生物が、上記（３）記載のアルカリジェネス・デニトリ
フィカンス サブｓｐ． デニトリフィカンス（Alcali
genes denitrificans subsp. denitrificans） ＫＳＦ
−０９０１菌株であることを特徴とする上記（４）記載
の製造方法。 （６）培養物が培養液であることを特徴とする上記
（４）または（５）記載の製造方法。

【０００８】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの酵素学的
および理化学的性質について説明する。 〈１〉酵素の作用 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼはムチン等の天然高分子
基質；２’−フコシルラクトース、６’−フコシル−Ｎ
−アセチルグルコサミン等のオリゴ糖；およびｐ−ニト
ロフェニル−α−Ｌ−フコシド等の合成基質中のα−Ｌ
−フコシル結合を特異的に加水分解し、Ｌ−フコースを
遊離する。

【０００９】〈２〉基質特異性 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの種々のα−Ｌ−フコシ
ド含有基質に対する活性を表１に示す。本発明の酵素は
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド等の合成基質；
２’−フコシルラクトース、６−フコシル−Ｎ−アセチ
ルグルコサミン等のオリゴ糖；ムチン等の天然高分子基
質などに作用し、これら基質中のα−１→２結合または
オリゴ糖鎖中α−１→６結合のフコース残基を加水分解
する。一方、オリゴ糖鎖中のα−１→３またはα−１→
４フコシル結合には作用しない。またｐ−ニトロフェニ
ル−β−Ｌ−フコピラノシドには作用しない。なお、相
対活性は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドに対
する活性を１００として表１に示されている。

【００１０】

【表１】

【００１１】〈３〉至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０である（図１参照）。安
定ｐＨ範囲は、４５℃で１時間保持した場合ｐＨ６．０
〜９．０である（図２参照）。

【００１２】〈４〉力価の測定法 酵素活性の測定は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコ
シドを基質とする場合は、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ
７．０の緩衝液、好ましくはリン酸カリウム緩衝液中に
おいて、３０〜５５℃、好ましくは５０℃で１０〜６０
分間、好ましくは１５分間反応を行った後、グリシン−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）などを加えて反応を停
止させ、次に遊離したｐ−ニトロフェノールの量を４１
０ｎｍの吸光度で測定することにより行うことができ
る。酵素の単位は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェ
ノールを遊離する酵素量を１ユニットとすることができ
る。その他の基質についてはｐＨ６〜８、好ましくはｐ
Ｈ７．０の緩衝液、好ましくはリン酸カリウム緩衝液中
において、３０〜５５℃、好ましくは５０℃で１０〜６
０分間、好ましくは３０分間反応を行った後、沸騰浴中
で３分間程度加熱して反応を停止し、次に遠心し、上澄
み液中の遊離Ｌ−フコース量をシュードモナス由来のＬ
−フコースデヒドロゲナーゼを用いて定量することによ
り測定することができる。

【００１３】〈５〉至適温度および安定温度 反応の至適温度は５５℃である（図３参照）。安定温度
範囲はｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液中に各温度で
１０分間保温した結果、５０℃までは安定であり、５５
℃で約６０％残存活性を示した（図４参照）。

【００１４】〈６〉ｐＨ、温度などによる失活の条件 ６５℃で１０分間保持することにより完全に失活する。
またｐＨ１１以上において４５℃で６０分間保持するこ
とにより完全に失活する。

【００１５】〈７〉阻害剤等の影響 銅（０．１ｍＭ）、水銀（０．１ｍＭ）、パラクロロメ
ルクリ安息香酸（０．５ｍＭ）により著しく阻害される
が、その他の金属イオン（１ｍＭ）、ＳＨ試薬（１ｍ
Ｍ）または生成物であるＬ−フコース（１ｍＭ）により
ほとんど影響を受けない。

【００１６】〈８〉精製方法 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの精製は、公知の酵素の
精製法を単独で、または併用して行うことができる。本
発明のα−Ｌ−フコシダーゼは菌体内および菌体外に生
産されるので、微生物の培養物、例えば培養液、菌体破
壊液またはこれらの混合物などから分離、精製すること
ができるが、培養液中に生産された酵素を精製する場合
には菌体を破壊する必要がないので簡単に行うことがで
き、このため大量生産に適しているので、培養液中に生
産された酵素を精製するのが好ましい。培養液から精製
する場合は、培養液を濾過または遠心分離により菌体を
除去し、次いで塩析法、各種クロマトグラフ法等の公知
の方法を適宜組み合わせることにより目的物を得ること
ができる。

【００１７】具体的には、次のような方法により分離、
精製することができる。培養液をそのまま、または菌体
を除去した後、あるいは菌体破壊液をストリームライン
−ディアエカラム（ファルマシア社製、商標）に通し、
吸着画分を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄
後（この洗浄は省略することができる）、０．２Ｍ塩化
ナトリウムを含む同緩衝液で活性画分を溶出する。この
活性画分に最終濃度が１Ｍになるように硫安を加える。
これをブチル−トヨパール６５０Ｍカラム（東ソー
（株）製、商標）に通して吸着させ、１Ｍの硫安を含む
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後（この洗
浄は省略することができる）、１Ｍ〜０Ｍの硫安を含む
同緩衝液によるリニアーグラジェント法により活性画分
を溶出させる。

【００１８】この活性画分またはこの活性画分を同緩衝
液で一夜透析した透析内液を、同緩衝液で予め平衡化し
たフコース−セルロファインカラムに通し、吸着した酵
素を５０ｍＭのＬ−フコースを含む１０ｍＭリン酸緩衝
液で溶出する。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で一夜透析する。この透析内液を、同緩
衝液で予め平衡化したＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ Ｑカラム
（ファルマシア社製、商標）に通し、吸着した酵素を同
緩衝液で洗浄後（この洗浄は省略することができる）、
０Ｍ〜０．３Ｍの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で溶出する（リニアーグラジェント
法）。ここまでの精製により目的物は電気泳動的に均一
であるが、ポリッシングのためセファクリルＳ−３００
ＨＲによりゲル濾過を行うのが好ましい。

【００１９】〈９〉分子量 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの分子量は約１０２，０
００である（ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）法）。 〈１０〉ポリアクリルアミド電気泳動 精製されたα−Ｌ−フコシダーゼは、ＰＡＧＥおよびＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて単一のバンドを示す。この時の
分子量はそれぞれ１０２，０００、５１，０００であ
る。 〈１１〉Ｋｍ値 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼのｐ−ニトロフェニル−
α−Ｌ−フコシドに対するＫｍ値は、１．３２×１０^-3
Ｍである。

【００２０】以上の結果と公知のα−Ｌ−フコシダーゼ
の性質とを比較すると、フラボバクテリウム・ファルギ
ニューム ＩＡＭ１４９３またはコリネバクテリウム
ｓｐ． ＦＳ−００７７から得られるα−Ｌ−フコシダ
ーゼ（特開昭６２−１５５０８６号公報）は至適ｐＨが
約８．５、至適温度が３４℃であるのに対し、本発明の
α−Ｌ−フコシダーゼは至適ｐＨが７．０〜８．０、至
適温度が５５℃である点で特に異なっている。

【００２１】また、フザリウム・オキシスポラム ＳＡ
２５２から得られるα−Ｌ−フコシダーゼ（特開昭６１
−５８５８７号公報）は至適ｐＨが４．５〜５．５で、
α−１→４結合に作用するのに対し、本発明のα−Ｌ−
フコシダーゼは至適ｐＨが７．０〜８．０で、α−１→
４結合に作用しない点で特に異なっている。このよう
に、本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは公知のものとは性
質が異なり、新規な酵素である。

【００２２】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼはアルカリ
ジェネス属に属する菌株から得ることができる。アルカ
リジェネス属に属する菌株としては、α−Ｌ−フコシダ
ーゼ生産能を有するものであればいかなる菌株でも使用
することができ、これらの菌株の変異株でも使用するこ
とができる。アルカリジェネス属に属するα−Ｌ−フコ
シダーゼ生産能を有する菌株の具体例として、例えばア
ルカリジェネス・デニトリフィカンス サブｓｐ． デ
ニトリフィカンス（Alcaligenes denitrificans subsp.
denitrificans） ＫＳＦ−０９０１菌株があげられ
る。この菌株は、静岡県掛川市内の土壌より本発明者ら
が新たに採取した菌株で、その菌学的性質は次の通りで
ある。

【００２３】〈形態的所見〉 （１）細胞の形態、大きさ：桿菌、０．７〜０．８×
１．５〜２．５μｍ （２）多形性 ：なし （３）運動性 ：あり （４）胞子 ：なし （５）べん毛 ：周べん毛 （６）グラム染色性：陰性

【００２４】〈生育状態〉 （１）肉汁寒天平板培養 集落の形状は円形であり、周縁は平滑で、表面隆起は扁
平状である。また、集落の色調は乳白色である。 （２）肉汁液体培養 生育し混濁する。 （３）ゼラチン穿刺培養 液化しない。

【００２５】〈生理学的性質〉 （１）硝酸塩の還元 ：陽性 （２）色素の生成 ：陰性 （３）インドールの生成：陰性 （４）デンプンの分解 ：陰性 （５）クエン酸の利用 ：陽性 （６）カタラーゼ ：陽性 （７）オキシダーゼ ：陽性 （８）ＭＲテスト ：陰性 （９）ＶＰテスト ：陰性 （10）エスクリンの加水分解：陰性 （11）脱窒反応：陽性 （12）ポリハイドロキシ酪酸の蓄積：陽性 （13）栄養要求性：陰性 （14）リジン デカルボキシラーゼ：陽性 （15）アルギニン ジヒドロラーゼ：陰性 （16）オルニチン デカルボキシラーゼ:陽性 （17）生育温度 ：１５〜４２℃ 至適温度 ：３０〜３７℃ （18）生育ｐＨ ：６．０〜９．０ 至適ｐＨ ：７．０〜８．０ （19）酸素に対する態度：好気性 〈その他〉α−Ｌ−フコシダーゼを菌体内および菌体外
に生産する。

【００２６】以上の性質から、ベルゲイズ マニアル
オブ システマチック バクテリオロジイ（Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology）を参照し、上記菌
株をアルカリジェネスに属する菌株と同定した。そし
て、公知のアルカリジェネス属に属する菌株とはα−Ｌ
−フコシダーゼを生産するという点において区別され
る。この菌株は、アルカリジェネス デニトリフィカン
ス サブｓｐ． デニトリフィカンス（Alcaligenes de
nitrificans subsp. denitrificans） ＫＳＦ−０９０
１と命名した。なおこの菌株は、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３９９３の受託番号で
寄託されている。

【００２７】アルカリジェネス属に属する微生物を用い
てα−Ｌ−フコシダーゼを生産するには、通常の微生物
の培養に用いる炭素源および窒素源を使用し、微生物を
培養することにより行うことができる。培養は液体培地
または固体培地を用いて行うことができるが、液体培地
を使用するのが好ましい。培養は次のようして行うのが
好ましい。

【００２８】炭素源および窒素源としてペプトン、酵母
エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスチープリカ
ー、ビタミン、アミノ酸等を用い、厳密な炭素源として
は各種有機酸、厳密な窒素源としては各種アンモニウム
塩、各種硝酸塩、尿素等を用いて、培地を通常の方法で
滅菌した後、アルカリジェネス属に属する微生物、例え
ばアルカリジェネス デニトリフィカンス サブｓｐ．
デニトリフィカンス（Alcaligenes denitrificans su
bsp. denitrificans） ＫＳＦ−０９０１菌株を接種
し、３０〜３７℃、ｐＨ７．０〜８．０で１〜４日間振
とうまたは通気撹拌により好気的に液体培養する。

【００２９】酵素を菌体外に生産する微生物、例えばア
ルカリジェネス デニトリフィカンス サブｓｐ． デ
ニトリフィカンス（Alcaligenes denitrificans subsp.
denitrificans） ＫＳＦ−０９０１菌株を用いてα−
Ｌ−フコシダーゼを生産すると、活性画分を菌体内から
抽出する操作を必要とせず、培養液から酵素を精製でき
るので、工業的生産に適している。

【００３０】培養終了後は、前記精製方法によりα−Ｌ
−フコシダーゼを分離、精製する。得られたα−Ｌ−フ
コシダーゼは中性付近に至適ｐＨを有し、熱に安定で、
しかもｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド等の合成
基質、オリゴ糖、およびムチン等天然高分子基質に作用
する基質特異性を有しているので、糖鎖の構造解析や機
能の研究に好適に利用できる。

【００３１】アルカリジェネス デニトリフィカンス
サブｓｐ． デニトリフィカンス（Alcaligenes denitr
ificans subsp. denitrificans） ＫＳＦ−０９０１菌
株は次のようにしてスクリーニングすることができる。
炭素源、窒素源等とリン酸塩、カリウム塩等の金属塩類
等およびｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドを含む
寒天平板上に菌体懸濁液を適量塗布し、３７℃で１日〜
４日間培養し、培地中の黄色く発色してくるコロニーを
分離する。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ 次のようにしてアルカリジェネス デニトリフィカンス
サブｓｐ． デニトリフィカンス（Alcaligenes deni
trificans subsp. denitrificans） ＫＳＦ−０９０１
菌株をスクリーニングした。すなわち、グルコース１
％、ペプトン０．５％、カザミノ酸０．２５％、ＫＨ ₂
ＰＯ₄ ０．１％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２％、
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド０．０５％およ
び寒天２％をｐＨ９．０に調整し、平板上に静岡県掛川
市より採取した土壌を滅菌水により希釈し、この土壌懸
濁液を上記培地に広げ３７℃で２日間培養を行い、培地
中の黄色く発色しているコロニーを分離した。

【００３３】実施例２ 実施例１で得たアルカリジェネス デニトリフィカンス
サブｓｐ． デニトリフィカンス（Alcaligenes deni
trificans subsp. denitrificans） ＫＳＦ−０９０
１、ペプトン０．５重量％、酵母エキス０．２５重量
％、リン酸水素二カリウム０．１重量％、および硫酸マ
グネシウム０．０２重量％（ｐＨ７．２）を含む液体培
地を５００ｍｌ容器で振とう培養し、種培養とした。次
いで種培養と同組成の培地３ literを５ liter容ジャー
ファーメンター３基に入れ、１２１℃で２０分間殺菌し
た。冷却後、上記の種培養液を接種し、３７℃で１日
間、毎分３ literの通気量と毎分３００回転の撹拌速度
の条件で培養した。

【００３４】培養終了後、最終濃度１０ｍＭになるよう
に０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、予め１
０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したストリームライン−デ
ィアエカラム（ファルマシア社製、５．０×１７ｃｍ、
商標）に菌体を含む培養物を通し、吸着した酵素を０．
２Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液で溶出
した。この活性画分を集め、最終濃度が１Ｍになるよう
に硫安を溶解した。これを１Ｍ硫安を含む１０ｍＭリン
酸緩衝液で予め平衡化したブチル−トヨパール６５０Ｍ
カラム（東ソー（株）製、２．６×３０ｃｍ、商標）に
通して吸着させ、１Ｍないし０Ｍの硫安を含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液のリニアーグラジェント法で溶出した。

【００３５】溶出された活性画分を集め、予め１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したフコース−セ
ルロファインカラム（１．６×７．５ｃｍ）に通し、吸
着した酵素を５０ｍＭのＬ−フコースを含む同緩衝液で
溶出した。活性画分を一晩１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）にて透析を行った。この透析内液を、同緩衝液
にて平衡化したＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ Ｑカラム（ファル
マシア社製、商標）に通し、吸着した酵素を０Ｍ−０．
３Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液のリ
ニアーグラジェント法で溶出した。

【００３６】この時点で得られた酵素は電気泳動的に単
一バンドを与えるが、ポリッシングのため、活性画分を
濃縮後セファクリルＳ−３００ＨＲ（ファルマシア社
製、１．６×６０ｃｍ、商標）でゲル濾過を行い、α−
Ｌ−フコシダーゼの精製標品７４μｇ（比活性５６８ｕ
ｎｉｔｓ／ｍｇ、収率２４％）を得た。

【００３７】実施例３ 実施例２で得たα−Ｌ−フコシダーゼの種々の基質に対
する酵素活性を次のようにして測定した。ｐ−ニトロフ
ェニル−α−Ｌ−フコシドを基質とした場合は、ｐＨ
７．０の１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液に１００μｌ
の酵素および２００μｌの基質を加え、５０℃で１５分
間反応を行った後、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１
０．０）を加えて反応を停止させ、次に遊離したｐ−ニ
トロフェノールの量を４１０ｎｍ吸光度で定量した。そ
の他の基質についてはｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液に１００μｌの酵素および２００μｌの基
質を加え、５０℃で３０分間反応を行った後、沸騰浴中
で３分間加熱して反応を停止し、次に遠心し、上澄み液
中の遊離Ｌ−フコース量をシュードモナス由来のＬ−フ
コースデヒドロゲナーゼを用いて定量した。結果は表１
に示した通りである。

【００３８】実施例３の結果から、実施例２で得た酵素
はｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド等の合成基
質；２’−フコシルラクトース、６’−フコシル−Ｎ−
アセチルグルコサミン等のオリゴ糖；ムチン等の天然高
分子基質などに作用し、これら基質中のα−１→２結合
またはオリゴ糖鎖中α−１→６結合のフコース残基を加
水分解することが分かる。一方、オリゴ糖鎖中のα−１
→３またはα−１→４フコシル結合には作用しないこと
が分かる。またｐ−ニトロフェニル−β−Ｌ−フコシド
には作用しないことが分かる。

【００３９】

【発明の効果】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは新規か
つ有用である。本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは菌体外
に生産されるため、菌体を破砕して活性画分を抽出する
操作を必要せず、このため工業的生産に適している。ま
た、この酵素は中性付近に至適ｐＨを有し、熱に安定
で、しかもｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド等の
合成基質、オリゴ糖、およびムチン等天然高分子基質に
作用する基質特異性を有しているので、糖鎖の構造解析
や機能の研究に有用である。

【００４０】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの製造方法
は、アルカリジェネスに属する微生物を用いているの
で、上記α−Ｌ−フコシダーゼを容易に製造することが
できる。

【００４１】本発明のアルカリジェネス・デニトリフィ
カンス サブｓｐ． デニトリフィカンス（Alcaligene
s denitrificans subsp. denitrificans） ＫＳＦ−０
９０１菌株は新規かつ有用である。この菌株は上記α−
Ｌ−フコシダーゼ生産能を有しており、しかも菌体外に
この酵素を生産するので、この菌株を用いることによ
り、α−Ｌ−フコシダーゼを容易に製造、精製すること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの至適ｐＨを示
すグラフである。

【図２】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの安定ｐＨを示
すグラフである。

【図３】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの至適温度を示
すグラフである。

【図４】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼの安定温度を示
すグラフである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の酵素学的性質を有することを特徴と
   するα−Ｌ−フコシダーゼ。 作用 天然高分子基質、オリゴ糖および合成基質中のα−Ｌ−
   フコシル結合に作用して、Ｌ−フコースを遊離する。 基質特異性 合成基質および天然基質中のα−１→２またはα−１→
   ６フコシル結合に作用する。一方、天然基質中のα−１
   →３またはα−１→４フコシル結合には作用しない。 至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨはｐＨ７．０〜８．０である。４５℃で１時間
   保持した場合、安定ｐＨ範囲は６．０〜９．０である。 反応至適温度および安定温度範囲 反応の至適温度は５５℃である。ｐＨ７．０で１０分間
   保持した場合、５０℃までは安定であり、６５℃以上で
   失活する。 阻害剤の影響 銅、水銀、パラクロロメルクリ安息香酸により著しく阻
   害される。Ｌ−フコースにはほとんど影響を受けない。 分子量 ＰＡＧＥにより測定した分子量は約１０２０００であ
   る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量は約５１０
   ００である。
2. 【請求項２】 アルカリジェネス・デニトリフィカンス
   サブｓｐ． デニトリフィカンス（Alcaligenes deni
   trificans subsp. denitrificans） ＫＳＦ−０９０１
   菌株由来であることを特徴とする請求項１記載のα−Ｌ
   −フコシダーゼ。
3. 【請求項３】 請求項１記載のα−Ｌ−フコシダーゼ生
   産能を有することを特徴とするアルカリジェネス・デニ
   トリフィカンス サブｓｐ． デニトリフィカンス（Al
   caligenes denitrificans subsp. denitrificans） Ｋ
   ＳＦ−０９０１菌株。
4. 【請求項４】 アルカリジェネス属に属し、α−Ｌ−フ
   コシダーゼを生産する能力を有する微生物を培養し、培
   養物からα−Ｌ−フコシダーゼを分離することを特徴と
   するα−Ｌ−フコシダーゼの製造方法。
5. 【請求項５】 α−Ｌ−フコシダーゼを生産する能力を
   有する微生物が、請求項３記載のアルカリジェネス・デ
   ニトリフィカンス サブｓｐ． デニトリフィカンス
   （Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans）
   ＫＳＦ−０９０１菌株であることを特徴とする請求項
   ４記載の製造方法。
6. 【請求項６】 培養物が培養液であることを特徴とする
   請求項４または５記載の製造方法。