JPH03108481A - アルカリホスファターゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 アルカリホスファターゼは組換えプラスミド作成やＤＮ
Ａ塩基配列決定の際の、ＤＮＡ及びＲＮＡの末端リン酸
基の除去、リン脂質等のリン酸残基を有する物質の定量
に用いられているほか、酵素免疫測定法における標識酵
素として使用されている。

本発明は、これらの用途に好適なアルカリホスファター
ゼ及びその製造法に関する。

〔従来の技術〕

アルカリホスファターゼの給源としては、これまでに大
腸菌及び仔牛小腸由来のものが知られている。

しかし、前者の酵素は酵素反応の分解産物である無機リ
ン酸及びエチレンジアミンテトラ酢酸（以下、ＥＤＴＡ
と略記することがある。）による阻害を受け［八、Ｔｏ
ｒｒｉａｎｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒ
ｋ、Ｖｏｌ、１２Ｂ、ｐ２１２（１９６８）］、後者の
酵素もＥＤＴＡによる阻害を受けるという欠点がある。

［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１３＋　１７８３＋　
Ｆｏｓｓｅｔ。

Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９７４）］　Ｌ、たがっ
て、充分な加水分解反応を進行させるためには、無機リ
ン酸濃度の低い反応液組成として基質濃度を高めなけれ
ばならない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、酵素反応の分解産物である無機リン酸
による阻害を受けにくく、効率的に反応が進行する新規
アルカリホスファターゼを得ること及び好熱菌を用いて
該酵素を製造する方法を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意研
究を重ね、自然界から分離した好熱性微生物について、
上記アルカリホスファターゼ生産能を有する菌株の検索
を行った。その結果、好熱性バチルス属に属する微生物
バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ　ｈｉｌｕｓ）Ｔ　Ｂ−４
４３（以下、Ｔ　Ｂ−４４３菌と称する。）が目的とす
るアルカリホスファターゼを生産することを見出し、か
かる知見に基づいて本発明を完成したのである。

すなわち本発明は、無機リン酸による阻害を受けにくい
アルカリホスファターゼを提供すると共に、好熱性バチ
ルス属に属し、該アルカリホスファターゼ生産能を有す
る微生物を培養し、培養液中に該アルカリホスファター
ゼを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
るアルカリホスファターゼの製造法を提供するものであ
る。

本発明に用いるアルカリホスファターゼ生産菌としては
、好熱性バチルス属に属し、上記のアルカリホスファタ
ーゼを生産し得る微生物であればよい。したがって、前
記Ｔ　Ｂ−４４３菌の他に、その自然的または人為的変
異株ならびにこれら菌株の遺伝子を導入された各種生物
も本発明のアルカリホスファターゼ生産能を有する限り
、本発明に使用することができる。

次に、ＴＢ−４４３菌の菌学的性質を示す。なお、この
菌学的性質の検討には「微生物の分類と同定」（長谷用
武治編著、東京大学出版会）及び「＠住物同定法」　（
衛生技術会）に記載されている方法。

培地組成を用いた。

〔形態的所見〕　（５５°Ｃ，１８時間培養）１、細胞
の形及び大きさ：桿状、０．３〜０．５χ１．５〜２．
５ｕｔｎ２、多形性：なし ３、運動性：なし ４、胞子：円筒形の内生胞子を細胞先端に形成し、胞子
のうが膨れる。

５、ダラム染色：陽性 ６、抗酸性：なし ７、カプセル：なし ８、真東顆粒：なし 〔生育状態〕　（５５°Ｃ２２４時間培養）■、肉汁寒
天平板培養 形状：円形 周縁二波状乃至裂片状 隆起：扁平状 光沢：鈍光 表面二浣状 色調二手透明 ２、肉汁寒天斜面培養 生育度：良好 形状：太糸状 ３、肉汁液体培養 表面生育；なし 濁度：やや混濁 沈渣：少量 着色、脱色：なし ４、肉汁ゼラチン穿刺培養（ゼラチンは３０％添加、５
５°Ｃで適時培養後、冷却して固化状態を判定）ゼラチ
ンを液化する ５、肉汁寒天穿刺培養 形状二表面生育のみ 表面生育：良好 ６、リドマスミルク リドマス退色なく、ｐＨややアルカリ性となる。

ミルクの凝固あり。

〔炭素源の利用性〕

Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、フラクトース、Ｄ−
マンニトール、デンプンを資化して増殖し、酸を生成す
る。

アラビノース、シュークロース、Ｄ−ガラクトース、イ
ノシトールの利用性は微弱またはなし。

以上の本国の菌学的諸性質から、パージエイズ・マニュ
アル・オブ・システマテインク・バクテリオロジー（Ｂ
ｅｒｇｅｙ’ｓ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ｓｙｓｔｅｍａ
ｔｉｃ　　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　（１９８４）
の分類方法にしたがって検索し、前記ＴＢ−４４３菌は
バチルス・ステアロサーモフィラスと大略一致したが、
運動性がない点で公知菌株と異なっていた。更に、標準
菌株バチルス・ステアロサーモフィラスＩＡＭ　１１０
０１，１１００２．１１００３゜１１００４．１２０４
３（東京大学応用微生物研究所保管株）はいずれも後述
の培養方法でアルカリホスファターゼを生産しなかった
。

以上の事項から明らかなように、ＴＢ−４４３菌は、公
知の菌株と区別されるため、これを新菌株として設定す
ることが適当であると結論された。

ＴＢ−４４３菌は工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第１０５２２号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０５２２
）として寄託されている。

本発明のアルカリホスファターゼ生産能を有する微生物
を栄養培地に培養し、培養物中に該アルカリホスファタ
ーゼを生成せしめ、これを採取することによって目的と
するアルカリホスファターゼが得られる。

本発明に使用する栄養培地としては、炭素源。

窒素源、無機物及び必要に応じ使用菌株の必要とする微
量栄養素を程よく含有するものであれば天然及び合成培
地のいずれでもよい。

炭素源としては通常微生物培養に用いられるグルコース
、デンプン、デキストリン、グリセロール、マルトース
、フラクトース、乳糖、キシロース、マンニトール、シ
ュークロース、イノシトールなどを使用できるが、中で
もグルコース、デンプン、デキストリン、グリセロール
２マルトースを主炭素源に用いることにより本酵素をよ
り効果的に生産することが出来る。窒素源としては綿実
粕、綿実油、大豆加水分解物、大豆油、ペプトン。

酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンステイープ
リカーなどの含窒素天然物やグルタミン酸。

Ｌ−アラニンなどのアミノ酸が利用できる。その他必要
に応じて銅、マグネシウム、カルシウム。

ナトリウム、コバルト、カリウムなどの金属の塩やビタ
ミンなどの微量栄養物を適宜含む培地を用いればよい。

培養は３６〜６２°Ｃの範囲で行うことができるが、４
５〜５５°Ｃの範囲が好適である。ｐｔ＋は中性域が望
ましい。

酵素の生成は条件によって変わってくるが、通常は６時
間から２４時間であり、アルカリホスファターゼの生成
が確認されたとき、好ましくは生成が最大に達したとき
に培養を停止する。

培養物中からのアルカリホスファターゼの採取は適宜既
知の方法を組合せて実施すればよい。例えば、培養終了
後、菌体内のアルカリホスファタ−ゼを取得する場合は
培養物中から菌体を遠心分離などにより集め、適当な手
段で菌体を破砕してアルカリフォスファターゼを抽出し
、次いでイオン交換、ゲル濾過及び疎水クロマトグラフ
ィーによって精製を行なう。

菌体タトのアルカリホスファターゼを取得する場合は、
先の遠心上清を濃縮し、同様のクロマトグラフィーで精
製を行なう。

アルカリフォスファターゼ活性の測定はＨｕｌｅｔｔ＆
　Ｃａｍｐｂｅｌｌの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　Ｌｏｔ　１３６４、（１９７１）ｌ　を改変して行
なった。２　ｍｌのＩＩ＠ＭＰニトロフェニルホスフェ
ート（以下、ｐ−ＮＰＰと略す。）及び１．２５ｍＭ　
　ＭｇＣ１ｚを含む１ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝ｉ　（ｐ
Ｈ９，０＞に対して、酵素液０．５−を添加し、３７°
Ｃで反応を開始した。一定時間後、０．５ｍＮの０．７
５Ｍ　　Ｋ２ＨＰＯ，を加えて反応を停止させ、遊離し
たｐ−ニトロフェノール（以下、ｐ−ＮＰと略す。）量
を４１０ｎｍの吸光度の増加により測定した。酵素の活
性は１分間に１μｌ１ｏｌｅのｐ−ＮＰを遊離する活性
を１ｕｎｉｔと定義した。

次に、後記実施例で得られた本酵素の理化学的性質を示
す。

（１）作用 本酵素は、リン酸モノエステル結合を加水分解する。

（２）至適ｐＨ ０，２Ｍの各種緩衝液を用い測定したところ、第１図に
示したように本酵素の至適ｐＨは９〜１０であった。

（３）至適温度 至適温度は第２図から６５〜７５°Ｃと判明した。

（４）安定ｐＨ範囲 本酵素標品を第３図に示す種々の緩衝液に溶解し、３７
°Ｃで１時間保持したのち、残存活性を測定した。その
結果、本酵素の安定ｐｌ＋範囲はｐＨ９〜１２の範囲で
あった。

（５）安定温度範囲 酵素液を１ｍＭ　　Ｍｇｃｘ、を含むＬＭ　　Ｔｒｉｓ
ＨＣｆｆｉ緩衝液（ｐＨ９，０）で各温度に３０分間保
持し、氷水中で５分間冷却したのち、残存活性を測定し
た。第４図に示したように５０″Ｃで６５％の活性を維
持していた。

（６）基質特異性 各種基質を１０ｍＭの濃度で本酵素と反応させ、ｌ　ｍ
ｌの２５％トリクロロ酢酸添加により反応を停止させた
後、反応液の一部をとり、Ｆｉｓｋｅ　＆　Ｓｕｂｂａ
ｒｏｗの変法〔生化学分析法、由岐英剛編、南江堂、ｐ
１３゜（１９８４）　］　で無機リン酸の定量を行った
。表１にｐＮＰＰに対する活性を１００％とした場合の
各種基質に対する相対活性を示した。

表１ ＮＰＰ ５’−ＡＭＰ ５’−ＣＭＰ ５°−ＧＭＰ ５’−ＩＭＰ ５′−ＵＭＰ ３°−ＡＭＰ Ｇｌｕｃｏｓｅ−６Ｐ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−２Ｐ ３Ｐ　　Ｇｌ　　ａｅｒａｔｅ （７）金属の影響 ５１ＩＩＭのＭｇ”ｌ　　Ｃｏ”、　　Ｚｎ１″により
３倍以上の活性先進が認められ、Ｃａ　”＋　　Ｃｕ　
”ではほとんど影響はなかった（表２）。

表２ 金属　　　濃度（＋ｗＭ）　　　　相対活性（％）Ｍ　
ｇ　Ｒ４ Ｃｏ”。

Ｚ　ｎ　ｔ　４ Ｍｎ” Ｃａ　２　＋ Ｃｕ　ｔ　＋ ＤＴＡ ０、　１ ５．０ ０．１ ５゜　０ Ｏｌｌ ５．０ ０．１ ５．０ ０．１ ５．０ ０．１ ５、　０ １．０ ５．０ ７３ ６０ ０８ １５ ４４ ０６ ３３ ４１ ０６ １４ ４ ９ １ ６ （８）分子量 ＳＤＳ　　ＰＡＧＥ法、ゲル濾過法で分子量を求めたと
ころそれぞれ５５，０００，１１２，０００であった。

このことから、本酵素は、分子量５５．０００のサブユ
ニントからなるダイマー構造をとっているものと推察さ
れる。

（９）無機リン酸による阻害 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ　−Ｂｕｒｋプロットによりｐ−
ＮＰＰに対するＫｍ値を、またＤｉｘｏｎプロットによ
りＫｚＨＰＯ４に対するＫｉ値を求め、市販のＥ、　ｃ
ｏｌｉ由来酵素及び仔牛小腸由来酵素と比較した。本酵
素は表３に示したように、他の二つの酵素に比較してＫ
ＩＩｌ値に大きな差はないが、Ｋｉ値が大きく、Ｋｉ＋
　Ｋｖａ値が約９〜２０倍の大きさでこれら公知の酵素
よりも無機リン酸による阻害を受けにくいという特徴を
有している。

表３ ＴＢ−４４３１，９４ｘｌＯ−’　３．０２ｘｌＯ−’
　　　　１．５６Ｅ、ｃｏｌｉ　　　３．２３ｘｌＯ−
’　５．３６ｘｌＯ−’　　　０．１６６００）　　キ
レート剤による阻害 表２に示したように、本酵素はｌ　ｍＭ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａ存在下で９１％、５ｍＭ　　ＥＤＴＡ存在下では９
６％の活性を保持しており、キレート剤による阻害を受
けにくい特徴を有している。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例 デンプン２．０％、グルコース１．０％、綿実粕１．０
％、Ｌ−アラニン０．５％、ＣａＣ１ｚ・２Ｈ，ＯＯ，
０５％、ＮａＣ１Ｏ，０３％、Ｃｕ５Ｏｎ・５Ｈ，００
，１３％、ＧｏＣＩ！、ｚ・６ＨｚＯＯ，００２％。

Ｋ（１０，０００８％及び水道水からなる培地３２を５
２容のジャー・ファーメンタ−に入れ、常法により殺菌
後ｐＨを７．０に調整し、バチルス・ステアロサーモフ
ィラス　ＴＢ−４４３（ＦＥＲＭＰ−１０５２２）菌を
種菌として接種し、５０゛Ｃ１通気１３　Ｎ／分、溶存
酸素濃度２．０　ｐｐｍの条件で１６時間の通気撹拌培
養を行った。

培養終了後、培養液を超音波処理してアルカリホスファ
ターゼ活性を測定したところ３．　Ｑ　ｕｎｉｔ／戚で
あった。同様に、遠心分離により菌体を除去した上清液
について酵素活性を測定したところ４、０　ｕｎｉｔ／
　ｄであった。

上記の遠心分離した菌体を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ７，２）緩衝液に懸濁し、超音波により菌体を
破砕後、Ｍ　ｇ　（ＣＨｓ　ＣＯＯ）　ｔを１Ｍ４度と
なるように添加し、４“Ｃで一晩撹拌抽出を行った。次
に、遠心分離により不溶物を除去し、１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓＨ（１！　（ｐＨ７，２）緩衝液に対して透析後、同
緩衝液で平衡化したＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　　Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌカラムへ添加した。活性画分はＩ　Ｃ１＋Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ　−ＨＣｊ２　（＋）１１７．２）緩衝液とＩＭ　
　Ｍｇ　（ＣＨｚＣＯＯ）ｚを含む同緩衝液によるグラ
ジェント溶出により回収し、濃縮後、０．１５Ｍ　　Ｍ
ｇ（ＣＨ，Ｃｏｏ）ｚを含む同緩衝液で平衡化した５ｕ
ｐｅｒｏｓｅ　１２のゲル濾過カラムへ添加した。更に
、活性画分を１．７Ｍ硫安を含む３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　
−ＨＣｌ　（ｐＨ７，２）緩衝液で平衡化したＰｈｅｎ
ｙｌ−５ｕｐｅｒｏｓｅの疎水クロマトカラムへ添加し
、溶離液中の硫安濃度を直線的に減少させることで溶出
させた。

精製酵素標品の純度決定をＳＤＳ電気泳動で行ったとこ
ろ、１本の蛋白バンドのみが認められた。

精製酵素標品の活性収率は１２％であった。

〔発明の効果〕

本発明によれば、培養期間の短い好熱菌を用いて、酵素
反応の分解産物である無機リン酸による阻害を受けにく
いアルカリホスファターゼを提供でき、さらに好ましい
態様としてキレート剤による阻害をも受けにくいアルカ
リホスファターゼを提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のアルカリホスファターゼの至適ｐＨを
、第２図は該アルカリホスファターゼの作用至適温度を
、第３図は該アルカリホスファターゼの安定ｐＨ範囲を
、第４図は該アルカリホスファターゼの安定温度範囲を
それぞれ示すものである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）無機リン酸による阻害を受けにくいアルカリホス
   ファターゼ。
2. （２）アルカリホスファターゼが、無機リン酸による阻
   害を受けにくく、かつキレート剤による阻害を受けにく
   いものである請求項１記載のアルカリホスファターゼ。
3. （３）好熱性バチルス属に属し、無機リン酸による阻害
   を受けにくいアルカリホスファターゼを生産する能力を
   有する微生物を培養し、培養液中に該アルカリホスファ
   ターゼを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴
   とするアルカリホスファターゼの製造法。
4. （４）好熱性バチルス属に属し、請求項１または２記載
   のアルカリホスファターゼ生産能を有する微生物がバチ
   ルス・ステアロサーモフィラスＴＢ−４４３（ＦＥＲＭ
   Ｐ−１０５２２）である請求項３記載の方法。