JPH0121955B2 - - Google Patents
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- JPH0121955B2 JPH0121955B2 JP58031388A JP3138883A JPH0121955B2 JP H0121955 B2 JPH0121955 B2 JP H0121955B2 JP 58031388 A JP58031388 A JP 58031388A JP 3138883 A JP3138883 A JP 3138883A JP H0121955 B2 JPH0121955 B2 JP H0121955B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規耐熱性リパーゼの製造法に関
し、更に詳しくは、リゾパス属に属するリゾパ
ス・キネンシス(Rhizopus chinensis)を培養す
ることによつて耐熱性およびPH安定性の優れた新
規リパーゼを製造する方法に関する。
し、更に詳しくは、リゾパス属に属するリゾパ
ス・キネンシス(Rhizopus chinensis)を培養す
ることによつて耐熱性およびPH安定性の優れた新
規リパーゼを製造する方法に関する。
リパーゼは、脂肪や脂肪酸エステルなどを分解
する酵素であり、従来、動物臓器、微生物などか
ら抽出、製造されている。しかし、これまでに得
られているリパーゼは、一般に熱に対して不安定
であり、PH安定域が狭い為、工業的利用に適して
いない。
する酵素であり、従来、動物臓器、微生物などか
ら抽出、製造されている。しかし、これまでに得
られているリパーゼは、一般に熱に対して不安定
であり、PH安定域が狭い為、工業的利用に適して
いない。
たとえば、リゾパス属に属するリゾパス・キネ
ンシスHI−S株を培養し、培養物からリパーゼ
を採取する方法は知られている(特公昭56−
42266号公報参照)。しかし、この方法で得られる
リパーゼは50℃を越える温度で失活し、また安定
PH領域がPH4.0〜8.0と狭いという欠点を有してい
る。
ンシスHI−S株を培養し、培養物からリパーゼ
を採取する方法は知られている(特公昭56−
42266号公報参照)。しかし、この方法で得られる
リパーゼは50℃を越える温度で失活し、また安定
PH領域がPH4.0〜8.0と狭いという欠点を有してい
る。
本発明者は、微生物を生産するリパーゼについ
て研究を行つた結果、リゾパス属に属するリゾパ
ス・キネンシス(IFO 4745)の培養により得ら
れるリパーゼは、耐熱性およびPH安定性に優れて
いることを見い出し、本発明を完成するに至つ
た。
て研究を行つた結果、リゾパス属に属するリゾパ
ス・キネンシス(IFO 4745)の培養により得ら
れるリパーゼは、耐熱性およびPH安定性に優れて
いることを見い出し、本発明を完成するに至つ
た。
すなわち、本発明の要旨は、30〜80℃の温度で
15分間処理した後少なくとも95%の残存活性を示
すことを特徴とする新規耐熱性リパーゼ、および
リゾパス属に属するリゾパス・キネンシス
(IFO4745)を培養し、培養液中に耐熱性リパー
ゼを生成、蓄積させ、培養液から耐熱性リパーゼ
を採取することを特徴とする耐熱性リパーゼの製
造法に存する。
15分間処理した後少なくとも95%の残存活性を示
すことを特徴とする新規耐熱性リパーゼ、および
リゾパス属に属するリゾパス・キネンシス
(IFO4745)を培養し、培養液中に耐熱性リパー
ゼを生成、蓄積させ、培養液から耐熱性リパーゼ
を採取することを特徴とする耐熱性リパーゼの製
造法に存する。
本発明の耐熱性リパーゼの中でも一定の高温条
件では長時間の熱処理後により高い残存活性を示
すものがより好ましく、また一層高温で高い残存
活性を示すものが好ましいことは言うまでもな
い。たとえば 30〜80℃の温度で15分間処理した後100%の残
存活性を示すもの、 80℃で60分間処理した後少なくとも95%の残存
活性を示すもの、 80℃で120分間処理した後少なくとも80%の残
存活性を示すもの、 90℃で60分間処理した後少なくとも60%の残存
活性を示すもの、さらに 90℃で120分間処理した後少なくとも35%の残
存活性を示すものなどが好ましい本発明の耐熱性
リパーゼである。
件では長時間の熱処理後により高い残存活性を示
すものがより好ましく、また一層高温で高い残存
活性を示すものが好ましいことは言うまでもな
い。たとえば 30〜80℃の温度で15分間処理した後100%の残
存活性を示すもの、 80℃で60分間処理した後少なくとも95%の残存
活性を示すもの、 80℃で120分間処理した後少なくとも80%の残
存活性を示すもの、 90℃で60分間処理した後少なくとも60%の残存
活性を示すもの、さらに 90℃で120分間処理した後少なくとも35%の残
存活性を示すものなどが好ましい本発明の耐熱性
リパーゼである。
本発明で用いるリゾパス・キネンシスは、財団
法人発酵研究所にIFO4745として寄託された公知
菌である。
法人発酵研究所にIFO4745として寄託された公知
菌である。
本発明の製造法においては、リゾパス・キネン
シスを次の様にして培養する。
シスを次の様にして培養する。
培地は、液状でも固体でもよく、培養は、静置
培養、振とう培養、通気撹拌培養のいずれでも行
えるが、好ましくは液状培地を用い、振とう培養
または通気撹拌培養により行う。
培養、振とう培養、通気撹拌培養のいずれでも行
えるが、好ましくは液状培地を用い、振とう培養
または通気撹拌培養により行う。
炭素源としては、グルコース、サツカロース、
マンノース、デキストリン、セルロース、デン
粉、グリセリン、ソルビツト、ふすま、米ぬかな
どが用いられる。
マンノース、デキストリン、セルロース、デン
粉、グリセリン、ソルビツト、ふすま、米ぬかな
どが用いられる。
窒素源としては、ペプトン、肉汁エキス、酵母
エキス、乾燥酵母、大豆粉、大豆粕、カゼイン、
グルテン、カザミノ酸、コーンスチープリカー、
尿素、コーンスチープミール、アンモニウム塩、
硝酸塩などが利用される。
エキス、乾燥酵母、大豆粉、大豆粕、カゼイン、
グルテン、カザミノ酸、コーンスチープリカー、
尿素、コーンスチープミール、アンモニウム塩、
硝酸塩などが利用される。
無機塩としては、各種リン酸塩、硫酸塩、塩酸
塩などが用いられる。
塩などが用いられる。
これらの他に、所望によりビタミン類、核酸な
どを培地に添加してもよい。
どを培地に添加してもよい。
通常、菌は前培養を行つた後、主培地に接種す
る。
る。
培養温度は20〜40℃、培養時間は2〜10日であ
り、培地は微酸性ないし中性が好ましい。また通
気は培地1当り0.5〜1/分の量が好ましい。
り、培地は微酸性ないし中性が好ましい。また通
気は培地1当り0.5〜1/分の量が好ましい。
液体培地の場合、耐熱性リパーゼは、主に培養
液中に蓄積される。従つて、培養物を過または
遠心分離して菌体を除去し、液または上澄液か
らリパーゼを採取する。
液中に蓄積される。従つて、培養物を過または
遠心分離して菌体を除去し、液または上澄液か
らリパーゼを採取する。
耐熱性リパーゼは、既知の分離精製手段により
採取することができる。たとえば、無機塩(たと
えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナ
トリウムなど)による塩析、親水性有機溶媒(た
とえばアルコール類、アセトンなど)による分画
沈澱、イオン交換樹脂などによる吸脱着、クロマ
トグラフイ、モレキユラーシーブ法、蛋白沈澱剤
(たとえば核酸、タンニン、リンタングステン酸
など)による沈澱、等電点沈澱法、透析法、電気
透析法、電気泳動法などをリパーゼの分離精製法
として例示することができる。
採取することができる。たとえば、無機塩(たと
えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナ
トリウムなど)による塩析、親水性有機溶媒(た
とえばアルコール類、アセトンなど)による分画
沈澱、イオン交換樹脂などによる吸脱着、クロマ
トグラフイ、モレキユラーシーブ法、蛋白沈澱剤
(たとえば核酸、タンニン、リンタングステン酸
など)による沈澱、等電点沈澱法、透析法、電気
透析法、電気泳動法などをリパーゼの分離精製法
として例示することができる。
本発明で得られる耐熱性リパーゼは、次の様な
特異性質を有している。
特異性質を有している。
(1) PH安定性
PH2.5〜11という広い範囲において100%の残
存活性を示し、PH安定性がよい(第1図参照)。
存活性を示し、PH安定性がよい(第1図参照)。
(2) 温度安定性
75℃で15分間の熱処理では全く失活せず、80
℃で120分間の処理後に80%、90℃で60分間の
処理後に60%の残存活性を示し、耐熱性が非常
に高い(第2図および第3図参照)。
℃で120分間の処理後に80%、90℃で60分間の
処理後に60%の残存活性を示し、耐熱性が非常
に高い(第2図および第3図参照)。
(3) 作用最適PH
PH6.5ないし中性付近に存在する(第4図参
照)。
照)。
(4) 作用最適温度
40〜60℃とやや高温側に広い最適温度範囲が
ある(第5図参照)。
ある(第5図参照)。
(5) トリグリセリドに対する位置特異性
トリグリセリドの1および3位のエステル結
合のみを切断し、2位のエステル結合には作用
しないという位置特異性がある。
合のみを切断し、2位のエステル結合には作用
しないという位置特異性がある。
(6) 単酸基トリグリセリドに対する脂肪酸特異性
トリオレインに対する分解活性を100とすると、
相対分解活性は、トリカプリンに対して154、
トリラウリンに対して89となる(第6図参照)。
トリオレインに対する分解活性を100とすると、
相対分解活性は、トリカプリンに対して154、
トリラウリンに対して89となる(第6図参照)。
(7) 等電点
等電点電気泳動法によれば9.2である。
(8) 分子量
SDS電気泳動法によれば30000である。
これらの性質は次の様にして測定された。
(a) リパーゼ活性測定法
オリーブ油1g、M/20酢酸緩衝液(PH5.6)
+M/100CaCl25mlを含む反応液を内径4.4cm、
高さ8.2cmのガラス容器に入れ、適宜希釈した
酵素液(0.05〜1ml)を加え、30℃で1時間、
500rpmで撹拌して反応させた後、エタノール
20mlを加えて反応を終了させた。
+M/100CaCl25mlを含む反応液を内径4.4cm、
高さ8.2cmのガラス容器に入れ、適宜希釈した
酵素液(0.05〜1ml)を加え、30℃で1時間、
500rpmで撹拌して反応させた後、エタノール
20mlを加えて反応を終了させた。
酵素力価は、遊離する脂肪酸をN/20水酸化
カリウムを用いてPH10を終点とする滴定により
求めた。1分間に1マイクロ当量の脂肪酸を遊
離させる酵素量を1単位とした。
カリウムを用いてPH10を終点とする滴定により
求めた。1分間に1マイクロ当量の脂肪酸を遊
離させる酵素量を1単位とした。
(b) 作用最適PH曲線の測定条件
オリーブ油1gおよびMcIlvaine緩衝液5ml
中に酵素溶液0.5mlを加え、30℃で60分間、
500rpmで撹伴して反応させ、最大活性を100と
して相対活性を求めた。
中に酵素溶液0.5mlを加え、30℃で60分間、
500rpmで撹伴して反応させ、最大活性を100と
して相対活性を求めた。
(c) 温度安定性曲線の測定条件
まず、酵素溶液を30、50、60、70、75、80、
90、95および100℃で15分間保つた後、5分間
氷冷し、残存活性を上記(a)のの方法に従つて測
定した。その結果を示したのが第2図である。
90、95および100℃で15分間保つた後、5分間
氷冷し、残存活性を上記(a)のの方法に従つて測
定した。その結果を示したのが第2図である。
一方、酵素溶液を80℃または90℃で、0、
30、60、90および120分間保つた後、5分間氷
冷し、同じく残存活性を測定した。その結果を
示したのが第3図である。
30、60、90および120分間保つた後、5分間氷
冷し、同じく残存活性を測定した。その結果を
示したのが第3図である。
(d) PH安定性曲線の測定条件
酵素溶液を、PH2〜4についてはグリシン−
塩酸緩衝液、PH4〜7についてはMcIlvaine緩
衝液、PH7〜12についてはグリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液中に加え、30℃で15時間処理し
た後、残存活性を上記(a)の方法に従つて測定し
た。
塩酸緩衝液、PH4〜7についてはMcIlvaine緩
衝液、PH7〜12についてはグリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液中に加え、30℃で15時間処理し
た後、残存活性を上記(a)の方法に従つて測定し
た。
(e) 作用最適温度曲線の測定条件
オリーブ油1gおよびM/20酢酸緩衝液(PH
5.6)+M/100CaCl25ml中に酵素溶液を加え、
30〜80℃の温度で60分間、500rpmで撹拌して
反応させ、最大活性を100として相対活性を求
めた。
5.6)+M/100CaCl25ml中に酵素溶液を加え、
30〜80℃の温度で60分間、500rpmで撹拌して
反応させ、最大活性を100として相対活性を求
めた。
本発明の製造法により得られるリパーゼは、上
述の様に耐熱性がよく、PH安定領域も広いから、
工業的に非常に有用である。たとえば、製油時に
用いると高温での作業が可能となり、油の流動性
が向上し、反応が容易になる。また、洗剤用酵
素、消化酵素としても優れたものである。
述の様に耐熱性がよく、PH安定領域も広いから、
工業的に非常に有用である。たとえば、製油時に
用いると高温での作業が可能となり、油の流動性
が向上し、反応が容易になる。また、洗剤用酵
素、消化酵素としても優れたものである。
次に実施例を示し、本発明を具体的に説明す
る。
る。
実施例
ペプトン5%、グルコース2%、NaNO30.1
%、KH2PO40.1%、MgSO4・7H2O0.05%を含む
培地をPH6.0に調整した後、その60mlずつを500ml
容坂口フラスコ50本に分注し、フラスコ1本当り
胞子数105個になるように植菌し、27℃で96時間
振とう培養を行い、40単位/mlの培養液3000ml
を得た。
%、KH2PO40.1%、MgSO4・7H2O0.05%を含む
培地をPH6.0に調整した後、その60mlずつを500ml
容坂口フラスコ50本に分注し、フラスコ1本当り
胞子数105個になるように植菌し、27℃で96時間
振とう培養を行い、40単位/mlの培養液3000ml
を得た。
この液に、最終80%飽和になる様に硫安を加
え、塩析沈澱させた後、SP−Sephadex(商標)
C−50、Sephadex G−100、等電点電気泳動の
精製手段により、デイスク電気泳動的に均質なリ
パーゼを得た。回収率60%。
え、塩析沈澱させた後、SP−Sephadex(商標)
C−50、Sephadex G−100、等電点電気泳動の
精製手段により、デイスク電気泳動的に均質なリ
パーゼを得た。回収率60%。
得られたリパーゼの活性は、比活性3000単位/
mgであつた。
mgであつた。
第1図は、耐熱性リパーゼのPH安定性曲線、第
2図および第3図は、耐熱性リパーゼの熱安定性
曲線、第4図は、耐熱性リパーゼの作用最適PH曲
線、第5図は、耐熱性リパーゼの作用最適温度曲
線、および第6図は、単酸基トリグリセリドに対
する脂肪酸特異性を示す図である。
2図および第3図は、耐熱性リパーゼの熱安定性
曲線、第4図は、耐熱性リパーゼの作用最適PH曲
線、第5図は、耐熱性リパーゼの作用最適温度曲
線、および第6図は、単酸基トリグリセリドに対
する脂肪酸特異性を示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 PH2.5〜11において100%の残存活性を示し、
30〜80℃の温度で15分間処理した後少なくとも95
%の残存活性を示し、PH6.5ないし中性付近に作
用最適PHがあり、40〜60℃に最適温度範囲があ
り、トリグリセリドの1および3位のエステル結
合のみを切断し、2位のエステル結合には作用し
ないというトリグリセリドに対する位置特異性が
あり、トリオレインに対する分解活性を100とす
ると、相対分解活性は、トリカプリンに対して
154、トリラウリンに対して89であり、電気泳動
法により測定した等電点は9.2であり、SDS電気
泳動法により測定した分子量は30000であること
を特徴とする新規耐熱性リパーゼ。 2 30〜80℃の温度で15分間処理した後100%の
残存活性を示す特許請求の範囲第1項記載の耐熱
性リパーゼ。 3 80℃で60分間処理した後少なくとも95%の残
存活性を示す特許請求の範囲第1項記載の耐熱性
リパーゼ。 4 80℃で120分間処理した後少なくとも80%の
残存活性を示す特許請求の範囲第1項記載の耐熱
性リパーゼ。 5 90℃で60分間処理した後少なくとも60%の残
存活性を示す特許請求の範囲第1項記載の耐熱性
リパーゼ。 6 90℃で120分間処理した後少なくとも35%の
残存活性を示す特許請求の範囲第1項記載の耐熱
性リパーゼ。 7 リゾパス属に属するリゾパス・キネンシス
(IFO 4745)(微工研条寄936号)を培養し、培養
液中に耐熱性リパーゼを生成、蓄積させ、培養液
から耐熱性リパーゼを採取することを特徴とする
耐熱性リパーゼの製造法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58031388A JPS59156282A (ja) | 1983-02-25 | 1983-02-25 | 新規耐熱性リパーゼおよびその製造法 |
US06/583,188 US4665029A (en) | 1983-02-25 | 1984-02-24 | Heat-resistant lipase |
DK102784A DK102784A (da) | 1983-02-25 | 1984-02-24 | Varmeresistent lipase |
EP84101974A EP0117553A3 (en) | 1983-02-25 | 1984-02-24 | Heat-resistant lipase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58031388A JPS59156282A (ja) | 1983-02-25 | 1983-02-25 | 新規耐熱性リパーゼおよびその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59156282A JPS59156282A (ja) | 1984-09-05 |
JPH0121955B2 true JPH0121955B2 (ja) | 1989-04-24 |
Family
ID=12329871
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58031388A Granted JPS59156282A (ja) | 1983-02-25 | 1983-02-25 | 新規耐熱性リパーゼおよびその製造法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4665029A (ja) |
EP (1) | EP0117553A3 (ja) |
JP (1) | JPS59156282A (ja) |
DK (1) | DK102784A (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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ATE117018T1 (de) * | 1986-10-17 | 1995-01-15 | Novo Nordisk As | Positionsmässig nicht spezifische lipase von candida-arten; verfahren für ihre herstellung und ihre verwendung. |
US5273898A (en) * | 1986-10-17 | 1993-12-28 | Noro Nordisk A/S | Thermally stable and positionally non-specific lipase isolated from Candida |
US5389536A (en) * | 1986-11-19 | 1995-02-14 | Genencor, Inc. | Lipase from Pseudomonas mendocina having cutinase activity |
US5166069A (en) * | 1989-02-22 | 1992-11-24 | Michigan Biotechnology Institute | Bacillus sp. A30-1 ATCC no. 53841 |
US5093256A (en) * | 1989-02-22 | 1992-03-03 | Shen Gwo Jenn | Essentially purified, thermostable and alkalophilic lipase from bacillus sp. a30-1 atcc 53841 |
US5246848A (en) * | 1991-05-20 | 1993-09-21 | Olin Corporation | Process for providing enhanced yield and simplified isolation of hydrophobic enzymes from culture media |
DE4329463A1 (de) * | 1993-09-01 | 1995-03-02 | Cognis Bio Umwelt | Mehrenzymgranulate |
DE4422433A1 (de) * | 1994-06-28 | 1996-01-04 | Cognis Bio Umwelt | Mehrenzymgranulat |
US5696299A (en) * | 1994-10-26 | 1997-12-09 | The Nisshin Oil Mills, Ltd. | Optical resolution for producing optically active alcohol |
US5600027A (en) | 1994-11-29 | 1997-02-04 | The Nisshin Oil Mills, Ltd. | Process for producing optically active alcohol containing phenyl group |
DE19515072A1 (de) * | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Cognis Bio Umwelt | Cellulasehaltiges Waschmittel |
DE19725508A1 (de) | 1997-06-17 | 1998-12-24 | Clariant Gmbh | Wasch- und Reinigungsmittel |
CN1575308B (zh) | 2001-10-22 | 2010-04-28 | 汉高两合股份公司 | 对棉有活性、具有去污能力的以氨基甲酸酯为基础的聚合物 |
ATE357497T1 (de) | 2002-12-20 | 2007-04-15 | Henkel Kgaa | Bleichmittelhaltige wasch- oder reinigungsmittel |
EP1668124A2 (en) | 2003-09-30 | 2006-06-14 | Goldschmidt GmbH | Thermostable hydrolase |
DE102005026522B4 (de) | 2005-06-08 | 2007-04-05 | Henkel Kgaa | Verstärkung der Reinigungsleistung von Waschmitteln durch Polymer |
DE102005026544A1 (de) | 2005-06-08 | 2006-12-14 | Henkel Kgaa | Verstärkung der Reinigungsleistung von Waschmitteln durch Polymer |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1084431A (en) * | 1964-05-06 | 1967-09-20 | Analyses Et De Rech S Biolog M | Improvements in and relating to lipases |
JPS4629787B1 (ja) * | 1968-07-02 | 1971-08-30 | ||
IT1048921B (it) * | 1972-05-03 | 1980-12-20 | Sir Soc Italiana Resine Spa | Procedimento per la preparazione di prodotti enzimatici ad attivita lipolitica |
JPS5642266B2 (ja) * | 1974-11-20 | 1981-10-03 | ||
US4019959A (en) * | 1975-10-06 | 1977-04-26 | Continental Oil Company | Bacterial production of lipase and pyocyanine from n-paraffins |
US4283494A (en) * | 1978-04-26 | 1981-08-11 | Meito Sangyo Kabushiki Kaisha | Microbial lipase, process for its preparation and microbiologically pure culture therefor |
JPS5763087A (en) * | 1980-09-30 | 1982-04-16 | Agency Of Ind Science & Technol | Treatment of culture mixture containing heat-resistant lipase |
CH671560A5 (ja) * | 1986-06-10 | 1989-09-15 | Lothar Miczka |
-
1983
- 1983-02-25 JP JP58031388A patent/JPS59156282A/ja active Granted
-
1984
- 1984-02-24 DK DK102784A patent/DK102784A/da unknown
- 1984-02-24 EP EP84101974A patent/EP0117553A3/en not_active Withdrawn
- 1984-02-24 US US06/583,188 patent/US4665029A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0117553A3 (en) | 1986-09-10 |
DK102784A (da) | 1984-08-26 |
JPS59156282A (ja) | 1984-09-05 |
DK102784D0 (da) | 1984-02-24 |
US4665029A (en) | 1987-05-12 |
EP0117553A2 (en) | 1984-09-05 |
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