BR102022013015A2 - Produção de amilases por aspergillus welwitschiae a partir de resíduo de malte - Google Patents

Produção de amilases por aspergillus welwitschiae a partir de resíduo de malte Download PDF

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Daniele Sartori
Matheus Mertz Ribeiro
Maria Ines Rezende
Cristiani Baldo Da Rocha
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Universidade Estadual De Londrina
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Abstract

produção de amilases por aspergillus welwitschiae a partir de resíduo de malte. a presente invenção expressa pela produção de amilases por fungos, apresenta vantagens por estes microrganismos apresentarem rápido crescimento e secretarem quantidades consideráveis destas enzimas. a produção de enzimas por linhagens selecionadas de aspergillus welwitschiae é uma opção para obtenção de maior produção destas enzimas. em paralelo à produção de amilases, tem-se o acúmulo de grande quantidade de resíduos liberados pela agroindústria, como o resíduo de malte. tais resíduos, ainda são considerados matérias-primas, passíveis de serem utilizados para obtenção de outros produtos. aliado à disponibilidade de resíduos de malte e linhagens selvagem (uelas15.262) e mutante (uelas15.262/35) de a. welwitschiae previamente selecionadas, a presente invenção padronizou as melhores condições de produção de amilases, a partir deste resíduo. sob as condições abióticas estabelecidas ambas as linhagens de a. welwitschiae produziram maior quantidade amilases no sexto dia de fermentação, a partir de resíduo de malte. no entanto, a produção de amilases pela linhagem mutante de a. welwitschiae foi 39,5 % superior à atividade de amilases produzidas pela linhagem selvagem de a. welwitschiae. neste sentido, a presente invenção disponibiliza produção de amilases por duas linhagens de a. welwitschiae a partir de resíduo de malte.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[01] Atualmente, a utilização do resíduo de malte proveniente em sua maioria de cervejarias, é destinado principalmente como ração para animais, parcialmente para a geração de energia e utilização como aditivo em indústrias de panificação. No entanto, o emprego deste resíduo nestes setores é limitado, devido à pequena porcentagem de utilização por diversos fatores, como: utilização como ração para animais, por ser um resíduo rico em algumas macromoléculas, mas com composição nutricional incompleta à alimentação animal, sendo utilizado apenas uma pequena parcela do resíduo; na geração de energia onde há necessidade de queimar o resíduo durante o processo, contribuindo com aumento da poluição ambiental e no emprego como aditivo alimentar, onde também uma pequena porcentagem do resíduo é empregada.
[02] Ainda, aliado à pequena porcentagem de reutilização do resíduo de malte, tem-se a grande deficiência nacional quanto à produção de enzimas, onde a maioria das enzimas empregadas em diversos setores são provenientes de outros países a um custo elevado. Além disso, a maioria das enzimas produzidas nacionalmente são obtidas por fermentação submersa, que quando comparadas à fermentação em estado sólido, apresenta maior custo, por exigir instalações mais sofisticadas e geralmente a presença de meios de cultivo sintéticos. Tais limitações, podem ser solucionadas com a presente invenção.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[03] Em busca prévia de anterioridade, a serem relatadas neste item, todas as acessadas envolvem a utilização do malte ou do bagaço de malte (resíduo) em processos de melhoria ou obtenção de novos produtos como detergentes, cervejas, ração animal entre outros. Quanto as amilases, as patentes relatadas envolvem a utilização destas enzimas, cuja fonte em alguns casos é fúngica, em diversos processos ou a obtenção de amilases por microrganismos.
[04] A invenção proposta neste pedido, diferencia-se por desenvolver um processo de produção de tais enzimas a partir de um resíduo agroindustrial, o malte, e a partir de linhagens previamente selecionadas de A. welwitschiae, quanto a características genéticas distintas, que as incapacitam quanto à produção ocratoxina A e fumonisina B2, portanto seguras, e que apresentam potencial para maior produção de amilases, sob condições abióticas estabelecidas.
[05] BR 10 2019 014296 0, intitulada: “COMPÓSITO BIODEGRADÁVEL UTILIZANDO BAGAÇO DE MALTE DE CERVEJA E SEUS PROCESSOS DE FABRICAÇÃO”;
[06] BR 10 2018 076152 8, intitulada “CERVEJA E FERMENTADO ALCOÓLICO A BASE DE MALTE ENRIQUECIDOS COM BIOATIVOS PRESENTES NA ROMÃ (PUNICA GRANATUM L.)”;
[07] BR 10 2018 067853 1, “MICROESFERAS DE ALGINATO-QUITOSANA COM AMILASES FÚNGICAS IMOBILIZADAS EM FASE INTERNA, SEU PROCESSO DE OBTENÇÃO E SEU USO NA HIDRÓLISE DE AMIDO EM AÇÚCARES REDUTORES”;
[08] BR 10 2017 026595 1, intitulada “COMPOSIÇÃO E MÉTODO PARA MOSTURAÇÃO DE MALTE”;
[09] BR 10 2013 031848 5 intitulada “PRODUÇÃO DE DEXTRANASE MICROBIANA POR FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO UTILIZANDO BAGAÇO DE MALTE COMO SUBSTRATO E/OU SUPORTE”;
[010] PI 1005557-6, “SISTEMAS ENZIMÁTICOS À BASE DE AMILASES OBTIDOS POR MEIO DE TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE”;
[011] PI 0915606-2, intitulada “ALFA-AMILASES VARIANTES DE BACILLUS SUBTILIS E MÉTODOS DE USO DAS MESMAS”;
[012] PI 9813865-0, intitulada “MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE ENZIMAS AMILASES”;
[013] PI 0408158-7, “AMILASES, ÁCIDOS NUCLÉICOS CODIFICANDO-AS E MÉTODOS PARA PREPARAR E EMPREGÁ-LAS”.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[014] A presente invenção se propõe a contribuir com a reutilização da grande quantidade de resíduos agroindustriais (resíduo de malte), gerados diariamente e com a redução dos custos para obtenção de amilases. Inicialmente, a utilização do resíduo de malte como matéria-prima para A. welwitschiae produzir amilases, proporcionará a recirculação deste resíduo, redução da poluição ambiental e redução do desperdício na cadeia produtiva.
[015] Ainda, a presente invenção trará maior contribuição econômica, visto que estas enzimas são de ampla aplicabilidade no setor industrial, na qual a maioria das amilases empregadas são importadas de outros países a um custo elevado. Um terceiro fator a ser solucionado indiretamente com a invenção, é o fato de as linhagens terem sido previamente selecionadas quanto à maior produção de amilases e quanto a incapacidade de tais linhagens produzirem micotoxinas, como fumonisina B2 e ocratoxina A. Estas micotoxinas quando produzidas por algumas linhagens de fungos, são termoestáveis podendo ser encontradas nos produtos finais, o que acarreta danos diretos ou indiretos à saúde humana e animal. Assim, a associação entre utilização de resíduo agroindustrial e linhagens selecionadas para obtenção de amilases, proporcionará principalmente benefícios econômicos, aliados à saúde e preservação ambiental.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[016] O resíduo de malte foi coletado de cervejaria localizada na cidade Londrina e imediatamente transportado a 25°C para o laboratório. O resíduo foi distribuído em bandejas (50 cm x 30 cm x 5 cm), coberto com papel alumínio e seco a 50°C por período de 72 horas, com homogeneizações periódicas.
[017] Após a secagem do resíduo de malte, o sistema de fermentação em estado sólido, foi preparado da seguinte forma: 1,4g do resíduo de malte foi inserido em frascos Erlenmeyers de 50 mL e autoclavados por 15 minutos. Cada frasco foi umedecido com 4 mL de meio Prescott & Dunn (1959) e foi inoculado com 107 conídios da linhagem mutante de A. welwitschiae UELAs15.262/35 (Bossa, 2020) ou linhagem selvagem de A. welwitschiae UELAs15.262 (Vanzela et al., 2020). Os frascos foram incubados a 35 °C por período de 10 dias e a cada dois dias o sistema foi umedecido com 500 μL de água destilada. O sistema de fermentação foi realizado em triplicata e calculado o desvio padrão.
[018] Decorrido o período de fermentação em estado sólido, foi adicionado a cada frasco 30 mL de água destilada, seguido de homogeneização do sistema e repouso por 60 minutos. O material fermentado foi então filtrado com papel Whatman n°1, acoplado a um sistema de filtração a vácuo. O filtrado, resultante de cada sistema de fermentação é o denominado Extrato Bruto Enzimático (EBE).
[019] A atividade de amilases foi determinada de acordo com Sperotto (2014). A reação foi constituída por 200 μL de tampão citrato fosfato 0.05M, pH 6,0 (1,05 g/100mL de ácido cítrico; 1,38 g/100mL NaH2PO4), 300 μL de amido solúvel (1%) e 100 μL de EBE obtido das réplicas de cada linhagem de Aspergillus welwitschiae. A mistura reacional foi incubada por 30 minutos a 40 °C e a interrupção da reação foi realizada com a adição 1,5 mL de DNS (3,5 ácido dinitrosalicílico) a cada amostra, seguido por incubação a 100°C durante 5 minutos e subsequente adição de 17,9 mL de água destilada. A quantidade de açúcar redutor foi avaliada a A550nm (Biochrom Libra S22). Sob tais condições, uma unidade (U) de atividade de amilases é definida como a quantidade que libera 1 μmoL de açúcar redutor por mL de amostra por minuto.
[020] A atividade de amilases produzidas por ambas as linhagens de A. welwitschiae UELAs15.262 e UELAs15.262/35 foi detectada a partir do segundo dia de fermentação.
[021] A variação da atividade de amilases produzidas pela linhagem UELAs15.262/35 de A. welwitschiae, foi de 433,2 U/mL a 1.445,6 U/mL. Durante o período de fermentação houve aumento da atividade de amilases até o sexto dia de fermentação, seguido de posterior queda da atividade de amilases até o décimo dia de fermentação. No entanto, a maior atividade de amilases foi detectada no sexto dia de fermentação - 1.446,5 U/mL (figura 1).
[022] Quanto à linhagem selvagem de A. welwitschiae (UELAs 15.262), também houve gradual aumento da atividade de amilases do segundo ao sexto dia de fermentação, seguido de posterior queda da atividade de amilases até o décimo dia de fermentação. A variação da atividade de amilases produzidas pela linhagem UELAs15.262 de A. welwitschiae, foi de 462,5 U/mL a 873,7 U/mL. E assim como A. welwitschiae mutante (UELAs15.262/35), a maior atividade de amilases ocorreu no sexto dia de fermentação - 873,7 U/mL (Gráfico 01).
[023] Nas condições avaliadas, durante o período de fermentação a maior diferença na atividade de amilases produzidas entre as linhagens selvagem (UELAs15.262) e mutante (UELAs15.262/35) de A. welwitschiae ocorreu no sexto dia de fermentação, mesmo período em que foi detectado maior atividade de amilases por ambas as linhagens. A atividade de amilases detectada pela linhagem mutante de A. welwitschiae foi 39,5 % superior à atividade de amilases produzidas pela linhagem selvagem de A. welwitschiae.
[024] Ambas as linhagens de A. welwitschiae foram aptas à produção de amilases a partir de resíduo de malte, destacando a linhagem mutante de A. welwitschiae cuja produção de amilases (atividade de amilases) foi superior.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:
[025] Figura 1: Atividade de amilases por linhagens de A. welwitschiae UELAs 15.262/35 e UELAs 15.262 a partir de resíduo de malte.

Claims (2)

1) PRODUÇÃO DE AMILASES POR ASPERGILLUS WELWITSCHIAE A PARTIR DE RESÍDUO DE MALTE, caracterizado por ser um processo com utilização do resíduo de malte, oriundos de cervejaria, para produção de amilases por meio da linhagem mutante de A. welwitschiae UELAs15.262/35 ou da linhagem selvagem de A. welwitschiae UELAs15.262;
2) PRODUÇÃO DE AMILASES POR ASPERGILLUS WELWITSCHIAE A PARTIR DE RESÍDUO DE MALTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo processo a ser realizado nas seguintes etapas: I. Separação do resíduo de malte em bandejas (50 cm x 30 cm x 5 cm), coberto com papel alumínio e seco a 50°C por período de 72 horas, com homogeneizações periódicas; II. Preparação da forma: 1,4g do resíduo de malte foi inserido em frascos Erlenmeyers de 50 mL e autoclavados por 15 minutos; cada frasco foi umedecido com 4 mL de meio Prescott & Dunn (1959) e foi inoculado com 107conídios da linhagem mutante de A. welwitschiae UELAs15.262/35 ou linhagem selvagem de A. welwitschiae UELAs15.262; III. Na sequência da etapa anterior os frascos foram incubados a 35°C por período de 10 dias e a cada dois dias o sistema foi umedecido com 500 μL de água destilada; IV. Em sequência, para a obtenção do extrato bruto enzimático (EBE) foi adicionado a cada frasco 30 mL de água destilada, seguido de homogeneização do sistema e repouso por 60 minutos; Filtração do material com papel Whatman n°1, acoplado a um sistema de filtração a vácuo; V. A atividade de amilases foi obtida pela reação constituída por 200 μL de tampão citrato fosfato 0.05M, pH 6,0 (1,05 g/100mL de ácido cítrico; 1,38 g/100mL NaH2PO4), 300 μL de amido solúvel (1%) e 100 μL de EBE obtido das réplicas de cada linhagem de Aspergillus welwitschiae; A mistura reacional foi incubada por 30 minutos a 40°C e a interrupção da reação foi realizada com a adição 1,5 mL de DNS (3,5 ácido dinitrosalicílico) a cada amostra, seguido por incubação a 100°C durante 5 minutos e subsequente adição de 17,9 mL de água destilada; A quantidade de açúcar redutor foi avaliada a A550nm;
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