JPS58158184A - 細菌のプロトプラスト融合法 - Google Patents
細菌のプロトプラスト融合法Info
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- JPS58158184A JPS58158184A JP57040366A JP4036682A JPS58158184A JP S58158184 A JPS58158184 A JP S58158184A JP 57040366 A JP57040366 A JP 57040366A JP 4036682 A JP4036682 A JP 4036682A JP S58158184 A JPS58158184 A JP S58158184A
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- Japan
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- protoplast
- fusion
- protoplasts
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- corynebacterium
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
- C12N15/03—Bacteria
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- Cell Biology (AREA)
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- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム
属細菌の効率的なプロトプラスト融合法に関する。
属細菌の効率的なプロトプラスト融合法に関する。
従来、プロトプラスト融合法による有用微生物の育種方
法としては酵母の品種改良法が開発され（特開昭５４−
１６３８８３）、アミノ酸発酵工業で重要な微生物であ
るブレビバクテリウム属、及びコリネバクテリウム属の
微生物についてもプロトプラスト融合方法が報告又は開
発されている（ Ａｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、
４３（５）、１００７〜１０１３．１９７９、特開昭
５６−１０９５８７）。 しかしながら、従来のブレビ
バクテリウム又はコリネバクテリウム属細菌のプロトプ
ラスト融合方法は融合頻度が５Ｘ１０′程度と低く、今
後プロトプラスト融合法によシ有用微生物を効率良く育
種するためには更に融合頻度の高いプロトプラスト融合
法の開発が急務となって来ている。そこで本発明者等は
高い頻度でプロトプラス１合する方法を開発することを
目的として種々研究を重ねた結果、細菌のプロトプラス
トをポリエチレングリコールと１０ｍＭ以上のカルシウ
ムイオンを含むｐＨ８，０〜１２０の高張液中で融合せ
しめると融合頻度が飛躍的に向上することを発見し本発
明を完成するに至った。
法としては酵母の品種改良法が開発され（特開昭５４−
１６３８８３）、アミノ酸発酵工業で重要な微生物であ
るブレビバクテリウム属、及びコリネバクテリウム属の
微生物についてもプロトプラスト融合方法が報告又は開
発されている（ Ａｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、
４３（５）、１００７〜１０１３．１９７９、特開昭
５６−１０９５８７）。 しかしながら、従来のブレビ
バクテリウム又はコリネバクテリウム属細菌のプロトプ
ラスト融合方法は融合頻度が５Ｘ１０′程度と低く、今
後プロトプラスト融合法によシ有用微生物を効率良く育
種するためには更に融合頻度の高いプロトプラスト融合
法の開発が急務となって来ている。そこで本発明者等は
高い頻度でプロトプラス１合する方法を開発することを
目的として種々研究を重ねた結果、細菌のプロトプラス
トをポリエチレングリコールと１０ｍＭ以上のカルシウ
ムイオンを含むｐＨ８，０〜１２０の高張液中で融合せ
しめると融合頻度が飛躍的に向上することを発見し本発
明を完成するに至った。
本発明は（１）ブレビバクテリウム属細菌のプロトプラ
ストとブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属
細菌のプロトプラストを、又は（２）コリネバクテリウ
ム属細菌のプロトプラストとコリネバクテリウム属細菌
のプロトプラストを、１０ｍＭ以上のカルシウムイオン
及び細胞融合促進剤を含むｐＨ８，０〜１２．０の高張
液中で細胞融合せしめることを特徴とする細菌のプロト
プラスト融合法である。
ストとブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属
細菌のプロトプラストを、又は（２）コリネバクテリウ
ム属細菌のプロトプラストとコリネバクテリウム属細菌
のプロトプラストを、１０ｍＭ以上のカルシウムイオン
及び細胞融合促進剤を含むｐＨ８，０〜１２．０の高張
液中で細胞融合せしめることを特徴とする細菌のプロト
プラスト融合法である。
本発明で使用するブレビバクテリウム属、又はコリネバ
クテリウム属の細菌としては野性法、薬剤耐性、栄養要
求性等を有する変異株、アミノ酸生産性の有無を問わず
すべて使用することができる。
クテリウム属の細菌としては野性法、薬剤耐性、栄養要
求性等を有する変異株、アミノ酸生産性の有無を問わず
すべて使用することができる。
栄養細胞を得るために使用する培地は微生物が充分生育
できるものであれば良く、例えば０Ｍ培地（酵母エキス
１０チ、ペプトン１．０％、食塩０５％、グルコース０
５％）等の完全栄養培地が使用される。この培地に、ブ
レビバクテリウム属、又はコリネバクテリウム属の微生
物を培養し、リゾチーム感受性の細胞を得チため、対数
増殖期にペニシリン等の細胞壁合成阻害剤を添加する、
添加量は微生物の生育を抑制しないか又は半抑制する程
度が望ましくペニシリンの場合には１〜２０μｔ／ １
ｏ ｍｇ程度が望ましい。添加後、更に３０〜１２０分
程度培養を継続して数世代増殖せしめてリゾチーム感受
性の栄養細胞を得る。
できるものであれば良く、例えば０Ｍ培地（酵母エキス
１０チ、ペプトン１．０％、食塩０５％、グルコース０
５％）等の完全栄養培地が使用される。この培地に、ブ
レビバクテリウム属、又はコリネバクテリウム属の微生
物を培養し、リゾチーム感受性の細胞を得チため、対数
増殖期にペニシリン等の細胞壁合成阻害剤を添加する、
添加量は微生物の生育を抑制しないか又は半抑制する程
度が望ましくペニシリンの場合には１〜２０μｔ／ １
ｏ ｍｇ程度が望ましい。添加後、更に３０〜１２０分
程度培養を継続して数世代増殖せしめてリゾチーム感受
性の栄養細胞を得る。
培養液から細胞を分離し、これを高張液で洗滌後、それ
ぞれの高張最少培地に懸濁し、これにリゾチームをｏ、
ｔ 〜１０ ”ｙ７ｔｒｔｅ添加し、３０〜４０Ｃに
保持して細胞のプロトプラスト化を行う。プロトプラス
ト化は時間と共に進行し、約３〜２４時間で完了する。
ぞれの高張最少培地に懸濁し、これにリゾチームをｏ、
ｔ 〜１０ ”ｙ７ｔｒｔｅ添加し、３０〜４０Ｃに
保持して細胞のプロトプラスト化を行う。プロトプラス
ト化は時間と共に進行し、約３〜２４時間で完了する。
上記高張液としては公知のものを使用すれば良く、例え
ば、０２５Ｍシュークロース、０．２５Ｍコハク酸２ナ
トリウム、２０ｍＭリン酸１カリウム、１００ ｍＭリ
ン酸２カリウム及び５’ｍＭのＥＤＴＡから成るＨＰ高
張液が使用される。又高張培地としては夫々の最少培地
に０．４１Ｍシュークロースと０．０１Ｍ硫酸マグネシ
ウムを加えたものが使用される。
ば、０２５Ｍシュークロース、０．２５Ｍコハク酸２ナ
トリウム、２０ｍＭリン酸１カリウム、１００ ｍＭリ
ン酸２カリウム及び５’ｍＭのＥＤＴＡから成るＨＰ高
張液が使用される。又高張培地としては夫々の最少培地
に０．４１Ｍシュークロースと０．０１Ｍ硫酸マグネシ
ウムを加えたものが使用される。
このようにして得られたプロトプラストは高張最少培地
で培養するとコロニーを形成し、栄養細胞に再生する。
で培養するとコロニーを形成し、栄養細胞に再生する。
この寒天培地としては０．３〜Ｏ８Ｍのコハク赦２ナト
リウムを含む完全栄養培地あるいは最少培地が用いられ
る。
リウムを含む完全栄養培地あるいは最少培地が用いられ
る。
上記の方法で得られたプロトプラストと細胞融合せしめ
る対象のプロトプラストを約等量の割合で混合し、゛こ
れを充分遠心分離する。運心分離したブラストプラスト
混合物を１００ ｍＭ以上のカルシウムイオンを含むｐ
Ｈ８，０〜１２０のＨＰ高張柩に慾濁し、これにポリエ
チレングリコール溶液を約１０倍量加え。３０〜３７１
Ｚ’ＫＩＯ〜９０分間保持する。
る対象のプロトプラストを約等量の割合で混合し、゛こ
れを充分遠心分離する。運心分離したブラストプラスト
混合物を１００ ｍＭ以上のカルシウムイオンを含むｐ
Ｈ８，０〜１２０のＨＰ高張柩に慾濁し、これにポリエ
チレングリコール溶液を約１０倍量加え。３０〜３７１
Ｚ’ＫＩＯ〜９０分間保持する。
ポリエチレングリコールとしては平均分子量７．０００
〜ｓ、 ｏ ｏ ｏのポリエチレングリコール６０００
等が使用される。カルシュラムイオンの供給源は、溶解
性の良いカルシュラム塩でおれば良く、通常塩化カルシ
ュラムを用いる。
〜ｓ、 ｏ ｏ ｏのポリエチレングリコール６０００
等が使用される。カルシュラムイオンの供給源は、溶解
性の良いカルシュラム塩でおれば良く、通常塩化カルシ
ュラムを用いる。
カルシウムイオン濃度は、ｊＯｍＭ以上必賛で必璧ｊ９
１０ｍＭ以下では融合頻度を充分高めることはできない
。
１０ｍＭ以下では融合頻度を充分高めることはできない
。
尚張液のｐＨは８０〜１２．０に調節することが心壁で
あり、単に１０ｍＭ以上のカルンウムイオンの存在のみ
では融合は促進されず、ｐＨ８，０〜１２．Ｏのアルカ
リ性でかつ１（１ｍＭ以上のカルシウムイオン及びポリ
エチレングリコールの共存下で融合することによっては
じめて効果が発揮され、 １０−３〜１０−５の頻度で
細胞融合せしめることができる。
あり、単に１０ｍＭ以上のカルンウムイオンの存在のみ
では融合は促進されず、ｐＨ８，０〜１２．Ｏのアルカ
リ性でかつ１（１ｍＭ以上のカルシウムイオン及びポリ
エチレングリコールの共存下で融合することによっては
じめて効果が発揮され、 １０−３〜１０−５の頻度で
細胞融合せしめることができる。
このようにして融合されたプロトプラストの栄養細胞ヘ
ノ再生は公知の方法（Ａｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｏｈｅｍ
、。
ノ再生は公知の方法（Ａｇｒ、 Ｂｉｏｌ、 Ｏｈｅｍ
、。
４３（５入１００５〜１０１３．１９７９）に従って行
えば良く、前記のプロトプラストの再生と同様の方法に
よって行われる。組み換え株の選択は、薬剤耐性、栄養
要求性等目的とする性質を有する融合株を常法に従って
分離すれば良い。
えば良く、前記のプロトプラストの再生と同様の方法に
よって行われる。組み換え株の選択は、薬剤耐性、栄養
要求性等目的とする性質を有する融合株を常法に従って
分離すれば良い。
以下、実施例にて詳細に説明する。
実施例Ｉ
ペプトン１．ｏｙ／ｄｔ２、酵母エキス１．０ ｆ／ｄ
、塩化ナトリウムｏ、５１１／＃及びシュークＣＩ−ス
０．５９／ｃｍ ヲ含ｊｙ ｐ Ｈ７，２（Ｄ 完全栄
養培地（ＣＭ培地）１０ｍｇを大型試験管に分注し加熱
滅菌した。
、塩化ナトリウムｏ、５１１／＃及びシュークＣＩ−ス
０．５９／ｃｍ ヲ含ｊｙ ｐ Ｈ７，２（Ｄ 完全栄
養培地（ＣＭ培地）１０ｍｇを大型試験管に分注し加熱
滅菌した。
この培地に、ブレピノくクテリウム・ラクトフェルメン
タムＡＪ３４４５ ＦＥＲＭ−Ｐ１９４４（Ｓ−（２−
アミノエチル）−システィン耐性（ＡＥｃｒ））を接種
し３１５Ｃで振盪培養を行った。 対数増泊中期（菌体
濃２ｔｏ８１固／ ｍｅ ）にペニンリンＧｉ３単位７
１０ｍ１冷加し、更に９０分間培養を続けた。培養液か
ら菌体を回収し、ｐＨ７，０のＨＰ液（高張希釈液）で
洗浄した。
タムＡＪ３４４５ ＦＥＲＭ−Ｐ１９４４（Ｓ−（２−
アミノエチル）−システィン耐性（ＡＥｃｒ））を接種
し３１５Ｃで振盪培養を行った。 対数増泊中期（菌体
濃２ｔｏ８１固／ ｍｅ ）にペニンリンＧｉ３単位７
１０ｍ１冷加し、更に９０分間培養を続けた。培養液か
ら菌体を回収し、ｐＨ７，０のＨＰ液（高張希釈液）で
洗浄した。
菌体を遠心分離し、得られた菌体を５’０００μ＆／ｍ
ｅリゾチーム０．４１Ｍシュークローズおよび００１Ｍ
硫酸マグネシウムを含む最少培地（第１表）に再懸濁し
、３１５Ｃに静置した。
ｅリゾチーム０．４１Ｍシュークローズおよび００１Ｍ
硫酸マグネシウムを含む最少培地（第１表）に再懸濁し
、３１５Ｃに静置した。
第１表 最少培地の組成
組 成 濃 度
シュークローズ ２．Ｏｆｆ／ｄｌｌ硫咳ア
ンモニウム ０．５ ９膚尿 素
０．３ ｆ／ｄｉ；ｌＫＨ
２ＰＯ４０，１ｆＩｌｄｌ１ ＭｇＳｏ４−７ Ｈ２Ｏ０，０４ｆ／ｄｌｌＦｅＳＯ４
−７Ｈ２０１，０”ｌｄ ＭｎＳ０４・４Ｈ２０１０）１ ＮａＣ１’ １０
”ｉ／４１２Ｍ５Ｇ
１０ 貿し−アラニン ４０ ；賀ニ
コチン酸アミド ５ ”Ｆｄアデニン
１０ 貿サイアミン塩酸塩
２００ μシラビオチン １００ 〃
シｆｐＨ７，２（ＫＯＨ） プロトプラストの形成を、光学顕微鏡で観察するととも
に、この細胞をｐＨ７，ＯＨＰ液で遠心洗浄後、２つに
分は一つはｐＨ７，ＯＨＰ液で希釈して０．５ Ｍコハ
ク酸２ナトリウムを含有した最少培地へ接種し、さらに
０．８ ｆ／ｒｉｌｌ軟寒天を含む同培地で重層した。
ンモニウム ０．５ ９膚尿 素
０．３ ｆ／ｄｉ；ｌＫＨ
２ＰＯ４０，１ｆＩｌｄｌ１ ＭｇＳｏ４−７ Ｈ２Ｏ０，０４ｆ／ｄｌｌＦｅＳＯ４
−７Ｈ２０１，０”ｌｄ ＭｎＳ０４・４Ｈ２０１０）１ ＮａＣ１’ １０
”ｉ／４１２Ｍ５Ｇ
１０ 貿し−アラニン ４０ ；賀ニ
コチン酸アミド ５ ”Ｆｄアデニン
１０ 貿サイアミン塩酸塩
２００ μシラビオチン １００ 〃
シｆｐＨ７，２（ＫＯＨ） プロトプラストの形成を、光学顕微鏡で観察するととも
に、この細胞をｐＨ７，ＯＨＰ液で遠心洗浄後、２つに
分は一つはｐＨ７，ＯＨＰ液で希釈して０．５ Ｍコハ
ク酸２ナトリウムを含有した最少培地へ接種し、さらに
０．８ ｆ／ｒｉｌｌ軟寒天を含む同培地で重層した。
もう一つは、リン酸緩爾液で希釈して０Ｍ培地に接種し
、さらに０．８ ｔ／ａ軟寒天を含む同培地で重層し３
１５Ｃで培養した。プレート上に出現するコロニーは、
各々高張条件で生育するコロニー（栄養細胞とプロトプ
ラスト）、低張条件で生育するコロニー（栄養細胞のみ
）を示し、その実験結果を第２表に示した。
、さらに０．８ ｔ／ａ軟寒天を含む同培地で重層し３
１５Ｃで培養した。プレート上に出現するコロニーは、
各々高張条件で生育するコロニー（栄養細胞とプロトプ
ラスト）、低張条件で生育するコロニー（栄養細胞のみ
）を示し、その実験結果を第２表に示した。
２ 、 ９．４ Ｘ １０
８４．ＯＸｌ０８４ ５０００ １．９Ｘ １
０９６．ｌＸ１０８１．２Ｘ１０８２１
４．２Ｘ１０７１．９Ｘ１０３２９４
Ｘ１０８７４×１０８ ４ １０００ ３２ｘ１ｏ”’ ８．４ＸＩ
Ｏ８２，８Ｘ１０８２１
２．９ Ｘ １０ ４．８ Ｘｌ０６リゾチ一ム処理
２１時間で、ペニシリン処理細胞はプロトプラスト化さ
れた。
８４．ＯＸｌ０８４ ５０００ １．９Ｘ １
０９６．ｌＸ１０８１．２Ｘ１０８２１
４．２Ｘ１０７１．９Ｘ１０３２９４
Ｘ１０８７４×１０８ ４ １０００ ３２ｘ１ｏ”’ ８．４ＸＩ
Ｏ８２，８Ｘ１０８２１
２．９ Ｘ １０ ４．８ Ｘｌ０６リゾチ一ム処理
２１時間で、ペニシリン処理細胞はプロトプラスト化さ
れた。
バムＡＪ１１７８４ ＦＥＲＭ−Ｐ６４０７ （イン
ロイシン要求性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐
性（ＡＨＶｒ） ） を培養してプロトプラスト化し
た。
ロイシン要求性、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸耐
性（ＡＨＶｒ） ） を培養してプロトプラスト化し
た。
ＡＪ３４１５及びＡＪ、１１７８４のプロトプラストを
Ｏ〜２．０ Ｍの塩化カルシウムを含むｐＨ６，０〜１
２．０のＨＰ高張液０．５ ｍｌに等量宛懸濁し、これ
に４５ｍ１の３３％ポリエチレングリコール−６０００
の水溶せしめた。プロトプラストの融合は時間と共に進
行した。融合反応液を遠心分離して融合プロトプラスト
を集め、これをｐＨ１０，５の１００ｍＭの塩化カルシ
ュラムを含むＨＰ高張液に懸濁し、次いでＬ−イア ｏ
（シフ３０ｆｆ／ａ、ａ−ＡＨＶ ５０００ ｐｔｉ／
ｍｅ１ＡＥＣ！ ５０００μｆ／ｍｅ及び０．５ Ｍコ
ハク酸２ナトリウムを含む第１表の高張最少寒天プレー
ト上に接種し、その土面を同寒天培地で薄層状に覆い３
１５Ｃにて１０日間培養を行った。
Ｏ〜２．０ Ｍの塩化カルシウムを含むｐＨ６，０〜１
２．０のＨＰ高張液０．５ ｍｌに等量宛懸濁し、これ
に４５ｍ１の３３％ポリエチレングリコール−６０００
の水溶せしめた。プロトプラストの融合は時間と共に進
行した。融合反応液を遠心分離して融合プロトプラスト
を集め、これをｐＨ１０，５の１００ｍＭの塩化カルシ
ュラムを含むＨＰ高張液に懸濁し、次いでＬ−イア ｏ
（シフ３０ｆｆ／ａ、ａ−ＡＨＶ ５０００ ｐｔｉ／
ｍｅ１ＡＥＣ！ ５０００μｆ／ｍｅ及び０．５ Ｍコ
ハク酸２ナトリウムを含む第１表の高張最少寒天プレー
ト上に接種し、その土面を同寒天培地で薄層状に覆い３
１５Ｃにて１０日間培養を行った。
プレート上に出現した組み換え株（Ｌ−インロの出現頻
度と融合ｐＨ又は添加カルシュウイオン（塩化力ルシュ
ウム）ａ度との関係を第３表及び第４表に示す。
度と融合ｐＨ又は添加カルシュウイオン（塩化力ルシュ
ウム）ａ度との関係を第３表及び第４表に示す。
６．５ ＜１０’
８．０ ４．２Ｘ１０ ’
１０．５ ２．０Ｘ１０ ”’１２．０
＜１０’ 第３表の結果は、１００ｍＭの塩化カル７ウムの共存下
で融合せしめた場合の出現頻度であり、０Ｍ培地に生育
したコロニー数に対する頻度で示した。
＜１０’ 第３表の結果は、１００ｍＭの塩化カル７ウムの共存下
で融合せしめた場合の出現頻度であり、０Ｍ培地に生育
したコロニー数に対する頻度で示した。
５ ＜１０−８
１０ ５．８Ｘ１０”
５０ ３．２Ｘ１０’
、１００ ２．０ＸｌＯ”
このような融合処理条件のもとで得られた組換え株の出
現頻度は各親株の復帰変異率よ！＋１０倍株物質として
生育度およびＡＨＶ又はＡＥＣに対する耐性度を第５表
に示した。第５表に示すように、この菌株は両親株の表
現型（工１θ要求性、ＡＨＶ耐性、 ’ＡＢＣ！ 耐
性）を有し、その表現型は継代培養しても安定であった
。
現頻度は各親株の復帰変異率よ！＋１０倍株物質として
生育度およびＡＨＶ又はＡＥＣに対する耐性度を第５表
に示した。第５表に示すように、この菌株は両親株の表
現型（工１θ要求性、ＡＨＶ耐性、 ’ＡＢＣ！ 耐
性）を有し、その表現型は継代培養しても安定であった
。
第５表に示す生育度は次のようにして測定した。
第１表の最少培地にＬ−イソロイシンを３０５／ｄｌｌ
Ｔｇ、加した培地（実験区（１）で使用）、Ｌ−イン
ロイシン３０τにＡＨＶを５．０ ’９／而（実験区（
２）で使用）又はＡＢＣを５．０ ”９ ／ ｍｌ（実
験区（３）で使用）添加した培地４．０ ｍｌを試験管
に分注し、試験菌を一定量宛接棟し、３１．５ｔ：’で
２４時間振盪培養し、５６２μｍに於る吸光度を測定し
生育度を求めた。
Ｔｇ、加した培地（実験区（１）で使用）、Ｌ−イン
ロイシン３０τにＡＨＶを５．０ ’９／而（実験区（
２）で使用）又はＡＢＣを５．０ ”９ ／ ｍｌ（実
験区（３）で使用）添加した培地４．０ ｍｌを試験管
に分注し、試験菌を一定量宛接棟し、３１．５ｔ：’で
２４時間振盪培養し、５６２μｍに於る吸光度を測定し
生育度を求めた。
第６衣の組成の培地を２０ｍ１宛、５００Ｒ１！容振盪
フラスコに入れ１１０ｔｒで１０分間蒸気殺菌した。こ
れにあらかじめ０Ｍスラントで生育せしめた第７表に示
す菌株を一白金耳づつ接種し３１５Ｃにて７２時間振盪
培養した。
フラスコに入れ１１０ｔｒで１０分間蒸気殺菌した。こ
れにあらかじめ０Ｍスラントで生育せしめた第７表に示
す菌株を一白金耳づつ接種し３１５Ｃにて７２時間振盪
培養した。
（ＮＨ４）、Ｓｏ、 ４．５ ｆ
席ＫＨ，Ｐｏ、 ０．１５
１／ｄｌ１ＭｇＳＯ４・７ Ｈ，ＯＯ，０４１１／ｄｌ
ｊＦθＳＯ，・７Ｈ，ＯＩ′麹 Ｍｎ５Ｏ，−４Ｈ，０１肩？、４ サイアミン・塩酸塩 １０００μ紗ｆビオチン
１００μｇ／！大豆蛋白塩酸加水分解液
１．０ｍ１７箇消泡剤 ２０シ席 炭酸男ルシウム（別殺菌） ５ ｔ／ｄｌｌ
培養液中に生成されたＬ−スレオニン及びＬ−リジンの
量を常法に従って足音した。その結果を第７表に示す。
席ＫＨ，Ｐｏ、 ０．１５
１／ｄｌ１ＭｇＳＯ４・７ Ｈ，ＯＯ，０４１１／ｄｌ
ｊＦθＳＯ，・７Ｈ，ＯＩ′麹 Ｍｎ５Ｏ，−４Ｈ，０１肩？、４ サイアミン・塩酸塩 １０００μ紗ｆビオチン
１００μｇ／！大豆蛋白塩酸加水分解液
１．０ｍ１７箇消泡剤 ２０シ席 炭酸男ルシウム（別殺菌） ５ ｔ／ｄｌｌ
培養液中に生成されたＬ−スレオニン及びＬ−リジンの
量を常法に従って足音した。その結果を第７表に示す。
第７表 アミノ酸の蓄積量
ｍ 株 Ｌ−−スレオテン 月：
リジンＡＪ１１７８４ １０
０ＡＪ３４４５ ０
’１８．０ＡＪ１１７８５の培養液を集
めて遠心分離し、菌体及び固形物を除去した。得られた
上清液５００ｍｅを強力チオン交換樹脂（［Ａｍｂｅｒ
ｌｉｔｅ Ｉ Ｒ−１２０Ｊ〔Ｈ型〕）のカラムに流し
た。３チアンモニア水で溶出［７、アミノ酸画分を集め
、脱塩及び脱色を行い、減圧濃縮した。アルコールを添
加し、冷却下に保存後、生成した結晶を果めで乾燥した
結果、純度９８％以上のＬ−スレオニン結晶５．４ｇが
得られた。
リジンＡＪ１１７８４ １０
０ＡＪ３４４５ ０
’１８．０ＡＪ１１７８５の培養液を集
めて遠心分離し、菌体及び固形物を除去した。得られた
上清液５００ｍｅを強力チオン交換樹脂（［Ａｍｂｅｒ
ｌｉｔｅ Ｉ Ｒ−１２０Ｊ〔Ｈ型〕）のカラムに流し
た。３チアンモニア水で溶出［７、アミノ酸画分を集め
、脱塩及び脱色を行い、減圧濃縮した。アルコールを添
加し、冷却下に保存後、生成した結晶を果めで乾燥した
結果、純度９８％以上のＬ−スレオニン結晶５．４ｇが
得られた。
実施例２
コリネバクテリウム・アセトグルタミヵムＡＪ３８５８
ＦＥＲＭ、Ｐ２７８６（ＡＥＣ及びＡＨＶ耐性）及び
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＪ３７９
２ ＦＫＲＭ−Ｐ２６５０（ＡＥＣ耐性、β−）Ａイド
ロキシコイシン（βＨＬ）耐性）を実施例１と同様の方
法で培養し、プロトフリスト化した。
ＦＥＲＭ、Ｐ２７８６（ＡＥＣ及びＡＨＶ耐性）及び
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＪ３７９
２ ＦＫＲＭ−Ｐ２６５０（ＡＥＣ耐性、β−）Ａイド
ロキシコイシン（βＨＬ）耐性）を実施例１と同様の方
法で培養し、プロトフリスト化した。
ＡＪ３８５８及びＡＪ３７９２のプロトプラストを塩化
カルシウム５０ ｍＭ及びＰＥＧ ６０００３３％を含
むｐＨ１０，０のＨＰ高張液に等量つつ懸濁し３６Ｃに
３０分間保愕してプロトプラスト融合登行フた。Ｊ冶プ
ロトプラストを遠心分離して集め、これをβ−ＨＬ １
０００ ｐｆ／ｍｅ、 ＡＨＶ ２０００ ｐｉ／ｍｅ
ＡＥＯ２０００μｆＩ／ｍｅ及びコノ・り酸２ナトリ
ウム１３５ｇ７ｃｍを含むｐＨ７，２の第１表の高張最
少寒天プレートに接種し、実施例１と同様の方法で培養
した。
カルシウム５０ ｍＭ及びＰＥＧ ６０００３３％を含
むｐＨ１０，０のＨＰ高張液に等量つつ懸濁し３６Ｃに
３０分間保愕してプロトプラスト融合登行フた。Ｊ冶プ
ロトプラストを遠心分離して集め、これをβ−ＨＬ １
０００ ｐｆ／ｍｅ、 ＡＨＶ ２０００ ｐｉ／ｍｅ
ＡＥＯ２０００μｆＩ／ｍｅ及びコノ・り酸２ナトリ
ウム１３５ｇ７ｃｍを含むｐＨ７，２の第１表の高張最
少寒天プレートに接種し、実施例１と同様の方法で培養
した。
実施例１と同様の方法で薬剤耐性度を測定した。
その結果を第８表に示す。
０ − １００ １００
１００β−ＨＬ １０００ ３２
８２ ８６ＡＨＶ ２０００
８１ ７８ ２ＯＡＦＣ２０００７
４７６８１ 尚、コノヨうな組み換え株（βＨＬｒ、 ＡＨＶｒ、
ＡＥＣ！ｒ）の出現頻度は１０−４〜１０−５であった
。
１００β−ＨＬ １０００ ３２
８２ ８６ＡＨＶ ２０００
８１ ７８ ２ＯＡＦＣ２０００７
４７６８１ 尚、コノヨうな組み換え株（βＨＬｒ、 ＡＨＶｒ、
ＡＥＣ！ｒ）の出現頻度は１０−４〜１０−５であった
。
実施例３
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ３４２０ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ１７０９’（ＡＥＯｒ、１１ｅ ）及びプレピ
ノ（クテリウム・フラバムＡＴＣＣ２１２６９（ＡＨｖ
ｒ）を実施例１と同様の方法で培養した後、プロトプラ
スト化を行った。ＡＪ３４２０及びＡＴＯＣ２１２６９
のプロトプラストを塩化カルシウム２００ ｍＭ及びＰ
Ｅ（）−６０００３３ｙ７ｃｍ含むｐＨ１０，５のＨＰ
高張液に等量宛懸濁し３５ｔｌ’に３０分間保持して融
合せしめた。
Ｍ−Ｐ１７０９’（ＡＥＯｒ、１１ｅ ）及びプレピ
ノ（クテリウム・フラバムＡＴＣＣ２１２６９（ＡＨｖ
ｒ）を実施例１と同様の方法で培養した後、プロトプラ
スト化を行った。ＡＪ３４２０及びＡＴＯＣ２１２６９
のプロトプラストを塩化カルシウム２００ ｍＭ及びＰ
Ｅ（）−６０００３３ｙ７ｃｍ含むｐＨ１０，５のＨＰ
高張液に等量宛懸濁し３５ｔｌ’に３０分間保持して融
合せしめた。
一合反応液を遠心分離して細胞を集め、これをＡＥＣ３
０００ａｆ／ｍｌ、ＡＨＶ ３０００ｔｄｔ／ｍｅ、Ｌ
−イソロイシン４０ ”９／ｄ及びコハク酸２ナトリウ
ム１３．５ ｆ／ａを含む第１表の最少寒天プレートに
接種し実施例１と同様の方法で培養した。プレー ト上
に出現したコロニーを組み換え株として分離した。コロ
ニーの出現頻度は０Ｍ完全培地に出選び実施例１と同様
の方法でＬ−イソロイシン要求性及び薬剤耐性度を測定
した。
０００ａｆ／ｍｌ、ＡＨＶ ３０００ｔｄｔ／ｍｅ、Ｌ
−イソロイシン４０ ”９／ｄ及びコハク酸２ナトリウ
ム１３．５ ｆ／ａを含む第１表の最少寒天プレートに
接種し実施例１と同様の方法で培養した。プレー ト上
に出現したコロニーを組み換え株として分離した。コロ
ニーの出現頻度は０Ｍ完全培地に出選び実施例１と同様
の方法でＬ−イソロイシン要求性及び薬剤耐性度を測定
した。
その結果を第９表に示す。
０ ０ ０ １００イソ
ロイシン ４０Ｍｙ／（Ｂ １００
１００ １０８イソロイシン ４０
２グアつ！
ロイシン ４０Ｍｙ／（Ｂ １００
１００ １０８イソロイシン ４０
２グアつ！
Claims (1)
- ■ブレビバクテリウム属の細菌のプロトプラストとブレ
ビバクテリウム又はコリネバクテリウム属の細菌のプロ
トプラストを、父は■コリネノくクテリウム属細菌のプ
ロトプラストとコリネノくクテリウム属細菌のプロト７
’ラストを、１０ｍＭ以上のカルシウムイオン及びポリ
エチレングリコールを含むｐＨ８，０〜１２．０の高張
液中で細胞融合せしめることを特徴とする細菌のプロト
プラスト融合法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57040366A JPS58158184A (ja) | 1982-03-15 | 1982-03-15 | 細菌のプロトプラスト融合法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57040366A JPS58158184A (ja) | 1982-03-15 | 1982-03-15 | 細菌のプロトプラスト融合法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58158184A true JPS58158184A (ja) | 1983-09-20 |
| JPH0318879B2 JPH0318879B2 (ja) | 1991-03-13 |
Family
ID=12578635
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57040366A Granted JPS58158184A (ja) | 1982-03-15 | 1982-03-15 | 細菌のプロトプラスト融合法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58158184A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0113569A2 (en) * | 1982-12-17 | 1984-07-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-glutamic acid by fermentation |
| JPS6274293A (ja) * | 1985-09-28 | 1987-04-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−イソロイシンの製造法 |
-
1982
- 1982-03-15 JP JP57040366A patent/JPS58158184A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0113569A2 (en) * | 1982-12-17 | 1984-07-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-glutamic acid by fermentation |
| EP0113569A3 (en) * | 1982-12-17 | 1986-05-14 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing l-glutamic acid by fermentation |
| JPS6274293A (ja) * | 1985-09-28 | 1987-04-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−イソロイシンの製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0318879B2 (ja) | 1991-03-13 |
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