BR112013003979A2 - métodos para produzir uma substância alvo, e para produzir uma solução de açúcar. - Google Patents

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Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA ALVO, E PARA PRODUZIR UMA SOLUÇÃO DE AÇÚCAR Uma técnica na qual uma solução de açúcar que pode ser usada como uma fonte de carbono para cultivar um microorganismo é eficientemente manufaturada a partir de uma matéria-prima de biomassa e a solução de açúcar obtida é utilizada para manufaturar uma substância alvo via fermentação. Em dito método para manufaturar uma substância alvo, no qual um microorganismos capaz de produzir a substância alvo é cultivado em um meio de cultura e a substância alvo é coletada do dito meio, a fonte de carbono para dito meio de cultura é um açúcar obtido por decomposição hidrotérmica de uma matéria-prima de biomassa, sacarificação de um componente contendo hemicelulose que tem migrado para dentro de água quente, tratamento da solução de açúcar obtida com um adsorvente, e remoção dos componentes que têm se tornado adsorvidos no mesmo.

Description

“MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA ALVO, E PARA : PRODUZIR UMA SOLUÇÃO DE AÇÚCAR” - Descrição À Um método para produzir uma substância alvo por * SS fermentação - Campo Técnico A presente invenção refere-se a um método para produzir uma substância alvo por fermentação, especialmente a um método para produzir uma substância alvo por fermentação usando uma matéria-prima de biomassa.
Técnica Anterior Tem-se como certo o uso de biomassa, por exemplo, porções não-comestíveis de plantas tais como cana-de-açúcar e milho, como fontes de f energia renováveis. ê Como técnicas para utilizar biomassa, por exemplo, técnicas para produzir etanol etc. têm sido praticamente implementadas, nas quais uma matéria-prima de biomassa tal como madeira é sacarificada com ácido sulfúrico diluído ou ácido sulfúrico concentrado, fases líquida e sólida são separadas, e a fase líquida é neutralizada e utilizada como uma matéria-prima para fermentação de etanol etc. (Documentos de Patente 1 e 2).
Com o propósito de usar biomassa como um substrato de fermentação, polissacarídeos tais como celulose e hemicelulose, que são os componentes principais do conteúdo sólido de biomassa, precisam ser sacarificados. Contudo, sacarificação com uma enzima é ineficiente, por causa das estruturas dos componentes da biomassa, e a sacarificação por um — tratamento ácido facilmente induz decomposição excessiva dos sacarídeos. Assim, ambos não podem ser citados como meios eficientes.
Tem sido revelada uma técnica de sujeitar várias biomassas a um tratamento hidrotérmico e à sacarificação do produto resultante com uma enzima (Documento de Patente 3), na qual componentes de lignina são solubilizados pelo tratamento hidrotérmico, e portanto sacarificação : enzimática de celulose e hemicelulose pode ser eficientemente realizada. - Como técnicas para eficientemente obter sacarídeos de uma matéria-prima de biomassa submetida a um tratamento hidrotérmico, têm sido * 5 propostos métodos para preparar materiais orgânicos usando uma matéria- . prima de biomassa, que compreende a etapa de decomposição hidrotérmica de submeter uma matéria-prima de biomassa à decomposição hidrotérmica por contato em contracorrente da matéria-prima de biomassa com água quente pressurizada para transferir componentes de lignina e componentes de —hemicelulose para dentro da água quente pressurizada, e com isso separar os componentes de lignina e os componentes de hemicelulose do sólido da biomassa, a primeira etapa de sacarificação enzimática de enzimaticamente , sacarificar celulose no conteúdo sólido da biomassa resultante da etapa de . decomposição hidrotérmica para obter uma primeira solução de açúcar contendo hexoses, e a etapa de decomposição por ácido sulfúrico dos componentes de hemicelulose na drenagem de água quente descarregada na etapa de decomposição hidrotérmica com ácido sulfúrico para obter uma segunda solução de açúcar contendo pentoses, e é caracterizado pelo fato de que a temperatura de reação da decomposição hidrotérmica é 180ºC a 240ºC (Documentos de Patente 4,5 e6).
Além disso, até agora é sabido que os produtos de decomposição excessiva de sacarídeos tais como furfural e 5-hidróxi-metil- furfural bem como vanilina derivados de lignina mostram inibições de crescimento e de metabolismo de microorganismos (Documento de Não- — Patente l),ecomo propósito de remover estas substâncias de uma solução de açúcar, têm sido propostos métodos para remover tais substâncias inibitórias utilizando uma membrana de nanofiltração ou membrana de osmose reversa (Documentos de Patente 7 e 8).
Referências da Técnica Anterior
Documentos de Patente : Documento de Patente 1: Pedido de Patente Japonês Publicado - baseado no Pedido PCT (Kohyo) de Número 9-507386 À Documento de Patente 2: Pedido de Patente Japonês Publicado * S&S baseadono Pedido PCT de Número 11-506934 - Documento de Patente 3: Pedido de Patente Japonês Publicado (Kokai) de Número. 2010-166831 Documento de Patente 4: Patente Japonesa de Número 4436429 Documento de Patente 5: Patente Japonesa de Número 4524351 Documento de Patente 6: Patente Japonesa de Número t 4427583 : Documento de Patente 7: Publicação de Patente Internacional 15º WO2009/110374 Documento de Patente 8: Publicação de Patente Internacional WO2010/067785 Documento de Não-Patente Documento de Não-Patente 1: Klinke HB, Thomsen AB, —AhringBK, Appl.
Microbiol.
Biotechnol., 2004 Nov, 66(1):10-26. Epub 2004 Aug6 Sumário da Invenção Objetivo a ser Alcançado pela Invenção Ao se submeter uma matéria-prima de biomassa a um tratamento hidrotérmico pressurizado, pode ser obtido o conteúdo sólido da biomassa consistindo principalmente de celulose, que proporciona eficiência favorável para sacarificação em hexoses, e hemicelulose transferida para dentro de água quente pode ser eficientemente sacarificada em pentoses.
Contudo, os inventores da presente invenção verificaram que se a solução de açúcar derivada da água quente contendo hemicelulose obtida neste método : fosse usada como uma fonte de carbono para a cultuõrma de um o microorganismo, o crescimento e o metabolismo do microorganismo seriam inibidos. AS Um objetivo da presente invenção é fornecer uma técnica para . eficientemente produzir uma solução de açúcar que pode ser usada como uma fonte de carbono para a cultura de um microorganismo a partir de uma matéria-prima de biomassa, e produzir uma substância alvo por fermentação usando a solução de açúcar obtida . Meios para Alcançar o Objetivo Os inventores da presente invenção conduziram várias pesquisas com o propósito de alcançar o objetivo anteriormente mencionado, ' como um resultado, verificaram que uma solução de açúcar obtida ao se : submeter uma matéria-prima de biomassa ao tratamento de decomposição
15. hidrotérmica e a sacarificação dos componentes de hemicelulose transferidos para dentro de água quente que contêm substâncias que inibem o crescimento e o metabolismo de microorganismos, e se estas substâncias forem removidas, poderia ser obtida uma fonte de carbono adequada para a cultura de microorganismos e a produção de uma substância alvo, e assim completaram apresente invenção.
A presente invenção por conseguinte fornece: (1) Um método para produzir uma substância alvo compreendendo cultivar um microorganismo tendo uma capacidade para produzir a substância alvo em um meio, e coletar a substância alvo do meio, emque o meio contém um sacarídeo obtido ao se submeter uma matéria-prima de biomassa a um tratamento de decomposição hidrotérmica, sacarificar componentes de hemicelulose transferidos para dentro de água quente para obter uma solução de açúcar, e submeter a solução de açúcar a um tratamento com um adsorvente para remover os componentes que foram : adsorvidos sobre o adsorvente. . (2) O método como descrito acima, em que o adsorvente é selecionado do grupo consistindo de um carbono ativado, uma resina de troca * 5 aniônica,euma resina de adsorção sintética.
. (3) O método como descrito acima, em que substâncias não- voláteis tendo um peso molecular de 3.000 ou menor diferentes de sacarídeos são removidas pelo tratamento com um adsorvente.
(4) O método como descrito acima, em que a substância alvo é um aminoácido ou um ácido nucleico.
(5) O método como descrito acima, em que o microorganismo tem capacidade de assimilação de xilose. t (6) O método como descrito acima, em que o microorganismo ' é uma bactéria. 18 (7) O método como descrito acima, em que o microorganismo é uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia.
(8) O método como descrito acima, em que o microorganismo é Escherichia coli.
(9) O método como descrito acima, em que o tratamento de — decomposição hidrotérmica da matéria-prima de biomassa é realizado pelo uso de água quente pressurizada de 175ºC a 240ºC.
(10) O método como descrito acima, em que o tratamento de decomposição hidrotérmica da matéria-prima de biomassa é realizado pelo contato em contracorrente da matéria-prima de biomassa com a água quente — pressurizada.
(11) O método como descrito acima, em que o tratamento de sacarificação é realizado com uma enzima de sacarificação.
(12) O método como descrito acima, em que a enzima diastática é celulase ou hemicelulase.
(13) O método como descrito acima, em que a matéria-prima : de biomassa é bagaço de cana-de-açúcar ou palha de arroz. , (14) Um método para produzir uma solução de açúcar à compreendendo as seguintes etapas de: TS a) submeter uma matéria-prima de biomassa a um tratamento . de decomposição hidrotérmica, b) sacarificar os componentes de hemicelulose transferidos para dentro de água quente pressurizada para obter uma solução de açúcar, e c) submeter a solução de açúcar obtida a um tratamento com um adsorvente para remover os componentes que foram adsorvidos sobre o adsorvente.
Modalidades para Realizar a Invenção : Doravante, a presente invenção será explicada em detalhe.
O método da presente invenção é um método para produzir uma substância alvo compreendendo cultivar um microorganismo tendo uma capacidade para produzir a substância alvo em um meio, e coletar a substância alvo do meio.
De acordo com a presente invenção, o meio contém um sacarídeo obtido ao se submeter uma matéria-prima de biomassa a um tratamento de decomposição hidrotérmica, sacarificar componentes de —hemicelulose transferidos para dentro de água quente para obter uma solução de açúcar, e submeter a solução de açúcar a um tratamento com um adsorvente para remover os componentes que foram adsorvidos sobre o adsorvente.
Na presente invenção, sacarídeo significa um sacarídeo obtido — pelo tratamento de decomposição hidrotérmica de uma biomassa contendo celulose.
O sacarídeo ao qual a presente invenção se refere é um sacarídeo contendo monossacarídeos como componentes principais, e especialmente, ele contém xilose ou glicose como um componente principal.
Além disso, ele contém quantidades pequenas de outros monossacarídeos tais como arabinose e manose, e oligossacarídeos tal como celobiose. : Biomassa refere-se aos recursos orgânicos renováveis * derivados de organismo exceto os recursos fósseis, ou aos organismos acumulados ou às substâncias orgânicas acumuladas derivadas de organismos * 5 como uma parte do sistema de ciclo de matéria da biosfera da Terra.
Na e. presente invenção, a matéria-prima de biomassa para obter o sacarídeo não é especialmente limitada desde que um material que seja uma matéria-prima derivada de biomassa, contenha componentes de hemicelulose que são transferidos para dentro de água quente por um tratamento hidrotérmico, e possa produzir um sacarídeo a partir dos componentes de hemicelulose quando é escolhido que ela seja submetida a um tratamento de sacarificação.
Contudo, em vista do uso efetivo de biomassa não-usada, porções não- * comestíveis de plantas são preferidas, e exemplos incluem, por exemplo, : bagaço de cana-de-açúcar, seiva separada da cana-de-açúcar ou do bagaço de cana-de-açúcar, colmo de arroz (palha de arroz), colmo de trigo (palha de trigo), debulho, madeira residual, galhos finos de árvore, sabugo de milho, switchgrass (Panicum virgatum), cacho de frutos vazios de palmeira oleaginosa, fibra de tapioca, etc.
A matéria-prima de biomassa anteriormente mencionada é —submetidaa um tratamento de decomposição hidrotérmica.
Embora a matéria- prima de biomassa possa ser usada como tal, ela pode ser submetida ao jato de vapor e ao arrebentamento, e por exemplo, ela pode ser moída para um tamanho de 5 mm ou menor se desejado.
À decomposição hidrotérmica é preferivelmente realizada pelo uso de água quente pressurizada de 175ºC a —240ºC, mais preferivelmente 200ºC a 230ºC.
Visto que os componentes de hemicelulose, e componentes celulose e de lignina começam a se dissolver em temperaturas de cerca de 140ºC, 230ºC, e 140ºC, respectivamente, a temperatura na faixa anteriormente mencionada é preferida com o propósito de suficientemente dissolver os componentes de hemicelulose.
O tratamento de decomposição hidrotérmica anteriormente í mencionado pode ser realizada pelo contato em contracorrente da matéria- . prima de biomassa com a água quente pressurizada. Um tal tratamento pode ser realizado pelo uso dos aparelhos revelados em Patentes Japonesas de * 5 Números 4436429, 4524351, e 4427583. Pelo tratamento de decomposição ão hidrotérmica da matéria-prima de biomassa, os componentes de lignina e os componentes de hemicelulose são transferidos para dentro da água quente a partir da matéria-prima de biomassa, e os componentes de celulose permanecem no conteúdo sólido.
A pressão de reação do tratamento de decomposição hidrotérmica é preferivelmente mais alta do que a pressão de vapor de saturação da água na temperatura usada em 0,1 mPa a 0,5 MPa, no qual a água dentro do aparelho muda-se para o estado de água quente pressurizada. : O tempo de reação é habitualmente de 20 minutos ou mais curto, preferivelmente 3 minutos a 15 minutos.
Então, a água quente é separada do conteúdo sólido, e os componentes de hemicelulose na água quente são submetidos ao tratamento de sacarificação. A sacarificação de hemicelulose pode ser realizada por decomposição enzimática usando uma enzima de sacarificação (enzima — diastática), ou decomposição por ácido sulfúrico usando ácido sulfúrico. Na presente invenção, decomposição enzimática é preferida.
A enzima de sacarificação não é especialmente limitada desde que seja escolhida a enzima de sacarificação que possa decompor a hemicelulose para gerar pentoses. Exemplos específicos da enzima de — sacarificação incluem hemicelulase. Hemicelulase é um termo genérico para se referir às enzimas envolvidas em hidrólise de ligações glicosídicas contidas em hemicelulose. Hemicelulose inclui polissacarídeos constituindo as paredes celulares de células de planta terrestre exceto celulose e pectina . Componentes de hemicelulose contêm abundantemente xilanay e OS componentes principais de hemicelulase são endo-1,4-B-xilanase (EC E 3.2.1.8), B-1,4-xilosidase (EC 3.2.1.37), etc., mas hemicelulase também
2. contém outras enzimas de hidrólise de ligação glicosídica. Exemplos de hemicelulase comercialmente disponível incluem Cellic Htec de Novozymes, * 5 etc, e Spezyme CP (Genencor, derivada de Trichoderma reesei), que é uma ds celulase, e Novozyme 188 (Novozyme, derivada de Aspergillus niger), que é uma B-glicosidase, também pode ser usada. Se estas enzimas forem postas para atuarem sobre hemicelulose, são geradas xilose, arabinose etc. Ademais, não apenas hemicelulose, mas também celulose pode ser transferida para dentro de água quente ou serem capturadas misturadas em água quente, e portanto glicose pode ser gerada pelo tratamento de sacarificação. Na presente invenção, glicose obtida pelo tratamento de sacarificação também pode ser : usada como uma fonte de carbono. ã Os sacarídeos gerados tais como xilose e arabinose pode ser depois isomerizados ou decompostos por uma reação química ou uma reação enzimática dependendo de seu uso.
A solução de açúcar obtida pode ser usada como tal, ou ela também pode ser utilizada como um produto seco após remoção de umidade dependendo de seu uso. Além disso, componentes na solução de açúcar podem ser utilizados após fracionamento apropriado. Produtos de fracionamento incluem um produto aproximadamente purificado e um produto purificado. Exemplos do produto purificado incluem xilose, glicose, etc.
O solvente usado para a reação enzimática pode ser a própria água utilizada para o tratamento hidrotérmico, ou um solvente aquoso tal como solução tampão. As condições de reação, tais como a temperatura e o pH de reação, podem ser como descritas em descrições anexadas às enzimas comercialmente — disponíveis, ou apropriadamente determinadas por experimentos preliminares etc. Por exemplo, quando Spezyme CP ou
Novozyme 188 descritas acima é usada, exemplos das condições são de 45ºC : a 60ºC e pH 4,5 a 6,5. A quantidade da enzima é habitualmente de 20 FPU a . 120 FPU (filter paper unit, unidade de papel de filtro) baseado na quantidade de sólido do substrato, e o tempo de reação é habitualmente de 24 horas a 144 * 5 horas. Embora a reação possa ser estaticamente realizada, ela pode ser e. conduzida com agitação. Ademais, antes da reação enzimática, um pré- tratamento tal como deslignificação ou decomposição parcial de hemicelulose pode ser realizado.
Quando a sacarificação é realizada pela decomposição por 10 ácido sulfúrico, a concentração de ácido sulfúrico é habitualmente preferivelmente de 0,1% a 5% em peso, mais preferivelmente 1% a 4% em peso. A temperatura de decomposição é habitualmente preferivelmente de ft 100ºC a 140ºC, mais preferivelmente de cerca de 120ºC, e o tempo da reação ' de decomposição é habitualmente preferivelmente de 30 minutos a 3 horas, mais preferivelmente cerca de 1 hora. Após a decomposição, o ácido sulfúrico pode ser removido por um tratamento com resina de troca iônica ou semelhante (Documentos de Patente | e 2). A solução de açúcar obtida pelo tratamento de sacarificação é submetida a um tratamento com um adsorvente para remover os componentes que estão adsorvidos sobre o adsorvente. Exemplos do adsorvente incluem carbono ativado, resinas de troca iônica, resinas de adsorção sintéticas, zeólita, sílica gel, etc. Exemplos específicos do adsorvente incluem os adsorventes descritos na seção de exemplos. A solução de açúcar obtida como descrito acima contém substâncias que inibem o crescimento e o —metabolismos de microorganismos. Tais substâncias inibitórias são principalmente substâncias não-voláteis tendo um peso molecular de 3.000 ou menor diferentes de sacarídeos. Portanto, o adsorvente é preferivelmente um adsorvente que seletivamente adsorve substâncias não-voláteis tendo um peso molecular de 3.000 ou menor diferentes de sacarídeos. Em adição, exemplos da operação para remover as substâncias não-voláteis tendo um peso molecular de 3.000 ou menor diferentes de sacarídeos incluem filtração em . gel, tratamento por membrana, etc. : Como o carbono ativado, por exemplo, os seguintes podem ser fi USAdos. a de Hokuetsu BA (Ajinomoto Fine-Techno Co., Inc.) Hokuetsu F (Ajinomoto Fine-Techno Co., Inc.) Hokuetsu HS (Ajinomoto Fine-Techno Co., Inc.) Hokuetsu KS (Ajinomoto Fine-Techno Co., Inc.) 10 Hokuetsu PF (Ajinomoto Fine-Techno Co., Inc.) Hokuetsu DS (Ajinomoto Fine-Techno Co., Inc.) Hokuetsu GS (Ajinomoto Fine-Techno Co., Inc.) A T-S (Kuraray Chemical Co., Ltd.) . Aldenite (Japan EnviroChemicals Ltd.) Alfemite (Mizusawa Industrial Chemicals, Ltd.) Kuraray Coal GG (Kuraray Chemical Co., Ltd.) Kuraray Coal GS (Kuraray Chemical Co., Ltd.) Kuraray Coal GW (Kuraray Chemical Co., Ltd.) Kuraray Coal GL (Kuraray Chemical Co., Ltd.) Kuraray Coal GLC (Kuraray Chemical Co., Ltd.) Kuraray Coal KW (Kuraray Chemical Co., Ltd.) Kuraray Coal GWC (Kuraray Chemical Co., Ltd.) Kuraray Coal PW (Kuraray Chemical Co., Ltd.) Kuraray Coal PK (Kuraray Chemical Co., Ltd.) Kuraray Coal PDX (Kuraray Chemical Co., Ltd.) Shirasagi M M743 (Nippon Biochemicals Co.) Carbofilan-6 (Nippon Biochemicals Co.) Carbofilan (Nippon Biochemicals Co.) Carbofilan-EX (Nippon Biochemicals Co.)
FP-1 (Nippon Biochemicals Co.) FP-3 (Nippon Biochemicals Co.) - FP-4 (Nippon Biochemicals Co.) FP-6 (Nippon Biochemicals Co.) ES FP-7 (Nippon Biochemicals Co.) ao FP-8 (Nippon Biochemicals Co.) FP-9 (Nippon Biochemicals Co.) WA-3 (Cataler Corporation) FW (Cataler Corporation) WA (Cataler Corporation) DSW-3 (Cataler Corporation) PW (Cataler Corporation) * FY-1 (Cataler Corporation) É DSW-5 (Cataler Corporation) SE-P1 (Cataler Corporation) FY-2 (Cataler Corporation) GA (Cataler Corporation) FM-150 (Cataler Corporation) Umebachi-A (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) Umebachi-Y (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) Umebachi-MA (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) Umebachi-H-C (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) Umebachi-F (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) Umebachi-FN (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) Umebachi-FT (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) Umebachi-IE (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) BUROKORU A (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) BUROKORU B (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) YASHIKORU L (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.)
YASHIKORU M (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) É YASHIKORU S (Taihei Chemical Industrial Co., Ltd.) . Como a resina de troca aniônica, podem ser usadas resinas de í troca aniônica do tipo acrílico, resinas de troca aniônica poliaminada do tipo AS estireno, resinas de troca aniônica dimetil-aminada do tipo estireno, resinas de ã troca aniônica do tipo gel, resinas de troca aniônica porosas, resinas de troca aniônica elevadamente porosas, resinas de troca aniônica do tipo do tipo I fortemente básicas, resinas de troca aniônica do tipo II fortemente básicas, resinas de troca aniônica moderadamente ou fracamente básicas, e resinas de troca aniônica fracamente básicas, e especialmente, os seguintes produtos podem ser utilizados.
Resina de troca aniônica do tipo acrílico ' WAIO (Diaion, Nippon Rensui Co.) . Resina de troca aniônica poliaminada do tipo estireno WAZ21 (Diaion, Nippon Rensui Co.) Resina de troca aniônica dimetil-aminada do tipo estireno WA30 (Diaion, Nippon Rensui Co.) Resinas de troca aniônica do tipo gel SAIOA, SAILIA, SAI2ZA, NSAIOO0, SA20A, SA21A (Diaion, — Nippon Rensui Co.) Resinas de troca aniônica porosas PA306S, PA308, PA312, PA316, PA3I8L, PA408, PA412, PA418 (Diaion, Nippon Rensui Co.) Resina de troca aniônica elevadamente porosas 28 HPA25 (Diaion, Nippon Rensui Co.) Resinas de troca aniônica do tipo I fortemente básicas Dowex"M 1X2 50-100 (Dowex *, Dow Chemical Co.) Dowex"M 1X2 100-200 (Dowex “, Dow Chemical Co.) Dowex "M 1X4 20-50 (Dowex “, Dow Chemical Co.)
Dowex"M 1X4 50-100 (Dowex' be Dow Chemical Co.)
É Dowex "MA 1X4 100-200 (Dowex ”, Dow Chemical Co.)
- Dowex"M 1X8 50-100 (Dowex "", Dow Chemical Co.)
: Dowex"" 1X8 100-200 (Dowex "“, Dow Chemical Co.) OS Dowex"M 1X8 200-400 (Dowex Y, Dow Chemical Co.) e Resinas de troca aniônica do tipo 1 fortemente básicas
Tipo estireno IRA400J (Amberlite, ORGANO CORPORATION) IRA402BL (Amberlite, ORGANO CORPORATION)
IRA404J (Amberlite, ORGANO CORPORATION) IRA900J (Amberlite, ORGANO CORPORATION) TRA904 (Amberlite, ORGANO CORPORATION)
. IRA458RF (Amberlite, ORGANO CORPORATION) : ASB-1 (IONAC, IONAC)
ASB-1P (IONAC, IONAC) NA-38 (IONAC, IONAC) Tipo acrílico IRA958 (Amberlite, ORGANO CORPORATION) Resinas de troca aniônica do tipo II fortemente básicas
Tipo estireno 21IRA410J (Amberlite, ORGANO CORPORATION) 2IRA411 (Amberlite, ORGANO CORPORATION) 2IRA910CT (Amberlite, ORGANO CORPORATION) ASB-2 (IONAC, IONAC)
A-554 (IONAC, IONAC) Resina de troca aniônica moderadamente ou fracamente básicas
Tipo acrílico IRA478RF (Amberlite, ORGANO CORPORATION)
Resinas de troca aniônica fracamente básicas . Tipo acrílico - IRA67 (Amberlite, ORGANO CORPORATION) í Tipo estireno SOS IRA96SB (Amberlite, ORGANO CORPORATION) a XE583 (Amberlite, ORGANO CORPORATION) Como a resina de adsorção sintética, podem ser usadas, resinas de adsorção sintéticas aromáticas, resinas de adsorção sintéticas do tipo não- funcional, resinas de adsorção sintéticas do tipo estireno, e resina de adsorção — sintéticas do tipo acrílico, e especialmente, os seguintes produtos podem ser usados.
Resinas de adsorção sintéticas aromáticas ie HP20 (Diaion, Nippon Rensui Co.) õ HP21 (Diaion, Nippon Rensui Co.) SP850 (Sepabeads, Nippon Rensui Co.) SP825L (Sepabeads, Nippon Rensui Co.) SP700 (Sepabeads, Nippon Rensui Co.) SP207 (Sepabeads, Nippon Rensui Co.) Resinas de adsorção sintéticas do tipo não-funcional SB74 (Duolite, Sumika Chemtex Co., Ltd.) SB76 (Duolite, Sumika Chemtex Co., Ltd.) SB77 (Duolite, Sumika Chemtex Co., Ltd.) XAD761 (Duolite, Sumika Chemtex Co., Ltd.) Resinas de adsorção sintéticas do tipo estireno AmberliteM “XAD'” 2000 (Amberlit, ORGANO CORPORATION) AmberliteM —XAD'M 4 (Amberlit, ORGANO CORPORATION) Amberlite MM — XADM” 2 (Amberlit, ORGANO
CORPORATION) Â Amberlite"* FPX66 (Amberlite, ORGANO CORPORATION) . Amberlite *M “XAD'"M 1180N (Amberlit, ORGANO CORPORATION) Eos: Resina de adsorção sintéticas do tipo acrílico See Amberlite M “XAD” 7HP (Amberlit, ORGANO CORPORATION) Em uma modalidade da presente invenção, o “tratamento de uma solução de açúcar com um adsorvente” pode ser substituído pela “eliminação de substâncias não-voláteis tendo um peso molecular de 3.000 ou menor diferentes de sacarídeos”.
Embora o tratamento com um adsorvente possa ser realizado : como um tratamento em batelada ou pelo uso de uma coluna, é preferível À utilizar uma coluna. No caso do tratamento em batelada, o adsorvente é posto dentro de um vaso contendo a solução de açúcar, e então o adsorvente e a solução de açúcar são separados. Quando uma coluna é usada, a solução de açúcar é fluída através de uma coluna recheada com o adsorvente, uma solução de lavagem é fluída através da coluna se necessária, e a solução fluída saindo da coluna (fração não-adsorvida) é coletada. Para o tratamento com um —adsorvente, a solução de açúcar obtida por um tratamento de sacarificação como tal pode ser usada, ou uma solução de açúcar apropriadamente concentrada ou diluída também pode ser usada. O tratamento com um adsorvente pode ser repetido duas ou mais vezes, e dois ou mais tipos de adsorventes podem ser utilizados em combinação para o tratamento com um — adsorvente.
A solução de açúcar obtida como descrito acima, da qual as substâncias —inibitórias de crescimento são removidas, pode ser adequadamente usada como uma fonte de carbono de um meio utilizado para a produção de uma substância alvo usando um microorganismo. A solução de açúcar pode ser usada como tal, ou pode ser apropriadamente concentrada, ou E sacarídeos podem ser usados após purificação. ó Na presente invenção, não é essencial utilizar o conteúdo sólido restante após o tratamento hidrotérmico da matéria-prima de biomassa . “ 5 easeparaçãoda água quente, mas o conteúdo sólido pode ser utilizado. Isto é, Esse se celulose contida no conteúdo sólido é tratada com uma enzima tal como celulase, pode ser obtida uma solução de açúcar contendo hexoses tal como glicose.
A solução de açúcar obtida pelo método anteriormente mencionado ou um seu produto de fracionamento pode ser usada(o) como, por exemplo, uma fonte de carbono na produção de uma substância alvo por fermentação. Exemplos da substância alvo incluem, por exemplo, alcoóis tais como as metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol e butanodiol. Exemplos da substância alvo também incluem ácido acético, ácido lático, ácido propiônico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos e ácidos nucleicos.
Especialmente, exemplos do L-aminoácido incluem L-lisina, L-ornitina, L-arginina, L-histidina, L-citrulina, L-isoleucina, L-alanina, L- valina, L-leucina, L-glicina, L-treonina, L-serina, L-prolina, L-fenil-alanina, L-tirosina, L-triptofano, L-cisteína, L-cistina, L-metionina, ácido L- glutâmico, ácido L-aspártico, L-glutamina, e L-asparagina.
Além disso, o L-aminoácido referido na presente invenção inclui derivados obtidos dos aminoácidos anteriormente mencionados como materiais inicial, e exemplos incluem GABA, p-hidróxi-D-fenil-glicina, — DOPA, ácido suceínico, ácido málico, ácido pirúvico, e cadaverina.
Exemplos do ácido nucleico incluem nucleosídeos de purina, nucleotídeos de purina, etc. Os nucleosídeos de purina incluem inosina, xantosina, guanosina, adenosina, etc., e os nucleotídeos de purina incluem 5*- fosfato-ésteres dos nucleosídeos de purina, por exemplo, ácido inosínico,
(inosina-5'*-fosfato, doravante também chamado de “IMP”), ácido xantílico (xantosina-5'-fosfato, doravante também chamado de “XMP”), ácido à. guanílico (guanosina-5S*-monofosfato, doravante também chamado de “GMP”), ácido adenílico (adenosina-S'-monofosfato, doravante também - “ 5 chamado de “AMP”), etc.
O ácido nucleico referido na presente invenção a inclui derivados de ácido nucleico obtidos dos ácidos nucleicos anteriormente mencionados como materiais iniciais, e exemplos incluem Ara-U (urazil- arabinosídeo), ZVA (Z-valaciclovir), etc.
A substância alvo produzida de acordo com a presente invenção pode consistir de um ou dois ou mais tipos de substâncias. <Microorganismos — utilizáveis para a produção da substancialmente intencionada> ' O microorganismo usado para a produção da substância alvo : não é especialmente limitado, desde que seja escolhido um microorganismo capaz de assimilar um sacarídeo obtido pelo método anteriormente mencionado tal como glicose e/ou xilose, tendo uma capacidade para produzir uma substância alvo, e seja capaz de acumular a substância alvo em um meio líquido ou em células microbianas quando é cultivado no meio.
Um microorganismo que é capaz de assimilar xilose é especialmente preferido.
À — quantidade da substância alvo a ser acumulada também não é especialmente limitada desde que ela seja acumulada em uma tal quantidade que possa ser coletada do meio.
Como o microorganismo usado na presente invenção ou uma cepa parental que é utilizada para derivar o microorganismo, podem ser —usados microorganismos pertencendo à família Enterobacteriaceae, cujos exemplos típicos são bactérias pertencendo ao gênero Escherichia e bactérias Pantoea, bactérias corineformes, etc.
Outros exemplos de microorganismos pertencendo à família Enterobacteriaceae incluem enterobactérias pertencendo às y-proteobactérias tais como àquelas pertencendo aos gêneros
Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella, ou E semelhantes, e exemplos de outros microorganismos incluem bactérias * Alicyelobacillus, bactérias Bacillus, leveduras pertencendo aos gêneros i Saccharomyces, Candida ou semelhantes, etc. Aa Como as bactérias pertencendo ao gênero Escherichia, podem ssa ser utilizadas aquelas mencionadas no trabalho de Neidhardt er al. (Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, “American Society for Microbiology”, Washington D.C., 1208, tabela 1), tal como Escherichia coli. Exemplos de cepas de tipo selvagem de Escherichia coli incluem, por exemplo, a cepa K1I2 e seus derivados, cepa MG1655 de Escherichia coli (Número ATCC 47076), cepa W3110 (Número ATCC 27325), etc. Estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC, Endereço: P.O. f Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, P números de registro são fornecidos para cada uma das cepas, e as cepas podem ser encomendadas pelo uso destes números de registro. Os números de registro das cepas estão listados no catálogo da American Type Culture Collection (referir a http://www.atcc.org/).
Ademais, exemplos das bactérias Enterobacter incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes etc., e exemplos das bactérias Pantoea incluem Pantoea ananatis. Algumas espécies de Enterobacter agglomerans têm sido recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii ou semelhantes, baseado na análise de sequência de nucleotídeos de 16S rRNA, etc. Ambas as bactérias Enterobacter e as bactérias Pantoea podem ser usadas desde que a — bactéria escolhida seja classificada na família Enterobacteriaceae. Quando uma cepa de Pantoea ananatis é gerada por uma técnica de engenharia genética, podem ser usadas cepa AJI13355 de Pantoea ananatis (FERM BP- 6614), cepa AJ13356 de Pantoea ananatis (FERM BP-6615), cepa AJ13601 de Pantoea ananatis (FERM BP-7207) e seus derivados. Estas cepas foram identificadas como Enterobacter agglomerans quando foram isoladas, e * depositadas como Enterobacter agglomerans. Contudo, foram recentemente , reclassificadas como Pantoea ananatis baseando-se no sequenciamento de nucleotídeos de 168 rRNA etc. como descrito acima. OS As bactérias corineformes são um grupo de microorganismos oe definido em “Bergey's Manual of Determinative Bacteriology”, 8" Ed., p.599 (1974), e podem ser usados microorganismos classificados em bacilos aeróbicos, gram-positivos e não-resistentes a ácido que são incapazes de esporular. As bactérias corineformes incluem bactérias que têm sido previamente classificados no gênero Brevibacterium mas são presentemente unidos ao gênero Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol. 41:255 (1991)), e bactérias pertencendo ao gênero Brevibacterium ou Microbacterium, que : estão intimamente relacionadas ao gênero Corynebacterium. : Exemplos específicos de tais bactérias corineformes incluem
15. osseguintes: Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium — thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens) ps Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacterium flavum Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum
Brevibacterium roseum É Brevibacterium saccharolyticum : Brevibacterium thiogenitalis | Corynebacterium ammoniagenes OS Brevibacterium album ÃO.
Brevibacterium cerinum Microbacterium ammoniaphilum Exemplos específicos destas bactérias incluem as seguintes cepas: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511 ft Corynebacterium callunae ATCC 15991 : Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium efficiens AJ12340 (FERM BP-1539) Corynebacterium herculis ATCC 13868 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJI1 2418 (FERM BP-2205) Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13869) Brevibacterium roseum ATCC 13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111 & Brevibacterium cerinum ATCC 15112 . Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 Estas cepas estão disponíveis, por exemplo, na American Type . * 5 Culture Collection (ATCC) (Endereço: P.O.
Box 1549, Manassas, VA e. 2010812301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos da América). A cepa AJ12340 foi depositada aos 27 de Outubro de 1987 em National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (atualmente agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- . ken, 305-8566, Japão), com um número de acesso de FERM BP-1539 sob as : disposições do Tratado de Budapeste.
A cepa AJI2418 foi depositada aos 5 15º de Janeiro de 1989 em National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry com um número de acesso de FERM BP-2205 sob as disposições do Tratado de Budapeste.
Quando bactérias Bacillus são usadas, seus exemplos incluem Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pumilus, etc.
Exemplos de Bacillus subtilis incluem cepa 168 Marburg Bacillus subtilis (ATCC 6051), cepa PY79 Bacillus subtilis (Plasmid, 1984, 12, 1-9), etc.
Exemplos de Bacillus amyloliquefaciens incluem cepa T Bacillus — amyloliquefaciens —“(ATCC 23842), cepa N Bacillus amyloliquefaciens (ATCC 23845), etc.
Exemplos de Bacillus pumilus incluem Bacillus pumilus Gottheil Número 3218 (ATCC 21005) (Patente U.S. de Número 3.616.206), etc.
Doravante, são descritos métodos para conceder uma capacidade para produzir um L-aminoácido ou ácido nucleico a tais cepas parentais como mencionadas acima. & Para conceder a capacidade para produzir um L-aminoácido, . podem ser usados os métodos convencionalmente utilizados na geração de bactérias corineformes ou bactérias do gênero Escherichia (veja “Amino Acid - * 5 Fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1º Edition, publicado aos 30 is de Maio de 1986, pp. 77-100). Tais métodos incluem os métodos de adquirir mutantes auxotróficos, cepas resistentes ao L-aminoácido, ou mutantes de regulação metabólica, ou construção de uma cepa recombinante de modo que ela sobre-expresse uma enzima de biossíntese de L-aminoácido. Aqui, na geração de uma bactéria produtora de L-aminoácido, podem ser concedidas uma ou mais das propriedades acima descritas tais como mutação de regulação metabólica, resistência a análogo ou auxotrofia. Expressão de uma i: ou mais enzimas de biossíntese de L-aminoácido pode ser intensificada. : Ademais, os métodos de conceder uma tal mutação auxotrófica, mutação de resistência a análogo, ou mutação de regulação metabólica podem ser combinados com os métodos de intensificar as enzimas de biossíntese.
Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente a análogo de L- aminoácido, ou cepa mutante de regulação metabólica com uma capacidade para produzir um L-aminoácido pode ser obtida ao se submeter uma cepa parental ou uma cepa de tipo selvagem a uma mutagênese convencional, tal como exposição aos raios-X ou à irradiação UV, ou tratamento com um mutágeno tal como N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina, etc., e então seleção daquelas que exibem uma mutação de regulação metabólica, resistência a análogo ou auxotrofia, e que também têm a capacidade para — produzir um L-aminoácido das cepas mutantes obtidas.
Além disso, a capacidade de produzir L-aminoácido também pode ser concedida ou intensificada pelo aumento da atividade enzimática por recombinação de gene. Um exemplo do método para aumentar atividade enzimática inclui modificar a bactéria de modo que seja intensificada a expressão de um gene codificador de uma enzima envolvida na biossíntese de L um L-aminoácido. Expressão de gene também pode ser aumentada pela . introdução de um plasmídeo de amplificação preparado pela introdução de um fragmento de DNA contendo o gene em um plasmídeo apropriado que . * 5 contém, por exemplo, pelo menos um gene responsável por replicação e eo proliferação do plasmídeo no microorganismo, aumento do número de cópias do gene no cromossomo por conjugação, transferência, ou semelhante, ou introdução de uma mutação na região de promotor do gene (referir à Publicação Internacional WO95/34672).
Quando um gene objetivo é introduzido no cromossomo ou plasmídeo de amplificação anteriormente mencionado, qualquer promotor pode ser usado para expressar o gene desde que o promotor escolhido . funcione em bactérias pertencendo às bactérias corineformes. O promotor õ pode ser o promotor nativo para o gene, ou um promotor modificado. À expressão de um gene também pode ser controlada pela escolha adequada de um promotor que fortemente funcione em bactérias pertencendo às bactérias corineformes, ou tornando as regiões -35 e -10 do promotor mais próximas da sequência de consenso. Estes métodos para intensificar a expressão de genes de enzima são totalmente descritos em Publicação Internacional WO00/18935, Publicação de Patente Européia de Número 1010755, etc.
Métodos específicos para conceder uma capacidade de produzir L-aminoácido às bactérias e bactérias munidas com a capacidade de produzir L-aminoácido são exemplificados(as) abaixo.
Bactérias produtoras de L-treonina Exemplos preferidos de microorganismos tendo capacidade de produção de L-treonina incluem bactérias nas quais estão intensificadas uma ou mais atividades de enzimas de sistema de biossíntese de L-treonina. Exemplos de enzimas da biossíntese de L-treonina incluem aspartocinase III (IysC), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), aspartocinase 1 (thrÃ),
homosserina cinase (thrB), e treonina sintase (thrC) codificada pelo operon S thr, e aspartato aminotransferase (aspartato transaminase) (aspC). Abreviação dos nomes dos genes são descritas entre parênteses (o mesmo deve se aplicar em todo este relatório descritivo). Dentre estas enzimas, aspartato semialdeído . * S desidrogenase, aspartocinsse 1, homosserina cinase, aspartato o aminotransferase, e treonina sintase são exemplos especialmente preferidos.
Os genes codificadores das enzimas da biossíntese de L-treonina podem ser introduzidos em uma bactéria Escherichia que tem uma capacidade reduzida para decompor treonina.
Um exemplo de uma tal bactéria Escherichia tendo uma capacidade reduzida para decompor treonina é a cepa TDH6 que é deficiente em atividade de treonina desidrogenase (Patente Japonesa Publicada de Número 2001-346578). . As atividades enzimáticas de enzimas da biossíntese de L- Sã treonina são inibidas pelo produto final, L-treonina.
Portanto, para construir cepas produtoras de L-treonina, é desejável que os genes para as enzimas da biossíntese de L-treonina sejam modificados de modo que as enzimas sejam dessensibilizadas para inibição de retro-alimentação pela L-treonina nas cepas produtoras de L-treonina.
Os genes thrÃ, thrB, e thrC anteriormente mencionados constituem o operon de treonina, que forma uma estrutura —atenuadora.
À expressão do operon de treonina é inibida pelas isoleucina e treonina no meio de cultura e também suprimida por atenuação.
Modificação do operon pode ser realizada pela remoção da sequência líder na região de atenuação ou no atenuador (consultar Lynn, S.P. et al., J.
Mol.
Biol. 194:59- 69 (1987); WO02/26993; WO2005/049808). O promotor nativo do operon de treonina está presente antes do operon de treonina, e pode ser substituído por um promotor não-nativo (consultar WO98/04715), ou pode ser construído um operon de treonina que tem sido modificado de modo que o gene de biossíntese de treonina seja controlado por repressor e promotor de fago-) (EP 0593792). Ademais, com o propósito de modificar uma bactéria de modo que ela seja dessensibilizada S para a inibição de retro-alimentação por L-treonina, pode ser selecionada uma : cepa resistente ao ácido a-amino-B-hidróxi-isovalérico (AHV).
í É preferível que seja aumentado o número de cópias do operon . * 5 de treonina que é modificado para dessensibilizar para a inibição de retro- ds alimentação pela L-treonina, ou a expressão do operon de treonina seja aumentada pela sua ligação em um promotor potente. O número de cópias também pode ser aumentado por, além da amplificação usando um plasmídeo, transferência do operon de treonina para um genoma usando um transposon, —fago-Mu, ou semelhante. Diferentes das enzimas da biossíntese de L-treonina, os genes envolvidos em rota glicolítica, ciclo TCA, ou cadeia respiratória, os genes que f regulam a expressão destes genes, ou os genes envolvidos em captação de . açúcar também podem ser preferivelmente intensificados. Exemplos de tais —genesincluem os genes codificadores de trans-hidrogenase (pnrAB, EP 733712 B), fosfoenolpiruvato carboxilase (pepC, WOS95/06114), fosfoenolpiruvato sintase (pps, EP 877090 B), e um gene codificador de piruvato carboxilase de bactéria corineforme ou bactéria Bacillus (WO99/18228, EP 1092776 A).
Também é preferível intensificar a expressão de um gene que concede ao hospedeiro resistência à L-treonina ou L-homosserina, ou concede resistência à L-treonina ou L-homosserina. Exemplos do gene que concede tal resistência incluem gene rhtA (Livshits, V.A. et al., 2003, Res. Microbiol., 154:123-135), rhtB (EP 0994190 A), gene rhtC (EP 1013765 A), genes yfiKk, e yeaS (EP 1016710 A). Os métodos para conceder a um hospedeiro — resistência à L-treonina são descritos em EP 0994190 A e WO90/04636.
Exemplos de bactérias produtoras de L-treonina e de cepas parentais que podem ser usadas para derivar tais bactérias incluem, mas não são limitados a, cepas pertencendo ao gênero Escherichia, tais como E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patente U.S. de Número 5.175.107,
Patente U.S. de Número 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) & (Patente U.S. de Número 5.631.157), E. coli NRRL-21593 (Patente U.S. de ' Número 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (Patente U.S. de Número í 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente U.S. de . * 5 Número5.376.538), E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (em russo), ão 14, 947-956 (1978)), E. coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A) etc.
A cepa TDH-6 é deficiente do gene thrC, bem como é assimiladora de sacarose, e o gene ilvA tem uma mutação hipomórfica (leaky mutation). Esta cepa também tem uma mutação no gene rhtd, que concede resistência à concentração alta de treonina ou homosserina. A cepa B-3996 contém o plasmídeo pVIC40, que foi obtido pela inserção do operon thrA*BC, incluindo um gene thrA mutante, no vetor derivado de RSFIO10.
Só Este gene thrA mutante codifica aspartocinase homosserina desidrogenase 1 é que é substancialmente dessensibilizada para a inibição de retro-inibição por treonina. A cepa B-3996 foi depositada aos 19 de Novembro de 1987 no All- Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscou, Rússia) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa também foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) aos 7 de Abril de —1987,sobo número de acesso VKPM B-3996.
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792 B) também pode ser usada como uma bactéria produtora de L-treonina ou uma cepa parental para derivá-la. A cepa B-5318 é prototrófica com relação à isoleucina, e um promotor PR e um repressor Cl de fago-lambda sensível à temperatura — substituem a região regulatória do operon de treonina no plasmídeo pVIC40. A cepa VKPM B-5318 foi depositada como um depósito internacional na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) aos 3 de Maio de 1990, sob o número de acesso de VKPM B-5318.
O gene shrd que codifica aspartocinase homosserina & desidrogenase I de Escherichia coli é um gene localizado nos nucleotídeos de : números 337 a 2.799 na sequência de genoma de cepa MGI1655 de Escherichia coli sob o Número de Acesso do GenBank de U00096, e . * 5 codificador da proteína registrada sob o Número de Acesso do GenBank de da AAC73113. O gene rthrB que codifica homosserina cinase de Escherichia coli é um gene localizado nos nucleotídeos de números 2.801 a 3.733 na sequência de genoma da cepa MG1655 de Escherichia coli sob o Número de Acesso do GenBank de U00096, e codificador da proteína registrada sob o Número de — Acesso do GenBank de AAC73114. O gene thrC que codifica treonina sintase de Escherichia coli é um gene localizado nos nucleotídeos de números 3.734 a 5.020 na sequência de genoma da cepa MG1655 Escherichia coli registrado : sob o Número de Acesso do GenBank de U00096, e codificador da proteína . registrada sob o Número de Acesso do GenBank de AAC73115. Estes três genes são codificados como o operon de treonina consistindo de thrLABC depois do gene thrL codificador do peptídeo líder. Para intensificar a expressão do operon de treonina, a região atenuadora que afeta a transcrição é desejavelmente removida do operon (WO2005/049808, WO2003/097839).
Um gene thrA mutante que codifica aspartocinase homosserina —desidrogenase [ resistente à inibição de retro-alimentação por treonina, bem como os genes thrB e thrC podem ser obtidos como um operon do plasmídeo pVIC40 bem conhecido que está presente na cepa VKPM B-3996 de E. coli produtora de treonina. pVIC40 é descrito em detalhe em Patente U.S. de Número 5.705.371.
O gene rhtÃd é um gene obtido como um gene que concede resistência às homosserina e treonina (rht: resistente às treonina/homosserina), localizado nos nucleotídeos de números 848.433 a 849.320 (fita complementar) na sequência de genoma da cepa MG1655 de Escherichia coli registrado sob o Número de Acesso do GenBank de U00096, e codificador da proteína registrada sob o Número de Acesso do GenBank de AAC73900. Também, foi revelado que a mutação rht A23 é uma substituição de A no lugar . de G em posição -1 com respeito ao códon de iniciação ATG (Livshits, V.A. | et al., 2003, Res.
Microbiol., 154:123-135, EP 1013765 A). Sao O gene asd de E. coli é um gene localizado nos nucleotídeos a de números 3.571.798 a 3.572.901 (fita complementar) na sequência de genoma da cepa MG1655 de Escherichia coli registrado sob o Número de Acesso do GenBank de U00096, e codificador da proteína registrada sob o Número de Acesso do GenBank de AAC76458. Pode ser obtido por PCR (consultar White, T.J. et al., 1989, Trends Genet, 5:185-189) utilizando iniciadores preparados baseando-se na sequência de nucleotídeos do gene.
Os genes asd de outros microorganismos também podem ser obtidos em uma r maneira similar. ; O gene aspC de E. coli é um gene localizado nos nucleotídeos de números 983.742 a 984.932 (fita complementar) na sequência de genoma da cepa MG1655 Escherichia coli registrado sob o Número de Acesso do GenBank de U00096, e codificador da proteína registrada sob o Número de Acesso do GenBank de AAC74014, e pode ser obtido por PCR.
Os genes aspC de outros microorganismos também podem ser obtidos em uma maneira similar.
Bactérias produtoras de L-lisina Bactérias produtoras de L-lisina e métodos para contruí-las são exemplificadas(os) abaixo.
Exemplos de cepas tendo capacidade de produção de L-lisina — incluem, por exemplo, cepas resistentes a análogo de L-lisina e cepas mutantes de regulação metabólica.
Exemplos de análogo de L-lisina incluem, mas não se limitam a, oxalisina, lisina hidroxamato, S-(2-amino-etil)-L- cisteína (também abreviada doravante como “AEC” ), y-metil-lisina, a-cloro- caprolactama etc.
Cepas mutantes tendo resistência a estes análogos podem ser obtidas ao se submeter uma bactéria pertencendo à família L Enterobacteriaceae ou uma bactéria corineforme a um tratamento de . mutagênese artificial convencional. Exemplos específicos de bactérias produtoras de L-lisina incluem cepa AJ1 1442 de Escherichia coli FERM BP- RO 1543, NRRL B-12185, veja Patente Japonesa Publicada de Número 56-18596 ão e Patente U.S. de Número 4.346.170), cepa VL611 de Escherichia coli (Patente Japonesa Publicada de Número 2000-189180), etc. Como uma Escherichia coli produtora de L-lisina, a cepa WC196 também pode ser usada (veja Publicação Internacional WO96/17930).
Ademais, uma bactéria produtora de L-lisina também pode ser construída pelo aumento de uma enzima de sistema de biossíntese de L-lisina. Aumento da atividade de uma tal enzima pode ser realizado pelo aumento do à: número de cópias do gene codificador da enzima em células, ou pela : modificação de uma sua sequência de controle de expressão.
Um gene pode ser modificado para intensificar a expressão, por exemplo, por aumento do número de cópias do gene nas células por meio de técnicas de recombinação genética. Por exemplo, um DNA recombinante pode ser preparado por ligação de um fragmento de DNA contendo o gene gapÃÁ com um vetor, preferivelmente um vetor de multi-cópias, que é capaz de — funcionar em um microorganismo hospedeiro, e introduzido em uma bactéria para transformá-la.
O aumento do número de cópias de um gene também pode ser realizado pela introdução de cópias múltiplas do gene em um DNA genômico de uma bactéria. Com o propósito de introduzir cópias múltiplas de um gene emum DNA genômico de uma bactéria, recombinação homóloga é realizada pelo uso de uma sequência cujas cópias múltiplas existem como alvos no DNA genômico. Como sequências cujas cópias múltiplas existem em DNA genômico, DNA repetitivo, e repetições invertidas existindo na extremidade de um elemento capaz de ser transposto podem ser usados. Outro gene pode ser introduzido além do gene gapÁA existindo em um genoma em tandem, ou e pode ser introduzido em um gene desnecessário em um genoma em um , número plural. Tal transferência de gene pode ser realizada pelo uso de um : vetor sensível à temperatura ou um vetor de integração. O Alternativamente, como revelado em Patente Japonesa o Publicada de Número 2-109985, também é possível incorporar o gene em um transposon, e permitir sua transferência para introduzir cópias múltiplas dos genes para dentro de um DNA genômico. A transferência do gene para o genoma pode ser confirmada pela realização da hibridização de Southern usando uma parte do gene como uma sonda.
Ademais, em adição ao aumento anteriormente mencionado do número de cópias de gene, a expressão de gene pode ser intensificada pela r substituição de uma sequência de controle de expressão tal como um À promotor do gene em um DNA de genoma ou plasmídeo por um promotor mais forte, ao se posicionar as regiões -35 e -10 do gene mais próximas da sequência de consenso, pela amplificação de um regulador que aumenta a expressão do gene, ou pela deleção ou atenuação de um regulador que diminui a expressão do gene de acordo com os métodos descritos em Publicação Internacional WO00/18935. Por exemplo, o promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor araBA, promotor PL e promotor PR de fago, promotor tet, promotor T7, promotor DIO , etc. são conhecidos como promotores fortes. Um promotor ou região de SD do gene gapA também pode ser modificado(a) de modo a se tornar mais forte pela introdução de uma substituição de nucleotídeo ou semelhante. Exemplos de —método para avaliar a força de um promotor ou de promotores fortes são descritos na dissertação de Goldstein er al. (“Prokaryotic promoters in biotechnology”, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128) etc. Em adição, é sabido que a substituição de vários nucleotídeos em um espaçador entre o sítio de ligação de ribossomo (ribosome binding site, RBS) e tradução de códon de iniciação, especialmente de uma sequência imediatamente antes do O códon de iniciação, afeta sobremaneira a eficiência de tradução de mRNA, e . portanto esta sequência pode ser modificada. Regiões de controle de expressão tal como promotor de um gene também podem ser identificadas -— * 5 pelousodeum vetor de pesquisa de promotor ou programa de computador de E análise de gene tal como GENETYX. Por tal substituição ou modificação de promotor como descrito acima, a expressão de um gene é intensificada. Substituição de uma sequência de controle de expressão também pode ser realizada, por exemplo, por um método usando um plasmídeo sensível à temperatura ou uma “Red-driven integration” (WO2005/010175). Exemplos de genes codificadores de enzimas da biossíntese de L-lisina incluem genes codificadores de enzimas da rota de diaminopimelato r tais como gene de di-hidro-dipicolinato sintase (dapA), gene de aspartocinase À (sC), gene de di-hidro-dipicolinato redutase (dapB), gene de
15. diaminopimelato descarboxilase (/ys4)) gene de diaminopimelato desidrogenase (ddh) (WO96/40934 para todos os genes precedentes), gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) (Patente Japonesa Publicada de Número 60-87788), gene de aspartato aminotransferase (aspC) (Publicação de Patente Japonesa (Kokoku) de Número 6-102028), gene de diaminopimelato epimerase (dapF) (Patente Japonesa Publicada de Número 2003-135066), e gene de aspartato semialdeído desidrogenase (asd) (WO00/61723), e genes codificadores de enzimas da rota de ácido amino-adípico tal como gene de homoaconitato hidratase (Patente Japonesa Publicada de Número 2000- 157276). Em adição, a cepa parental pode mostrar um nível aumentado de — expressão do gene envolvido em eficiência de energia (cyo) (EP 1170376 A), o gene codificador de nicotinamida nucleotídeo trans-hidrogenase (pntÃB) (Patente U.S. de Número 5,830,716), o gene ybjE codificador de uma proteína tendo atividade de excreção de L-lisina (WO2005/073390), o gene codificador de glutamato desidrogenase (gahÃA) (Valle F. er al., 1983, Gene
23:199-209), ou uma combinação arbitrária destes. Abreviações dos genes são É mostradas entre parênteses. . É sabido que a di-hidro-dipicolinato sintase de tipo selvagem Í derivada de Escherichia coli sofre de inibição de retro-alimentação por L- . “ 5 lisina, e é sabido que a aspartocinase de tipo selvagem derivada de E Escherichia coli sofre de supressão e inibição de retro-alimentação por L- lisina. Portanto, quando o gene dapA e o gene IysC são usados, estes genes são preferivelmente genes codificadores de enzimas mutantes dessensibilizadas para a inibição de retro-alimentação por L-lisina.
Exemplos de DNA codificador de uma di-hidro-dipicolinato sintetase mutante dessensibilizada para inibição de retro-alimentação por L- lisina incluem um DNA codificador de uma tal proteína tendo uma sequência : de aminoácidos na qual o resíduo de histidina na posição 118 está substituído é pelo resíduo de tirosina. Exemplos de DNA codificador de uma aspartocinase mutante dessensibilizada para inibição de retro-alimentação por L-lisina incluem um DNA codificador de uma AKIII tendo uma sequência de aminoácidos na qual o resíduo de treonina na posição 352, o resíduo de glicina na posição 323, e o resíduo de metionina na posição 318 estão substituídos pelos resíduos de isoleucina, asparagina e isoleucina, respectivamente (para estes mutantes, veja Patentes U.S. de Números
5.661.012 e 6.040.160). Tais DNAs mutantes podem ser obtidos por mutagênese sítio-específica usando PCR ou semelhante.
Plasmídeos de ampla variedade de hospedeiros RSFD80, pCABI, e pCABD2 são conhecidos como plasmídeos contendo um gene —dapA mutante codificador de uma di-hidro-dipicolinato sintase mutante e um gene lysC mutante codificador de uma aspartocinase mutante (Patente U.S. de Número 6.040.160). Cepa JM109 de Escherichia coli transformada com o plasmídeo foi chamada de AJ12396 (Patente U.S. de Número 6.040.160), e a cepa foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-
Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Organism Depositary) aos | 28 de Outubro de 1993 e recebeu um número de acesso de FERM P-13936, e . * 5 odepósitofoiconvertido em um depósito internacional sob as disposições do Ee Tratado de Budapeste em 1 de Novembro de 1994 e recebeu um número de acesso de FERM BP-4859. RSFD80 pode ser obtida da cepa AJ12396 por um método convencional. Exemplos de tais enzimas envolvidas na produção de L-lisina incluem homosserina desidrogenase, lisina descarboxilase (cadd, IldecC), enzima múálica, etc., e cepas nas quais as atividades destas enzimas estão decrescidas ou deletadas são reveladas em WO95/23864, WO96/17930, f WO2005/010175, etc. É É preferido que expressões de ambos os genes cad e IdeC codificadores de lisina descarboxilase sejam decrescidas com o objetivo de decrescer ou deletar a atividade de lisina descarboxilase. Expressão de ambos os genes pode se decrescida, por exemplo, pelo método descrito em WO2006/078039.
Com o propósito de reduzir ou eliminar as atividades destas enzimas, uma mutação pode ser introduzida nos genes em um genoma pelo método de mutagênese habitual ou pela técnica de recombinação de gene de modo que atividades intracelulares das enzimas sejam reduzidas ou eliminadas. Tal introdução de uma mutação pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de recombinação genética para eliminar os genes codificadores das enzimas no genoma ou para modificar uma sequência de controle de expressão tal como uma sequência de Shine-Dalgarno (SD). Isto também pode ser realizado pela introdução de uma mutação para substituição de aminoácido (mutação errônea, missense), de um códon de terminação (mutação sem sentido, nonsense), ou uma mutação por deslocamento de fase ss de leitura (frame shift) para adição ou deleção de um ou dois nucleotídeos em & regiões codificadoras das enzimas no genoma, ou deleção parcial ou total dos . genes (Wang, J.P. et al., 2006, J.
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Chem., 266:20833-20839). As atividades enzimáticas também podem ser decrescidas ou eliminadas pela construção de um gene codificador de uma enzima mutante, cuja região codificadora está totalmente ou parcialmente deletada, e substituição de um gene normal por ele em um genoma por recombinação homóloga ou semelhante, ou pela introdução de um transposon ou fator IS no gene.
Por exemplo, com o propósito de introduzir uma mutação que . decresce ou elimina as atividades das enzimas acima mencionadas por é recombinação genética, os seguintes métodos são usados.
Um gene mutante é preparado pela modificação de uma sequência parcial de um gene objetivo de modo que ele não codifique uma enzima que funciona normalmente, e então uma bactéria pertencendo à família Enterobacteriaceae pode ser transformada com um DNA contendo o gene mutante para causar recombinação de um gene correspondente no genoma com o gene mutante para substituir o gene — objetivo pelo gene mutante no genoma.
Exemplos de tal substituição de gene usando recombinação homóloga incluem métodos de uso de um DNA linear tal como o método chamado de Red-driven integration (Datsenko, K.A, e Wanner, B.L., 2000, Proc.
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USA, 97:6640-6645), e o método utilizando a Red driven integration em combinação com um sistema de — excisão derivado de fago * (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., 2002, J.
Bacteriol., 184:5200-5203) (consultar WO2005/010175), um método de uso de um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (Patente U.S. de Número 6.303.383, Patente Japonesa Publicada de Número 05-007491), etc.
Ademais, tal mutagênese sítio-específica baseada em substituição de gene usando recombinação homóloga pode ser realizada pelo
Ne uso de um plasmídeo que não é capaz de replicar em um hospedeiro. : Exemplos preferidos de bactérias produtoras de L-lisina É incluem Escherichia coli WC196AcadAAldeC/pCABD2 (WO2006/078039). —* 5 A cepa foiconstruída pela introdução de um plasmídeo pCABD?2 contendo E genes de biossíntese de lisina (Patente U.S. de Número 6.040.160) na cepa WCI196 tendo genes cadà e IdcC submetidos à disrupção, que codificam lisina descarboxilase.
A cepa WC196 foi gerada da cepa W3110, que foi derivada de Escherichia coli K-12, pela substituição do gene /ysC de tipo selvagem no cromossomo da cepa W3110 por um gene lysC mutante codificador de uma aspartocinase mutante III na qual treonina na posição 352 foi substituída por isoleucina, resultando em dessensibilização da sua inibição - de retro-alimentação por L-lisina (Patente U.S. de Número 5.661.012), e concedendo à cepa resultante resistência à AEC (Patente U.S. de Número À 15. 5.827.698) À cepa WCI96 foi chamada de Escherichia coli AJI3069, depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba- shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) aos 6 de Dezembro de 1994, e recebeu um número de acesso de FERM P-14690. Então, ela foi convertida em um depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste aos 29 de Setembro de 1995, e recebeu um número de acesso de FERM BP-5252 (Patente U.S. de Número 5.827.698). A própria cepa WC1I96AcadAAldeC (também chamada de “WCI96LC”) também é uma bactéria preferida produtora de L-lisina (Pedido Publicado de Patente U.S. de Número 2006/0160191). A WCI1I96AcadAÁAldeC foi chamada de AJI10692, e depositada na agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism
Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- O ken, 305-8566, Japão) aos 7 de Outubro de 2008 como um depósito . internacional e recebeu um número de acesso de FERM BP-11027. | Em WC196AcadAAldeC, é introduzida uma mutação no gene .* 5 xyld codificador de xilose isomerase, e é feito com que a cepa perca a o capacidade de assimilação de xilose.
A sequência de aminoácidos de xilose isomerase de Escherichia coli é mostrada em SEQ ID NO: 2. O resíduo de prolina da posição 158 nesta sequência de aminoácidos está substituído por um resíduo de leucina em WC196AcadAAldeC.
Na presente invenção, é preferível usar a cepa cujo gene xy/A está retromutado para o gene de tipo selvagem.
Com o propósito de retromutar o gene xy/A para o gene de tipo selvagem, o gene mutado pode ser substituído por um gene xy/A derivado de é uma cepa de tipo selvagem por substituição de gene, ou um gene xy/A de uma cepa de tipo selvagem pode ser introduzido por transdução de P1 como í 15 descrita na seção de exemplos.
A cepa preparada para ter o gene xy/A de tipo selvagem pode crescer em um meio contendo xilose como a única fonte de carbono, e portanto uma tal cepa pode ser selecionada baseando-se neste fenótipo.
O plasmídeo pCABD2 contém um gene dapA mutante derivado de Escherichia coli e codificador de uma di-hidro-dipicolinato sintase (DDPS) tendo uma mutação para dessensibilização à inibição de retro- alimentação por L-lisina, um gene /ysC mutante derivado de Escherichia coli e codificador de aspartocinase III tendo uma mutação para dessensibilização à inibição de retro-alimentação por L-lisina, o gene dapB derivado de Escherichia coli e codificador de di-hidro-dipicolinato redutase, e o gene ddh derivado de Brevibacterium lactofermentum e codificador de diaminopimelato desidrogenase (Publicações Internacionais WO95/16042 e WO01/53459). Os procedimentos descritos acima para intensificar a expressão de gene das enzimas envolvidas na biossíntese de L-lisina, e os métodos para e. reduzir as atividades enzimáticas podem ser similarmente aplicados aos genes . codificadores de outras enzimas de biossíntese de L-aminoácido.
Ê Exemplos de bactérias corineformes produtoras de L-lisina . 5 incluem cepas mutantes resistentes à AEC (cepa AJ11082 de Brevibacterium o lactofermentum (NRRL B-11470) etc., consultar Publicações de Patente Japonesa de Números 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58- 10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 e 7- 112438); cepas mutantes exigindo um aminoácido tal como L-homosserina — para seu crescimento (consultar Publicações de Patente Japonesa de Números 48-28078 e 56-6499); cepas mutantes mostrando resistência à AEC e adicionalmente exigindo um aminoácido tal como L-leucina, L-homosserina, . L-prolina, L-serina, L-arginina, L-alanina e L-valina (consultar Patentes U.S.
de Números 3.708.395 e 3.1825.472); cepas mutantes produtoras de L-lisina : 15 mostrando resistência à DL-a-amino-e-caprolactama, a-amino-lauril-lactama, análogo de ácido aspártico, droga sulfa, quinóide e N-lauroil-leucina; cepas mutantes produtoras de L-lisina mostrando resistência à oxaloacetato descarboxilase ou a um inibidor de enzima do trato respiratório (Patentes Japonesas Publicadas de Números 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, —53-86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995, 56-39778, Publicações de Patente Japonesa de Números 53-43591 e 53-1833); cepas mutantes produtoras de L- lisina exigindo inositol ou ácido acético (Patentes Japonesas Publicadas de Números 55-9784 e 56-8692); cepas mutantes produtoras de L-lisina que são suscetíveis ao ácido fluoro-pirúvico ou à temperatura de 34ºC ou mais alta (Patentes Japonesas Publicadas de Números 55-9783 e 53-86090); cepas mutantes produtoras de L-lisina de bactérias Brevibacterium ou Corynebacterium mostrando resistência ao etileno-glicol (Patente U.S. de Número 4,411,997) etc. Bactérias produtoras de L-cisteína
Exemplos de bactérias produtoras de Lr-cisteína e cepas Ás parentais para derivá-las incluem, mas não são limitados a, bactérias . Escherichia tais como E. coli IMI5 transformada com tipos múltiplos de É alelos de gene cysE codificadores de serina acetiltransferase resistentes à * 5 inibição de retro-alimentação (Patente U.S. de Número 6.218.168, Pedido de a Patente Russo de Número 2003121601), E. coli W3110 na qual um gene codificador de uma proteína adequada para excreção de substâncias citotóxicas é sobre-expressado (Patente U.S. de Número 5.972.663), cepa de E. coli tendo atividade de cisteína dessulfidrase decrescida (Patente Japonesa Publicada de Número 11-155571), e E. coli W3110 na qual está aumentada a atividade do fator de controle transcricional positivo do regulon de cisteína codificado pelo gene cysB (WO01/27307). : Bactérias produtoras de L-leucina
Exemplos de bactérias produtoras de L-leucina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-leucina incluem, mas não se limitam a, cepas bacterianas de Escherichia, tais como cepas de £. coli resistentes à leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, Patente U.S. de Número 6.124.121)) ou análogos de leucina incluindo B-2- tienil-alanina, 3-hidróxi-leucina, 4-azaleucina, 5,5,5-trifluoro-leucina, etc. (Publicação de Patente Japonesa de Número 62-34397 e Patente Japonesa Publicada de Número 8-70879), cepas de E. coli obtidas pelo método de engenharia genética descrito em WOS96/06926, E. coli H-9068 (Patente
Japonesa Publicada de Número 8-70879), etc.
A bactéria usada na presente invenção pode ser aperfeiçoada pela intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos em biossíntese de L- Exemplos preferidos de tais genes incluem os genes do operon leuABCD, cujo um exemplo típico é o gene leuà mutante codificador de isopropil malato sintase que tem sido mutado para ser dessensibilizado para a inibição de retro-alimentação por L-leucina (Patente U.S. de Número
6.403.342). Em adição, a bactéria usada na presente invenção pode ser O aperfeiçoada pela intensificação da expressão de um ou mais genes . codificadores de proteínas que exportam L-aminoácido das células Í bacterianas.
Exemplos de tais genes incluem b2682 e b2683 (os genes ygaZH) sto EP 1230041 42). eo Exemplos de cepas produtoras de L-isoleucina de bactérias corineformes incluem a bactéria corineforme cujo gene brnE codificador de uma proteína de excreção de aminoácido de cadeia ramificada está amplificado (Patente Japonesa Publicada de Número 2001-169788), a bactéria —corineforme munida com a capacidade de produzir L-isoleucina por fusão de protoplasto com uma bactéria produtora de L-lisina (Patente Japonesa Publicada de Número 62-74293), a bactéria corineforme cuja homosserina . desidrogenase está intensificada (Patente Japonesa Publicada de Número 62- Ê 91193), a cepa resistente ao hidroxamato de treonina (Patente Japonesa Publicada de Número 62-195293), cepa resistente ao ácido a-ceto-malônico (Patente Japonesa Publicada de Número 61-15695), e a cepa resistente à metil-lisina (Patente Japonesa Publicada de Número 61-15696). Bactérias produtoras de L-histidina Exemplos de bactérias produtoras de L-histidina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- histidina incluem, mas não se limitam a, cepas bacterianas de Escherichia, tais como cepa 24 de E. coli (VKPM B-5945, RU2003677), cepa 80 de E. coli (VKPM B-7270, RU2119536), E. coli NRRL B-12116 - B12121 (Patente U.S. de Número 4.388.405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675), E. coli H-9343 (FERM BP-6676) (Patente U.S. de Número 6.344.347), E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP 1085087 A), E. coli AISO/pFM201 (Patente U.S. de Número 6.258.554), etc.
Exemplos de bactérias produtoras de L-histidina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-
histidina também incluem cepas nas quais está intensificada a expressão de a um ou mais genes codificadores de enzimas da biossíntese de L-histidina. . Exemplos de tais genes incluem gene de ATP fosforribosiltransferase (hisG), | gene de fosforribosil AMP ciclo-hidrolase (hisl), gene de fosforribosil-ATP .* 5 pirofosfo-hidrolase (his/), gene de fosforribosilformimino-5-amino-imidazol > carboxamida ribotídeo isomerase (his4), gene de amidotransferase (hisH), gene de histidinol fosfato aminotransferase (hisC), gene de histidinol fosfatase (hisB), gene de histidinol desidrogenase (hisD), etc. É sabido que as enzimas da biossíntese de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são inibidas por L-histidina, e portanto a capacidade para produzir L-histidina também pode ser eficientemente intensificada pela introdução de uma mutação que concede resistência à . inibição de retro-alimentação no gene codificador de ATP : fosforribosiltransferase (hisG) (Patentes Russas de Números 2003677 e 2119536).
Exemplos específicos de cepas que são capazes de produzir L- histidina incluem E. coli FERM-P 5038 e 5048 que têm sido transformadas com um vetor transportando um DNA codificador de uma enzima da biossíntese de L-histidina (Patente Japonesa Publicada de Número 56- 005099), cepas de E. coli transformadas com um gene codificador de uma proteína envolvida em exportação de aminoácido (EP 1016710 A), cepa 80 de E. coli que é resistente às sulfaguanidina, DL-1,2,4-triazol-3-alanina, e estreptomicina (VKPM B-7270, Patente Russa de Número 2119536), etc.
Bactérias produtoras de ácido L-glutâmico Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem, mas não se limitam a, cepas bacterianas de Escherichia, tais como E. coli VL334hrC* (EP 1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) é auxotrófica para L-isoleucina e L-treonina e contém genes thrC e ilvA mutantes (Patente U.S. de Número 4.278.765). Um alelo de tipo E selvagem do gene thrC foi transferido por transdução geral usando , bacteriófago PI crescido em células de tipo selvagem de E. coli KI2 (VKPM : B-7), resultando na cepa VL334thrC* (VKPM B-8961) produtora de ácido-L- . * 5 glutâmicoauxotrófica para L-isoleucina.
e Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de ácido L-glutâmico também incluem, mas não se limitam a, cepas nas quais está intensificada a expressão de um ou mais genes codificadores de uma enzima da biossíntese de ácido L-glutâmico. Exemplos de tais genes incluem os genes codificadores de glutamato desidrogenase (gdh4), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintetase (gltA4B), isocitrato desidrogenase (icdA), . aconitato hidratase (acnÃ, acnB), citrato sintase (gltá), metil citrato sintase : (prpO), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato desidrogenase (aceEF, Ipdá), piruvato cinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsá), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgml), fosfoglicerato cinase (pgh), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gap4), triose fosfato isomerase (tpiÃ), frutose bisfosfato aldolase (fbp), fosfofrutocinase (pfkA, pfkB), glicose fosfato isomerase (pgi), etc. Dentre estas enzimas, glutamato desidrogenase, citrato —sintase, fosfoenolpiruvato carboxilase, e metil citrato sintase são preferidas.
Exemplos de cepas que têm sido modificadas de modo que seja intensificada a expressão de o gene de citrato sintetase, o gene de fosfoenolpiruvato carboxilase, e/ou o gene de glutamato desidrogenase incluem aqueles revelados em EP 1078989 A, EP 955368 A, e EP 952221 A.
Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de ácido L-glutâmico também incluem cepas nas quais está reduzida ou eliminada a atividade de uma ou mais enzimas que catalisam uma ou mais reações que direcionam a síntese de um ou mais compostos diferentes de ácido L-glutâmico, por exemplo, pela direção da síntese para longe da rota de e. biossíntese de ácido L-glutâmico. Exemplos destas enzimas incluem isocitrato . liase (ace), a-ceto-glutarato desidrogenase (suc4), fosfotransacetilase (pta), | acetato cinase (ack), aceto-hidróxi ácido sintase (ilvG), acetolactato sintase .* 5 (ilv)), formiato acetiltransferase (pfl), lactato desidrogenase (Idh), glutamato e descarboxilase (gadAB), etc. Bactérias Escherichia sem atividade de a-ceto- glutarato desidrogenase ou com atividade reduzida de a-ceto-glutarato desidrogenase e métodos para obter tais bactérias são descritos em Patentes U.S. de Números 5.378.616 e 5.573.945. Especialmente, estas cepas incluem as seguintes: E. coli W3110sucA::Km' E. coli AJ12624 (FERM BP-3853) - E. coli AJ1 2628 (FERM BP-3854) Ê E. coli AJ12949 (FERM BP-4881) E. coli W3110sucA::Km' é obtida pela disrupção do gene de a-ceto-glutarato desidrogenase (doravante também chamado de “gene sucAÔ) de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente em a-ceto-glutarato desidrogenase.
Exemplos de bactérias corineformes com atividade decrescida —dea-ceto-glutarato desidrogenase incluem, por exemplo, as seguintes cepas: Cepa L30-2 de Brevibacterium lactofermentum (Patente Japonesa Publicada de Número 2006-340603) Cepa AS de Brevibacterium lactofermentum (WO95/34672) Brevibacterium lactofermentum AJI2821 (FERM BP-4172, — Patente Francesa de Número 9401748) Brevibacterium flavum AJI2822 (FERM BP-4173, Patente Francesa de Número 9401748) Corynebacterium glutamicum AJI2823 (FERM BP-4174, Patente Francesa de Número 9401748)
Cepa L30-2 Corynebacterium glutamicum (Patente Japonesa e Publicada de Número 2006-340603) . Outros exemplos de bactéria produtora de ácido L-glutâmico À incluem bactérias Escherichia que são resistentes a um antimetabólito de - * 5 ácido aspártico.
Estas cepas também podem ser deficientes em a-ceto- o glutarato desidrogenase e incluem, por exemplo, E. coli AJI3199 (FERM BP- 5807) (Patente U.S. de Número 5.908.768), FFRM P-12379, que adicionalmente está decrescida em uma atividade para decompor ácido L- glutâmico (Patente U.S. de Número 5.393.671); AJ13138 (FERM BP-5565) (Patente U.S. de Número 6.110.714), etc.
Um exemplo de uma bactéria produtora de ácido L-glutâmico que pertence a Pantoea ananatis é a cepa AJ13355 de Pantoea ananatis.
Esta . cepa foi isolada do solo em Iwata-shi, Shizuoka-ken, Japão, e foi identificada como sendo capaz de se proliferar em um meio contendo ácido L-glutâmico e : 15 uma fonte de carbono em um pH baixo.
A cepa AJ13355 Pantoea ananatis foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1- 1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) aos 19 de Fevereiro de 1998 e recebeu um número de acesso de FERM P-16644. Elr foi então convertido em um depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste aos 11 de Janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6614. Esta cepa foi originalmente identificada como Enterobacter agglomerans quando foi isolada, e depositada como Enterobacter agglomerans AJ13355. Contudo, foi recentemente reclassificada como — Pantoea ananatis baseando-se no sequenciamento de nucleotídeos de 16S TRNA etc.
Ademais, exemplos de uma bactéria produtora de ácido L- glutâmico de Pantoea ananatis também incluem bactérias Pantoea deficientes em atividade de a-ceto-glutarato desidrogenase (aKGDH) ou tendo atividade reduzida de aKGDH.
Exemplos de uma tal cepa incluem AJ13356 (Patente e... U.S. de Número 6.331.419), que foi derivada por deleção do gene de subunidade de aKGDH-E1 (suc4) em AJ13355, e a cepa SC17sucA (Patente U.S. de Número 6.596.517) que é uma cepa deficiente em gene sucÃA derivada - 5 dacepaSCl7,e foi selecionada de AJ13355 devido às suas propriedades de ses. baixa produção de muco.
À cepa AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, a agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent —Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba- shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-8566)) aos 19 de Fevereiro de 1998, e recebeu um número de acesso de FERM P-16645. Então, o depósito - foi convertido em um depósito internacional sob as disposições do Tratado de À Budapeste aos 11 de Janeiro de 1999, e recebeu um número de acesso de FERM BP-6616. Embora as cepas AJI3355 e AJI3356 tenham sido depositada no depósito anteriormente mencionado como Enterobacter agglomerans, elas são chamadas de Pantoea ananatis neste relatório descritivo.
A cepa SCl7sucA recebeu o número privado de AJ417, e foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary aos 26 de Fevereiro de
2004, sob um número de acesso de FERM BP-08646. Exemplos de bactérias Pantoea ananatis produtoras de ácido L-glutâmico adicionalmente incluem cepas SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, AJI13601, NP106, e NAL.
A cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi obtida — pela introdução do plasmídeo RSFCPG contendo o gene de citrato sintase (gltA), o gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppsA), e o gene de glutamato desidrogenase (gdhA) derivados de Escherichia coli, e o plasmídeo pSTVCB contendo o gene de citrato sintase (glt4) derivado de Brevibacterium lactofermentum, na cepa SC17sucA.
A cepa AJ13601 foi selecionada da cepa
SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB devido à sua resistência à concentração alta O de ácido L-glutâmico em um pH baixo. Ademais, a cepa NP106 foi derivada da cepa AJ13601 por eliminação do plasmídeo RSFCPG+pSTVCB. A cepa AJ1I13601 foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science . * 5 and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central Ses 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-8566) aos 18 de Agosto de 1999, e recebeu o número de acesso FERM P-
17516. Então, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste aos 6 de Julho de 2000, e recebeu um número de acesso de FERM BP-7207.
Ademais, a capacidade para produzir ácido L-glutâmico também pode ser concedida às bactérias corineformes por um método de - amplificação do gene yggB codificador do canal mecanossensível (WO2006/070944), e um método de introdução de um gene yggB mutante no À 15 qual uma mutação é introduzida na região codificadora. O gene yggB é um gene localizado nos nucleotídeos de números 1.337.692 a 1.336.091 (fita complementar) da sequência de genoma de cepa ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum registrada com o Número de Acesso ao GenBank de NC 003450, e codificadora de uma proteína de membrana também chamada de NCgl1221 e registrada com um Número de Acesso ao GenBank de NP 600492.
Exemplos de outros métodos para conceder ou intensifica a capacidade de produção de ácido L-glutâmico também incluem um método de conceder resistência a um análogo de ácido orgânico, um inibidor de cadeia — respiratória, etc., e um método de conceder sensibilidade a um inibidor de síntese de parede celular. Exemplos de tais métodos incluem o método de conceder resistência ao ácido monofluoro-acético (Patente Japonesa Publicada de Número 50-113209), o método de conceder resistência à adenina ou timina (Patente Japonesa Publicada de Número 57-065198), o método de atenuar urease (Patente Japonesa Publicada de Número 52- fe 038088), o método de conceder resistência ao ácido malônico (Patente . Japonesa Publicada de Número 52-038088), o método de conceder resistência Í às benzopironas ou naftoquinonas (Patente Japonesa Publicada de Número - * 5 56-1889), o método de conceder resistência a HOQNO (Patente Japonesa AR Publicada de Número 56-140895), o método de conceder resistência ao ácido a-ceto-malônico (Patente Japonesa Publicada de Número 57-2689), o método de conceder resistência à guanidina (Patente Japonesa Publicada de Número 56-35981), o método de conceder sensibilidade à penicilina (Patente Japonesa Publicada de Número 4-88994), etc.
Exemplos específicos de tais cepas resistentes incluem as seguintes cepas: - Brevibacterium flavum AJ3949 (FERM BP-2632; Patente Japonesa Publicada de Número 50-113209) i 15 Corynebacterium glutamicum AJII628 (FERM P-5736; Patente Japonesa Publicada de Número 57-065198) Brevibacterium flavum AJI1355 (FERM P-5007; Patente Japonesa Publicada de Número 56-1889) Corynebacterium glutamicum AJI1I368 (FERM P-5020; — Patente Japonesa Publicada de Número 56-1889) Brevibacterium flavum AJI1217 (FERM P-4318; Patente Japonesa Publicada de Número 57-2689) Corynebacterium glutamicum AJII218 (FERM P-4319; Patente Japonesa Publicada de Número 57-2689) Brevibacterium flavum AJI1564 (FERM BP-5472; Patente Japonesa Publicada de Número 56-140895) Brevibacterium flavum AJI1439 (FERM BP-5136; Patente Japonesa Publicada de Número 56-35981) Corynebacterium glutamicum H7684 (FERM BP-3004;
Patente Japonesa Publicada de Número 04-88994)
o Brevibacterium lactofermentum AJI1426 (FERM P-5123;
: Patente Japonesa Publicada de Número 56-048890) | Corynebacterium glutamicum AJII440 (FERM P-5137;
. * 5 PatenteJaponesa Publicada de Número 56-048890) e à.
Brevibacterium lactofermentum AJI1796 (FERM P-6402;
Patente Japonesa Publicada de Número 58-158192)
Bactérias produtoras de L-fenil-alanina
Exemplos de bactérias produtoras de L-fenil-alanina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-fenil- alanina incluem, mas não se limitam a, cepas bacterianas de Escherichia, tais como E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197) que é faltante de . corismato mutase-prefenato desidrogenase e do repressor de tirosina (WO03/044191), E. coli HW1089 (ATCC 55371) que contém o gene pheA34 codificador de corismato mutase-prefenato desidratase que tem sido mutado para ser dessensibilizado para inibição de retro-alimentação (Patente U.S. de Número 5.354.672), E. coli MWEC101-b (KR8903681), E. coli NKRL B- 12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146, e NRRL B-12147 (Patente U.S. de Número 4.407.952). Também, as seguintes cepas podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-fenilallanina: E coli K12 [W3110(tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566) que contém genes codificadores de corismato mutase-prefenato desidratase que têm sido mutados para serem dessensibilizados para inibição de retro-alimentação, E coli K-12 [W3]110(tyrA/pPHAD] (FERM BP-12659), £. coli K-12 [W3110(tyrA)/)pPHATerm] (FERM BP-12662)) e E coli K-12 [W31 10(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] chamada de AJI2604 (FERM BP- 3579, EP 488424 BI). Ademais, também podem ser usadas bactérias Escherichia produtoras de L-fenil-alanina com atividade intensificada da proteína codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG (Pedidos Publicados de Patente U.S. de Números 2003/0148473 e 2003/0157667, WO03/044192). e Como bactérias corineformes produtoras de fenil-alanina, as . cepas de Cornebacterium glutamicum BPS-13 (FERM BP-1777), K17 i (FERM BP-2062), e K78 (FERM BP-2063) (EP 331145 A, Patente Japonesa .- 5 Publicada de Número 02-303495), cuja atividade de fosfoenolpiruvato e carboxilase ou piruvato cinase está reduzida, cepa tirosina-auxotrófica (Patente Japonesa Publicada de Número 05-049489), etc. podem ser usadas. Uma bactéria que eficientemente produz fenil-alanina também pode ser obtida pela modificação de uma bactéria de modo que a bactéria incorpore subprodutos, por exemplo, pelo aumento da quantidade de expressão do gene de captação de L-triptofano, tnaB ou mtr, ou do gene de captação de L-tirosina, tyrP (EP 1484410). : Bactérias produtoras de L-triptofano : Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- triptofano incluem, mas não se limitam a, cepas bacterianas de Escherichia, tais como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e E. coli JP6015/pMU91 (DSM10123) que são faltantes de triptofanoil-tRNA sintetase codificada por um gene trpS mutante (Patente U.S. de Número 5.756.345), E. coli SV164 —(pGH5) que contém o alelo ser4 codificador de fosfoglicerato desidrogenase e o alelo trpE codificador de antranilato sintase, que estão dessensibilizadas para inibição de retro-alimentação por serina e triptofano, respectivamente (Patente U.S. de Número 6.180.373), E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B- 12263), e E. coli AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) que são faltantes de —triptofanase (Patente U.S. de Número 4371.614), e E coli AGX17/pGX50,pACKGA4-pps na qual está intensificada a capacidade de produzir fosfoenolpiruvato (WO97/08333, Patente U.S. de Número
6.319.696). Bactérias produtoras de Lr-triptofano pertencendo ao gênero Escherichia com atividade intensificada da proteína codificada pelo gene so yedA ou pelo gene yddG também podem ser usadas (Pedidos Publicados de o Patente U.S. de Números 2003/0148473 e 2003/0157667). - Exemplos de bactérias produtoras de L-triptofano e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- - 7 5 triptofano também incluem cepas nas quais uma ou mais atividades das fd seguintes “enzimas estão intensificadas: antranilato sintase (trpE), fosfoglicerato desidrogenase (ser4), 3-desóxi-D-arabino-heptulosonato-7- fosfato sintase (aroG), 3-desidroquinato sintase (aroB), shikimato desidrogenase (aroE), shikimato cinase (aroL), 5-enolpiruvilshikimato-3- fosfato sintase (aro4), corismato sintase (aroC), prefenato desidratase, corismato mutase, e triptofano sintase (trp4B). Prefenato desidratase e corismato mutase são codificadas pelo gene phed como uma enzima - bifuncional (corismato mutase/prefenato desidratase, CM/PDH). Dentre estas À enzimas, fosfoglicerato desidrogenase, 3-desóxi-D-arabino-heptulosonate-7- fosfato sintase, 3-desidroquinato sintase, shikimato desidratase, shikimato cinase, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase, corismato sintase, prefenato desidratase, e corismato mutase-prefenato desidratase são especialmente preferidas. Ambas antranilato sintase e fosfoglicerato desidrogenase sofrem da inibição de retro-alimentação por L-triptofano e L-serina, e portanto uma mutação de dessensibilização à inibição de retro-alimentação pode ser introduzida nos genes codificadores de destas enzimas. Exemplos específicos de cepas tendo uma tal mutação incluem E. coli SV164 tendo uma antranilato sintase do tipo dessensibilizado e uma cepa transformante obtida pela introdução em E. coli SV164 de pGH5 (WO94/08031) contendo um gene —serd mutante codificador de fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada para inibição de retro-alimentação.
Exemplos de bactérias produtoras de Lr-triptofano e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- triptofano também incluem cepas que têm sido transformadas com o operon
S1 de triptofano, que contém um gene codificador de antranilato sintase o dessensibilizada para inibição (Patentes Japonesas Publicadas de Números 57- “. . 71397, 62-244382, Patente U.S. de Número 4.371.614). Além disso, a capacidade de produção de L-triptofano pode ser concedida pela . 5 intensificação da expressão de um gene que codifica triptofano sintase no e operon de triptofano (trpBA4). Triptofano sintases incluem ambas as subunidades a e fi, que são codificadas pelos genes trpd e trpB, respectivamente.
Em adição, a capacidade de produção de Lr-triptofano pode ser aperfeiçoada pela intensificação da expressão do operon de isocitrato liase-malato sintase (WO2005/103275). Como bactérias corineformes, podem ser usadas Corynebacterium glutamicum AJ12118 (FERM BP-478, Patente Japonesa de . Número 01681002), que é resistente à sulfaguanidina, a bactéria corineforme introduzida com o operon de triptofano (Patente Japonesa Publicada de À 15 Número 63-240794), e a bactéria corineforme introduzida com um gene codificador de shikimato cinase derivada da bactéria corineforme (Patente Japonesa Publicada de Número 01-994749). Bactérias produtoras de L-prolina Exemplos de bactérias produtoras de L-prolina e cepas — parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-prolina incluem, mas não se limitam a, cepas bacterianas de Escherichia, tal como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) que é faltante do gene ilvA e podem produzir Lr-prolina (EP 1172433). A bactéria usada na presente invenção pode ser aperfeiçoada pela intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos em biossíntese de L-prolina.
Exemplos de genes preferidos para bactérias produtoras de L-prolina incluem o gene proB codificador de glutamato cinase que é dessensibilizado para inibição de retro-alimentação por L-prolina (Patente DE 3127361). Em adição, a bactéria usada na presente invenção pode ser aperfeiçoada pela intensificação da expressão de um ou mais genes " codificadores de proteínas responsáveis pela secreção de L-aminoácidos da - célula bacteriana.
Exemplos de tais genes são genes b2682 e b2683 (genes | ygazH) (EP 1239041 A2). AO Bactérias Escherichia tendo uma capacidade para produzir L- e prolina incluem as seguintes cepas de E. coli: NRKRL B-12403 e NRRL B- 12404 (Patente GB 2075056), VKPM B-8012 (Pedido de Patente Russo 2000124295), mutantes de plasmídeo descritos em Patente DE 3127361, mutantes de plasmídeo descritos por Bloom F.R. er al (“The 15º Miami Winter Symposium”, 1983, p. 34), etc.
Bactérias produtoras de L-arginina Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e cepas , parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- : arginina incluem, mas não se limitam a, cepas bacterianas de Escherichia, tal como cepa237 de E. coli (VKPM B-7925) (Pedido Publicado de Patente U.S. de Número 2002/058315 Al) e suas cepas derivadas hospedando N- acetilglutamato sintase mutante (Pedido de Patente Russo de Número 2001112869), E. coli cepa 382 (VKPM B-7926) (EP 1170358 Al), e uma cepa produtora de arginina transformada com um gene argà codificador de —N-acetilglutamato sintetase (EP 1170361 A1). Exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- arginina também incluem cepas nas quais está intensificada a expressão de um ou mais genes codificadores de uma enzima da biossíntese de L-arginina. — Exemplos de tais genes incluem o gene de N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), gene de ornitina acetil transferase (argJ), gene de N-acetilglutamato cinase (argB), gene de acetilornitina transaminase (argD), gene de ornitina carbamoil transferase (argF), gene de ácido argininosuccínico sintetase (argG), gene de ácido argininosuccínico liase (arg), e gene de carbamoil fosfato sintetase (carÃ4B). de Bactérias produtoras de L-valina . Exemplos de bactérias produtoras de L-valina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-valina - * 5 incluem, mas não se limitam a, cepas que têm sido modificadas para sobre- e expressarem o operon ilvGMEDA (Patente U.S. de Número 5,998,178). É desejável remover a região no operon ilvVGMEDA que é exigida para atenuação de modo que a expressão do operon não seja atenuada pela L- valina produzida.
Ademais, o gene ilvA no operon é desejavelmente — submetido à disrupção de modo que seja decrescida a atividade de treonina desaminase.
Exemplos de bactérias produtoras de L-valina e cepas . parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-valina também incluem mutantes tendo mutações em amino-acil t-RNA sintetase À 15 (Patente U.S. de Número 5.658.766). Por exemplo, pode ser usada £. coli VL1970, que tem uma mutação no gene ileS codificador de isoleucina tRNA sintetase.
E. coli VL1970 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) aos 24 de Junho de 1988 sob o número de acesso VKPM B-4411. Ademais, cepas mutantes que exigem ácido lipóico para crescimento e/ou são faltantes de H-ATPase (WO96/06926) também podem ser usadas como cepas parentais para derivar as bactérias produtoras de L- valina.
Exemplos de bactérias produtoras de L-valina do tipo de — bactérias corineformes incluem, por exemplo, cepas modificadas de modo que seja intensificada a expressão de um gene codificador de uma enzima da biossíntese de L-valina.
Exemplos de enzima da biossíntese de L-valina incluem enzimas codificadas pelos genes presente no operon ilvBNC, isto é, aceto-hidróxi ácido sintetase codificada por ilvBN e isômero-redutase codificada por ilvC (WO00/50624). Visto que o operon ilvBNC está sujeito à ” regulação de expressão por L-valina e/ou L-isoleucina e/ou L-leucina, é . desejável eliminar a atenuação para evitar a supressão de expressão por L- valina que é produzida. 215 A concessão às bactérias corineformes da capacidade de e produção de L-valina pode ser realizada pela diminuição ou eliminação da atividade de pelo menos um tipo de enzima que está envolvida em uma rota metabólica que decresce a produção de L-valina. Por exemplo, é considerado o decréscimo da atividade de treonina desidratase envolvida na síntese de L- —leucina, ou da atividade de uma enzima envolvida na síntese de D-pantotenato (WO00/50624).
Exemplos de métodos para conceder a capacidade de produção . de L-valina também incluem conceder resistência a um análogo de aminoácido ou semelhante.
Exemplos incluem, por exemplo, cepas mutantes que são auxotróficas para L-isoleucina e L-metionina, e resistentes à D-ribose, ao purina ribonucleosídeo ou ao pirimidina ribonucleosídeo, e têm uma capacidade para produzir L-valina (FERM P-1841, FERM P-29, Publicação de Patente Japonesa de Número 53-025034), cepas mutantes resistentes à —policetídeos (FERM P-1763, FERM P-1764, Publicação de Patente Japonesa de Número 06-065314), e cepas mutantes resistentes à L-valina em um meio contendo ácido acético como a única fonte de carbono e sensíveis aos análogos de ácido pirúvico (ácido fluoro-pirúvico etc.) em um meio contendo glicose como a única fonte de carbono (FERM BP-3006, BP-3007, Patente — Japonesa de Número 3006929).
Bactérias produtoras de L-isoleucina Exemplos de bactérias produtoras de L-isoleucina e cepas parentais que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- isoleucina incluem, mas não se limitam a, mutantes que são resistentes à 6-
dimetil-amino-purina (Patente Japonesa Publicada de Número 5-304969), iss mutantes que são resistentes aos análogos de isoleucina tais como tia- . isoleucina e hidroxamato de isoleucina, e mutantes que são adicionalmente resistentes à DL -etionina e/ou ao hidroxamato de arginina (Patente Japonesa * 5 Publicada de Número 5-130882) Em adição, cepas recombinantes ines transformadas com genes codificadores de proteínas envolvidas em biossíntese de L-isoleucina, tais como treonina desaminase e aceto-hidroxato sintase, também podem ser usadas como cepas parentais para derivar bactérias produtoras de L-isoleucina (Patente Japonesa Publicada de Número 2-458,FR 0356739, e Patente U.S. de Número 5.998.178). Exemplos de cepas de bactérias corineformes produtoras de L- isoleucina incluem a bactéria corineforme cujo gene brnE codificador de uma . proteína de excreção de aminoácido de cadeia ramificada está amplificado (Patente Japonesa Publicada de Número 2001-169788), a bactéria —corineforme munida com a capacidade de produção de L-isoleucina por fusão de protoplasto com uma bactéria produtora de L-lisina (Patente Japonesa Publicada de Número 62-74293), a bactéria corineforme cuja homosserina desidrogenase está intensificada (Patente Japonesa Publicada de Número 62- 91193), a cepa resistente ao hidroxamato de treonina (Patente Japonesa —Publicadade Número 62-195293), cepa resistente ao ácido a-ceto-malônico (Patente Japonesa Publicada de Número 61-15695), e a cepa resistente à metil lisina (Patente Japonesa Publicada de Número 61-15696).
Bactérias produtoras de L-metionina Exemplos de bactérias produtoras de L-metionina e de cepas — parentais para derivar bactérias produtoras de L-metionina incluem, mas não se limitam a, cepa mutante auxotrófica para L-treonina e cepa mutante resistente à norleucina (Patente Japonesa Publicada de Número 2000- 139471). Ademais, também podem ser usadas como cepas parentais uma cepa deficiente em repressor de metionina e cepas recombinantes transformadas com genes codificadores de proteínas envolvidas em biossíntese de L- O metionina tais como homosserina transsuccinilase e cistationina y-sintase - (Patente Japonesa Publicada de Número 2000-139471). Métodos para conceder capacidade de produção de ácido «* 5 nucleicoaum microorganismo e às bactérias produtoras de ácido nucleico ão serão exemplificados abaixo.
Uma bactéria tendo uma capacidade para produzir um ácido nucleico pode ser obtida pela concessão, por exemplo, de auxotrofia para nucleosídeo purínico ou resistência a uma droga tal como análogo de purina à tais bactérias como descritas acima (Publicações Patente Japonesa de Números 38-23099, 54-17033, 55-45199, 57-14160, 57-41915 e 59-42895). Por exemplo, uma bactéria Bacillus tendo auxotrofia ou resistência à droga ' pode ser obtida pelo tratamento da bactéria com agente mutagênico que é usado para tratamento de mutagênese habitual tal como N-metil-N'-nitro-N- À 15 —nitroso-guanidina (NTG) ou EMS (metano-sulfonato de etila).
Exemplos de bactérias Bacillus que produzem um nucleosídeo purínico incluem os seguintes.
Como um exemplo específico de cepa produtora de inosina cepa pertencendo ao gênero Bacillus, pode ser usada a cepa KMBS16 de Bacillus subtilis. Esta cepa é derivada da conhecida cepa trpC2 de Bacillus subtilis (168 Marburg), em que gene purR codificador do repressor de operon de purina (purR::spc), o gene purà codificador de succinil-AMP sintase (purA::erm), e o gene deoD codificador de nucleosídeo purínico fosforilase (deoD::kan) foram submetidos à disrupção (Patente Japonesa Publicada de Número 2004-242610, Pedido Publicado Patente U.S. de Número 2004166575 Al). À cepa AJ3772 Bacillus subtilis (FERM P-2555, Patente Japonesa Publicada de Número 62-014794) etc. também pode ser usada.
Exemplos de bactérias Bacillus tendo uma capacidade para produzir guanosina incluem a bactéria Bacillus que tem atividade aumentada de IMP desidrogenase (Patente Japonesa Publicada de Número 3-58787), sãos! bactéria Bacillus que é obtida pela introdução de um vetor que inclui um gene : que concede resistência aos análogos de purina ou à decoilinina em um mutante auxotrófico para adenina (Publicação de Patente Japonesa de Número + 5 4-28357),eto. e Exemplos de bactérias Bacillus que produzem um nucleotídeo purínico incluem os seguintes.
Como bactérias Bacillus produtoras de ácido inosínico, cepas de Bacillus subtilis produtoras de inosina que têm atividade atenuada de —fosfatase têm sido relatadas (Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805; Fujimoto, M., Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259).
Exemplos de bactérias produtoras de ácido guanílico incluem mutantes de . bactérias Bacillus que têm auxotrofia para adenina, resistência à decoiinina ou ao metionina-sulfóxido e uma capacidade para produzir ácido 5'-guanílico —(guanosina-S-monofosfato, doravante também chamado de “GMP”) (Publicação de Patente Japonesa de Número 56-12438).
Ademais, uma bactéria produtora de ácido xantílico pode ser construída pelo método usado para gerar bactérias corineformes, cujo um exemplo típico é Corynebacterium ammoniagenes. Por exemplo, pela obtenção de uma cepa intensificada em PRPP amidotransferase (Patente Japonesa Publicada de Número 8-168383), podem ser construídas uma cepa resistente a aminoácido alifático (Patente Japonesa Publicada de Número 4- 262790), ou uma cepa resistente à desidroprolina (Publicação Não-Examinada de Patente Sul-Coreana de Número 2003-56490), uma bactéria produtora de — ácido xantílico.
Além disso, exemplos de um método para gerar bactérias Bacillus que têm uma capacidade para produzir uma substância derivada de purina também incluem intensificação de atividade de uma enzima envolvida em biossíntese de purina que é comum para a biossíntese de nucleosídeos purínicos e nucleotídeos purínicos, i.e., enzima da biossíntese de purina, em E células bacterianas. A atividade da enzima nas células é preferivelmente = aumentada para um nível maior do que aquele de uma cepa não-modificada de bactéria Bacillus, por exemplo, uma bactéria Bacillus de tipo selvagem. A «* 5 frase “atividade é aumentada” inclui, por exemplo, quando o número de E moléculas de enzima por célula é aumentado, e quando a atividade específica por molécula de enzima é aumentada, etc. Por exemplo, a atividade pode ser aumentada pelo aumento da quantidade do gene da enzima. Exemplos da enzima envolvida na biossíntese de purina incluem, por exemplo, fosforribosil pirofosfato amidotransferase, fosforribosil pirofosfato sintetase (PRPP sintetase [EC: 2.7.6.1]), etc. Alguns dos catabólitos produzidos pelo metabolismos de - fontes de açúcar tal como glicose que fluem para a rota de pentose fosfato são convertidos em ribose-5-fosfato via ribulose-5-fosfato. A partir do ribose-5- fosfato biossintetizado, é produzido fosforribosil pirofosfato (PRPP), que é um precursor indispensável para as biossínteses de nucleosídeo purínico, histidina e triptofano. Especialmente, ribose-5-fosfato é convertido em PRPP por fosforribosil pirofosfato sintetase. Portanto, uma capacidade para produzir substância derivada de purina pode ser concedida a uma bactéria Bacillus ou uma tal capacidade de uma bactéria Bacillus pode ser intensificada por sua modificação de modo que a atividade de sua fosforribosil pirofosfato sintetase é aumentada.
A frase “atividade de fosforribosil pirofosfato sintetase é aumentada” significa que a atividade de fosforribosil pirofosfato sintetase — aumenta em comparação com aquela de uma cepa não-modificada tal como uma cepa de tipo selvagem ou uma cepa parental. A atividade da fosforribosil pirofosfato sintetase pode ser medida, por exemplo, pelo método de Switzer et al. (Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11) ou Roth et al. (Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17). Uma bactéria Bacillus na qual a atividade de fosforribosil
5º pirofosfato sintetase está aumentada pode ser produzida, por exemplo, pelo e aumento da expressão de um gene codificador da fosforribosil pirofosfato fo sintetase em uma bactéria Bacillus de acordo com um método usando um plasmídeo ou integrando um gene em um cromossomo, que pode ser realizado - * 5 na mesma maneira que aquela do método descrito em Patente Japonesa = Publicada de Número 2004-242610.
Por outro lado, quando PRPP que é um precursor indispensável para as biossínteses de nucleotídeos purínicos e nucleosídeos purínicos é antes produzido, um pouco dele é convertido em nucleotídeos —purínicos e nucleosídeos purínicos pelas enzimas envolvidas na biossíntese de purina. Exemplos de genes codificadores de tais enzimas incluem os genes do operon de purina de Bacillus subtilis, especialmente, genes do operon S purEKB-purC(orn)QLF-pur MNH(J)-purD (Ebbole D.J. e Zalkin H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87) (atualmente também chamado de 15º purEKBCSQLFMNHD, “Bacillus subtilis and Its Closest Relatives”, Editor - chefe: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002, Número de Acesso ao GenBank de NC 000964), e os genes do regulon pur de Escherichia coli (“Escherichia and Salmonella”, Second Edition, Editor- chefe: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).
Consequentemente, pela intensificação da expressão destes genes, uma capacidade para produzir uma substância derivada de purina pode ser concedida ou intensificada. Em adição, genes do operon de purina que podem ser usados na presente invenção não se limitam a estes, e genes derivados de outros microorganismos, animais e plantas também podem ser utilizados.
Exemplos do método para aumentar a expressão do operon de purina incluem aumento da expressão de genes do operon de purina em uma bactéria Bacillus por um método usando plasmídeo ou integrando os genes dentro de um cromossomo ou semelhante.
O segundo método para aumentar a expressão do operon de 1 de purina inclui substituir um promotor nativo do operon de purina por um - promotor mais forte, e substituir a região -35 ou -10 do promotor nativo por uma sequência de consenso.
AA Por exemplo, em Bacillus subtilis (cepal68 Marburg de B. o subtilis, ATCC 6051), a sequência -35 do operon de purina é uma sequência de consenso (TTGACA), mas a sequência -10 é TAAGAT, que difere da sequência de consenso TATAAT (Ebbole, D.J. e H.
Zalikn, J.
Biol.
Chem., 1987, 262, 8274-8287). Portanto, pela substituição da sequencia -10 (TAAGAT) por uma sequência de consenso, pela aproximação da sequência - 10 (TAAGAT) mais próxima da sequência de consenso, ou modificando-a para TATAAT, TATGAT ou TAAAAT, a atividade transcricional do operon , de purina pode ser aumentada.
Uma sequência de promotor pode ser substituída pelo mesmo método que aquela da substituição de gene, que é descrito abaixo.
O terceiro método para aumentar a expressão do operon de purina inclui decrescer a expressão do repressor de operon de purina (Patente U.S. de Número 6.284.495). A frase “expressão de um repressor de operon de purina” inclui tanto transcrição de um gene de operon de purina quanto a tradução de um produto de transcrição.
Ademais, “decrescer a expressão” inclui decrescer a expressão para ser menor do que aquela em uma cepa não- modificada tal como uma bactéria Bacillus de tipo selvagem, e substancialmente eliminar a expressão.
Expressão do repressor de operon de purina (repressor — purínico) pode ser decrescida, por exemplo, pelo tratamento de uma bactéria Bacillus com irradiação de raios ultravioleta ou com um mutágeno usado em um tratamento de mutagênese habitual tal como NTG ou EMS e pode ser utilizada seleção de um mutante mostrando expressão decrescida do repressor purínico.
Ademais, uma bactéria Bacillus com expressão decrescida do e e repressor purínico também pode ser obtida, por exemplo, por além de um tratamento de mutagênese, substituição de um gene codificador do repressor purínico em um cromossomo (purR, Número de acesso ao GenBank de -* 5 NC 000964, região codificadora corresponde aos nucleotídeos de números SS RL 54439 a 55293) por um gene correspondente que não funciona normalmente (doravante, também chamado de “gene do tipo submetido à disrupção”) por recombinação homóloga utilizando uma técnica de recombinação de gene (“Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. e Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202). Ademais, uma capacidade para produzir uma substância derivada de purina também pode ser intensificada pela atenuação da captação , de substâncias derivadas de purina para dentro de células. Por exemplo, a captação de nucleosídeos purínicos pelas células pode ser atenuada pelo bloqueio de uma reação envolvida na captação de nucleosídeos purínicos pelas células. Exemplos da reação envolvida na captação de nucleosídeos purínicos pelas células incluem reações catalisadas por nucleosídeo permeases.
Ademais, quando um nucleosídeo purínico é produzido, a atividade de uma enzima que decompõe o nucleosídeo purínico pode ser decrescida com o propósito de intensificar a capacidade para produzir o nucleosídeo purínico. Exemplos de uma tal enzima incluem nucleosídeo purínico fosforilase. Nucleotídeos purínicos biossintetizados a partir de PRPP por enzimas envolvidas em biossíntese de purina são desfosforilados e com isso convertidos em um nucleosídeo purínico. Para eficientemente causar o acúmulo de um nucleosídeo purínico, é preferível reduzir as atividades de nucleosídeo purínico fosforilases, que adicionalmente degradam nucleosídeos purínicos em hipoxantina ou semelhante. Isto é, é preferível atenuar ou eliminar uma atividade de uma nucleosídeo purínico fosforilase que utiliza e nucleosídeos purínicos tal como inosina, como um substrato. LE Especialmente, a atividade de nucleosídeo purínico fosforilase pode ser decrescida pela disrupção dos genes deoD e pupG codificadores de * 5 nucleosídeo purínico fosforilase em bactérias Bacillus. À bactéria Bacillus da e presente invenção pode ser modificada por disrupção de um ou ambos os genes deoD e pupG. Como os genes deoD e pupG, por exemplo, podem ser usados aqueles genes derivados de bactérias Bacillus (deoD; Número de Acesso ao GenBank de NC 000964, região codificadora: 2134672-2135370, pupG; Número de Acesso ao GenBank de NC 000964, região codificadora: 2445610-2446422). A capacidade para produzir uma substância derivada de purina . também pode ser intensificada pelo decréscimo da atividade de suceinil-AMP : sintase. Exemplos do gene codificador de succinil-AMP sintase incluem o genepurd. Exemplos do gene purà gene incluem, por exemplo, aqueles tendo a sequência de nucleotídeos registrada com Número de Acesso ao GenBank de NC 000964 (região codificadora corresponde aos nucleotídeos de números 4153460 a 4155749 da fita complementar). A capacidade para produzir uma substância derivada de purina também pode ser intensificada pelo decréscimo de uma atividade de inosina monofosfato (IMP) desidrogenase. Exemplos do gene codificador de IMP desidrogenase incluem o gene guaB. Exemplos do gene guaB incluem, por exemplo, aqueles tendo a sequência de nucleotídeos registrada com Número de Acesso ao GenBank de NC 000964 (região codificadora corresponde aos — nucleotídeos de números 15913 a 17376).
Além disso, como um método para intensificar uma capacidade para produzir substância derivada de purina, pode ser considerada amplificação de um gene codificador de uma proteína tendo uma atividade de excreção de uma substância derivada de purina. Um exemplo de uma bactéria na qual um gene tem sido amplificado é uma bactéria Bacillus na qual o gene if rhtÃA está amplificado (Patente Japonesa Publicada de Número 2003-219876). . Quando as bactériss produtoras de L-aminoácido anteriormente mencionadas são geradas por recombinação de gene, os genes a - * 5 serem usados não são limitados aos genes tendo a informação genética is mencionada acima ou aos genes tendo sequências conhecidas, mas variantes conservativas, i.e, genes tendo mutações conservativas, tais como seus homólogos ou genes artificialmente modificados, também podem ser usados, desde que as funções das proteínas codificadas não sejam degradadas.
Isto é, podem ser genes codificadores de uma sequência de aminoácidos conhecida contendo substituições, deleções, inserções, adições ou semelhantes de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições. : Na presente invenção, um gene participando em assimilação É de xilose pode ser amplificado.
Exemplos de gene participando em assimilação de xilose incluem o gene xy/E codificador de xilose permease (WO2006/043730), o gene xy/A codificador de xilose isomerase, o gene xy/B codificador de xilulocinase, e os genes xylF, xylG e xylH codificadores de transportador de xilose ABC (Pedido Publicado Patente U.S. de Número 2009/0117623). Ademais, visto que os genes participando em assimilação de xilose, genes xilaBFGHR, formam uma estrutura de operon, estes genes podem ser totalmente amplificados, ou um promotor antes do gene xy/d pode ser intensificado. <Cultura de microorganismo para a produção da substância alvo> Pelo uso de uma solução de açúcar produzida pelo método da presente invenção ou um seu produto de fracionamento (estes podem ser doravante também coletivamente chamados de “sacarídeo”) como uma fonte de carbono, um microorganismo tendo uma capacidade para produzir uma substância alvo é cultivado, e a substância alvo é coletada de um meio ou de células microbianas.
E Exceto se o sacarídeo anteriormente mencionado for usado cs como uma fonte de carbono, pode ser utilizado o mesmo método como aqueles métodos de fermentação habituais.
AO Para o método da presente invenção, podem ser usadas cultura fes em batelada, cultura em batelada alimentada e cultura contínua.
O sacarídeo obtido pela presente invenção pode estar contido em meio de iniciação ou em meio de alimentação, ou pode estar contido em ambos estes meios.
A cultura em batelada alimentada refere-se a um método de cultura no qual um meio é contínua ou intermitentemente alimentado para dentro de um vaso de cultura, e o meio não é extraído até o término da cultura.
A cultura contínua significa um método no qual um meio é contínua ou intermitentemente alimentado em um vaso de cultura, e o meio é extraído do vaso (habitualmente em um volume equivalente ao volume de meio —alimentado)ao mesmo tempo.
O meio de iniciação significa o meio usado na cultura em batelada, na cultura em batelada alimentada, ou na cultura contínua antes da alimentação do meio de alimentação (meio usado no momento do início da cultura), e meio de alimentação significa um meio que é fornecido a um tanque de fermentação na cultura em batelada alimentada ou — cultura contínua.
A cultura em batelada significa um método no qual meio novo é preparado para cada cultura, e a cepa é inoculada no meio, cujo meio não é modificado até a colheita.
O sacarídeo pode ser usado em qualquer concentração desde que a concentração seja adequada para produzir uma substância alvo. — Concentração do sacarídeo no meio é preferivelmente cerca de 0,1% a 50% p/v, mais preferivelmente cerca de 0,5% a 40% p/v, especialmente preferivelmente cerca de 1% a 30% p/v.
A solução de açúcar obtida de acordo com a presente invenção principalmente consiste de xilose e arabinose, mas pode conter hexoses tais como glicose e manose. Portanto, uma solução de açúcar contendo ambas SO pentoses e hexoses pode ser usada como a solução de açúcar da presente . invenção. Embora a proporção de pentoses e hexoses na solução de açúcar não é especialmente limitada desde que a solução de açúcar seja obtida de - > 5 acordo com a presente invenção, a proporção (proporção em peso) é de preferivelmente 10:0,1 a 100, mais preferivelmente 10:0,1 a 10, ainda mais preferivelmente 10:0,1 a 5, adicionalmente preferivelmente 10:1 a 5, especialmente preferivelmente 10:1 a 3.
O sacarídeo produzido pelo método da presente invenção pode — ser independentemente usando, ou também pode ser utilizado em combinação com outras fontes de carbono obtida por outros métodos tais como xilose, glicose, frutose, sacarose, melaço residual, e hidrolisado de amido. Neste . caso, sacarídeo obtido pelo método da presente invenção e outras fontes de carbono podem ser misturados em uma proporção arbitrária. Preferidas como as outras fontes de carbono são sacarídeos tais como frutose, sacarose, lactose, galactose, melaço residual, hidrolisado de amido, e uma solução de açúcar obtida pela hidrólise de outra biomassa, alcoóis tais como etanol e glicerol, e ácidos orgânicos tais como ácido fumárico, ácido cítrico, e ácido succínico. Embora a proporção de misturação de a solução de açúcar da presente invenção e a outra fonte de carbono não seja especialmente limitada, a proporção de misturação (proporção em peso) é preferivelmente 1:0,5 a 10, mais preferivelmente 1:1 a 5, especialmente preferivelmente 1:2 a 3. Como o meio a ser usado, meios convenientemente utilizados na produção de L-aminoácidos por fermentação usando microorganismos — podem ser usados, desde que o sacarídeo obtido pelo método da presente invenção seja usado como a fonte de carbono. Isto é, meios convencionais contendo, além da fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, íons inorgânicos, e opcionalmente outros componentes orgânicos, conforme a necessidade podem ser usados. Como a fonte de nitrogênio, podem ser utilizados sais inorgânicos de amônio tais como sulfato de amônio, cloreto de E amônio, fosfato de amônio, acetato de amônio, e uréia, nitratos, nitrogênio . orgânico tal como hidrolisado de feijão-soja, gás amônia, amônia aquosa, etc. Ademais, peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, -* 5 licordemacerado de milho, hidrolisado de feijão-soja etc. também podem ser ' utilizados. O meio pode conter um ou mais tipos destas fontes de nitrogênio. Estas fontes de nitrogênio também podem ser usadas para ambos o meio de iniciação e o meio de alimentação. Ademais, a mesma fonte de nitrogênio pode ser utilizada para ambos o meio de iniciação e o meio de alimentação, ouafontede nitrogênio do meio de alimentação pode ser diferente daquela do meio de iniciação.
O meio preferivelmente contém uma fonte de ácido fosfórico e - uma fonte de enxofre em adição à fonte de carbono e à fonte de nitrogênio. Como a fone de ácido fosfórico, podem ser utilizados di-hidrogeno-fosfato de potássio, hidrogeno-fosfato de dipotássio, polímeros de fosfato tal como ácido pirofosfórico etc. Embora a fonte de enxofre possa ser qualquer substância contendo átomos de enxofre, sais de ácido sulfúrico tais como sulfatos, tio- sulfatos e sulfitos, e aminoácidos contendo enxofre tais como cisteína, cistina e glutationa são desejáveis, e sulfato de amônio é especialmente desejável.
Ademais, o meio pode conter um fator promotor de crescimento (nutriente tendo um efeito promotor de crescimento) em adição as componentes anteriormente mencionados. Como o fator promotor de crescimento, metais traço, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos bem como peptona, casaminoácido, extrato de levedo, produto de degradação de — proteína de feijão-soja etc. contendo as substâncias citadas podem ser usados. Exemplos dos metais traço incluem ferro, manganês, magnésio, cálcio etc. Exemplos das vitaminas incluem vitamina B,, vitamina B,, vitamina Br, ácido nicotínico, nicotinamida, vitamina Bi, etc. Estes fatores promotores de crescimento podem estar contidos no meio de iniciação ou no meio de alimentação. ão Ademais, quando é usado um mutante auxotrófico que exige . um aminoácido ou semelhante para seu crescimento, é preferível suplementar um nutriente exigido ao meio. Especialmente, visto que a rota de biossíntese - * 5 de L-Hisina é intensificada e a capacidade de degradação de L-lisina é Ê frequentemente atenuada em bactérias produtoras de L-lisina que podem ser usadas na presente invenção como descrita abaixo, são preferivelmente adicionados um ou mais tipos de substâncias selecionadas de L-treonina, L- homosserina, L-isoleucina e L-metionina. O meio de iniciação e o meio de alimentação podem ter composição de meio igual ou diferente. Ademais, o meio de iniciação e o meio de alimentação podem ter concentração de enxofre igual ou diferente. Ademais, quando o meio de alimentação é alimentado em . estágios múltiplos, as composições dos meios de alimentação nos estágios podem ser iguais ou diferentes.
Em adição, o meio usado na presente invenção pode ser quer um meio natural quer um meio sintético, desde que ele contenha uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, e outros componentes conforme exigidos.
A cultura é preferivelmente realizada por 1 dia a 7 dias sob condições aeróbicas. A temperatura da cultura é de 20ºC a 45ºC, preferivelmente 24ºC a 45ºC, especialmente preferivelmente 33ºC a 42ºC. À cultura é preferivelmente realizada como cultura de aeração, com controle da concentração de oxigênio para cerca de 5% a 50%, desejavelmente cerca de 10%, da concentração de saturação. Ademais, pH é preferivelmente controlado para ser 5 a 9 durante a cultura. Para ajustar o pH, podem ser — usadas substâncias alcalinas ou ácidas inorgânicas ou orgânicas, tais como carbonato de cálcio, e gás amônia.
Se a cultura é realizada sob tais condições como descritas acima preferivelmente por cerca de 10 horas a 120 horas, uma quantidade notável de uma substância alvo é acumulada no meio de cultura.
Quando um aminoácido básico tal como L-lisina é produzido, ee a produção pode ser realizada por um método no qual a fermentação é o conduzida pelo controle do pH do meio durante a cultura para ser de 6,5 a 9,0 e do pH do meio no término da cultura para ser 7,2 a 9,0 e pelo controle da -* 5 pressãono tanque de fermentação para ser positiva durante a cultura, e pelo e fornecimento de gás dióxido de carbono ou um gás misto contendo gás dióxido de carbono no meio para proporcionar um período de cultura no qual o meio contém 2 g/L ou mais de íons bicarbonato e/ou íons carbonato, de modo que estes íons bicarbonato e/ou íons carbonato sirvam como contra-fons de cátions predominantemente consistindo de um aminoácido básico, e o aminoácido básico objetivo é então coletado (Patente Japonesa Publicada de Número 2002-65287, Pedido Publicado Patente U.S. de Número ; 2002/0025564, EP 1813677 A). Ademais, em fermentação de ácido L-glutâmico, a cultura — pode ser realizada com precipitação de ácido L-glutâmico no meio pelo uso de um meio líquido ajustado para ter uma condição sob a qual ácido L- glutâmico é precipitado. A condição sob a qual ácido L-glutâmico é precipitado é, por exemplo, pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, especialmente preferivelmente pH 4,0 (EP 1078989A).
Coleta da substância alvo do meio de cultura pode ser habitualmente realizada por uma combinação de métodos conhecidos tais como um método de resina de troca iônica e método de precipitação. Quando a substância alvo se acumula dentro das células, as células podem ser —rompidas, por exemplo, com ondas supersônicas ou semelhante, e a substância alvo pode ser coletada pelo método de resina de troca iônica ou semelhante a partir do sobrenadante obtido pela remoção por centrifugação das células da suspensão de células rompidas. Quando a substância alvo é um aminoácido ou um ácido nucleico, a substância alvo a ser coletada pode ser um composto na forma livre, ou pode ser um sal tal como sulfato, cloreto, fo carbonato, sal de amônio, sal de sódio, e sal de potássio. - A substância alvo coletada de acordo com a presente invenção pode conter células microbianas, componentes do meio, umidade e -* 5 metabólitos subprodutos do microorganismo em adição à substância alvo. e Pureza da substância alvo coletada é 50% ou maior, preferivelmente 85% ou maior, especialmente preferivelmente 95% ou maior (Patente U.S. de Número
5.431.933, Patente Japonesa de Número 1214636, Patentes U.S. de Números
4.956.471, 4.777.051, 4.946.654, 5.840.358, 6.238.714, Pedido Publicado Patente U.S. de Número 2005/0025878). Exemplos Doravante, a presente será mais especificamente explicada - com referência aos exemplos. [Exemplo 1] f 15 Bagaço de cana-de-açúcar (tamanho de partícula, 0,35 mm a 1,0 mm; 200 g) foi suspenso em água em uma concentração de 0,05% (p/v), e submetido a um tratamento de decomposição hidrotérmica a 175ºC em um reator de volume de 5 L por 60 minutos. Separação de sólido-líquido da pasta obtida foi realizada. Após esfriamento, Spezyme CP (Genencor, 60 FPU/g de conteúdo sólido)eNovozyme 188 (Novozyme, 64 FPU/g de conteúdo sólido) foram adicionadas em uma fração de água quente, e um tratamento de sacarificação foi realizado em pH 5,0 a 5,5 e a 50ºC por 96 horas. O procedimento acima foi repetido 5 vezes para obter a solução de açúcar.
A solução de açúcar obtida foi analisada por HPLC sob as — seguintes condições.
Sistema de análise por HPLC: Dionex ISC-3000 Coluna: CarboPac PA1 Analytical (2,0 mm x 250 mm) Coluna de guarda: CarboPac PA1 Guard (2,0 mm x 50 mm) Fase móvel:
À: água o B: NaOH 0,1 M - C: CH;COONa 0,5 M/ NaOH 0,1 M Padrão de gradiente é mostrado em Tabela 1. ROS Temperatura da coluna: 30ºC Le Taxa de fluxo: 0,25 mL/minuto Detector: detecção eletroquímica (PAD) Volume de injeção: 5,0 uL Tabela 1 Tempo (min) EN B[%] Cc) -30,0 o 100 o -20,0 o 100 o 0,0 90 10 o 25,0 90 10 o 40,0 36 sa o 50,0 o 88 12 70,0 o a 36 : 710 o o 100 80,0 o o 100 . 10 Como um resultado da análise anteriormente mencionada, foi verificado que a solução de açúcar obtida continha xilose e glicose em uma proporção de 13:2 (proporção em peso seco). [Exemplo 2] A solução de açúcar obtida em Exemplo 1 foi concentrada até —quea concentração de açúcar se tornasse 5,19% (p/v) (pureza de sacarídeo, 34%; pH 4,82). Na solução de açúcar obtida, carbono ativado, Hokuetsu BA (Ajinomoto Fine-Techno Co., Inc.; doravante chamado de “carbono BA”) foi adicionado em uma proporção de 10% (p/p), 50% (p/p), ou 100% (p/p) baseada no peso de monossacarídeo total na solução de açúcar, e a mistura foi agitada a 50ºC por 60 minutos, e filtrada pelo uso de um funil de vidro e papel de filtro para coletar um filtrado.
Pureza de sacarídeo foi melhorada para 37%, 53%, e 56%, respectivamente, nos filtrados obtidos.
Ademais, os valores de pH dos filtrados foram 4,90, 4,90, e 5,08, respectivamente.
A solução de açúcar obtida em Exemplo 1 também foi agitada —sobas mesmas condições sem adição de carbono ativado, e o filtrado foi coletado.
No filtrado obtido por este método, a concentração de açúcar e o pH e a não mudaram. . Pureza de sacarídeo foi calculada de acordo com a equação “(concentração de açúcar/teor de sólido total) x 100”. Como para o teor de -* 5 sólidototal,oteorde umidade na amostra foi medido pelo uso de um medidor ão de umidade por Karl Fischer (Kyoto Electronics Manufacturing Co., Ltd., MKA-210), e o teor de sólido total foi calculado de acordo com a equação “teor de sólido total = 100 - teor de umidade”. Para a medição usando o medidor de umidade por Karl Fischer, Aquamicron Titrant SS (10 mg) foi usado como o solvente de titulação, e Aquamicron Dehydrated Solvent CP foi usado como o solvente desidratado (ambos produzidos por Mitsubishi Chemical Co., Ltd.). Então, o crescimento de uma bactéria produtora de L-lisina foi avaliado pelo uso da solução de açúcar não tratada e três tipos de soluções de Í 15 açúcar obtidas pelo tratamento com carbono BA como a fonte de carbono.
Uma bactéria produtora de L-lisina E. coli foi cultivada a 37ºC sobre o meio de ágar LB (contendo 500 mg/L de piruvato de sódio) por 24 horas.
Às células obtidas foram raspadas da placa, inoculadas em 4 mL do meio MS- Xyl10 descrito abaixo contido em um tubo de ensaio em forma de L —(ADVANTEC, Japão) em uma OD620 de 0,25, e cultivadas a 37ºC com agitação a 70 rpm, e OD600 foi periodicamente medida.
Para a cultura agitada e a medição de OD600, foi usado um aparelho de cultura de tubo de ensaio pequeno, BIO PHOTORECORDER TVS062CA (ADVANTEC, Japão). Os resultados obtidos após 10 horas da cultura são mostrados em Tabela 2. [Meio MS-Xyl10] Fonte de carbono* 10 g/L (esterilização por filtração) MgSO0,4 7H;0 1 g/L (separadamente esterilizado) (NH,)2SO, 249/L KH,PO, 18/L
Extrato de levedo 2g8L e de FeSO, 0,01 g/L o MnSO;, 0,01 g/L HEPES 4,76 g/L - - &S *Fontede carbono: reagente xilose (Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd., e.
Japão) ou solução de açúcar tratada com carbono ativado (concentração é indicada em termos de concentração de monossacarídeo) Tabela 2: Crescimento de células após cultura por 10 horas Fonte de carbono eae Seleção de açúcar não-tratada O mei emirados o Solução de açúcar tratada com carbono BA (100%) 40 Como um resultado, quando as soluções de açúcar tratadas . 10 com carbono BA foram usadas como a fonte de carbono, foi observado crescimento de células no máximo 20 vezes maior em comparação com o caso do uso da solução de açúcar não-tratada. [Exemplo 3] A solução de açúcar descrita em Exemplo 1 foi concentrada até que a concentração de açúcar se tornasse 5,19% (pureza de sacarídeo, 34%; pH 4,82). Na solução de açúcar obtida, carbono ativado, Hokuetsu F (Ajinomoto Fine-Techno Co., Inc.; doravante chamado de “carbono F”), foi adicionado em uma proporção de 10% (p/p), 50% (p/p), ou 100% (p/p) baseada no peso de monossacarídeo total na solução de açúcar, e a mistura foi agitada a 50ºC por 60 minutos, e filtrada para coletar um filtrado.
Pureza de sacarídeo foi melhorada para 40%, 56%, e 56%, respectivamente, nos filtrados obtidos.
Ademais, os valores de pH dos filtrados foram 4,98, 5,17, e 5,62, respectivamente.
A solução de açúcar obtida em Exemplo 1 também foi agitada —sobas mesmas condições sem adição de carbono ativado, e o filtrado foi coletado.
No filtrado obtido por este método, a concentração de açúcar e o pH
BB não mudaram. Pureza de sacarídeo foi calculada na mesma maneira que a dass usada em Exemplo 2. . Então, o crescimento de uma bactéria E. coli produtora de L- lisina foi avaliado usando a solução de açúcar não-tratada e três tipos de - > 5 soluçõesde açúcar obtidos pelo tratamento com carbono F como a fonte de O carbono. A cultura foi realizada na mesma maneira que aquela de Exemplo 2, exceto que o carbono ativado usado para o tratamento da solução de açúcar foi modificado para carbono F. Os resultados obtidos após 10 horas da cultura são mostrados em Tabela 3. —Tabela3: Crescimento de células após cultura por 10 horas Fonte de carbono aqi Xilose 100 Solução de açúcar não-tratada 4 Solução de açúcar tratada com carbono F (10%) 3 Solução de açúcar tratada com carbono F (50%) 21 ” Solução de açúcar tratada com carbono F (100%) 71 Como um resultado, quando as soluções de açúcar tratadas com carbono F foram usadas como a fonte de carbono, foi observado crescimento de células no máximo 18 vezes maior em comparação com o caso de uso da solução de açúcar não-tratada.
[Exemplo 4] A solução de açúcar descrita em Exemplo 1 foi concentrada até que a concentração de açúcar se tornasse 5,45%. A solução de açúcar obtida (200 mL; pureza de sacarídeo, 37%; pH 4,88) foi fluída através de uma coluna recheada com uma resina de trona aniônica poliaminada do tipo — estireno (Nippon Rensui, Inc., WAZO0, 100 mL) em uma taxa de fluxo de 3,3 mL/minuto durante 60 minutos, e água (100 mL) foi adicionalmente fluída através da coluna.
A solução de açúcar foi coletada na saída da coluna como três frações separadas de 60 mL, 190 mL, e 45 mL (Frações 1, 2, e 3, — respectivamente). As concentrações de açúcar das frações foram 0,08%, 3,93%, e 1,77%, respectivamente. Ademais, a taxa de recuperação total de sacarídeos foi 78%. O. Pureza de sacarídeo foi melhorada de 37% para 57% na . solução fluída saindo da coluna de Fração 2 obtida pelo procedimento acima (doravante chamada de “solução de açúcar tratada com resina de troca -* 5 aniônic”). Ademais, pH da solução foi 9,23. A pureza de sacarídeo foi à R calculada na mesma maneira que aquela descrita em Exemplo 2.
Então, o crescimento de uma bactéria E. coli produtora de L- lisina foi avaliado usando a solução de açúcar não-tratada e a solução de açúcar tratada com resina de troca aniônica. Cultura da bactéria produtora de L-lisinae avaliação foram realizadas nas mesmas maneiras como aquelas de Exemplo 2. Como um controle, cultura e avaliação foram realizadas similarmente pelo uso de uma solução de açúcar de modelo misto de reagente : glicose e xilose (glicose:xilose (proporção em peso) = 7:10) no lugar da solução de açúcar como a fonte de carbono. As quantidades de células obtidas comas soluções de açúcar foram calculadas baseando na quantidade de células obtida no controle, que foi considerada como 100. Os resultados obtidos após 15 horas da cultura são mostrados em Tabela 4.
Tabela 4: Crescimento de células após cultura por 15 horas Condição do meio e ra Solução de açúcar de modelo reagente 100 Solução de açúcar não-tratada 8 Solução de açúcar tratada com resina de troca aniônica 35 Como um resultado, sob a condição de uso da solução de — açúcar tratada com resina de troca aniônica como a fonte de carbono, foi observado crescimento de células no máximo 4,4 vezes maior em comparação com a condição de uso da solução de açúcar não-tratada.
[Exemplo 5] A solução de açúcar descrita em Exemplo 1 foi concentrada até que a concentração de açúcar se tornasse 5,45%. A solução de açúcar obtida (200 mL; pureza de sacarídeo, 37%; pH 4,88) foi fluída através de uma coluna recheada com uma resina de adsorção sintética do tipo éster de ácido metacrílico (Nippon Rensui Inc., HP2MG, 100 mL) em uma taxa de fluxo de O & 3,3 mL/minuto durante 60 minutos, e água (105 mL) foi adicionalmente o fluída através da coluna.
A solução de açúcar foi coletada na saída da coluna como três r* & frações separadas de 73 ml, 200 ml, e 27 mb (Frações 1,2, e 3, —. respectivamente). As concentrações de açúcar das frações foram 0,01%, 4,85%, e 2,42%, respectivamente.
Ademais, a taxa de recuperação total de sacarídeos foi 97%. Pureza de sacarídeo foi melhorada de 37% para 65% na — solução fluída saindo da coluna de Fração 2 obtida pelo procedimento acima (doravante chamada de “solução de açúcar tratada com resina de adsorção sintética”). Ademais, pH da solução foi 5,22. A pureza de sacarídeo foi : calculada na mesma maneira que aquela descrita em Exemplo 2. Então, o crescimento de uma bactéria E. coli produtora de L- lisina foi avaliado usando a solução de açúcar não-tratada e a solução de açúcar tratada com resina de adsorção sintética nas mesmas maneiras como aquelas de Exemplo 4. Os resultados obtidos após 15 horas da cultura são mostrados em Tabela 5. Tabela 5: Crescimento de células após cultura por 15 horas Condição do meio egaamtn ta COME Dela aeedarda oo E" Solução de açúcar tratada com resina de adsorção sintética 28 Como um resultado, sob a condição de uso da solução de açúcar tratada com resina de adsorção sintética como a fonte de carbono, foi observado crescimento de células de no máximo 3,1 maior em comparação com a condição de uso da solução de açúcar não-tratada. [Exemplo 6] 2s De acordo com o método descrito em Patente Japonesa de Número 4436429, palha de arroz foi submetida a um tratamento de decomposição hidrotérmica para obter água quente descarregada.
A enzima de sacarificação foi adicionada nesta água quente descarregada para realizar o um tratamento de sacarificação. A solução de açúcar obtida foi analisada por . HPLC na mesma maneira que aquela de Exemplo 1, e foi verificado que continha xilose e glicose em uma proporção de 3:2 (proporção em peso). Esta -* 5 solução de açúcar foi concentrada até que a concentração de açúcar se . tornasse 7,66%, e foi centrifugada a 3.000 rpm por 20 minutos, e o sobrenadante foi filtrado sob pressão reduzida pelo uso de um filtro de vidro (Whatman GFC 150 mmf) para remover o conteúdo sólido. A concentração de açúcar da solução de açúcar obtida foi 7,64%.
A solução de açúcar transparente obtida (1.200 mL; pureza de sacarídeo, 40%; pH 4,04) foi fluída através de uma coluna recheada com uma resina de trona aniônica poliaminada do tipo estireno (Nippon Rensui Inc., Y WAZ20, 850 mL) em uma taxa de fluxo de 19,2 mL/minuto durante 60 minutos, e 1.300 mL de água foram adicionalmente fluídos através da coluna. i 15 A solução de açúcar foi coletada na saída da coluna como três frações separadas de 630 mL, 2.100 mL, e 1.000 mL (Frações 1, 2, e 3, respectivamente). As concentrações de açúcar das frações foram 0,15%, 5,26%, e 1,00%, respectivamente. Ademais, a taxa de recuperação total de sacarídeos foi 78%. Quando 2.800 mL de água foram adicionalmente fluídos através da coluna, a taxa de recuperação total de sacarídeos foi melhorada para 85%, e quando 3.800 mL de ácido sulfúrico 1 N foram adicionalmente fluídos através da coluna, a taxa de recuperação total de sacarídeos foi melhorada para 93%.
Pureza de sacarídeo foi melhorada de 40% para 41% na — solução fluída saindo da coluna de Fração 2 obtida pelo procedimento acima (doravante chamada de “solução de açúcar tratada com resina de troca aniônica”). Ademais, pH da solução foi 8,81. A pureza de sacarídeo foi calculada na mesma maneira que aquela descrita em Exemplo 2.
Então, a produção de L-lisina foi realizada pelo uso de uma bactéria E. coli produtora de L-lisina, e a solução de açúcar não-tratada ou a — solução de açúcar tratada com resina de troca aniônica como a fonte de o carbono. A bactéria produtora de L-lisina foi cultivada a 37ºC sobre o meio de ágar LB (contendo 500 mg/L de piruvato de sódio) por 24 horas. As .- 5 células obtidasforam raspadas da placa, inoculadas em 300 mL de um meio . de produção de lisina contido em um fermentador de vaso de volume de 1 L (Kojima Special Glass Manufacturing Co., Ltd.) em uma OD620 de 0,14, e pré-cultivadas a 37ºC e pH 6,7 com agitação a 900 rpm. O meio de pré- cultura obtido (45 mL) foi adicionado em 255 mL do meio de produção de lisina contido em um fermentador de vaso de volume de 1 L, e cultura principal foi realizada a 37ºC e pH 6,7 com agitação a 900 rpm. Como a fonte de carbono do meio de produção de lisina, foram usadas a solução de açúcar : não-tratada ou a solução de açúcar tratada com resina de troca aniônica. Em adição, quando foi usada apenas a solução de açúcar não-tratada como o À 15 sacarídeo no meio, não foram observados crescimento de células e acúmulo de L-lisina, e portanto as células foram cultivadas em um meio no qual 1/3 de sacarídeos contidos no meio foi derivado da solução de açúcar não-tratada, e 2/3 dos sacarídeos contidos no meio consistiram de reagente glicose e xilose (glicose:xilose (proporção em peso) = 7:10). Esta condição foi chamada de “solução de açúcar não-tratada (diluição x3)”.
Após 10 horas do início da cultura, o meio de cultura foi amostrado, e Foram medidas suas OD620 e concentração de L-lisina. OD620 foi medida para o meio de cultura diluído 26 vezes com água pelo uso de um espectrofotômetro UV-1620 (Shimadzu Corporation, Japão). A concentração — de lisinano meio de cultura foi medida pelo uso de um analisador de lisina BF-5 (Oji Scientific Instruments). Incrementos de quantidade de células e de quantidade de L-lisina produzida desde o início da cultura até a amostragem foram representados como ACell e ALys, respectivamente, e taxa de melhoria obtida com o uso do tratamento com resina de troca aniônica foi calculada para cada uma. Os resultados obtidos após a cultura por 10 horas são “E mostrados em Tabela 6. ; Tabela 6: Crescimento de células e capacidade de produção de L-lisina após cultura por 10 horas ã | Solução de açúcar não-tratada (diluição x) aa OR [Solução de açúcar tratada com resina de troca aniônica | 138 [rag as a) z 5 Como um resultado, quando a solução de açúcar tratada com resina de troca aniônica foi usada como a fonte de carbono, ambos o aumento em quantidade de células e o aumento em quantidade de L-lisina produzida foram maiores do que aqueles obtidos pelo uso da solução de açúcar não- tratada como a fonte de carbono. Ademais, a taxa de melhoria de produção de L-lisina obtida com o tratamento de resina foi maior do que a taxa de À melhoria do crescimento de células. Por estes resultados, foi demonstrado que a capacidade de produção de L-lisina da bactéria produtora de L-lisina foi ' melhorada pela purificação da solução de açúcar com a resina de troca aniônica. [Exemplo 7] Decomposição hidrotérmica de palha de arroz, sacarificação, concentração, e filtração sob pressão reduzida foram realizadas nas mesmas maneiras como aquelas de Exemplo 6, e 930 mL da solução de açúcar transparente obtida (pureza de sacarídeo, 40%; pH 4,04) foram fluídos através —deuma coluna recheada com 700 mL de uma resina de troca aniônica do tipo éster de ácido metacrílico (Nippon Rensui Inc., HP2MG) em uma taxa de fluxo de 15,8 mL/minuto durante 60 minutos, e 1.200 mL de água foram adicionalmente fluídos através da coluna.
A solução de açúcar foi coletada na saída da coluna como três frações separadas de 450 mL, 1.010 mL, e 570 mL (Frações 1, 2, e 3, respectivamente). As concentrações de açúcar das frações foram 0,02%, 5,06%, e 3,41%, respectivamente. Ademais, a taxa de recuperação total de sacarídeos foi 99,5%. "o Pureza de sacarídeo foi melhorada de 40% para 48% na o solução fluída saindo da coluna de Fração 2 obtida pelo procedimento acima (doravante chamada de “solução de açúcar tratada com resina de adsorção -- 5 sintética”). Ademais, pH da solução foi 4,41. A pureza de sacarídeo foi : calculada na mesma maneira que aquela descrita em Exemplo 2.
Então, a produção de L-lisina foi realizada pelo uso de uma bactéria E. coli produtora de L-lisina e da solução de açúcar não-tratada ou da solução de açúcar tratada com resina de adsorção sintética como a fonte de — carbono. A cultura foi realizada na mesma maneira que aquela de Exemplo 6 exceto que a solução de açúcar tratada com resina de adsorção sintética foi usada como a fonte de carbono no lugar da solução de açúcar tratada com : resina de troca aniônica. Os resultados obtidos após a cultura por 10 horas são mostrados em Tabela 7. “15 Tabela7: Crescimento de células e capacidade de produção de L-lisina após cultura por 10 horas Condição do mei aceuta | Menarineo | Alzs | Menosaao | Sojução de açúcar não-tratada (diluição 3) aa aaa Como um resultado, quando a solução de açúcar tratada com resina de adsorção sintética foi usada como a fonte de carbono, ambos o aumento em quantidade de células e o aumento em quantidade de L-lisina produzida foram maiores do que aqueles obtidos pelo uso da solução de açúcar não-tratada como a fonte de carbono. Ademais, a taxa de melhoria de produção de L-lisina obtida com o tratamento de resina foi maior do que a taxa de melhoria do crescimento de células. Por estes resultados, foi demonstrado que a capacidade de produção de L-lisina da bactéria produtora —deL-lisina foi melhorada pela purificação da solução de açúcar com a resina de adsorção sintética [Exemplo 8]
A resina de adsorção sintética usada em Exemplo 7 foi depois “Ee lavada com10 L de água após fluir a solução de açúcar e a água, e substâncias o adsorvidas sobre a resina foram eluídas com 7.000 mL de metanol 40%, e então depois eluídas com 5.500 mL de metanol 100%. O solvente nestes -- 5 eluatos foi removido pelo uso de um evaporador e um secador por . congelamento, e então o resíduo foi dissolvido em água para preparar uma amostra de componentes adsorvidos sobre a resina de adsorção sintética.
Como para os componentes adsorvidos coletados da resina, a fração eluída da resina de adsorção sintética com a solução de metanol 40% é chamada de EL- 1,eafração eluída da mesma resina com metanol 100% é chamada de EL-2. Foi avaliada a influência de cada um dos componentes adsorvidos sobre a resina de adsorção sintética anteriormente mencionados : sobre o crescimento de uma bactéria produtora de L-lisina.
Reagente xilose foi usado como um meio de fonte de carbono, e a cultura foi realizada na mesma maneira que aquela de Exemplo 2. Cada uma das frações EL-1 e EL-2 foi adicionada no meio com ajuste dos volumes das frações de modo que as concentrações de impureza relativas às concentrações de monossacarídeo devam ser iguais àquela da solução de açúcar não submetida ao tratamento com a resina.
Os resultados obtidos após a cultura por 10 horas são mostrados emTabela?&. Tabela 8: Crescimento de células após cultura por 10 horas Fonte de carbono lr eps Xilose 100 Xilose + EL-I 56 Xilose + EL-2 48 Como um resultado, 44% e 52% de decréscimo em crescimento de células foi observado com a adição de EL-1 e EL-2, respectivamente, em comparação com a condição de não adicionar os componentes adsorvidos sobre resina de adsorção sintética.
Por estes resultados, foi demonstrado que os componentes adsorvidos pela resina de adsorção sintética afetaram adversamente o crescimento de células da bactéria produtora de L-lisina.
Ns [Exemplo 9] o Com o propósito de caracterizar as substâncias que inibiram o crescimento de células contidas na solução de açúcar derivada de biomassa -- 5 não-usada,foirealizado o seguinte experimento.
Decomposição hidrotérmica i de palha de arroz, sacarificação, concentração, e filtração sob pressão reduzida foram realizadas nas mesmas maneiras como aquelas de Exemplo 6, e 120 g da solução de açúcar transparente obtida (concentração de sacarídeo, 7,64%; pH 4,04) foram concentrados até a secura pelo uso de um evaporador —paraobter95 gde componentes voláteis como dreno de concentração.
Então, foi avaliada a influência das impurezas voláteis na solução de açúcar derivada da biomassa não-usada sobre o crescimento de . uma bactéria produtora de L-lisina.
O dreno de concentração anteriormente mencionado foi adicionado no meio contendo reagente xilose como uma fonte de carbono com ajuste do volume do dreno de modo que a concentração de componente volátil relativa à concentração de sacarídeo do meio deva ser igual àquela da solução de açúcar não-tratada.
A cultura da bactéria produtora de L-lisina foi realizada na mesma maneira que aquela de Exemplo 2. Os resultados obtidos após a cultura por 10 horas são mostrados em Tabela 9. —Tabela9: Crescimento de células após cultura por 10 horas Fonte de carbono Ng Xilose 100 Solução de açúcar não-tratada 3 Xilose + dreno de concentração 101 Como um resultado, sob a condição de adição do dreno de concentração, foi observado o crescimento de células em comparação com aquela observado sem a adição das impurezas.
Por este resultado, foi demonstrado que, dentre as impurezas contidas na solução de açúcar derivada — da biomassa não-usada, os componentes inibindo o crescimento de células da bactéria produtora de L-lisina foram componentes não-voláteis. [Exemplo 10]
Com o propósito de caracterizar as substâncias que inibiram o E crescimento de células contidas na solução de açúcar derivada de biomassa o não-usada, foi realizado o seguinte experimento.
Decomposição hidrotérmica de palha de arroz, sacarificação, concentração, e filtração sob pressão -* 5 reduzida foram realizadas nas mesmas maneiras como aquelas de Exemplo 6, " a solução de açúcar transparente obtida (concentração de sacarídeo, 7,64%; pH 4,04) foi concentrada um concentração de sacarídeo de 4,71%, e 21 g da solução de açúcar obtida foram submetidos à separação usando uma membrana de filtração por peso molecular (Millipore, Amicon Ulitra-15 3K) a4.500xg por 60 minutos para obter 4 g de uma solução concentrada por membrana contendo substâncias tendo um peso molecular de 3.000 ou maior e 17 g de uma fração de peso molecular baixo contendo substâncias tendo um : peso molecular menor do que 3.000 como um filtrado.
As concentrações de açúcar da solução concentrada por membrana (fração de peso molecular alto) i 15) e o filtrado (fração de peso molecular baixo) foram 5,25% e 4,67%, respectivamente.
À taxa de recuperação de sacarídeos nesta operação de separação foi de 102%. Então, o crescimento de uma bactéria produtora de L-lisina foi avaliado usando a solução de açúcar não-tratada, a solução concentrada por membrana, eo filtrado.
A cultura foi realizada na mesma maneira que aquela de Exemplo 2 exceto que uma solução de açúcar mista de reagente glicose e xilose foi usada como a fonte de carbono.
A solução concentrada por membrana ou o filtrado foi adicionada(o) no meio de modo que a concentração de impureza relativa à concentração de açúcar no meio se — tornasse igual àquela na solução de açúcar não-tratada.
Os resultados obtidos após a cultura por 10 horas são mostrados em Tabela 10. Tabela 10: Crescimento de células após cultura por 10 horas Fonte de carbono AA raiç Solução mista de reagente sacarídeo 100 Solução de açúcar não-tratada 2 Solução concentrada (fração de peso molecular alto) 85 Filtrado (fração de peso molecular alto baixo) 1
Como um resultado, quando a solução concentrada por Ein membrana foi adicionada, 85% de crescimento foi observado em comparação o com o controle (nenhuma solução concentrada por membrana nem o filtrado foi adicionado). Em contraste, quando a solução de açúcar não-tratada ou o .- 5 filtrado foi adicionado, 2% ou 1% de crescimento foi observado em ' comparação com: o controle, e assim inibição de crescimento notável foi observada.
Por estes resultados, foi demonstrado que as impurezas que inibiram o crescimento de células da bactéria produtora de L-lisina foram substâncias tendo um peso molecular de 3.000 ou menor. 10 [Exemplo 11] Palha de arroz foi submetida à decomposição hidrotérmica na mesma maneira como aquela de Exemplo 6 para obter água quente : descarregada.
A enzima de sacarificação foi adicionada nesta água quente descarregada para realizar um tratamento de sacarificação.
A solução de açúcar obtida foi concentrada, e então submetida à filtração pressurizada a 0,2 MPa usando um papel de filtro de 2,5 um (Whatman) para remover o conteúdo sólido.
A concentração de açúcar da solução de açúcar transparente obtida foi de 4,72% (p/v). Na solução de açúcar transparente obtida (pureza de sacarídeo, 40,5%; pH 4,04), carbono BA foi adicionado em uma quantidade de 50% (p/p) ou 100% (p/p) baseada no peso de monossacarídeo total na solução de açúcar, e a mistura foi agitada a 50ºC por 60 minutos, e filtrada para coletar o filtrado.
A pureza de sacarídeo foi melhorada para 42,4% e 46,5% nos filtrados obtidos, respectivamente.
Ademais, os valores de pH dos filtrados —foram4,10€e4,18, respectivamente.
A solução de açúcar transparente anteriormente mencionada também foi agitada sob as mesmas condições sem adição de carbono ativado, e o filtrado foi coletado.
No filtrado obtido por este método, a concentração de açúcar e o pH não mudaram.
À pureza de sacarídeo foi calculada na mesma maneira que a usada em Exemplo 2. fo Então, o crescimento de uma bactéria produtora de L-lisina foi o avaliado usando a solução de açúcar não-tratada e dois tipos de soluções de açúcar obtidas do tratamento com carbono BA como a fonte de carbono.
E Só Como a bactéria produtora de L-lisina, foi usada a . cepaWC196LCxylA/pPCABD?2. Visto que foi reconhecido que a cepa E WCI196LC (WC196AcadAAIldeC) havia perdido a capacidade de assimilação de xilose devido à mutação do gene xy/4, a cepa WC196LCxylA/pCABD? foi obtida pela preparação de uma cepa retromutada na qual o gene xy/Ad mutante —foiretromutado para o genótipo de cepa MG1655 de E. coli de tipo selvagem usando a transdução Pl, e introdução do plasmídeo pCABD2 na cepa retromutada obtida. ; A sequência de nucleotídeos do gene xy/A da cepa MG1655 e a sequência de aminoácidos codificada por esta sequência de nucleotídeos são À 15 mostradas em SEQ ID NOS: | e 2, respectivamente.
No gene xy/A da cepa WCI196LC, C na posição 473 em SEQ ID NO: 1 está substituído por T, e como um resultado, Pro na posição 158 da sequência de aminoácidos codificada está substituído por Leu.
A retro-mutação de xy/d foi especialmente realizada como segue A cepa MGI655 foi inoculada em 4 mL de meio líquido LB, e cultivada durante a noite a 37ºC com agitação para obter um meio de pré- cultura, e 100 uL do meio de pré-cultura foram inoculados em 4 mL do meio líquido LB contendo 20 uL de lisado P1 e CaCl; 5 mM.
Então, cultura foi realizada a 37ºC por 3 a 6 horas com agitação para realizar a lise das células, um volume apropriado de clorofórmio foi adicionado em 1 mL do meio de cultura obtido, e a mistura foi agitada em um misturador turbilhonante por 3 minutos, e então centrifugada a 12,00 rpm por 10 minutos para obter um lisado P1 derivado da cepa MG1655 como sobrenadante.
A cepa WCI96LC foi cultivada em 4 mL do meio LB contendo CaCl, 5 mM até que OD660 se tornasse cerca de 0,3 a 0,6, 1 mL do E meio de cultura obtido e 50 uL do lisado P1 derivado da cepa MG1655 Eee preparado acima foram misturados, e a mistura foi deixada em repouso a 37ºC por 15 minutos.
As células foram coletadas, suspensas em 0,9 mL do nO. 5 meio LB e 0,1 mL de uma solução de citrato de sódio 1 M, e cultivadas a . 37ºC por 1 hora.
As células foram coletadas, lavadas com o meio M9 não contendo fonte de carbono, então aplicadas em meio de ágar M9 contendo 0,4% de xilose, e cultivadas a 37ºC por cerca de 12 horas como cultura estacionária . Uma colônia que apareceu sobre o meio de ágar foi usada como a cepa WCI96LCxylA.
A cepa WCI96LCxylA foi transformada com pCABD?2 para obter a cepa WC196LCxylA/pCABD?2. A cepa WC196LCxylA/pCABD? foi cultivada a 37ºC por 24 . horas sobre o meio de ágar LB (contendo 20 mg/L de estreptomicina). Um décimo da quantidade das células obtidas foi raspado do meio de ágar, “15 inoculado em 20 mL do meio MS-10 descrito abaixo em um frasco de Sakaguchi de volume de 500-mL, e cultivado a 37ºC com agitação a 120 rpm, e OD600 e concentração de L-lisina (Lys) foram periodicamente medidas.
Os resultados obtidos após 10 horas da cultura são mostrados em Tabela 11. [Meio MS-10] — Fonte de carbono* 10 g/L (esterilização por filtração) MgSO,4 7H;0 1 g/L (separadamente esterilizado) (NH,),SO, 248/L KH3PO, 18L Extrato de levedo 2g/L —FeSO. 0,01 g/L MnSO, 0,01 g/L Sulfato de estreptomicina 20 mg/L CaCO; 30 g/L *Fonte de carbono: a solução de açúcar não-tratada, a solução de açúcar de modelo reagente obtida por misturação de reagente xilose, arabinose, !ESER galactose, e glicose (todas foram produzidas por Wako Pure Chemical o Industries, Co., Ltd., Japão) na mesma composição como aquela da solução de açúcar não-tratada, ou uma solução de açúcar tratada com carbono ativado -- 5 foram usadas (concentrações são indicadas em termos de concentração de : monossacarídeo). Tabela 11: Crescimento de células e acúmulo de L-lisina após 7 horas de cultura [solução de açúcar tratada com 100% de carbono BA og Como um resultado, quando as soluções de açúcar tratadas com carbono BA foram usadas, foram observadas melhoria da quantidade de É células de no máximo 3 vezes e melhoria da concentração de acúmulo de L- e lisina de no máximo 4 vezes em comparação com o caso de uso da solução de açúcar não-tratada. Por estes resultados, foi demonstrado que o tratamento com carbono BA da solução de sacarídeo C5 derivada da biomassa foi efetivo —paramelhoraria do crescimento de células e da produção de L-lisina.
[Exemplo 12] Palha de arroz foi submetida à decomposição hidrotérmica na mesma maneira como aquela de Exemplo 6 para obter água quente descarregada. A enzima de sacarificação foi adicionada nesta água quente —descarregada para realizar um tratamento de sacarificação. A solução de açúcar obtida foi concentrada, e então foi submetida à filtração pressurizada a 0,2 MPa usando um papel de filtro de 2,5 um (Whatman) para remover o conteúdo sólido. A concentração de açúcar da solução de açúcar transparente obtida foi de 4,72% (p/v). Na solução de açúcar transparente obtida, carbono —F foiadicionado em uma quantidade de 50% (p/p) ou 100% (p/p) baseada no peso de monossacarídeo total na solução de açúcar, e a mistura foi agitada a 50ºC por 60 minutos, e filtrada para coletar o filtrado. A pureza de sacarídeo foi melhorada para 41,2% e 45,8% nos filtrados obtidos, respectivamente. : Ademais, os valores de pH dos filtrados foram 4,24 e 4,49, respectivamente. . A solução de açúcar transparente anteriormente mencionada também foi agitada sob as mesmas condições sem adição de carbono ativado, .- 5 eofiltrado foi coletado.
No filtrado obtido por este método, a concentração . de açúcar e o pH não mudaram.
Pureza de sacarídeo foi calculada na mesma maneira que a usada em Exemplo 2. Então, cultura da cepa WC1I96LCxylA/pCABD foi avaliada usando a solução de açúcar não-tratada e dois tipos de soluções de açúcar obtidos do tratamento com carbono F como a fonte de carbono.
A cultura foi realizada na mesma maneira que aquela de Exemplo 11 exceto que o carbono ativado usado para o tratamento da solução de açúcar foi mudado de carbono : BA para carbono F.
Os resultados obtidos após 10 horas da cultura são mostrados em Tabela 12. “15 Tabela 12: Crescimento de células e acúmulo de L-lisina após 7 horas de cultura |-Sofação de agtenenieatdao SS a Solução de açúcar não-tratada Pag OQ [ Solução de açúcar tratada com 100% de carbono E Rg Como um resultado, quando as soluções de açúcar tratadas com carbono F foram usadas, foram observadas melhoria da quantidade de células de no máximo 3,2 vezes e melhoria da concentração de acúmulo de L- —lisinadeno máximo 4,5 vezes em comparação com o caso de uso da solução de açúcar não-tratada.
Por estes resultados, foi demonstrado que o tratamento com carbono F da solução de sacarídeo C5 derivada da biomassa foi efetivo para melhoria de crescimento de células e de produção de L-lisina. [Exemplo 13] Palha de arroz foi submetida à decomposição hidrotérmica na mesma maneira como aquela de Exemplo 6 para obter água quente descarregada.
A enzima de sacarificação foi adicionada nesta água quente descarregada para realizar um tratamento de sacarificação. A solução de ' açúcar obtida foi concentrada para a concentração de açúcar de 7,64%, e . centrifugada a 10.000 g por 10 minutos para remover o conteúdo sólido. À concentração de açúcar da solução de açúcar obtida foi 8,06%.
A solução de açúcar transparente obtida (520 mL; pureza de E sacarídeo, 41,5%; pH 4,08) foi fluída através de uma coluna recheada com i uma resina de trona aniônica poliaminada do tipo estireno (Nippon Rensui, Inc., WA20, 370 mL) em uma taxa de fluxo de 8,0 mL/minuto durante 60 minutos, e água (710 mL) foi adicionalmente fluída através da coluna.
A solução de açúcar foi coletada na saída da coluna como três frações separadas de 300 mL, 620 mL, e 350 mL (Frações 1, 2, e 3, respectivamente). As concentrações de açúcar das frações foram 0,38%, : 4,94%, e 2,32%, respectivamente. Ademais, a taxa de recuperação total de sacarídeos foi 77%. Quando 230 mL de água foram adicionalmente fluídos i 15 — através da coluna, a taxa de recuperação de sacarídeo aumentou para 82%, e quando 560 mL de ácido sulfúrico 1 N foram fluídos através da coluna, a taxa de recuperação de sacarídeo aumentou para 85%. Pureza de sacarídeo na solução fluída saindo da coluna de Fração 2 obtida pelo procedimento acima (doravante chamada de “solução de açúcar tratada com resina de troca aniônica”) foi 41%. Ademais, pH da solução foi 6,98. A pureza de sacarídeo foi calculada na mesma maneira que aquela descrita em Exemplo 2.
Então, a produção de L-lisina foi realizada pelo uso da cepa WCI96LCxylA/pPCABD?2 com a solução de açúcar não-tratada ou a solução — de açúcar tratada com resina de troca aniônica como a fonte de carbono. À cepa WCI96LCxylA/pCABD? foi cultivada a 37ºC por 24 horas sobre o meio de ágar LB (contendo 20 mg/L de sulfato de estreptomicina). Um décimo da quantidade das células obtidas foi raspado do meio de ágar, inoculado em 300 mL de um meio de pré-cultura contido em um fermentador de vaso de volume de 1 L (Kojima Special Glass Manufacturing Co., Ltd.) em i uma OD620 de 0,14, e pré-cultivadas a 37ºC e pH 6,7 por 24 horas com . agitação a 900 rpm.
O meio de pré-cultura obtido (45 mL) foi adicionado em 255 mL do meio de cultura principal contido em um fermentador de vaso de .- SS volumedelL,e cultura principal foi realizada a 37ºC e pH 6,7 com agitação E a 900 rpm.
Como a fonte de carbono do meio de cultura principal, a solução Í de açúcar não-tratada ou a solução de açúcar tratada com resina de troca aniônica foi usada. [Meio de pré-cultura] Glicose 40 g/L (separadamente esterilizado) MgSO,7H,0 1,2 g/L (separadamente esterilizado) (NH4)2SO,4 8 gl , KH,PO, 18/L Hidrolisado de feijão-soja* 0,6 g/L “15. FeSOr7H,O 0,03 g/L MnSO,4H,0 0,03 g/L L-Isoleucina 0,3 g/L DL-Metionina 0,2 g/L L-Treonina 0,3 g/L —Sulfatode estreptomicina 20 mg/L *Hidrolisado de feijão-soja: concentração é indicada em termos de nitrogênio total. | [Meio de cultura principal] Fonte de carbono** 30 g/L (esterilização por filtração) MgSO,;7H,0 1,2 g/L (separadamente esterilizado) (NH1)SO, 8 g/L KH,PO, 18/L Hidrolisado de feijão-soja* 0,6 g/L FeSO,7H,0 0,03 g/L
MnSO,'4H,0 0,03 g/L L-Isoleucina 0,3 g/L V DL-Metionina 0,2 g/L L-Treonina 0,3 g/L -- 5 Sulfatodeestreptomicina 20 mg/L **Fonte de carbono: a solução de açúcar não-tratada, a solução de açúcar de i modelo reagente obtida pela misturação de reagente xilose, arabinose, galactose, e glicose (todas foram produzidas por Wako Pure Chemical Industries, Co., Ltd., Japão) na mesma composição que aquela da solução de açúcar não-tratada, ou a solução de açúcar tratada com resina de troca aniônica foram usadas (concentrações são indicadas em termos de concentração de monossacarídeo). . Após 10 horas do início da cultura, o meio de cultura foi amostrado, e OD620 e concentração de L-lisina foram medidas.
OD620 foi medida para o meio de cultura diluído 26 vezes com água pelo uso de um espectrofotômetro UV-1620 (Shimadzu Corporation, Japão). A concentração de lisina no meio de cultura foi medida pelo uso de um analisador de lisina BF-5 (Oji Scientific Instruments). Os resultados obtidos após a cultura por 10 horas são mostrados em Tabela 13. —Tabela13: Crescimento de células e acúmulo de L-lisina após cultura por 10 horas oo o ss dote A Solução de açúcar tratada com resina de troca aniônica Como um resultado, quando a solução de açúcar tratada com resina de troca aniônica foi usada como a fonte de carbono, a quantidade de células foi melhorada 4,2 vezes, e o acúmulo de L-lisina foi melhorado 4,6 — times, em comparação com o caso de uso da solução de açúcar não-tratada como a fonte de carbono.
Ademais, em comparação com o caso de uso da solução de açúcar de modelo reagente como a fonte de carbono, foram obtidos resultados substancialmente comparativos, i.e, a quantidade de ' células foi 1,2 vezes, e o acúmulo de L-lisina foi 0,9 vez. Por estes resultados, foi demonstrado que o tratamento com resina de troca aniônica da solução de açúcar C5 derivada da biomassa foi efetivo para melhoria de crescimento de .-. 5 — célulasede capacidade de produção de aminoácido. [Exemplo 14] à Decomposição hidrotérmica de palha de arroz, sacarificação, concentração e centrifugação foram realizadas nas mesmas maneiras como aquelas de Exemplo 6, e 520 mL da solução de açúcar transparente obtida 10 (pureza de sacarídeo, 41%; pH 4,08) foram fluídos através de uma coluna recheada com 370 mL de uma resina de troca aniônica do tipo éster de ácido metacrílico (Nippon Rensui Inc., HP2MG) em uma taxa de fluxo de 8,0 . mL/minuto durante 60 minutos, e 450 mL de água foram adicionalmente fluídos através da coluna.
A solução de açúcar foi coletada na saída da coluna como três frações separadas de 260 mL, 460 mL, e 210 mL (Frações 1, 2, e 3, respectivamente). As concentrações de açúcar das frações foram 0,10%, 4,91%, e 6,55%, respectivamente. Ademais, a taxa de recuperação total de sacarídeos foi 87%. Quando 280 mL de água foram adicionalmente fluídos — através da coluna, a taxa de recuperação de sacarídeos aumentou para 97%, e quando 620 mL de metanol 100% foram fluídos através da coluna, a taxa de recuperação de sacarídeos aumentou para 98%.
A pureza de sacarídeo foi melhorada de 41% para 47% na solução fluída saindo da coluna de Fração 2 obtida pelo procedimento acima — (doravante chamada de “solução de açúcar tratada com resina de adsorção sintética”). Ademais, pH da solução foi 4,37. A pureza de sacarídeo foi calculada na mesma maneira que aquela descrita em Exemplo 2.
Então, a produção de L-lisina foi realizada pelo uso da cepa WCI196LCxylA/pCABD?2 com a solução de açúcar não-tratada ou a solução de açúcar tratada com resina de adsorção sintética como a fonte de carbono.
À cultura foi realizada na mesma maneira que aquela de Exemplo 13 exceto que a resina usada para o tratamento da solução de açúcar foi modificada para a resina de adsorção sintética.
Os resultados obtidos após a cultura por 10 horas . 5 — sãomostradosem Tabela 14. Tabela 14: Crescimento de células e acúmulo de L-lisina após cultura por 10 horas | Solução de açúcar de modelo reagente o ga Como um resultado, quando a solução de açúcar tratada com resina de adsorção sintética foi usada como a fonte de carbono, a quantidade de células foi melhorada 4 vezes, e o acúmulo de L-lisina foi melhorado 4,2 - vezes, em comparação com o caso de uso da solução de açúcar não-tratada : como a fonte de carbono.
Ademais, em comparação com o caso de uso da solução de açúcar de modelo reagente como a fonte de carbono, resultados substancialmente comparativos foram obtidos, i.e., a quantidade de células foi 1,1 vezes, e o acúmulo de L-lisina foi 0,8 vez.
Por estes resultados, foi demonstrado que o tratamento com resina de adsorção sintética da solução de açúcar C5 derivada da biomassa foi efetivo para melhoria de crescimento de células e de capacidade de produção de aminoácido.
Aplicabilidade industrial De acordo com a presente invenção, uma substância alvo pode ser eficientemente produzida por fermentação usando uma matéria-prima de biomassa, especialmente uma matéria-prima de biomassa não usada como alimento, tal como bagaço de cana-de-açúcar e palha de arroz.
Especificamente, a solução de açúcar obtida de acordo com a presente invenção não inibe o crescimento e o metabolismo de microorganismos, diferentemente de uma solução de açúcar contendo pentoses derivada de biomassa obtida pelos tratamento com água quente e tratamento de sacarificação convencionais.
Ademais, se a solução de açúcar obtida de acordo com a presente invenção for usada como uma fonte de carbono para fermentação, eficiência de produção de uma substância alvo é melhorada em um grau maior do que aquele da melhoria em crescimento de -. 5 microorganismo.

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para produzir uma substância alvo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microorganismo tendo uma capacidade para produzir a substância alvo em um meio, e coletar a -- 5 substânciaalvodo meio, em que : o meio contém um sacarídeo obtido ao se submeter uma matéria-prima de biomassa a um tratamento de decomposição hidrotérmica, sacarificar componentes de hemicelulose transferidos para dentro de água quente para obter uma solução de açúcar, e submeter a solução de açúcar a 10 um tratamento com um adsorvente para remover os componentes que foram adsorvidos sobre o adsorvente.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o adsorvente é selecionado do grupo consistindo de um carbono ativado, uma resina de troca aniônica, e uma resina de adsorção sintética.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que substâncias não-voláteis tendo um peso molecular de 3.000 ou menor diferentes de sacarídeos são removidas pelo tratamento com um adsorvente.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que a substância alvo é um aminoácido ou um ácido nucleico.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o microorganismo tem capacidade de assimilação de xilose.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é uma bactéria.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é Escherichia coli.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações | a 8, caracterizado pelo fato de que o tratamento de decomposição hidrotérmica Lib 5 da matéria-prima de biomassa é realizado pelo uso de água quente . pressurizada de 175ºC a 240ºC.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o tratamento de decomposição hidrotérmica da matéria-prima de biomassa é realizado pelo contato em —contracorrente da matéria-prima de biomassa com a água quente pressurizada.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o tratamento de sacarificação é realizado E com uma enzima de sacarificação.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado É 15 —pelofatode que a enzima de sacarificação é celulase ou hemicelulase.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a matéria-prima de biomassa é bagaço de cana-de-açúcar ou palha de arroz.
14. Método para produzir uma solução de açúcar, caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas de: a) submeter uma matéria-prima de biomassa a um tratamento de decomposição hidrotérmica, b) sacarificar os componentes de hemicelulose transferidos para dentro de água quente pressurizada para obter uma solução de açúcar, e c) submeter a solução de açúcar obtida a um tratamento com um adsorvente para remover os componentes que foram adsorvidos sobre o adsorvente.
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