BRPI0500892B1 - L-amino acid production transgenic bacteria of the genus escherichia, and, method for producing an l-aminoacid - Google Patents
L-amino acid production transgenic bacteria of the genus escherichia, and, method for producing an l-aminoacid Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0500892B1 BRPI0500892B1 BRPI0500892B1 BR PI0500892 B1 BRPI0500892 B1 BR PI0500892B1 BR PI0500892 B1 BRPI0500892 B1 BR PI0500892B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- amino acid
- gene
- coli
- producing
- xylose
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 119
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 title claims description 32
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 43
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-SQOUGZDYSA-N Xylose Natural products O[C@@H]1CO[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-SQOUGZDYSA-N 0.000 claims description 118
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 71
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 67
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 67
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 63
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 60
- 229960003487 Xylose Drugs 0.000 claims description 59
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 52
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 47
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 47
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 46
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 38
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 35
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 34
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 claims description 32
- 229960002885 Histidine Drugs 0.000 claims description 30
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims description 28
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 28
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims description 28
- -1 pentose sugars Chemical class 0.000 claims description 28
- 229960004799 Tryptophan Drugs 0.000 claims description 27
- 239000001963 growth media Substances 0.000 claims description 27
- 230000001965 increased Effects 0.000 claims description 22
- 230000001131 transforming Effects 0.000 claims description 11
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims description 8
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 claims description 2
- 150000001480 arabinoses Chemical class 0.000 claims 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 81
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 47
- 239000002609 media Substances 0.000 description 47
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 47
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 46
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 46
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- 150000001479 arabinose derivatives Chemical class 0.000 description 24
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 23
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 23
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 17
- 230000001976 improved Effects 0.000 description 17
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 16
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 229940021015 I.V. solution additive Amino Acids Drugs 0.000 description 13
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 13
- 229960002429 Proline Drugs 0.000 description 13
- 102100001537 CA9 Human genes 0.000 description 12
- 101710040946 CA9 Proteins 0.000 description 12
- 108020000244 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 11
- 101700051122 XYLD Proteins 0.000 description 11
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 10
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 10
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L mgso4 Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 102000006589 Alpha-ketoglutarate dehydrogenase Human genes 0.000 description 9
- 108020004306 Alpha-ketoglutarate dehydrogenase Proteins 0.000 description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 9
- 101710013413 HOM6 Proteins 0.000 description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 8
- 101710004853 THRA Proteins 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 8
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 8
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 8
- 230000002759 chromosomal Effects 0.000 description 8
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 8
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 101700078547 thrC Proteins 0.000 description 8
- 102100000499 XYLB Human genes 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 108091022071 xylulokinase Proteins 0.000 description 7
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 6
- 229960002433 Cysteine Drugs 0.000 description 6
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 6
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- 241000520272 Pantoea Species 0.000 description 6
- 241000588696 Pantoea ananatis Species 0.000 description 6
- 229960005190 Phenylalanine Drugs 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 6
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 6
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 6
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N n-butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 101700012521 rhtA Proteins 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 101710037369 HSK Proteins 0.000 description 5
- 229960000310 ISOLEUCINE Drugs 0.000 description 5
- 125000000010 L-asparaginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 5
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 5
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 5
- 125000000393 L-methionino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(SC([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 5
- 229920000978 Start codon Polymers 0.000 description 5
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101700064853 yddG Proteins 0.000 description 5
- 101710002794 BH2105 Proteins 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 4
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N L-serine Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 4
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 4
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Trimethylglycine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101700075090 XDH Proteins 0.000 description 4
- 101700047052 XYLA Proteins 0.000 description 4
- 101700051037 XYLB Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000009632 agar plate Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 101710038586 axlA Proteins 0.000 description 4
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 4
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Inorganic materials [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 101700053031 xylA2 Proteins 0.000 description 4
- 101710038554 xynBS9 Proteins 0.000 description 4
- 101700058586 AATP1 Proteins 0.000 description 3
- 108010063377 Aspartokinase Homoserine Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L Cadmium chloride Chemical compound Cl[Cd]Cl YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 210000003578 Chromosomes, Bacterial Anatomy 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- ZAQJHHRNXZUBTE-WUJLRWPWSA-N D-xylulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 3
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 3
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 3
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 3
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 3
- 150000008545 L-lysines Chemical class 0.000 description 3
- 125000000773 L-serino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])*)C([H])([H])O[H] 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 3
- 101700025361 abf2 Proteins 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N acetic acid ethyl ester Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 3
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 101700042792 xylG Proteins 0.000 description 3
- 101700011551 xylH Proteins 0.000 description 3
- 101700065758 xylR Proteins 0.000 description 3
- 101700070761 yiaB Proteins 0.000 description 3
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 2
- 108020004465 16S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 102100017225 AHI1 Human genes 0.000 description 2
- 101700009241 AHI1 Proteins 0.000 description 2
- 101710028045 AMY1A Proteins 0.000 description 2
- 102000021286 ATP binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091010258 ATP binding proteins Proteins 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 2
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 2
- GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N D-(+)-Galactose Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N 0.000 description 2
- FNZLKVNUWIIPSJ-RFZPGFLSSA-N D-xylulose 5-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-RFZPGFLSSA-N 0.000 description 2
- 101700075701 DAP Proteins 0.000 description 2
- 101710004917 Dd703_1457 Proteins 0.000 description 2
- 108010021809 EC 1.1.1.1 Proteins 0.000 description 2
- 102000007698 EC 1.1.1.1 Human genes 0.000 description 2
- 108010071598 EC 2.7.1.39 Proteins 0.000 description 2
- 108010022394 EC 4.2.3.1 Proteins 0.000 description 2
- 102000006843 EC 4.2.3.1 Human genes 0.000 description 2
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N Fructose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 2
- 101700014779 GLB1 Proteins 0.000 description 2
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 125000003338 L-glutaminyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 125000000241 L-isoleucino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])[C@@](C([H])([H])[H])(C(C([H])([H])[H])([H])[H])[H] 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 125000002068 L-phenylalanino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 108090000416 L-ribulose-5-phosphate 4-epimerases Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N Maltose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@H]1CO)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N 0.000 description 2
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 101710030456 NCKIPSD Proteins 0.000 description 2
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 108010092494 Periplasmic Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N Phosphoenolpyruvic acid Natural products OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000030951 Phosphotransferases Human genes 0.000 description 2
- 108091000081 Phosphotransferases Proteins 0.000 description 2
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 2
- 101710035823 Rsph17029_2422 Proteins 0.000 description 2
- GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N S-Aminoethyl-L-cysteine Chemical compound NCCSC[C@H](N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 206010039447 Salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 101710027038 aspC Proteins 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic Effects 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 235000005824 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 101710006741 cys-17 Proteins 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 2
- 108020001979 glutamate 5-kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000005133 glutamate 5-kinase Human genes 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 101700083182 ilvA Proteins 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 2
- 108060000012 kgd Proteins 0.000 description 2
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 101700059090 malS Proteins 0.000 description 2
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000000865 phosphorylative Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091015478 xylose binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 101700029923 yiaA Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N α-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (-)-propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- NNIFTGRSDICEMZ-GDVGLLTNSA-N (2S)-2,6-diamino-4-methylhexanoic acid Chemical compound NCCC(C)C[C@H](N)C(O)=O NNIFTGRSDICEMZ-GDVGLLTNSA-N 0.000 description 1
- NZWPVDFOIUKVSJ-YFKPBYRVSA-N (2S)-2,6-diamino-N-hydroxyhexanamide Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NO NZWPVDFOIUKVSJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KEZRWUUMKVVUPT-BYPYZUCNSA-N (2S)-2-amino-3-(dimethylamino)propanoic acid Chemical compound CN(C)C[C@H](N)C(O)=O KEZRWUUMKVVUPT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZAYJDMWJYCTABM-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-hydroxy-4-methylpentanoate Chemical compound CC(C)C(O)C(N)C(O)=O ZAYJDMWJYCTABM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTOFYLAWDLQMBZ-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumyl-3-thiophen-2-ylpropanoate Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CS1 WTOFYLAWDLQMBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDXGCVGKTPQXFA-UHFFFAOYSA-N 3-chloroazepan-2-one Chemical compound ClC1CCCCNC1=O NDXGCVGKTPQXFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- XFGVJLGVINCWDP-UHFFFAOYSA-N 5,5,5-trifluoroleucine Chemical compound FC(F)(F)C(C)CC(N)C(O)=O XFGVJLGVINCWDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-FJFJXFQQSA-N 9-β-D-arabinofuranosylguanine Chemical compound C12=NC(N)=NC(O)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 1
- 101700086422 ARAF Proteins 0.000 description 1
- 102000005416 ATP-Binding Cassette Transporters Human genes 0.000 description 1
- 108010006533 ATP-Binding Cassette Transporters Proteins 0.000 description 1
- 108091022082 Acyl transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000019632 Acyl transferases Human genes 0.000 description 1
- 229960003767 Alanine Drugs 0.000 description 1
- BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N Ammonium bisulfate Chemical compound [NH4+].OS([O-])(=O)=O BIGPRXCJEDHCLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229960005261 Aspartic Acid Drugs 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 101700000977 CAD1 Proteins 0.000 description 1
- 101700066527 CBS Proteins 0.000 description 1
- 229940106157 CELLULASE Drugs 0.000 description 1
- 102100018125 CLYBL Human genes 0.000 description 1
- 229960003563 Calcium Carbonate Drugs 0.000 description 1
- 241000222178 Candida tropicalis Species 0.000 description 1
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- PPQRONHOSHZGFQ-VPENINKCSA-N D-xylose 5-phosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- 101710018378 DLEU1 Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108060002350 DPS Proteins 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L Dipotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004530 EC 2.2.1.2 Proteins 0.000 description 1
- 102000007610 EC 2.3.1.1 Human genes 0.000 description 1
- 108010032178 EC 2.3.1.1 Proteins 0.000 description 1
- 108010058756 EC 2.4.2.17 Proteins 0.000 description 1
- 108010048581 EC 4.1.1.18 Proteins 0.000 description 1
- 101710028349 ECU11_0530 Proteins 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 108060003107 GATC Proteins 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 101710008770 HTN1 Proteins 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L Iron(II) sulfate Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BITYXLXUCSKTJS-UHFFFAOYSA-N Isopropylmalic acid Chemical compound CC(C)C(O)(C(O)=O)CC(O)=O BITYXLXUCSKTJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N L-Asparagine Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010018080 L-arabinose isomerase Proteins 0.000 description 1
- 125000001214 L-asparto group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- 125000003290 L-leucino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N L-ribopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UCORVYFPSA-N L-ribulose Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UCORVYFPSA-N 0.000 description 1
- FNZLKVNUWIIPSJ-CRCLSJGQSA-N L-ribulose 5-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 125000000205 L-threonino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])O[H] 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 1
- 108020004687 Malate Synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000035633 Metabolized Effects 0.000 description 1
- 229960004452 Methionine Drugs 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M Monopotassium phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RFMMMVDNIPUKGG-UHFFFAOYSA-N N-Acetylglutamic acid Chemical compound CC(=O)NC(C(O)=O)CCC(O)=O RFMMMVDNIPUKGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N Ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000932831 Pantoea stewartii Species 0.000 description 1
- 241000120709 Pentila Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010090127 Periplasmic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001148062 Photorhabdus Species 0.000 description 1
- 229960004063 Propylene glycol Drugs 0.000 description 1
- 241000588768 Providencia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 102100008098 TALDO1 Human genes 0.000 description 1
- 102100014437 TDO2 Human genes 0.000 description 1
- OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N Tetracycline Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O OFVLGDICTFRJMM-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- 229960002180 Tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 108020004484 Trp Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091022043 Tryptophanase Proteins 0.000 description 1
- 229960004441 Tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 1
- 101710019445 WARS1 Proteins 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N Xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 Xylitol Drugs 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 241000588901 Zymomonas Species 0.000 description 1
- 101700077780 abaB Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JJHPQGFGFRPCCH-UHFFFAOYSA-N acetic acid;butane Chemical compound CCCC.CC(O)=O JJHPQGFGFRPCCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 101700029301 araA Proteins 0.000 description 1
- 101700026697 araD Proteins 0.000 description 1
- 101700065983 araE Proteins 0.000 description 1
- 101700068371 araG Proteins 0.000 description 1
- 108060000101 argA Proteins 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 101700021706 aroP Proteins 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogens Species 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000001488 breeding Effects 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003399 chemotactic Effects 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 101700015572 ctpD Proteins 0.000 description 1
- 101700055018 cysB Proteins 0.000 description 1
- 101700036154 cysE Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710014135 exp5 Proteins 0.000 description 1
- 230000002349 favourable Effects 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 108091006088 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034448 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 125000000267 glycino group Chemical group [H]N([*])C([H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002318 immunoblotting Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N iso-propanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJHIKXHVCXFQLS-PYWDMBMJSA-N keto-D-sorbose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-PYWDMBMJSA-N 0.000 description 1
- 230000004140 ketosis Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 1
- 229960003390 magnesium sulfate Drugs 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 101700062583 ompP Proteins 0.000 description 1
- 101700083843 ompX Proteins 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000000750 progressive Effects 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 101710015455 ptsG Proteins 0.000 description 1
- 101710018447 ptsM Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001718 repressive Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 101710038424 sqv-6 Proteins 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 101710026783 thrL Proteins 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 102000035402 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005683 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000003641 trioses Chemical class 0.000 description 1
- 101710019269 trpS2 Proteins 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 101700014082 xylF Proteins 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- 101700007076 yaaX Proteins 0.000 description 1
Description
“BACTÉRIA TRANSGÊNICA PRODUTORA DB L-AMINOÁCIDO DO GÊNERO ESCHERICHIA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO” Campo Técnico A presente invenção refere-se a um método para produzir L-aminoácidos por fermentação de pentose, e mais especificamente a um método para produzir L-aminoácidos usando bactérias tendo melhorada expressão de genes de utilização de xilose por fermentação de mistura de arabinose e/ou xilose junto com glucose como uma fonte de carbono. A fonte de carbono barata, que inclui uma mistura de hexoses e pentoses de frações de hemicelulose a partir de biomassa celulósica, pode ser utilizada para a produção comercial de L-aminoácidos, por exemplo, L-histidina, L-treonína, L-lisina, ácido L-glutâmico e L-triptofano. Técnica antecedente Conveneionalmentc, L-aminoácidos tem sido produzidos industrial mente por processos de fermentação usando cepas de diferentes microorganismos. O meio de fermentação para o processo tipicamente contém quantidades suficientes de diferentes fontes de carbono e nitrogênio.
Tradicionalmente, vários carboídratos como hexoses, pentoses, trioses; vários ácidos orgânicos e álcoois tem sido usados como uma fonte de carbono. Hexoses incluem glucose, fructose, manose, sorbose, galactose e outros. Pentoses incluem arabinose, xilose, ribose e outros. No entanto, os carboídratos mencionados acima e outras fontes de carbono tradicionais, como melado, milho, cana-de-açúcar, amido, seus hidrolisados, etc,, atualmente usados na indústria são bastante caros. Assim, é desejável encontrar fontes alternativas mais baratas para a produção de L-aminoácidos. A biomassa celulósica é uma carga de alimentação favorável para a produção de L-aminoácido porque é tanto prontamente disponível quanto menos onerosa do que os carboídratos, milho, cana-de-açúcar ou outras fontes de carbono. Quantidades típicas de celulose, hemicelulose e lignina em biomassa são aproximadamente 40 - 60% de celulose, 20 - 40% de hemicelulose 10 - 25% de lignina e 10% de outros componentes. A fração celulose consiste de polímeros de um açúcar hexose, tipicamente glucose. A fração hemicelulose é completada por açúcares principalmente pentose, incluindo xilose e arabinose. A composição de várias cargas de alimentação de biomassa é mostrada na tabela 1. (http://www,ott.doe.gov/biofúels/understanding_biomass.html) Tabela 1.
Informação mais detalhada sobre a composição de acima de 150 amostras de biomassa é resumida em “Biomass Feedstock Composition and Property Database" (http://www.ott.doe.govA)iofuels/progs/buscal .cgi).
Espera-se que, no futuro próximo, seja desenvolvido um processo industrial para a conversão efetiva de biomassa celulósica em carga de alimentação de fermentação utilizável, tipicamente uma mistura de carboidratos. Assim, espera-se que aumenta, no futuro próximo, a utilização de fontes de energia renováveis, como celulose e hemicelulose para a produção de compostos utilizáveis (Aristidou, A., Pentila. M., Curr. Opin, Biotechnol, 2000, abril, 11:2,187 - 198). No entanto, uma grande maioria de artigos publicados e patentes, ou pedidos de patente, descreve a utilização de biomassa celulósica por biocatalisadores (bactérias e leveduras) para a produção de etanol, que se espera seja utilizável como um combustível alternativo. Estes processos incluem a fermentação de biomassa celulósica usando cepas diferentes modificadas de Zymomonas mobilis (Deanda K. et al, Appl. Environ. Microbiol., 1996 dezembro, 62:12,4465 - 70; Mohagheghi A. et al, Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, 98 - 100: 885 - 98; Lawford H. G., Rousseau J. D., Appl. Biochem. Biotechnol, 2002,98 - 100:429 - 48; pedidos PCT WO 95/28476, WO 98/50524), cepas modificadas de Escherichia coli (Dien B. S. et al, Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84 - 86:181 - 96; Nichols N. N. et al, Appl. Microbiol, Biotechnol, 2001 julho, 56: 1 - 2, 120 - 5;
Patente U.S. 5.000.000). Xilitol pode ser produzido por fermentação de xilose a partir de açúcares hemicelulósicos usando Candida tropicalis (Walthers T. et al, Appl Biochem. Biotechnol, 2001, 91 - 93: 423 - 35), 1,2-propanodiol pode ser produzido por fermentação de arabinose, ffuctose, galactose, glucose, lactose, maltose, sacarose, xilose, e combinação dos mesmos usando ceparecombinante de Escherichia coli (Patente U.S. 6.303.352). Também, foi mostrado que ácido 3-desidroshikímico pode ser obtido por fermentação de uma mistura de glucose/xilose/arabinose usando cepa de Escherichia coli. As maiores concentrações e rendimentos de ácido 3-desidroshikímico foram obtidos quando a mistura de glucose/xilose/arabinose foi usada como a fonte de carbono, como comparado quando ou xilose ou glucose sozinhas foram usadas como uma fonte de carbono (Kai Li e 1. W. Frost, Biotechnol. Prog., 1999, 15,876 - 883). .
Foi registrado que Escherichia coli pode utilizar pentoses como L-arabinose e D-xílose (Escherichia coli and Salmonella, segunda edição, editor chefe: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. C., 1996).
Transporte de L-arabinose na célula é realizado por dois sistemas indutíveis: (1) permease de baixa afinidade (Km a cerca de 0,1 mM) codificada por gene araE, e (2) uma afinidade elevada (Km 1 a 3 μΜ) sistema codificado por operon araFG. O gene araF codifica uma proteína de ligação periplásmica (306 aminoácidos) com função de receptor quimiotáctico e o locus araG codifica uma proteína de membrana interna. O açúcar é metabolizado por um conjunto de enzimas codificadas por operon araBAD: uma isomerase (codificada pelo gene araA), que converte reversivelmente a aldose em L-ribulose; uma quinase (codificada pelo gene araB), que fosforila a cetose em L-ribulose 5-fosfato; e L-ríbulose-5-fosfato-4-epimerase (codificada polo gene araD), que catalisa a formação de D-xilose-5-fosfato (Escherichia coli and Salmonelía, segunda edição, editor chefe: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. D., 1996). A maioria das cepas de E. coli crescem em D-xilose, mas uma mutação é necessária para a cepa K-12 crescer sobre o composto. A utilização desta pentose ocorre através de uma via indutível e repressível de catabólito envolvendo o transporte através da membrana citoplásmica por duas permeases indutíveis (não ativas em D-ribose ou D-arabinose), isomerização para D-xilulose, e fosforilação dependente de ATP da pentulose para dar D-xilulose 5-fosfato. O sistema de transporte de afinidade elevada (Km 0,3 a 3 μΜ) depende de uma proteína de ligação periplásmica (37.000 Da) e é provavelmente acionada por um composto de alta energia. O sistema de afinidade baixa (Km a cerca de 170 μΜ) é energizado por uma força motiva de prótons. Estes sistema D-xilose-próton-simport é codificado pelo gene xylE. O agrupamento de genes principal especificando a utilização de D-xilose é xylAB(RT). O gene xylA codifica a isomerase (54.000 D.a) e o gene xylB codifica a quinase (52.000 Da). O operon contém dois pontos de início de transcrição, com um dos mesmos sendo inserido a montante da matriz de leitura aberta de xylB. Porque a permease de baixa afinidade é especificada pelo xylE não ligado, o locus xylT, também chamado xylF (xylFGHR) provavelmente codifica para o sistema de transporte de alta afinidade e assim deve conter pelo menos dois genes (um para uma proteína periplásmica e um para uma proteína de membrana integral) (Escherichia coli and Salmonelía, segunda edição, editor chefe: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. C., 1996). Os genes xylFGHR codificam para os transportadores ABC de xilose, onde o gene xylF codifica a proteína de ligação de xilose putativa, o gene xylG codifica a proteína de ligação ATP putativa, o gene xylH codifica o componente de membrana putativa, e o gene xylR codifica o ativador de transcrição de xilose. A introdução dos genes de E. coli acima mencionados que codificam para L-arabinose isomerase, L-riboloquinases, L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase, xilose isomerase e xiluloquinase, além de transaldolase e transcetolase, permitem que um micróbio, como Zymomonas mobilis, metatolizem arabinose e xilose em etanol (WO/9528476, WO98/50524). Em contraste, genes Zymomonas que codificam para álcool desidrogenase (ADH) e pimvato descarboxilase (PDH) são utilizáveis para a produção de etanol por cepas de Escherichia coli (Dien B. S. et al, Appl Biochem. Biotechnol, 2000, 84 - 86:181 - 96; patente U.S. 5.000.000).
Um processo para produzir L-aminoácidos, como L-isoleucina, L-histidina, L-treonina e L-triptofano, por fermentação de uma mistura de glucose e pentoses, como arabinose e xilose, foi descrita anteriormente pelos autores da presente invenção (pedido de patente russa número 2003105269).
No entanto, atualmente, não se encontram disponíveis relatórios descrevendo bactérias tendo melhorada expressão dos genes de utilização de xilose como os do locus xylABFGHR, ou uso destes genes para a produção de L-aminoácidos a partir de uma mistura de açúcares hexose e pentose.
Sumário da invenção Um objeto da presente invenção é melhorar a produção de uma cepa produtora de L-aminoácido, de modo a prover uma bactéria produtora de L-aminoácido tendo melhorada expressão de genes de utilização de xilose, e para prover um método para produzir L-aminoácidos a partir de uma mistura de açúcares hexose, como glucose, e açúcares de pentose, como xilose ou arabinose, usando a bactéria. Uma carga de alimentação de fermentação obtida da biomassa celulósica pode ser usada como uma fonte de carbono para o meio de cultura. Este objetivo foi atingido ao se descobrir que um o locus xylABFGHR clonado em um vetor de número de cópias baixo melhora a produção de L-aminoácidos, por exemplo, L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico e L-triptofano. Um microorganismo é usado que é capaz de crescer na carga de alimentação de fermentação e é eficaz na produção de L-aminoácidos. A carga de alimentação de fermentação consiste de xilose e arabinose junto com glucose, como a fonte de carbono. As cepas produtoras de L-aminoácido são exemplificadas por cepa de Escherichia coli. Assim, a presente invenção foi completada. É um objeto da presente invenção prover uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacieriaceae que tem uma atividade melhorada de qualquer uma das enzimas de utilização de xilose da mesma. t f . E um outro objeto da presente invenção prover a bactena descrita acima, em que a bactéria pertence ao gênero Escherichia. É um outro objetivo da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que a bactéria pertence ao gênero Pantoea. É um outro objeto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que as atividades das enzimas de utilização de xilose são melhoradas por aumento da quantidade de expressão do locus xylABFGHR- É um outro objeto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que as atividades das enzimas de utilização de xilose são aumentadas por aumento do número de cópias do locus xylABFGHR ou modificação de uma seqüência de controle de expressão dos genes, de modo que a expressão dos genes é melhorada. É um outro objeto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que o número de cópias é aumentado por transformação da bactéria com um vetor de baixo número de cópias hospedando o locus xylABFGHR. É um outro objeto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que o locus xylABFGHR se origina de uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia. É um outro objeto da presente invenção prover um método para produzir L-aminoácidos, que compreende cultivar a bactéria descrita acima em um meio de cultura contendo uma mistura de açúcares glucose e pentose, e coletando o L-aminoácido do meio de cultura. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que os açúcares de pentose são arabinose e xilose. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a mistura de açúcares é uma mistura de carga de alimentação de açúcares obtidos da biomassa celulósica. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que o L-aminoácido a ser produzido é L-histidina. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a bactéria tem melhorada expressão de genes para biossíntese de L-histidina, É um outro objetivo da presente invenção prover o método descrito acima, em que o L-aminoácido a ser produzido é L-treonina. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a bactéria tem melhorada expressão de genes para biossíntese de L-treonina. É um outro objetivo da presente invenção prover o método descrito acima, em que o L-aminoácido a ser produzido é L-lisina. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a bactéria tem melhorada expressão de genes para biossíntese de L-lisina. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que o L-aminoácido a ser produzido é ácido L-glutâmicO· É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a bactéria aumentou expressão de genes para biossíntese de ácido L-glutâmico. É um outro objetivo da presente invenção prover o método descrito acima, em que o L-aminoácido a ser produzido é L-triptofano. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a bactéria tem melhorada expressão de genes para biossíntese de L-triptofano. O método para produzir L-aminoácidos inclui a produção de L-histidina por fermentação de uma mistura de açúcares glucose e pentose, como arabinose e xilose. Também, o método para produzir L-aminoácidos inclui a produção de L-treonina por fermentação de uma mistura de açúcares glicose e pentose, como arabinose e xilose. Também, o método para produzir L-aminoácidos inclui a produção de L-lisina por fermentação de uma mistura de açúcares glicose e pentose, como arabinose e xilose. Também,· o método para produzir L-aminoácidos inclui a produção de ácido L-glutâmico pela fermentação de uma mistura de açúcares de glicose e pentose, tais como arabinose e xilose. Também, o método para produzir L-aminoácidos inclui a produção de L-triptofano por fermentação de uma mistura de açúcares glicose e pentose, como arabinose e xilose. Esta mistura de açúcares glucose e pentose usados como uma carga de alimentação de fermentação pode ser obtida das fontes sub-utilizadas de biomassa de plantas, como biomassa celulósica, preferivelmente hidrolisado de celulose.
Breve descrição dos desenhos A figura 1 mostra a estrutura de locus xylABFGHR sobre o cromossomo de cepa MG1655 de E. coli. As setas no diagrama indicam as posições de iniciadores usados no PCR.
Descrição das formas de realização preferidas Na presente invenção, “bactéria produtora de L-aminoácido” significa uma bactéria, que tem a capacidade de causar o acúmulo de L-aminoácidos em um meio, quando a bactéria da presente invenção é cultivada no meio. A capacidade produtora de L-aminoácido pode ser prejudicada ou melhorada por criação. O termo “bactéria produtora de L-aminoácido” usado aqui também significa uma bactéria que é capaz de produzir e causar o acúmulo de L-aminoácidos em um meio de cultura em quantidades maiores do que uma cepa de tipo selvagem ou parental, e preferivelmente significa que o microorganismo é capaz de produzir e causar o acúmulo em um meio de uma quantidade não menor que 0,5 g/L, mais preferivelmente não menor que 1,0 g/L do L-aminoácido de marcação. “L-aminoácidos” incluem L-alanina, L-arginma, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L-valina. A família Enterobacteriaceae incluí bactéria pertencendo ao gênero Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigeüa, Morgandla Yersinia etc. Especificamente, aqueles classificados na Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada na base de dados da NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/ Taxonomy/wgetorg? mode=Tree&id= 123 6&lvl=3 &keep= 1 fesrchuiode^ 1 & unlock) pode ser usado. Uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia ou Pantoea é preferida. A frase “uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia” significa que a bactéria é classificada no gênero Escherichia de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa versada na técnica de microbiologia· Exemplos de uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia como usado na presente invenção incluem mas não estão limitados a Escherichia Coli (E-Coli). A bactéria pertencente ao gênero Escherichia que pode ser usada na presente invenção não é particularmente limitada, contudo para exemplo, bactéria descrita por Neidhart F.C. et al (.Escherichia Coli e Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabela 1) são englobadas pela presente invenção. A frase “uma bactéria que pertence ao gênero Pantoea” significa que uma bactéria é classificada como o gênero Pantoea de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa versada na técnica de microbiologia, Algumas espécies de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas como Pantoe agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii ou semelhantes, com base em análise da sequência de nucleotídeos de 16S rRNA, etc. A frase “tendo atividade melhorada de uma enzima de utilização de xilose” significa que a atividade da enzima por célula é maior do que a de uma cepa não modificada, por exemplo uma cepa de tipo selvagem. Os exemplos incluem onde o número de moléculas de enzima por célula aumenta, e onde a atividade específica por molécula de enzima aumenta, e assim em diante. Quantidade da proteína codificada pelo gene pode ser medida por métodos conhecidos incluindo SDS-PAGE seguido por ensaio de immunoblotting (análise de Western blotting) e semelhantes. Além disso, uma cepa de tipo selvagem que pode atuar como um controle inclui, por exemplo, Escherichia coli K-12.Como um resultado da melhora da atividade intracelular de uma enzima de utilização de xilose, o acúmulo de L-aminoácido, como L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico ou L-triptofano, em um meio é observado.
As “enzimas de utilização de xilose” incluem enzimas de transporte de xilose, isomerização de xilose, e fosforilação de xilose, e proteínas regulatórias. Estas enzimas incluem xilose isomerase, xiluloquinase, transportadores de xilose, e ativador de transcrição de xilose. A xilose isomerase catalisa a reação de isomerização de D-xilose em D-xilulose. A xiluloquinase catalisa a reação de fosforilação de D-xilulose usando ATP dando D-xilulose-5- fosfato e ADP. A presença de atividade de enzimas de utilização de xilose, como xilose isomerase, xiluloquinase é determinada por complementação de mutantes de E. coli negativos para xilose isomerase - ou negativos para xiluloquinase correspondentes, respectivamente. A frase “bactéria pertencendo ao gênero Escherichia significa que a bactéria é classificada como o gênero Escherichia de acordo com a classificação conhecida do versado na técnica de microbiologia. Um exemplo de um microorganismo pertencendo ao gênero Escherichia como usado na presente invenção é Escherichia coli (E. coli). A frase “aumentar a quantidade de expressão de gene(s)” significa que a quantidade de expressão de gene(s) é maior do que a de uma cepa não modificada, por exemplo uma cepa de tipo selvagem. Os exemplos desta modificação incluem o aumento do número de gene(s) expresso(s) por célula, o aumento do nível de expressão do gene(s) e assim em diante. A quantidade do número de cópias de um gene expresso é medida, por exemplo, por restrição do DNA cromossômico seguido por Southern Blotting usando uma sonda com base na sequência de genes, hibridização in situ com fluorescência (FISH), e outros. O nível da expressão de genes pode ser medido por vários métodos incluindo Northern blotting, RT-PCR quantitativo, e outros. Além disso, uma cepa tipo selvagem que pode atuar como um controle inclui, por exemplo, Escherichia coli K-12. Como um resultado da melhora da atividade intracelular de uma enzima de utilização de xilose, o acúmulo de L-ammoácido, como L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico ou L-triptofano, em um meio contendo açúcar pentose, como xilose é observado. A melhora das atividades de enzimas de utilização de xilose em uma célula bacteriana pode ser atingida por aumento da expressão dos genes que codificam para referidas enzimas. Os genes de utilização de xiilose incluem quaisquer genes derivados de bactérias da família Enterobacteriaceae, assim como genes derivados de outras bactérias como thermophilic Bacillus sp, (Bioche, MoL Bio. Int., 1996,39(5), 1049-1062). Os genes derivados de bactérias pertencendo ao gene Escherichia são preferidos. O gene codificador de xilose isomerase de E. coli (números EC 5.3.1.5) é conhecido e foi designado xylÀ (números de nucleotídeo 3727072 a 3728394 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.1, gi:16131436). O gene codificação para xiluloquinase (número EC 2.7.1.17) é conhecido e foi designado xylB (números de nucleotídeo 3725546 a 3727000 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 16131435). O gene codificação para o sistema de transporte de proteína de ligação de xilose é conhecido e foi designado xylF (números de nucleotídeo 3728760 a 3729752 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.1, gi:16131437). O gene codificação para proteína de ligação ATP putativa de sistema de transporte de xilose é conhecido e foi designado xylG (números de nucleotídeo 3729830 a 3731371 na seqüência de acesso GenBank NCJ00913.1, gi: 1613143B). O gene codificação para componente permease do sistema de transporte de xilose tipo ABC é conhecido e foi designado gene xylH (números de nucleotídeo 3731349 a 3732530 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 16131439). O gene codificador de o regulador transcricional do operon xyl é conhecido e foi designado xylR (números de nucleotídeo 3732608 a 3733786 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 16131440).Assim, os genes mencionados acima podem ser obtidos por PCR (reação de cadeia polimerase; refere-se a White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) usando iniciadores baseados na seqüência de nucleotídeos dos genes.
Os genes codificação para as enzimas de utilização de xilose de outros microorganismos podem ser similarmente obtidos. O gene xyl A de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (A) ou (B): (A) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQID NO: 2; ou (B) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos que inclui deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, e que tem uma atividade de xilose isomerase. O gene xylB de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (C) ou (D): (C) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4; ou (D) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos que inclui deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, e que tem uma atividade de xiluloquinase, O gene xylF de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (E) ou (F): (E) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6; ou (F) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos que inclui deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6, e que tem atividade para aumentar a quantidade de L-aminoácido, como L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico ou L-triptofano em um meio, quando a quantidade de proteína é aumentada em uma bactéria produtora de L-aminoácido junto com a quantidade de proteínas codificadas por genes xylAB e xylGHR. O gene xylG de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (G) ou (H): (G) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8; ou (H) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos que inclui deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8, e que tem uma atividade para aumentar a quantidade de L-aminoácido, como L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico ou L-triptofano em um meio, quando a quantidade de proteína é aumentada em uma bactéria produtora de L-amínoácido junto com a quantidade de proteínas codificadas por genes xylAB e xylFHR, O gene xylH de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (I) ou (J): (I) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10; (J) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10, e que tem uma atividade para aumentar a quantidade de L-aminoácido, como L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico ou L-triptofano em um meio, quando a quantidade de proteína é aumentada em uma bactéria produtora de L-aminoácido junto com a quantidade de proteínas codificadas por genes xylAB e xylFGR. O gene xylR de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (K) ou (L): (K) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12; (L) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, e que tem uma atividade para aumentar a quantidade de L-aminoácido, como L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico ou L-triptofano em um meio, quando a quantidade de proteína é aumentada em uma bacténa produtora de L-aminoácido junto com a quantidade de proteínas codificadas por genes xylAB e xylFGH. O DNA codificador de xilose isomerase inclui um DNA codificador de proteína que inclui deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos em uma ou mais posições da proteína (A), desde que a atividade da proteína não seja perdida. Apesar do número de “vários” aminoácidos diferir dependendo da posição ou do tipo de resíduos de aminoácidos na estrutura tri-dimensional da proteína, ele pode ser de 2 a 50, preferivelmente 2 a 20, e mais preferivelmente 2 a 10 para a proteína (A). Isto é porque alguns aminoácidos tem uma alta homologia para uma outra e substituição destes aminoácidos não afeta muito a estrutura tri-dimensional da proteína e sua atividade. Assim, a proteína (B) pode ter homologia de não menos que 30 a 50%, preferivelmente 50 a 70%, mais preferivelmente 70 -90%, ainda mais preferivelmente mais do que 90% e mais preferivelmente mais do que 95% com relação a toda a sequência de aminoácidos para xilose isomerase, e que tem a atividade de xilose isomerase. A mesma abordagem e determinação de homologia podem ser aplicados a outras proteínas (C), (E)* (G),(I)e(K).
Para avaliar o grau de proteína ou homologia de DNA, vários métodos de cálculo como busca BLAST, busca FASTA e ClustalW, podem ser usados. BLAST (Basic Local Alignment SearchTool) é o algoritmo de busca heurístico empregado pelos programas blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn, e tblastx, estes programas conferem significância ás suas descobertas usando os métodos estatísticos de Karlin, Samuel e Stephen F. Altschul (“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes”. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87: 2264 - 68; “Applications and statisties for multiple high-scoring segments in molecular sequences”. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90: 5873 - 7). O método de busca FASTA descrito por W. R. Pearson (“Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA”, Methods in Enzymology, 1990 183: 63 - 98). O método ClustalW descrito por Thompson J. D., Higgins D. G. and Gibson T. J. (“CLUSTAL W: improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic AcidsRes. 1994,22:4673 -4680).
As mudanças na proteína definida em (A), como descritas acima, são tipicamente mudanças conservativas de modo a manter a atividade da proteína. As mudanças de substituição incluem as em que pelo menos um resíduo na seqüência de aminoácido foi removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os exemplos de aminoácidos que podem ser substituídos para um aminoácido original na proteína acima e que são considerados como substituições conservativas incluem:: Ala substituído com ser ou thr; arg substituído com gin, his, ou lys; asn substituído com glu, gin, . lys, his, asp; asp substituído com asn, glu, ou gin; cys substituído com ser ou ala; gin substituído com asn, glu, lys, his, asp, ou arg; glu substituído com asn, gin, lys, ou asp; gly substituído com pro; his substituído com asn, lys> gin, arg, tyr; ile substituído com leu, met, vai, phe, leu substituído com ile, met, vai, phe; lys substituído com asn, glu, gin, his, arg; met substituído com ile, leu, vai, phe; phe substituído com trp, tyr, met, ile, ou leu; ser substituído com thr, ala; thr substituído com ser ou ala; trp substituído com phe, tyr; tyr substituído com his, phe, ou trp; e vai substituído com met, ile, leu. O DNA codificador de substancialmente a mesma proteína que a proteína definida em (A) pode ser obtido por, por exemplo, modificação da seqüência de nucleotídeos codificando pela proteína definida em (A) usando a mutagênese dirigida ao sítio de modo que um ou mais resíduos de aminoácidos serão deletados, substituídos, inseridos ou adicionados. Este DNA modificado pode ser obtido por métodos convencionais usando tratamentos com reagentes e condições gerando mutações. Estes tratamentos incluem o tratamento de DNA codificando por proteínas da presente invenção como hidroxilamina ou tratamento da bactéria hospedando o DNA e°m irradiação UV ou reagentes como N-metil-N’mitro-N-nitrosoguanidina ou ácido nitroso. O DNA que codifica para a xilose isomerase inclui variantes que podem ser encontradas em diferentes cepas de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia devido à diversidade natural. O DNA codificador destas variantes pode ser obtido por isolamento do DNA que hibridiza com o gene xylA ou uma parte do gene sob condições estrigentes, e que codifica para a proteína tendo uma atividade de xilose isomerase. A frase “condições estringentes” referida aqui inclui condições sob as quais um assim chamado híbrido específico é formado, e híbrido não específico não é formado. Por exemplo, as condições estringentes incluem condições sob as quais DTSÍAs tendo elevada homologia, por exemplo DNAs tendo homologia a não menos que 70%, preferivelmente não menos que 80%, mais preferivelmente não menos que 95% um para o outro, são hibridizados. Altemativamente, as condições estringentes são exemplificadas por condições que compreendem condições comuns de lavagem em Southern hibridização, por exemplo, 60 °C, 1 x SSC, 0,1% de SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS. Duração do procedimento de lavagem depende do tipo de membrana usada para blottíng e, como uma regra, que é recomendada pelo fabricante. Por exemplo, a duração recomendada de lavagem de membrana Hybond ™ N+ de náilon (Amersham) sob condições estringentes é de 15 minutos. Preferivelmente, a lavagem pode ser realizada 2 a 3 vezes. Uma sequência parcial da sequência de nucleotídeos de SEQID NO: 1 também pode ser usada como uma sonda para DNA que codifica para variantes e hibridiza com genes xylA. Esta sonda pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos produzidos com base na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 1, como iniciadores, e um fragmento de DNA contendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 como um gabarito. Quando um fragmento de DNA em um comprimento de cerca de 300 bp é usado como sonda, as condições de lavagem para a hibridização podem ser, por exemplo, 50 °C, 2 x SSC, e 0,1% de SDS.
Os DNAs que codificam para substancialmente as mesmas proteínas como as outras enzimas de utilização de xilose podem ser obtidos por métodos que são similares aos usados para obter xilose isomerase, como descrito acima. A transformação de uma bactéria com um DNA codificador de uma proteína significa a introdução do DNA em uma célula de bactéria, por exemplo por métodos convencionais para aumentar a expressão do gene codificador de a proteína da presente invenção e para melhorar a atividade da proteína em uma célula bacteriana. A bactéria da presente invenção também inclui uma onde a atividade da proteína da presente invenção é melhorada por transformação da referida bactéria com um DNA codificando uma proteína como definido em (A) ou (B), (C) ou (D), (E) ou (F), (G) ou (Η), (I) ou (J), e (K) ou (L), ou por alteração da seqüência de regulação da expressão de referido DNA no cromossomo da bactéria.
Um método para melhorar a expressão de genes inclui o aumento do número de cópias de genes. A introdução de um gene em nm vetor que é capaz de funcionar em uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia aumenta o número de cópias do gene. Para estes fins, vetores de múltiplas cópias podem ser preferivelmente usados. Preferivelmente, os vetores de baixo número de cópias são usados. O vetor de baixo número de cópias é exemplificado por pSClOl, pMW118, pMW119 e outros. O termo “vetor de baixo número de cópias” é usado para vetores que tem um número de cópias de até 5 cópias por célula. Os métodos de transformação incluem qualquer método bem conhecido dos versados na técnica. Por exemplo, um método para tratar células recipientes com cloreto de cálcio de modo a aumentar a permeabilidade das células para DNA foi registrado para Escherichia coli K-12 (Mandei, M. e Higa, A., J. Mol BioL, 53,159 (1970)) e pode ser usado. À melhora da expressão de genes pode ser também obtida por introdução de cópias múltiplas do gene em um cromossomo bacteriano por, por exemplo, um método de recombinação homóloga, integração Mu ou semelhantes. Por exemplo, um ciclo de integração Mu permite a introdução em um cromossomo bacteriano de até 3 cópias do gene.
Por outro lado, a melhora da expressão de genes pode ser obtida por colocação do DNA da presente invenção sob o controle de um promotor mais potente em vez do promotor nativo. A resistência de um promotor é definida pela frequência de atos de iniciação da síntese de RNA. Os métodos para avaliar a resistência de um promotor e exemplos de promotores potentes são descritos por Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates altemate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987 - 2994). Por exemplo, promotor Pr é conhecido como um promotor constitutivo potente. Outros promotores potentes conhecidos são promotor Pl, promotor lac, promotor trp, promotor trc, de fago lambda e outros. A melhora de tradução pode ser obtida por introdução de uma sequência Shine-Dalgamo mais eficaz (seqüência SD) no DNA da presente invenção em vez da seqüência SD nativa. A seqüência SD é uma região a montante do códon de partida do mRNA que interage com o 16S RNA do ribossoma (Shine J. e Dalgamo L., Proc. Natl Ácad. Sei. USA, 1974, 71,4, 1342-6). O uso de um promotor mais potente pode ser combinado com a multiplicação do método de cópias de genes.
Altemativamente, um promotor pode ser melhorado por, por exemplo, introdução de uma mutação no promotor para aumentar o nível de transcrição de um gene localizado a jusante do promotor. Além disso, sabe-se que a substituição de vários nucleotídeos em um espaçador entre o sítio de ligação de ribossoma (RBS) e o códon de partida, e particularmente as seqüências imediatamente a montante do códon de partida afetam profundamente a capacidade de tradução de mRNA. Por exemplo, uma faixa de 20 vezes nos níveis de expressão foi encontrada, dependendo da natureza dos três nucleotídeos precedendo o códon de partida (Gold et al, Annu. Rev. Microbiol., 35,365 - 403,1981; Hui et al., EMBO J., 3,623 - 629,1984). Métodos para preparação de DNA cromossômico, hibridização, PCR, preparação de plasmídeo DNA, digestão e ligação de DNA, transformação, seleção de um oligonucleotídeo como um iniciador e o outro pode ser os métodos comuns bem conhecidos dos versados na técnica. Estes métodos são descritos em Sambrook, J., e Russell D., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edítion”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), e outros. A bactéria da presente invenção pode ser obtida por introdução dos dNAs acima mencionados em uma bactéria inerentemente tendo uma capacidade para produzir L-histidina. Altemativamente, a bactéria da presente invenção pode ser obtida ao conferir uma capacidade para produzir L-histidina à bactéria já hospedando os DNAs.
Os exemplos de bactérias produtoras de L-aminoácidos pertencendo ao gênero Escherichia são descritos abaixo.
Bactérias produtoras de L-histidina Os exemplos de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia tendo capacidade de produção de L-histidina incluem cepas de bactérias produtoras de L-histidina pertencendo ao gênero Escherichia, como cepa E. coli 24 (VKPM B-5945, RU2003677); cepa E. coli 80 (VKPM B-7270, RU2119536); cepas E coli NRRL B-12116 - B12121 (US4388405); cepas E coli H-9342 (FERM BP-6675) e H-9343 (FERM BP-6676) (US6344347); cepa E. coli H-9341 (FERM BP-Ó674) (EP1085087); cepa E. coli AI80/pFM201 (US6258554) e outros.
Preferivelmente, a bactéria da presente invenção é adicionalmente modificada para intensificar a expressão de operon histidina, que preferivelmente inclui o gene hisG codificador de ATP-fosfo-ribosil-transferase cuja inibição de retroalimentação por L-histidina está dessensibilizada (Patentes Russas 200367 e 2119536), para bactérias produtoras de L-histidina.
Bactérias produtoras de L-treonina Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de L-treonina da presente invenção incluem, mas não se limitam a, bactérias produtoras de L-treonina pertencentes ao gênero Escherichia, como cepa E. coli TDH-ó/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patente U.S. 5.175.107, Patente U.S. 5.705.371), E coli cepaNRRL-21593 (Patente U.S. 5.939.307), cepa E. coli FERM BP-3756 (Patente U.S. 5.474.918), cepas E, coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente U.S. 5.376.538), cepa E coli MG422 (Gusyatiner et ai, Genetika (em russo), 14, 947-956 (1978)), cepas E. coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A), e semelhantes. A cepa TDH-6 é deficiente em gene thrC, também é assimilativa de sacarose, e o gene ilvA possui uma mutação subnormal, Esta cepa também possui uma mutação no gene rhtA, que confere resistência a concentrações altas de treonina ou homosserina. A cepa B-3996 contém o plasmídeo pVIC40 que foi obtido por inserção de um operon thrA*BC que inclui um gene thrA mutante em um vetor derivado de RSF1010. Este gene thrA codifica aspartocinase-homosserina-desidrogenase I que tem substancialmente dessensibilizado inibição de retroalimentação por treonina. A cepa B-3996 foi depositado aos 19 de novembro de 1987 no All-Union Scientifíc Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscou, Federação Russa) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa também foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Dorozhny proezd. 1, Moscou 117545, Federação Russa).
Preferivelmente, a bactéria da presente invenção é adicionalmente modificada para intensificar a expressão de um ou mais dos seguintes genes: - o gene thrA mutante que codifica aspartocinase- homosserina-desidrogenase I resistente à inibição de retroalimentação por treonina; - o gene thrB que codifica homosserina-cinase; - o gene thrC que codifica treonina-sintase; - o gene rhtA que codifica uma proteína de transmembrana putativa; - o gene asd que codifica aspartato-(i-semialdeído- desidrogenase; e - o gene aspC que codifica aspartato-amino-transferase (aspartato-transaminase).
O gene thrA que codifica aspartatocinase-homosserina-desidrogenase I de Escherichia coli tem sido elucidado (números de nucleotídeo 337 a 2799 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.2. gi: 49175990). O gene thrA está localizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K-12. O gene thrB que codifica homosserina-cinase de Escherichia coli tem sido elucidado (números de nucleotídeo 2801 a 3733 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.2. gi: 49175990). O gene thrB está localizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. coli K-12.0 gene thrC que codifica treonina-sintase de Escherichia coli tem sido elucidado (números de nucleotídeo 3734 a 5020 na seqüência de acesso GenBank NCJ300913.2. gi: 49175990). O gene thrC está localizado entre o gene thrAB e a matriz de leitura aberta yaaX no cromossomo de E. coli K-12. Todos os três genes funcionam como um único operon treonina.
Um gene thrA mutante que codifica asparto-cinase-homosserina-desidrogenase I resistente à inibição de retroalimentação por treonina, bem como os genes thrB e thrC, podem ser obtidos como um operon do plasmídeo pVIC40 bem conhecido que está presente na cepa VKPM B-3996 de E. coli produtora de treonina. Plasmídeo pVIC40 é descrito em detalhe na Patente U.S. 5.705.371. O gene rhtA existe a 18 min no cromossomo de E. coli perto do operon glnHPO que codifica componentes do sistema de transporte de glutamina, e o gene rhtA é idêntico a ORF1 (gene ybiF, números 764 a 1651 no número de acesso de GenBank AAA218541, gi: 440181), localizado entre os genes pexB e ompX. A unidade expressando uma proteína codificada por ORF1 tem sido chamada de gene rhtA (rht: resistência a homosserina e treonina). Também, foi verificado que a mutação rhtA23 é uma substituição de G por A na posição-1 com respeito ao códon de iniciação ATG (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology em conjugação com o 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, Califórnia, August 24-29,1997, abstractNo. 457, EP 1013765 A). O gene asd de E. coli já tem sido elucidado (números de nucleotídeo 3572511 a 3571408 na sequência de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 16131307), e pode ser obtido por PCR (reação em cadeia da polimerase: referir a White, T. J. et ai, Trends Genet., 5, 185 (1989)) utilizando iniciadores baseados na sequência de nucleotídeos do gene. Os genes asd de outros microorganismos podem ser obtidos em uma maneira semelhante.
Também, o gene aspC de E, coli já tem sido elucidado (números de nucleotídeo 983742 a 984932 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 161298895), e pode ser obtido por PCR. Os genes aspC de outros microorganismos podem ser obtidos em uma maneira semelhante, Bactérias produtoras de L-lisina Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina pertencentes ao gênero Escherichia incluem mutantes possuindo resistência a um análogo de L-lisina. O análogo de L-lisina inibe o crescimento de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, mas esta inibição é total ou parcialmente dessensibilizada quando L-lisina está presente em um meio, Exemplos de análogo de L-lisina incluem, mas não se limitam a, oxalisina, lisina hidroxamato, S-(2-amino-etil)-L-cisteína (AEC), y-metil-lisina, a-cloro-caprolactama, etc. Mutantes possuindo resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidos ao se submeter as bactérias pertencentes ao gênero Escherichia a um tratamento de mutagênese artificial convencional. Exemplos específicos de cepas bacterianas úteis para produzir L-lisina incluem Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; veja Patente U.S. 4.346.170) e Escherichia coli VL1611. Nestes microorganismos, inibição de retroalimentação por L-lisina é dessensibilizada. A cepa WC196 pode ser usada como uma bactéria produtora de L-lisina de Escherichia coli. Esta cepa bacteriana foi procriada ao se conferir resistência a AEC à cepa E3110, que foi derivada de Escherichia coli K-12, A cepa resultante foi chamada de cepa Escherichia coli AJ13069, e foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technologia, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) aos 6 de dezembro de 1994 e recebeu um número de acesso FERM P-14690. Então, foi convertido em um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste aos 29 de setembro de 1995, e recebeu um número de acesso FERM BP-5252 (Patente U.S. 5.827.698). Bactérias produtoras de ácido L-glutâmico Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de ácido L-glutãmico da presente invenção incluem, mas não se limitam a, bactérias produtoras de ácido L-glutâmico pertencentes ao gênero Escherichia, como cepa E. coli VL334thrC+ (EP 1172433), cepa E- coli VL334 (VKPM B-1641) é uma cepa auxotrófica produzindo L-isoleucina e L-treonina possuindo mutações nos genes thrC e UvA (Patente U.S. 4.278.765). Um alelo de tipo selvagem do gene thrC foi transferido pelo método de transdução geral usando um bacteriófago PI crescido em células de cepa E. coli K12 (VKPM B-7). Como um resultado, uma cepa VL334thrC+ (VKPM B-8961) auxotrófica em relação à L-isoleucina foi obtida. Esta cepa é capaz de produzir ácido L-glutâmico.
Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico da presente invenção incluem mutantes que são deficientes em uma atividade de α-ceto-glutarato-desidrogenase ou possuem uma atividade de α-ceto-glutarato-desidrogenase reduzida. Bactérias pertencendo ao gênero Escherichia deficientes em uma atividade de a-ceto-glutarato-desidrogenase ou possuindo uma atividade de a-ceto-glutarato-desidrogenase reduzida e métodos para a obtenção delas são descritos nas Patentes U.S. 5.378.616 e 5.573.945. Especificamente estas cepas incluem as seguintes: E. coli W3110sucA::Kmr E coli AJ12624 (FERM BP-3853) E. coli AJ12628 (FERM BP-3854) E coli AJ12949 (FERM BP-4881) E. coli W3110sucA::Rmr é obtida pela disrupção de um gene de α-ceto-glutarato-desidrogenase (daqui em diante referido como “gene sucA”) de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente em uma a-ceto-glutarato-desidrogenase.
Outros exemplos de bactérias produtoras de ácido L- glutâmico, incluem cepas mutantes pertencendo ao gênero Pantoea que são deficientes em uma atividade de α-ceto-glutarato-desidrogenase ou possuem uma atividade de α-ceto-glutarato-desidrogenase diminuída, e podem ser obtidas como descrito acima. Tais cepas incluem Pantoea ananatis AJ13356 (Patente U.S. 6.331.419), Pantoea ananatis AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technologia, Ministry of International Trade and Industry (correntemente, National Institute of Advances Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-S566, Japão) aos 19 de fevereiro de 199S e recebeu um número de acesso FERM P-16645. Foi então convertido em um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste aos 11 de janeiro de 1999, e recebeu um número de acesso FERM BP-6615. Pantoea ananatis AJ13356 é deficiente em uma atividade de a-ceto-glutarato-desidrogenase como um resultado de disrupção de um gene de subunidade KGDH-E1 (sucA). A cepa acima foi identificada como Enterobacter agglomerans quando foi isolada e depositada como Enterobacter agglomerans AJ13356. Contudo, foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis baseando-se no seqüenciamento de nucleotídeos de 16S rRNA e assim por diante. Embora AJ13356 tenha sido depositada no depósito acima mencionado como Enterobacter agglomerans, para os propósitos desta invenção, é descrita como Pantoea ananatis.
Bactérias produtoras de L-triptofano Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de L-triptofano da presente invenção incluem, mas não se limitam a, bactérias produtoras de L-triptofano pertencendo ao gênero Escherichia, como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015 /pMU91 (DSM10123) deficientes em triptofanil-tRNA-sintetase codificada por um gene trpS mutante (Patente U.S. 5.756,345); E. coli SV164 (pGH5) possuindo alelo serA livre de inibição de retroalimentação por serina (Patente U.S. 6.180.373); E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) e AGX (pGX50)aroP (NRRL B-12264) deficiente na enzima triptofanase (Patente U.S. 4.371.614); E. coli AGX17/pGX50,pACK50,pACKG4-pps na qual uma capacidade de produzir fosfoenol-piruvato é intensificada (WO 9708333, Patente U.S. 6,319.696), e semelhantes podem ser usados.
Previamente, foi identificado que o gene yddG codifica uma proteína de membrana que não está envolvida em uma rota biossintética de qualquer L-aminoácido. Também, é sabido que o gene yddG confere ao microorganismo uma resistência a L-fenil-alanina e vários análogos de aminoácido quando o alelo de tipo selvagem do gene é amplificado em um vetor de multicópias no microorganismo. Além disso, o gene yddG pode intensificar a produção de L-fenil-alanina ou L-triptofano quando cópias adicionais são introduzidas em células de cepa produtora respectiva (WO 03044192). Assim é desejável que a bactéria produtora de L-triptofano seja adicionalmente modificada para possuir expressão intensificada de matriz de leitura aberta yddG, Bactérias produtoras de L-arginina Exemplos de cepas originárias para derivação das bactérias produtoras de L-arginina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, bactérias produtoras de L-arginina, tais como cepa 237 de E.coli (VKPM B-7925) (Pedido de Patente U.S. 2002058315) e suas cepas derivadas acolhendo síntese de N-acetilglutamato mutante (Pedido de Patente Russo No. 2001112869), cepa 382 de E.coli (VKPM B-7926) (Pedido de Patente Europeu EP1170358), uma cepa produtora de arginina na qual o gene argA codificando a N-acetilglutamato sintetase é introduzido (JP 57-5693A), e semelhantes.
Bactérias produtoras de L-fenil-alanina Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de L-feml-alanina da presente invenção incluem, mas não se limitam a, bactérias produtoras de L-fenil-alanina do gênero Escheríchia, como E. coli AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197); E. coli HW1089 (ATCC 55371) hospedando o gene pheA34 (Patente U.S, 5.354.672); E. coli MWEClOl-b (KR8903681); E. coli NRRL B-12141, NRRLB-12145, NRRL B-12146 e NRRL B-12147 (Patente U.S. 4.407.952). Também, como uma cepa parental, E. coli K-12 (W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA/pPHAD] (FERM BP-12659), E, coli K-12 [W3110 (tyrA)/pHATerm] (FERM BP-12662) e E. coli K-12 [W3U0 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] chamada de AJ12604 (FERM BP-3579) podem ser usadas (EP 488424 Bl). Em adição, bactérias produtoras de L-fenil-alanina pertencendo ao gênero Escherichia com atividade intensificada de proteína codificada pelo gene yedA ou gene yddG também podem ser usadas (Pedidos de Patente U.S. 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).
Bactérias produtoras de L-cisteína Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de L-cisteína da presente invenção incluem, mas nao se limitam a, bactérias produtoras de L-cisteína do gênero Escherichia, como cepa E. coli JM14 que é transformada com diferentes alelos cysE codificadores de serina-acil-transferases resistentes à retroalimentação (Patente U.S. 6.218.168, Pedido de Patente Russa 2003121601); cepa E. coli W3110 possuindo genes superexpressados que codificam proteínas adequadas para secreção de substâncias tóxicas para células (Patente U.S. 5.972.663); cepas de E. coli possuindo atividade de cisteína-dessulfo-hidrase diminuída (JP 11-155571 A); cepa E. coli W3110 com atividade aumentada de um regulador transcricional positivo para regulon de cisteína codificado pelo gene cysB (WO 0127307A1), e semelhantes.
Bactérias produtoras de L-leucina Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de L-leucina da presente invenção incluem, mas não se limitam a, bactérias produtoras de L-leucina do gênero Escherichia, como cepas de E. coli resistentes a análogos de leucina incluindo β-2-tienil-alanina, 3-hidróxi-leucina, 4-azaleucina, 5,5,5-trifluoro-leucina (JP 62-34397B e JP 08-70879A); cepas de E. coli obtidas pelo método de engenharia genética descrito em WO 96/06926; cepa E. coli H-9068 (JP 08-70879À), e semelhantes. A bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-leucina. Exemplos incluem genes do operon leuABCD, que são preferivelmente representados por um gene leuA mutante codificador de isopropil-malato-sintase livre de inibição de retroalimentação por L-leucina (Patente U.S. 6.403.342). Em adição, a bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes codificadores de proteínas que excretam L-aminoácido da célula bacteriana. Exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (Pedido de Patente Russa 2001117632).
Bactéria produtora de L-nrolina Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de L-prolina da presente invenção incluem, mas não se limitam a, bactérias produtoras de L-prolina do gênero Escherichia, como cepa E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) que é deficiente em gene ilvA, e é capaz de produzir L-prolina (EP 1172433). A bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-prolina. Exemplos de tais genes para bactérias produtoras de L-prolina incluem o gene proB codificador de glutamato-cinase cuja inibição de retroalimentação por L-prolina está dessensibilizada (Patente DE 3127361). Em adição, a bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes codificadores de 5U proteínas excretando L-aminoácido de uma célula bacteriana. Tais genes são exemplificados pelos genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP 1239041A2).
Exemplos de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia que possuem uma atividade para produzir L-prolina incluem as seguintes cepas de E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente GB 2075056), VKPM B-8012 (Pedido de Patente Russa 2000124295), mutantes de plasmídeo descritos em Patente DE 3127361, mutantes de plasmídeo descritos por Bloom F, R. et aí (The 15* Miami Winter Symposium, 1983, p. 34), e semelhantes. ) As cepas produzindo L-aminoácido acima mencionadas podem ser ainda modificadas para melhora da taxa de assimilação de pentose ou para melhora da capacidade biossintética de L-aminoácido pelo escopo amplo dos métodos bem conhecidos dos versados na técnica. A taxa de utilização para açúcares de pentose pode ser ainda 5 melhorada por amplificação dos genes de assimilação de pentose, genes araFg e araBAD para arabinose, ou por mutações nos sistemas de assimilação de glucose (PTS e não PTS), como mutações ptsG (Nichols N, N. et al, Appl· Microbiol. BiotechnoL, 2001, julho 56:1 - 2,120-5). O processo da presente invenção inclui um processo para 10 produzir um L-aminoácido compreendendo as etapas de cultivar as bactérias produtoras de L-aminoácido em um meio de cultura, deixando o L-aminoácido se acumular no meio de cultura, e coletando o L-aminoácido do meio de cultura, em que o meio de cultura contém uma mistura de açúcares glucose e pentose. Também, o método da presente invenção inclui um método 25 para produzir L-histidina compreendendo as etapas de cultivar a bactéria produtora de L-histidina da presente invenção em um meio de cultura, deixando L-histidina se acumular no meio de cultura, e coletando L-histidina do meio de cultura, em que o meio de cultura contém uma mistura de açúcares glucose e pentose. Também, o método da presente invenção inclui um método para a produção de L-treonina compreendendo as etapas de cultivar a bactéria produtora de L-treonina da presente invenção em um meio de cultura, permitindo que L-treonina se acumule no meio de cultura, e coletar L-treonina do meio de cultura, no qual o meio de cultura contém uma mistura de glicose e açúcares de pentose. Também, o método da presente invenção inclui um método para a produção de ácido L-glutâmico compreendendo as etapas de cultivar a bactéria produtora de ácido L-glutâmico da presente invenção em um meio de cultura, permitindo que ácido L-glutâmico se acumule no meio de cultura, e colhendo ácido L-glutâmico do meio de cultura, em que o meio de cultura contém uma mistura de açúcares de glicose e pentose. Também, o método da presente invenção inclui um método para produzir L-triptofano compreendendo as etapas de cultivar a bactéria produtora de L-triptofano da presente invenção em um meio de cultura, permitindo que L-triptofano se acumule no meio de cultura, e coletar L-lisina do meio de cultura, no qual o meio de cultura contém uma mistura açúcares de glicose e pentose. A mistura de açúcares de pentose, como xilose e arabinose, junto com açúcar hexose, como glucose, pode ser obtida de fontes sub-utilizadas de biomassa. Glucose, xilose, arabinose e outros carboidratos são liberados da biomassa da planta por vapor e/ou hidrólise de ácido concentrada, hidrólise de ácido diluída, hidrólise usando enzimas, como celulase, ou tratamento com álcali. Quando o substrato é um material celulósico, a celulose pode ser hidrolisada em açúcares simultaneamente ou separadamente e também fermentada em L-aminoácido. Porque hemicelulose é geralmente mais fácil de hidrolisar em açúcares do que celulose, é preferível prehidrolisar o material celulósico, separar as pentoses e então hidrolisar a celulose por tratamento com vapor, ácido, álcali, celulases ou combinações dos mesmos para formar glucose.
Uma mistura consistindo de relações diferentes de glucose/ xilose / arabinose foi usada neste estudo para aproximar a composição de mistura de carga de alimentação de glucose e pentoses, que poderíam ser potencialmente derivadas de hidrolisados de plantas (ver seção de exemplo).
Na presente invenção, o cultivo, a coleta e a purificação de L-aminoácido do meio e outros podem ser realizados em um modo similar a um método de fermentação convencional em que o aminoácido é produzido usando um microorganismo. O meio usado para cultura pode ser ou um meio sintético ou um meio natural, desde que o meio inclua uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio e minerais e, se necessário, quantidades apropriadas de nutrientes que o microorganismo requer para o crescimento. A fonte de carbono pode incluir vários carboidratos como glucose, sacarose, arabinose, xilose e outros açúcares de pentose e hexose, que a bactéria produtora de L-aminoácido pode utilizar como uma fonte de carbono. Glucose, xilose, arabinose e outros carboidratos podem ser uma parte da mistura de carga de alimentação de açúcares obtida de biomassa celulósica.
Os açúcares de pentose apropriados para fermentação na presente invenção incluem, mas não são limitados a xilose e arabinose.
Como a fonte de nitrogênio, vários sais de amônio como amônia e sulfato de amônio, outros compostos de nitrogênio como aminas, uma fonte de nitrogênio natural como peptona, hidrolisado de soja e microorganismos fermentativos digeridos são usados. Como minerais, monofosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio, e outros são usados. Nutrientes adicionais podem ser adicionados no meio se necessário. Por exemplo, se o microorganismo requer prolina para crescimento auxotrofia de prolina(, uma quantidade suficiente de prolina pode ser adicionada ao meio para cultivo.
Preferivelmente, o cultivo é realizada sob condições aeróbicas como uma cultura em agitação, e uma cultura em agitação com aeração, a uma temperatura de 20 a 40 °C, preferivelmente 30 a 38 °C. O pH da cultura está geralmente entre 5 e 9, preferivelmente entre 6,5 e 7,2. O pH da cultura pode ser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases, e tampões. Geralmente, um cultivo de 1 a 5 dias leva ao acúmulo de L-aminoácido alvo no meio líquido.
Após cultivo, sólidos como células podem ser removidos do meio líquido por centrifugação ou filtração em membrana, e então o L-aminoácido alvo pode ser coletado e purificado por métodos de troca de íons, concentração e cristalização.
Exemplos A presente invenção será mais concretamente explicada abaixo com referência aos seguintes exemplos não limitativos.
Exemplo 1. Clonagem do locus xvlABFGHR do cromossomo de cepa E. coli MG1655.
Baseado em análise do genoma da cepa E. coli MG1655, os genes xylABFGHR podem ser clonados como um fragmento HindlII único (13,1 kb) de fragmentos cromossômicos HindlII 556 no total (fig. 1). Para este fim, uma coleção de genes foi construída usando vetor pUC19, que é capaz de sobreviver em E. coli com inserções deste tamanho.
Para construir esta coleção, DNA cromossômico de MG1655 foi digerido com HindlII restrictases e o vetor pUC19 foi digerido com Xbal restrictase. A cepa MG 1655 (ATCC47076, ATCC700926) pode ser obtida de American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA., 20110-2209, U.S.A.).
As extremidades pegajosas em ambas as preparações de DNA foram subsequentemente cheias por fragmento Klenow de modo a evitar a auto-ligação (enchimento com duas bases). Após o procedimento de ligação uma poça de plasmídeos pUC19 recombinantes foi obtida. O tamanho da coleção é maior que 200 mil clones. A coleção de genes foi analisada por PCR usando iniciadores complementes à sequência de plasmídeo e inciadores complementares ao fragmento cromossômíco de clonagem. Os fragmentos de DNA com peso molecular apropriado não foram encontrados dentre os produtos PCR, que foi interpretado como significando que o fragmento correspondendo ao operon xylABFGHR estava faltando da coleção construída. Este resultado pode ser devido à influência negativa do gene malS, e os ORFs yiaA e yiaB (com função desconhecida), que também estão presentes no fragmento HindIII de interesse. Outra razão possível para seleção negativa é o tamanho grande do locus Xyl Para superar este problema, novas coleções de genes foram construídas com base em um plasmídeo pUC19 modificado. A abordagem principal é clonar o locus Xyl como um conjunto de fragmentos sem o gene malS adjacente e ORís e yiaB.
Para este fim, um poliligador de plasmídeo pUC19 foi modificado por inserção de um fragmento de DNA sintético contendo o sítio de restrição Mlul. Duas coleções de genes foram construídas no vetor de clonagem de pUC19 modificado. A primeira coleção foi criada por digestão do DNA cromossômico de cepa MG 165 5 e pUC19 modificado com HindlA e Nlul restrictases seguido por ligação. O volume da coleção foi maior que 4.000 clones. A coleção de genes foi analisada por PCR usando iniciadores complementares à sequência de plasncádeos, e iniciadores 1 (SEQID NO: 13) e 2 (SEQ ID NO: 14) que são complementares ao fragmento xylABFG do locus xyl. Os fragmentos de DNA esperados com o peso molecular apropriado foram encontrados dentre os produtos PCR. A próxima etapa foi saturar a coleção de genes com um fragmento de interesse. Para esta finalidade, DNA da coleção de genes original foi digerido por endonucleases, sítios de restrição dos quais não existem no fragmento de interesse. Existem Eco 1471, Kpnl, Mlsl, Rrill07I, A frequência do plasmídeo de interesse na coleção enriquecida foi de 1/800 clones. A coleção enriquecida foi analisada por PCR, como acima mencionado. Após cinco enriquecimentos sequenciais da coleção, a população de células, somente dez clones contendo genes xylABFG foram encontrados. O polímero resultante contendo fragmento de DNA Hindlll - Mlul com genes xylABFG foi designado como pUC19/xylA-G. Então o fragmento Hinàlll-MphUOll contendo os ORFs yiaA e yiaB foi eliminado do plasmídeo pUC19/xylA-G; as extremidades pegajosas foram tomadas cegas por fragmento Klenow e um ligador sintético contendo um sítio de restrição EcoBl foi inserido por ligação. Assim, o plasmídeo pUC19/xylA-G-2 foi obtido. Então, o plasmídeo pUC19/xylA-G-2 resultante foi cortado por EheI restrictase, as extremidades pegajosas foram tomadas cegas por fragmento Klenow e um ligador sintético contendo um sítio de restrição Hindlll foi inserido por ligação. Assim o plasmídeo pUC19/xylA-G-3 foi obtido. Um sítio de restrição Hindlll foi inserido com o fragmento de DNA restante contendo genes xylHR, resultando no locus xyl completo. A segunda coleção foi criada por digestão do DNA cromossômico de cepa MG1655 e um pUC19 modificado com Pstl e MM restrictases, seguido por ligação, o volume da coleção foi maior que 6.000 clones. A coleção de genes foi analisada por PCR usando iniciadores complementares á seqüência de plasmídeos e iniciadores 3 (SEQID NO: 15) e 4 (SEQ ID NO: 16), que são complementares ao fragmento cromossômico de clonagem. Os fragmentos de DNA com peso molecular apropriado foram encontrados dentre os produtos PCR. A próxima etapa foi uma subdivisão seqüencial da coleção de genes na população de células com tamanho conhecido, acompanhado por análise PCR. Após sete subdivisões seqüenciais da coleção, a população de células contendo genes xylHR continha somente dez clones. Dentre esta população, um fragmento de DNA de interesse foi encontrado por análise de restrição. O plasmídeo resultante contendo fragmento de DNA Pstl- Mlul com genes xylHR foi designado como pUC19/xylHR. Então, o fragmento de DNA Hinâlíl-MM do plasmídeo pUC19/xylHR foi ligado no plasmídeo pUC19/xylA-G-3, que tinha sido previamente tratado com Hináíil e MM restrictases. Finalmente, o locus completo xyl de cepa MG1655 foi obtido. O plasmídeo de múltiplas cópias resultante contendo o locus completo xylABFGHR foi designado pUC19/xylA-R.
Então o fragmento de DNA ifmdlII-EcoRl do plasmídeo pUC19/xylA-R foi reclonado no vetor pMW199mod de baixo número de cópias, que tinha sido previamente digerido com Hinà\ll e EcoRI restrictases, resultando em um plasmídeo pMW119mod-xylA-R que continha o locus xylABFGHR completo. O vetor de baixo número de cópias pMW199mod foi obtido de vetor pMW119 comercialmente disponível por eliminação de fragmento Pvuíl- Pvull. Este fragmento contém o sítio de múltipla clonagem e foi a parte principal do gene lacZ.O gene lacZ contém sítios para repressor lacl seguido por inserção de ligador sintético contendo sítios EcoRl e HinâJll, que são necessários para inserção de locus xylABFGHR do plasmídeo pUC19/xylA-R.
Exemplo 2: Produção de L-histidina por bactéria produtora de L-histidina a partir da fermentação de uma mistura de glucose e pentoses.
Cepa de E. coli 80 produzindo L-histidina foi usada como uma cepa para produção de L-histidina por fermentação de uma mistura de glucose e pentoses. A cepa E. coli 80 (VKPM B-7270) é descrito em detalhes na patente russa número RU2119536 e foi depositada junto ao Russian National Collection of Industrial Microorganisms (Rússia, 113545 Moscow, lst Dorozhny proezd, 1) em 15 de outubro de 1999 sob número de acesso VRPM B-7270. Então, ela foi transferida para um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 12 de julho de 2004. Transformação de cepa 80 com o plasmídeo pMWl 19mod-xylA-R foi realizada por métodos comuns, dando a cepa 80/pMWl 19mod-xylA-R.
Para obter a cultura da semente, ambas cepas 80 e 80/pMWl 19mod-xylA-R foram cultivadas em um agitador rotativo (250 rpm) a 27 °C durante 6 horas em tubos de teste de 40 ml (0 18 mm) contendo 2 ml de L-caldo com 1 g/1 de estreptomicina, Para a cepa 80/pMW119mod-xylA-R, 100 mg/1 ampicilina foram adicionalmente adicionados. Então, 2 ml (5%) de semente de material foram inoculados no meio de fermentação. A fermentação foi realizada em um agitador giratório (250 rpm) a 27 °C durante 65 horas em tubos de teste de 40 ml contendo 2 ml de meio de fermentação.
Após cultivo, a quantidade de L-histidma que tinha acumulado no meio de cultura foi determinada por cromatografia em papel. A composição da fase móvel é a seguinte: butanol: acetato: água = 4:1:1 (v/v), Uma solução (0,5%) de ninhidrína em acetona foi usada como um reagente visualizante. Os resultados são apresentados na tabela 2. A composição do meio de fermentação (g/1): Carboidratos (total) 100,0 Mameno 0,2 de TN (nitrogênio total) (hidrolisado de soja) L-prolina 0,8 (NH4)2S04 25,0 K2HP04 2,0 MgS04-7H20 1,0 FeS04-7H20 0,01 MnS04-5H20 0,01 HCldetiamina 0,001 Betaína 2,0 CaC03 6,0 Estreptomicina 1,0 Carboidratos (glucose, arabinose, xilose), L-prolina, betaína e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaC03 seco por calor é esterilizado a 110 °C durante 30 minutos. O pH é ajustado a 6,0 por KOH antes da esterilização. Como pode ser visto na tabela 2, expressão aumentada do locus de xyLABFGHR melhorou a produtividae da cepa SO de E. Coli produtora de L-histidina, cultivada no meio contendo xilose.
Tabela 2 Exemplo 3. Produção de L-treonina por fermentação de uma mistura de glicose e pentoses usando bactéria produtora de L-treonina Cepa B-3996 de E. coli produzindo L-treonina foi usada para avaliar a produção de L-treonina por fermentação de uma mistura de glicose e pentose. Transformação da cepa B-3996 com o plasmídeo pMW119mod-xylA-R e o vetor pMWl 19 foi realizada por método ordinário usando CaCl2, dando cepas 3996/pMWl 19mod-xylA-R e 3996/pMWl 19, respectivamente.
Ambas as cepas 3996/pMWl 19mod-xylA-R e 3996/pMWl 19 de E. coli foram crescidas por 12-15 horas a 37°C sobre placas de ágar contendo estreptomicina (50 mg/L) e ampicilina (150 mg/L). Então, o meio de fermentação contendo xilose (4%) como uma fonte de carbono foi inoculado com uma alça de cepas. A fermentação foi realizada em 2 mL de meio de fermentação contendo estreptomicina (50 mg/L) em tubos de ensaio de 20 x 200 mm. Células foram crescidas por 25 horas a 32°C com agitação a 250 rpm.
Após cultivo, a quantidade de L-treonina que foi acumulada no meio foi determinada por cromatografia em papel usando a seguinte fase móvel: butanol: ácido acético: água = 4: 1: 1 (v/v). Uma solução (2%) de ninhidrina em acetona foi usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo L-treonina foi cortada. L-treonina foi eluída em solução aquosa de CdCl2 a 0,5%, e a quantidade de L-treonina foi estimada espectrofotometricamente a 540 nm. Os resultados são apresentados na Tabela 3. A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente, CaC03 seco por calor é esterilizado a 180°C por 2 h. O pH é ajustado para 7,0, Antibiótico é introduzido no meio após a esterilização.
Tabela 3 Como pode ser visto da Tabela 3, expressão aumentada do locus xylÁBFGHR melhorou a produtividade da cepa Β-3996/pMWl 19 de E. coli produzindo L-treonina cultivada no meio contendo xilose.
Exemplo 4. Produção de L-lisina nor fermentação de uma mistura de glicose e pentoses usando bactéria produtora de L-lisina Cepa WC196AcadA Aidc foi usada para evaliar a produção de L-lisina por fermentação de uma mistura de glicose e pentose. Cepa WC196AcadA Aldc foi obtida da cepa WX196 por inativação de lisina-descarboxilases codificadas pelo gene UcC e gene cadA como descrito na Patente U.S. 5.827.698. Transformação da cepa WC196AcadA Aldc com o plasmídeo pMWl 19mod-xylA-R e o vetor pMWl 19 foi realizada por método ordinário usando CaCl2, dando cepas WC196AcadA Aldc/pMW119mod-xylA-R e WC196AcadA Aldc/pMW119, respectivamente.
Ambas as cepas WC196AcadA Aldc/pMWl 19 e WC196AcadA Aldc/pMWl 19mod-xylA-R de E. coli foram crescidas por 1215 horas a 37°C sobre placas de ágar contendo ampicilina (150 mg/L). Então, o meio de fermentação contendo quer xilose (4%) quer mistura de xilose (2%) / glicose (2%) como uma fonte de carbono foram inoculadas com uma alça de cepas. A fermentação foi realizada em 2 mL de meio de fermentação em tubos de ensaio de 20x200 mm. Células foram crescidas por 25 horas a 32°C com agitação a 250 rpm.
Após cultivo, a quantidade de L-lisina que foi acumulada no meio foi determinada por cromatografia em papel usando a seguinte fase móvel: butanol: ácido acético: água = 4: 1: 1 (v/v). Uma solução (2%) de ninhidrina em acetona foi usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo L-lisina foi cortada. L-Lisina foi eluída em solução aquosa de CdCl2 a 0,5%, e a quantidade de L-Lisina foi estimada espectrofotometricamente a 540 nm. Os resultados são apresentados na Tabela 4. A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente, CaC03 seco por calor é esterilizado a 180°C por 2 h. O pH é ajustado para 7,0 com KOH. Antibiótico é introduzido no meio após a esterilização.
Tabela 4 Como pode ser visto da Tabela 4, expressão aumentada do locus xylABFGHR melhorou a produtividade da cepa WC196AcadA Aldc/pCABD2/pMWl 19 de E. coli produzindo L-lisina cultivada no meio contendo xilose.
Exemplo 5: Produção de ácido L-glutâmico pela fermentação de uma mistura de glicose e pentoses usando bactéria produtora de ácido L-glutâmico. A cepa AJ12624 de E.Coli produtora de ácido L-glutâmico foi usada para avaliar a produção de ácido L-glutâmico pela fermentação de uma mistura de glicose e pentose. Transformação da cepa AJ12624 com o plasmídeo de pMW119mod-xylA-R e vetor pMW119 foi realizada pelo método ordinário usando CaCl2, produzindo cepas AJ12624/pMW119mod-xylA-R e AJ12624/pMWl 19, respectivamente.
Ambas as cepas de E. coli AJ12624/pMW119 e AJ 12624/ pMW119mod-xylA-R foram crescidas por 12-15 horas a 37°C em placas de L-agar contendo ampicilina (150 mg/1). Então, o meio de fermentação contendo xilose (4%) como uma fonte de carbono foi inoculado com uma alça de cepas. A fermentação foi realizada em 2 ml de meio de fermentação em tubos de ensaio 10x200 mm. Células foram crescidas por 48 horas a 32°C com agitação a 250 rpm.
Após o cultivo, a quantidade de ácido L-glutâmico que foi acumulada no meio foi determinada por cromatografia de papel usando a seguinte fase móvel: butanohácido acético:água = 4:1:1 (v/v). Uma solução (2%) de ninidrina em acetona foi usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo ácido L-glutâmico foi cortada, ácido L-glutãmico foi eluído em uma solução aquosa a 0,5% de CdCl2, e a quantidade de ácido L-glutâmico foi estimada espectrofotometricamente a 540 nm. Os resultados são apresentados na Tabela 5. A composição do meio de fermentação (g/1): Carboidratos 40,0 (NH4)2S04 25,0 KH2P04 2,0 MgS04.7H20 1,0 HCldeTiamina 0,0001 L-isoleucina 0,07 CaC03 25,0 Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCOa esterilizado por calor a seco a 180°C por 2 h. pH é ajustado para 7,2. Tabela 5 Como pode ser visto da Tabela 5, expressão aumentada do locus xylABFGHR melhorou a produtividade da cepa AJ12624/pMW119 de E. coli produzindo ácido L-glutâmico cultivada no meio contendo xilose. Exemplo 6: Produção de L-triptofano por fermentação de uma misturajje glicose e pentoses usando bactéria produtora de L-triptofano Cepa SV164/pGH5 de E, coli produzindo L-triptofano foi usada para avaliar a produção de L-triptofano por fermentação de uma mistura de glicose e pentose. Transformação da cepa SV164/pGH5 com o plasmídeo pMWl 19mod-xylA-R e o vetor pMWl 19 foi realizada por método ordinário usando CaCl2, dando cepas SV164/pGH5/pMW 119mod-xyl A-R e SV164/pGH5/pMW 119, respectivamente.
Ambas as cepas SV164/pGH5/pMW119 e SV164/pGH5/pMW119mod-xylA-R de E. coli foram crescidas por 12-15 horas a 37°C sobre placas de ágar contendo tetraciclina (30 mg/L) e ampicilina (150 mg/L). Então, o meio de fermentação contendo quer xilose (4%) quer mistura de xilose (2%) / glicose (2%) como uma fonte de carbono foram inoculadas com uma alça de cepas. A fermentação foi realizada em 2 mL de meio de fermentação contendo estreptomicina (50 mg/L) em tubos de ensaio de 20x200 mm. Células foram crescidas por 48 horas a 302°C com agitação a 250 rpm.
Após cultivo, a quantidade de L-triptofano que foi acumulada no meio foi determinada por TLC, placas de TLC de 10 cm x 15 cm revestidas com camadas de 0,11 mm de gel de sílica Sorbfil sem indicador fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Kranosdar, Rússia). As placas Sorbfil podem ser desenvolvidas com uma fase móvel: propan-2-ol: acetato de etila: amônia aquosa 25%: água = 40: 40: 7: 16 (v/v). Uma solução (2%) de ninhidrina em acetona foi usada como um reagente de visualização. Os resultados são apresentados na Tabela 7. Os componentes do meio de fermentação são mostrados na Tabela 5, mas devem ser esterilizados em grupos separados A, B, C, D, E, F, e H, como mostrado, para evitar interações adversas durante a esterilização.
Tabela 6:___________________________ __________________________________ | Solução A teve pH 7,1 ajustado por NH4OH.
Tabela 7______________________________________________________________________ Como pode ser visto da Tabela 7, expressão aumentada do locus xylABFGHR melhorou a produtividade da cepa SV164/pGH5/pMWl 19 de E. coli produzindo L-triptofano cultivada no meio contendo xilose.
Apesar da invenção ter sido descrita em detalhes com referência às formas de realização preferidas da mesma, será evidente para os versados na técnica que várias mudanças podem ser feitas, e equivalentes empregados, sem sair do escopo da invenção. Cada um dos documentos acima mencionados é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
REIVINDICAÇÕES
Claims (10)
1. Bactéria transgênica produtora de L-aminoãcido do gênero Escherichia, caracterizada pelo falo de que a referida bactéria lem uma expressão aumentada dos genes do locus xylABFGHR por transformação com um vetor compreendendo os genes do locus xylABFGHR que se origina de uma bactéria pertencendo ao gênero Esdwrichkt, ou por modificação de um promotor ou sequência Shine-Dalgamo do locus xylABFGHR, em que os genes do locus xylABFGHR compreendem as sequências de nucleotídcos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11.
2. Bactéria transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a bactéria é transformada com um vetor de baixo número de cópias hospedando o locus xylABFGHR.
3. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a bactéria transgênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em um meio de cultura contendo uma mistura de açúcares glucose e pentose, e coletar o L-aminoácido do meio de cultura.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os açúcares de pentose são arabinose e xilose.
5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a mistura de açúcares é uma mistura de carga de alimentação de açúcares obtidos da bi o massa celulósica.
6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato dc que o L-aminoácido a ser produzido c L-histidina.
7. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido a ser produzido é L-treonina.
8. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido a ser produzido é L-lisina.
9. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido a ser produzido é ácido L-glutâmico.
10. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido a ser produzido é L-triptofano.
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8003367B2 (en) | Method for producing L-amino acids by fermentation using bacteria having enhanced expression of xylose utilization genes | |
US7422880B2 (en) | Method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family having a pathway of glycogen biosynthesis disrupted | |
EP1828396B1 (en) | Method for producing l-amino acids using bacteria of the enterobacteriaceae family | |
US7811798B2 (en) | Method for producing an L-amino acid by fermentation using a bacterium having an enhanced ability to utilize glycerol | |
US8137938B2 (en) | Method for producing an L-amino acid | |
BRPI0715584B1 (pt) | método para produzir um l-aminoácido | |
BRPI0807756B1 (pt) | Método para produzir l-lisina e/ou l-treonina | |
BR102017020967A2 (pt) | método para produzir um l-aminoácido | |
BRPI1100666B1 (pt) | método para produzir um l-aminoácido | |
US20090209011A1 (en) | Method for Producing an L-Amino Acid Using a Bacterium of the Enterobacteriaceae Family With Enhanced Expression of the fucPIKUR Operon | |
BR102018005065A2 (pt) | Método para produzir um l-aminoácido | |
US20090155861A1 (en) | Method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family | |
BR112016007182B1 (pt) | Método para produzir um l-aminoácido | |
BR102014009838B1 (pt) | Método para produzir um l-aminoácido | |
BR122012013081B1 (pt) | Método para produzir um l-aminoácido | |
BR102016012032A2 (pt) | Método para produzir um l-aminoácido | |
JP7524909B2 (ja) | L-アミノ酸の製造方法 | |
JP2010263789A (ja) | L−アミノ酸生産菌及びl−アミノ酸の製造法 | |
RU2471868C2 (ru) | Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот | |
CN1749390B (zh) | 使用木糖利用基因表达增强的细菌进行发酵以生产l—氨基酸的方法 | |
CA2595501A1 (en) | A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family having a pathway of glycogen biosynthesis disrupted | |
RU2283346C1 (ru) | Способ получения l-аминокислот методом ферментации с использованием бактерий, обладающих повышенной экспрессией генов утилизации ксилозы | |
EP1853714B1 (en) | Method for producing l-amino acids using bacterium of the enterobacteriaceae family | |
BRPI1005716A2 (pt) | métodos para produzir uma solução de açúcar e para produzir uma substância alvo | |
RU2304615C2 (ru) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia |