BRPI0500892B1

BRPI0500892B1 - L-amino acid production transgenic bacteria of the genus escherichia, and, method for producing an l-aminoacid

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Publication number: BRPI0500892B1
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Publication date: 2017-08-15

Description

“BACTÉRIA TRANSGÊNICA PRODUTORA DB L-AMINOÁCIDO DO GÊNERO ESCHERICHIA, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO” Campo Técnico A presente invenção refere-se a um método para produzir L-aminoácidos por fermentação de pentose, e mais especificamente a um método para produzir L-aminoácidos usando bactérias tendo melhorada expressão de genes de utilização de xilose por fermentação de mistura de arabinose e/ou xilose junto com glucose como uma fonte de carbono. A fonte de carbono barata, que inclui uma mistura de hexoses e pentoses de frações de hemicelulose a partir de biomassa celulósica, pode ser utilizada para a produção comercial de L-aminoácidos, por exemplo, L-histidina, L-treonína, L-lisina, ácido L-glutâmico e L-triptofano. Técnica antecedente Conveneionalmentc, L-aminoácidos tem sido produzidos industrial mente por processos de fermentação usando cepas de diferentes microorganismos. O meio de fermentação para o processo tipicamente contém quantidades suficientes de diferentes fontes de carbono e nitrogênio.

Tradicionalmente, vários carboídratos como hexoses, pentoses, trioses; vários ácidos orgânicos e álcoois tem sido usados como uma fonte de carbono. Hexoses incluem glucose, fructose, manose, sorbose, galactose e outros. Pentoses incluem arabinose, xilose, ribose e outros. No entanto, os carboídratos mencionados acima e outras fontes de carbono tradicionais, como melado, milho, cana-de-açúcar, amido, seus hidrolisados, etc,, atualmente usados na indústria são bastante caros. Assim, é desejável encontrar fontes alternativas mais baratas para a produção de L-aminoácidos. A biomassa celulósica é uma carga de alimentação favorável para a produção de L-aminoácido porque é tanto prontamente disponível quanto menos onerosa do que os carboídratos, milho, cana-de-açúcar ou outras fontes de carbono. Quantidades típicas de celulose, hemicelulose e lignina em biomassa são aproximadamente 40 - 60% de celulose, 20 - 40% de hemicelulose 10 - 25% de lignina e 10% de outros componentes. A fração celulose consiste de polímeros de um açúcar hexose, tipicamente glucose. A fração hemicelulose é completada por açúcares principalmente pentose, incluindo xilose e arabinose. A composição de várias cargas de alimentação de biomassa é mostrada na tabela 1. (http://www,ott.doe.gov/biofúels/understanding_biomass.html) Tabela 1.

Informação mais detalhada sobre a composição de acima de 150 amostras de biomassa é resumida em “Biomass Feedstock Composition and Property Database" (http://www.ott.doe.govA)iofuels/progs/buscal .cgi).

Espera-se que, no futuro próximo, seja desenvolvido um processo industrial para a conversão efetiva de biomassa celulósica em carga de alimentação de fermentação utilizável, tipicamente uma mistura de carboidratos. Assim, espera-se que aumenta, no futuro próximo, a utilização de fontes de energia renováveis, como celulose e hemicelulose para a produção de compostos utilizáveis (Aristidou, A., Pentila. M., Curr. Opin, Biotechnol, 2000, abril, 11:2,187 - 198). No entanto, uma grande maioria de artigos publicados e patentes, ou pedidos de patente, descreve a utilização de biomassa celulósica por biocatalisadores (bactérias e leveduras) para a produção de etanol, que se espera seja utilizável como um combustível alternativo. Estes processos incluem a fermentação de biomassa celulósica usando cepas diferentes modificadas de Zymomonas mobilis (Deanda K. et al, Appl. Environ. Microbiol., 1996 dezembro, 62:12,4465 - 70; Mohagheghi A. et al, Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, 98 - 100: 885 - 98; Lawford H. G., Rousseau J. D., Appl. Biochem. Biotechnol, 2002,98 - 100:429 - 48; pedidos PCT WO 95/28476, WO 98/50524), cepas modificadas de Escherichia coli (Dien B. S. et al, Appl. Biochem. Biotechnol, 2000, 84 - 86:181 - 96; Nichols N. N. et al, Appl. Microbiol, Biotechnol, 2001 julho, 56: 1 - 2, 120 - 5;

Patente U.S. 5.000.000). Xilitol pode ser produzido por fermentação de xilose a partir de açúcares hemicelulósicos usando Candida tropicalis (Walthers T. et al, Appl Biochem. Biotechnol, 2001, 91 - 93: 423 - 35), 1,2-propanodiol pode ser produzido por fermentação de arabinose, ffuctose, galactose, glucose, lactose, maltose, sacarose, xilose, e combinação dos mesmos usando ceparecombinante de Escherichia coli (Patente U.S. 6.303.352). Também, foi mostrado que ácido 3-desidroshikímico pode ser obtido por fermentação de uma mistura de glucose/xilose/arabinose usando cepa de Escherichia coli. As maiores concentrações e rendimentos de ácido 3-desidroshikímico foram obtidos quando a mistura de glucose/xilose/arabinose foi usada como a fonte de carbono, como comparado quando ou xilose ou glucose sozinhas foram usadas como uma fonte de carbono (Kai Li e 1. W. Frost, Biotechnol. Prog., 1999, 15,876 - 883). .

Foi registrado que Escherichia coli pode utilizar pentoses como L-arabinose e D-xílose (Escherichia coli and Salmonella, segunda edição, editor chefe: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. C., 1996).

Transporte de L-arabinose na célula é realizado por dois sistemas indutíveis: (1) permease de baixa afinidade (Km a cerca de 0,1 mM) codificada por gene araE, e (2) uma afinidade elevada (Km 1 a 3 μΜ) sistema codificado por operon araFG. O gene araF codifica uma proteína de ligação periplásmica (306 aminoácidos) com função de receptor quimiotáctico e o locus araG codifica uma proteína de membrana interna. O açúcar é metabolizado por um conjunto de enzimas codificadas por operon araBAD: uma isomerase (codificada pelo gene araA), que converte reversivelmente a aldose em L-ribulose; uma quinase (codificada pelo gene araB), que fosforila a cetose em L-ribulose 5-fosfato; e L-ríbulose-5-fosfato-4-epimerase (codificada polo gene araD), que catalisa a formação de D-xilose-5-fosfato (Escherichia coli and Salmonelía, segunda edição, editor chefe: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. D., 1996). A maioria das cepas de E. coli crescem em D-xilose, mas uma mutação é necessária para a cepa K-12 crescer sobre o composto. A utilização desta pentose ocorre através de uma via indutível e repressível de catabólito envolvendo o transporte através da membrana citoplásmica por duas permeases indutíveis (não ativas em D-ribose ou D-arabinose), isomerização para D-xilulose, e fosforilação dependente de ATP da pentulose para dar D-xilulose 5-fosfato. O sistema de transporte de afinidade elevada (Km 0,3 a 3 μΜ) depende de uma proteína de ligação periplásmica (37.000 Da) e é provavelmente acionada por um composto de alta energia. O sistema de afinidade baixa (Km a cerca de 170 μΜ) é energizado por uma força motiva de prótons. Estes sistema D-xilose-próton-simport é codificado pelo gene xylE. O agrupamento de genes principal especificando a utilização de D-xilose é xylAB(RT). O gene xylA codifica a isomerase (54.000 D.a) e o gene xylB codifica a quinase (52.000 Da). O operon contém dois pontos de início de transcrição, com um dos mesmos sendo inserido a montante da matriz de leitura aberta de xylB. Porque a permease de baixa afinidade é especificada pelo xylE não ligado, o locus xylT, também chamado xylF (xylFGHR) provavelmente codifica para o sistema de transporte de alta afinidade e assim deve conter pelo menos dois genes (um para uma proteína periplásmica e um para uma proteína de membrana integral) (Escherichia coli and Salmonelía, segunda edição, editor chefe: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. C., 1996). Os genes xylFGHR codificam para os transportadores ABC de xilose, onde o gene xylF codifica a proteína de ligação de xilose putativa, o gene xylG codifica a proteína de ligação ATP putativa, o gene xylH codifica o componente de membrana putativa, e o gene xylR codifica o ativador de transcrição de xilose. A introdução dos genes de E. coli acima mencionados que codificam para L-arabinose isomerase, L-riboloquinases, L-ribulose 5-fosfato 4-epimerase, xilose isomerase e xiluloquinase, além de transaldolase e transcetolase, permitem que um micróbio, como Zymomonas mobilis, metatolizem arabinose e xilose em etanol (WO/9528476, WO98/50524). Em contraste, genes Zymomonas que codificam para álcool desidrogenase (ADH) e pimvato descarboxilase (PDH) são utilizáveis para a produção de etanol por cepas de Escherichia coli (Dien B. S. et al, Appl Biochem. Biotechnol, 2000, 84 - 86:181 - 96; patente U.S. 5.000.000).

Um processo para produzir L-aminoácidos, como L-isoleucina, L-histidina, L-treonina e L-triptofano, por fermentação de uma mistura de glucose e pentoses, como arabinose e xilose, foi descrita anteriormente pelos autores da presente invenção (pedido de patente russa número 2003105269).

No entanto, atualmente, não se encontram disponíveis relatórios descrevendo bactérias tendo melhorada expressão dos genes de utilização de xilose como os do locus xylABFGHR, ou uso destes genes para a produção de L-aminoácidos a partir de uma mistura de açúcares hexose e pentose.

Sumário da invenção Um objeto da presente invenção é melhorar a produção de uma cepa produtora de L-aminoácido, de modo a prover uma bactéria produtora de L-aminoácido tendo melhorada expressão de genes de utilização de xilose, e para prover um método para produzir L-aminoácidos a partir de uma mistura de açúcares hexose, como glucose, e açúcares de pentose, como xilose ou arabinose, usando a bactéria. Uma carga de alimentação de fermentação obtida da biomassa celulósica pode ser usada como uma fonte de carbono para o meio de cultura. Este objetivo foi atingido ao se descobrir que um o locus xylABFGHR clonado em um vetor de número de cópias baixo melhora a produção de L-aminoácidos, por exemplo, L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico e L-triptofano. Um microorganismo é usado que é capaz de crescer na carga de alimentação de fermentação e é eficaz na produção de L-aminoácidos. A carga de alimentação de fermentação consiste de xilose e arabinose junto com glucose, como a fonte de carbono. As cepas produtoras de L-aminoácido são exemplificadas por cepa de Escherichia coli. Assim, a presente invenção foi completada. É um objeto da presente invenção prover uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacieriaceae que tem uma atividade melhorada de qualquer uma das enzimas de utilização de xilose da mesma. t f . E um outro objeto da presente invenção prover a bactena descrita acima, em que a bactéria pertence ao gênero Escherichia. É um outro objetivo da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que a bactéria pertence ao gênero Pantoea. É um outro objeto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que as atividades das enzimas de utilização de xilose são melhoradas por aumento da quantidade de expressão do locus xylABFGHR- É um outro objeto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que as atividades das enzimas de utilização de xilose são aumentadas por aumento do número de cópias do locus xylABFGHR ou modificação de uma seqüência de controle de expressão dos genes, de modo que a expressão dos genes é melhorada. É um outro objeto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que o número de cópias é aumentado por transformação da bactéria com um vetor de baixo número de cópias hospedando o locus xylABFGHR. É um outro objeto da presente invenção prover a bactéria descrita acima, em que o locus xylABFGHR se origina de uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia. É um outro objeto da presente invenção prover um método para produzir L-aminoácidos, que compreende cultivar a bactéria descrita acima em um meio de cultura contendo uma mistura de açúcares glucose e pentose, e coletando o L-aminoácido do meio de cultura. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que os açúcares de pentose são arabinose e xilose. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a mistura de açúcares é uma mistura de carga de alimentação de açúcares obtidos da biomassa celulósica. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que o L-aminoácido a ser produzido é L-histidina. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a bactéria tem melhorada expressão de genes para biossíntese de L-histidina, É um outro objetivo da presente invenção prover o método descrito acima, em que o L-aminoácido a ser produzido é L-treonina. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a bactéria tem melhorada expressão de genes para biossíntese de L-treonina. É um outro objetivo da presente invenção prover o método descrito acima, em que o L-aminoácido a ser produzido é L-lisina. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a bactéria tem melhorada expressão de genes para biossíntese de L-lisina. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que o L-aminoácido a ser produzido é ácido L-glutâmicO· É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a bactéria aumentou expressão de genes para biossíntese de ácido L-glutâmico. É um outro objetivo da presente invenção prover o método descrito acima, em que o L-aminoácido a ser produzido é L-triptofano. É um outro objeto da presente invenção prover o método descrito acima, em que a bactéria tem melhorada expressão de genes para biossíntese de L-triptofano. O método para produzir L-aminoácidos inclui a produção de L-histidina por fermentação de uma mistura de açúcares glucose e pentose, como arabinose e xilose. Também, o método para produzir L-aminoácidos inclui a produção de L-treonina por fermentação de uma mistura de açúcares glicose e pentose, como arabinose e xilose. Também, o método para produzir L-aminoácidos inclui a produção de L-lisina por fermentação de uma mistura de açúcares glicose e pentose, como arabinose e xilose. Também,· o método para produzir L-aminoácidos inclui a produção de ácido L-glutâmico pela fermentação de uma mistura de açúcares de glicose e pentose, tais como arabinose e xilose. Também, o método para produzir L-aminoácidos inclui a produção de L-triptofano por fermentação de uma mistura de açúcares glicose e pentose, como arabinose e xilose. Esta mistura de açúcares glucose e pentose usados como uma carga de alimentação de fermentação pode ser obtida das fontes sub-utilizadas de biomassa de plantas, como biomassa celulósica, preferivelmente hidrolisado de celulose.

Breve descrição dos desenhos A figura 1 mostra a estrutura de locus xylABFGHR sobre o cromossomo de cepa MG1655 de E. coli. As setas no diagrama indicam as posições de iniciadores usados no PCR.

Descrição das formas de realização preferidas Na presente invenção, “bactéria produtora de L-aminoácido” significa uma bactéria, que tem a capacidade de causar o acúmulo de L-aminoácidos em um meio, quando a bactéria da presente invenção é cultivada no meio. A capacidade produtora de L-aminoácido pode ser prejudicada ou melhorada por criação. O termo “bactéria produtora de L-aminoácido” usado aqui também significa uma bactéria que é capaz de produzir e causar o acúmulo de L-aminoácidos em um meio de cultura em quantidades maiores do que uma cepa de tipo selvagem ou parental, e preferivelmente significa que o microorganismo é capaz de produzir e causar o acúmulo em um meio de uma quantidade não menor que 0,5 g/L, mais preferivelmente não menor que 1,0 g/L do L-aminoácido de marcação. “L-aminoácidos” incluem L-alanina, L-arginma, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L-valina. A família Enterobacteriaceae incluí bactéria pertencendo ao gênero Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigeüa, Morgandla Yersinia etc. Especificamente, aqueles classificados na Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada na base de dados da NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/ Taxonomy/wgetorg? mode=Tree&id= 123 6&lvl=3 &keep= 1 fesrchuiode^ 1 & unlock) pode ser usado. Uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia ou Pantoea é preferida. A frase “uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia” significa que a bactéria é classificada no gênero Escherichia de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa versada na técnica de microbiologia· Exemplos de uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia como usado na presente invenção incluem mas não estão limitados a Escherichia Coli (E-Coli). A bactéria pertencente ao gênero Escherichia que pode ser usada na presente invenção não é particularmente limitada, contudo para exemplo, bactéria descrita por Neidhart F.C. et al (.Escherichia Coli e Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Tabela 1) são englobadas pela presente invenção. A frase “uma bactéria que pertence ao gênero Pantoea” significa que uma bactéria é classificada como o gênero Pantoea de acordo com a classificação conhecida por uma pessoa versada na técnica de microbiologia, Algumas espécies de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas como Pantoe agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii ou semelhantes, com base em análise da sequência de nucleotídeos de 16S rRNA, etc. A frase “tendo atividade melhorada de uma enzima de utilização de xilose” significa que a atividade da enzima por célula é maior do que a de uma cepa não modificada, por exemplo uma cepa de tipo selvagem. Os exemplos incluem onde o número de moléculas de enzima por célula aumenta, e onde a atividade específica por molécula de enzima aumenta, e assim em diante. Quantidade da proteína codificada pelo gene pode ser medida por métodos conhecidos incluindo SDS-PAGE seguido por ensaio de immunoblotting (análise de Western blotting) e semelhantes. Além disso, uma cepa de tipo selvagem que pode atuar como um controle inclui, por exemplo, Escherichia coli K-12.Como um resultado da melhora da atividade intracelular de uma enzima de utilização de xilose, o acúmulo de L-aminoácido, como L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico ou L-triptofano, em um meio é observado.

As “enzimas de utilização de xilose” incluem enzimas de transporte de xilose, isomerização de xilose, e fosforilação de xilose, e proteínas regulatórias. Estas enzimas incluem xilose isomerase, xiluloquinase, transportadores de xilose, e ativador de transcrição de xilose. A xilose isomerase catalisa a reação de isomerização de D-xilose em D-xilulose. A xiluloquinase catalisa a reação de fosforilação de D-xilulose usando ATP dando D-xilulose-5- fosfato e ADP. A presença de atividade de enzimas de utilização de xilose, como xilose isomerase, xiluloquinase é determinada por complementação de mutantes de E. coli negativos para xilose isomerase - ou negativos para xiluloquinase correspondentes, respectivamente. A frase “bactéria pertencendo ao gênero Escherichia significa que a bactéria é classificada como o gênero Escherichia de acordo com a classificação conhecida do versado na técnica de microbiologia. Um exemplo de um microorganismo pertencendo ao gênero Escherichia como usado na presente invenção é Escherichia coli (E. coli). A frase “aumentar a quantidade de expressão de gene(s)” significa que a quantidade de expressão de gene(s) é maior do que a de uma cepa não modificada, por exemplo uma cepa de tipo selvagem. Os exemplos desta modificação incluem o aumento do número de gene(s) expresso(s) por célula, o aumento do nível de expressão do gene(s) e assim em diante. A quantidade do número de cópias de um gene expresso é medida, por exemplo, por restrição do DNA cromossômico seguido por Southern Blotting usando uma sonda com base na sequência de genes, hibridização in situ com fluorescência (FISH), e outros. O nível da expressão de genes pode ser medido por vários métodos incluindo Northern blotting, RT-PCR quantitativo, e outros. Além disso, uma cepa tipo selvagem que pode atuar como um controle inclui, por exemplo, Escherichia coli K-12. Como um resultado da melhora da atividade intracelular de uma enzima de utilização de xilose, o acúmulo de L-ammoácido, como L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico ou L-triptofano, em um meio contendo açúcar pentose, como xilose é observado. A melhora das atividades de enzimas de utilização de xilose em uma célula bacteriana pode ser atingida por aumento da expressão dos genes que codificam para referidas enzimas. Os genes de utilização de xiilose incluem quaisquer genes derivados de bactérias da família Enterobacteriaceae, assim como genes derivados de outras bactérias como thermophilic Bacillus sp, (Bioche, MoL Bio. Int., 1996,39(5), 1049-1062). Os genes derivados de bactérias pertencendo ao gene Escherichia são preferidos. O gene codificador de xilose isomerase de E. coli (números EC 5.3.1.5) é conhecido e foi designado xylÀ (números de nucleotídeo 3727072 a 3728394 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.1, gi:16131436). O gene codificação para xiluloquinase (número EC 2.7.1.17) é conhecido e foi designado xylB (números de nucleotídeo 3725546 a 3727000 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 16131435). O gene codificação para o sistema de transporte de proteína de ligação de xilose é conhecido e foi designado xylF (números de nucleotídeo 3728760 a 3729752 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.1, gi:16131437). O gene codificação para proteína de ligação ATP putativa de sistema de transporte de xilose é conhecido e foi designado xylG (números de nucleotídeo 3729830 a 3731371 na seqüência de acesso GenBank NCJ00913.1, gi: 1613143B). O gene codificação para componente permease do sistema de transporte de xilose tipo ABC é conhecido e foi designado gene xylH (números de nucleotídeo 3731349 a 3732530 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 16131439). O gene codificador de o regulador transcricional do operon xyl é conhecido e foi designado xylR (números de nucleotídeo 3732608 a 3733786 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 16131440).Assim, os genes mencionados acima podem ser obtidos por PCR (reação de cadeia polimerase; refere-se a White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) usando iniciadores baseados na seqüência de nucleotídeos dos genes.

Os genes codificação para as enzimas de utilização de xilose de outros microorganismos podem ser similarmente obtidos. O gene xyl A de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (A) ou (B): (A) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQID NO: 2; ou (B) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos que inclui deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2, e que tem uma atividade de xilose isomerase. O gene xylB de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (C) ou (D): (C) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4; ou (D) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos que inclui deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, e que tem uma atividade de xiluloquinase, O gene xylF de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (E) ou (F): (E) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6; ou (F) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos que inclui deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 6, e que tem atividade para aumentar a quantidade de L-aminoácido, como L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico ou L-triptofano em um meio, quando a quantidade de proteína é aumentada em uma bactéria produtora de L-aminoácido junto com a quantidade de proteínas codificadas por genes xylAB e xylGHR. O gene xylG de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (G) ou (H): (G) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8; ou (H) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos que inclui deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8, e que tem uma atividade para aumentar a quantidade de L-aminoácido, como L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico ou L-triptofano em um meio, quando a quantidade de proteína é aumentada em uma bactéria produtora de L-amínoácido junto com a quantidade de proteínas codificadas por genes xylAB e xylFHR, O gene xylH de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (I) ou (J): (I) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10; (J) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 10, e que tem uma atividade para aumentar a quantidade de L-aminoácido, como L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico ou L-triptofano em um meio, quando a quantidade de proteína é aumentada em uma bactéria produtora de L-aminoácido junto com a quantidade de proteínas codificadas por genes xylAB e xylFGR. O gene xylR de Escherichia coli é exemplificado por um DNA que codifica a seguinte proteína (K) ou (L): (K) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12; (L) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 12, e que tem uma atividade para aumentar a quantidade de L-aminoácido, como L-histidina, L-treonina, L-lisina, ácido L-glutâmico ou L-triptofano em um meio, quando a quantidade de proteína é aumentada em uma bacténa produtora de L-aminoácido junto com a quantidade de proteínas codificadas por genes xylAB e xylFGH. O DNA codificador de xilose isomerase inclui um DNA codificador de proteína que inclui deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos em uma ou mais posições da proteína (A), desde que a atividade da proteína não seja perdida. Apesar do número de “vários” aminoácidos diferir dependendo da posição ou do tipo de resíduos de aminoácidos na estrutura tri-dimensional da proteína, ele pode ser de 2 a 50, preferivelmente 2 a 20, e mais preferivelmente 2 a 10 para a proteína (A). Isto é porque alguns aminoácidos tem uma alta homologia para uma outra e substituição destes aminoácidos não afeta muito a estrutura tri-dimensional da proteína e sua atividade. Assim, a proteína (B) pode ter homologia de não menos que 30 a 50%, preferivelmente 50 a 70%, mais preferivelmente 70 -90%, ainda mais preferivelmente mais do que 90% e mais preferivelmente mais do que 95% com relação a toda a sequência de aminoácidos para xilose isomerase, e que tem a atividade de xilose isomerase. A mesma abordagem e determinação de homologia podem ser aplicados a outras proteínas (C), (E)* (G),(I)e(K).

Para avaliar o grau de proteína ou homologia de DNA, vários métodos de cálculo como busca BLAST, busca FASTA e ClustalW, podem ser usados. BLAST (Basic Local Alignment SearchTool) é o algoritmo de busca heurístico empregado pelos programas blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn, e tblastx, estes programas conferem significância ás suas descobertas usando os métodos estatísticos de Karlin, Samuel e Stephen F. Altschul (“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes”. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87: 2264 - 68; “Applications and statisties for multiple high-scoring segments in molecular sequences”. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90: 5873 - 7). O método de busca FASTA descrito por W. R. Pearson (“Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA”, Methods in Enzymology, 1990 183: 63 - 98). O método ClustalW descrito por Thompson J. D., Higgins D. G. and Gibson T. J. (“CLUSTAL W: improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic AcidsRes. 1994,22:4673 -4680).

As mudanças na proteína definida em (A), como descritas acima, são tipicamente mudanças conservativas de modo a manter a atividade da proteína. As mudanças de substituição incluem as em que pelo menos um resíduo na seqüência de aminoácido foi removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os exemplos de aminoácidos que podem ser substituídos para um aminoácido original na proteína acima e que são considerados como substituições conservativas incluem:: Ala substituído com ser ou thr; arg substituído com gin, his, ou lys; asn substituído com glu, gin, . lys, his, asp; asp substituído com asn, glu, ou gin; cys substituído com ser ou ala; gin substituído com asn, glu, lys, his, asp, ou arg; glu substituído com asn, gin, lys, ou asp; gly substituído com pro; his substituído com asn, lys> gin, arg, tyr; ile substituído com leu, met, vai, phe, leu substituído com ile, met, vai, phe; lys substituído com asn, glu, gin, his, arg; met substituído com ile, leu, vai, phe; phe substituído com trp, tyr, met, ile, ou leu; ser substituído com thr, ala; thr substituído com ser ou ala; trp substituído com phe, tyr; tyr substituído com his, phe, ou trp; e vai substituído com met, ile, leu. O DNA codificador de substancialmente a mesma proteína que a proteína definida em (A) pode ser obtido por, por exemplo, modificação da seqüência de nucleotídeos codificando pela proteína definida em (A) usando a mutagênese dirigida ao sítio de modo que um ou mais resíduos de aminoácidos serão deletados, substituídos, inseridos ou adicionados. Este DNA modificado pode ser obtido por métodos convencionais usando tratamentos com reagentes e condições gerando mutações. Estes tratamentos incluem o tratamento de DNA codificando por proteínas da presente invenção como hidroxilamina ou tratamento da bactéria hospedando o DNA e°m irradiação UV ou reagentes como N-metil-N’mitro-N-nitrosoguanidina ou ácido nitroso. O DNA que codifica para a xilose isomerase inclui variantes que podem ser encontradas em diferentes cepas de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia devido à diversidade natural. O DNA codificador destas variantes pode ser obtido por isolamento do DNA que hibridiza com o gene xylA ou uma parte do gene sob condições estrigentes, e que codifica para a proteína tendo uma atividade de xilose isomerase. A frase “condições estringentes” referida aqui inclui condições sob as quais um assim chamado híbrido específico é formado, e híbrido não específico não é formado. Por exemplo, as condições estringentes incluem condições sob as quais DTSÍAs tendo elevada homologia, por exemplo DNAs tendo homologia a não menos que 70%, preferivelmente não menos que 80%, mais preferivelmente não menos que 95% um para o outro, são hibridizados. Altemativamente, as condições estringentes são exemplificadas por condições que compreendem condições comuns de lavagem em Southern hibridização, por exemplo, 60 °C, 1 x SSC, 0,1% de SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS. Duração do procedimento de lavagem depende do tipo de membrana usada para blottíng e, como uma regra, que é recomendada pelo fabricante. Por exemplo, a duração recomendada de lavagem de membrana Hybond ™ N+ de náilon (Amersham) sob condições estringentes é de 15 minutos. Preferivelmente, a lavagem pode ser realizada 2 a 3 vezes. Uma sequência parcial da sequência de nucleotídeos de SEQID NO: 1 também pode ser usada como uma sonda para DNA que codifica para variantes e hibridiza com genes xylA. Esta sonda pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos produzidos com base na sequência de nucleotídeos de SEQ ID No. 1, como iniciadores, e um fragmento de DNA contendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 como um gabarito. Quando um fragmento de DNA em um comprimento de cerca de 300 bp é usado como sonda, as condições de lavagem para a hibridização podem ser, por exemplo, 50 °C, 2 x SSC, e 0,1% de SDS.

Os DNAs que codificam para substancialmente as mesmas proteínas como as outras enzimas de utilização de xilose podem ser obtidos por métodos que são similares aos usados para obter xilose isomerase, como descrito acima. A transformação de uma bactéria com um DNA codificador de uma proteína significa a introdução do DNA em uma célula de bactéria, por exemplo por métodos convencionais para aumentar a expressão do gene codificador de a proteína da presente invenção e para melhorar a atividade da proteína em uma célula bacteriana. A bactéria da presente invenção também inclui uma onde a atividade da proteína da presente invenção é melhorada por transformação da referida bactéria com um DNA codificando uma proteína como definido em (A) ou (B), (C) ou (D), (E) ou (F), (G) ou (Η), (I) ou (J), e (K) ou (L), ou por alteração da seqüência de regulação da expressão de referido DNA no cromossomo da bactéria.

Um método para melhorar a expressão de genes inclui o aumento do número de cópias de genes. A introdução de um gene em nm vetor que é capaz de funcionar em uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia aumenta o número de cópias do gene. Para estes fins, vetores de múltiplas cópias podem ser preferivelmente usados. Preferivelmente, os vetores de baixo número de cópias são usados. O vetor de baixo número de cópias é exemplificado por pSClOl, pMW118, pMW119 e outros. O termo “vetor de baixo número de cópias” é usado para vetores que tem um número de cópias de até 5 cópias por célula. Os métodos de transformação incluem qualquer método bem conhecido dos versados na técnica. Por exemplo, um método para tratar células recipientes com cloreto de cálcio de modo a aumentar a permeabilidade das células para DNA foi registrado para Escherichia coli K-12 (Mandei, M. e Higa, A., J. Mol BioL, 53,159 (1970)) e pode ser usado. À melhora da expressão de genes pode ser também obtida por introdução de cópias múltiplas do gene em um cromossomo bacteriano por, por exemplo, um método de recombinação homóloga, integração Mu ou semelhantes. Por exemplo, um ciclo de integração Mu permite a introdução em um cromossomo bacteriano de até 3 cópias do gene.

Por outro lado, a melhora da expressão de genes pode ser obtida por colocação do DNA da presente invenção sob o controle de um promotor mais potente em vez do promotor nativo. A resistência de um promotor é definida pela frequência de atos de iniciação da síntese de RNA. Os métodos para avaliar a resistência de um promotor e exemplos de promotores potentes são descritos por Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates altemate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987 - 2994). Por exemplo, promotor Pr é conhecido como um promotor constitutivo potente. Outros promotores potentes conhecidos são promotor Pl, promotor lac, promotor trp, promotor trc, de fago lambda e outros. A melhora de tradução pode ser obtida por introdução de uma sequência Shine-Dalgamo mais eficaz (seqüência SD) no DNA da presente invenção em vez da seqüência SD nativa. A seqüência SD é uma região a montante do códon de partida do mRNA que interage com o 16S RNA do ribossoma (Shine J. e Dalgamo L., Proc. Natl Ácad. Sei. USA, 1974, 71,4, 1342-6). O uso de um promotor mais potente pode ser combinado com a multiplicação do método de cópias de genes.

Altemativamente, um promotor pode ser melhorado por, por exemplo, introdução de uma mutação no promotor para aumentar o nível de transcrição de um gene localizado a jusante do promotor. Além disso, sabe-se que a substituição de vários nucleotídeos em um espaçador entre o sítio de ligação de ribossoma (RBS) e o códon de partida, e particularmente as seqüências imediatamente a montante do códon de partida afetam profundamente a capacidade de tradução de mRNA. Por exemplo, uma faixa de 20 vezes nos níveis de expressão foi encontrada, dependendo da natureza dos três nucleotídeos precedendo o códon de partida (Gold et al, Annu. Rev. Microbiol., 35,365 - 403,1981; Hui et al., EMBO J., 3,623 - 629,1984). Métodos para preparação de DNA cromossômico, hibridização, PCR, preparação de plasmídeo DNA, digestão e ligação de DNA, transformação, seleção de um oligonucleotídeo como um iniciador e o outro pode ser os métodos comuns bem conhecidos dos versados na técnica. Estes métodos são descritos em Sambrook, J., e Russell D., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edítion”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), e outros. A bactéria da presente invenção pode ser obtida por introdução dos dNAs acima mencionados em uma bactéria inerentemente tendo uma capacidade para produzir L-histidina. Altemativamente, a bactéria da presente invenção pode ser obtida ao conferir uma capacidade para produzir L-histidina à bactéria já hospedando os DNAs.

Os exemplos de bactérias produtoras de L-aminoácidos pertencendo ao gênero Escherichia são descritos abaixo.

Bactérias produtoras de L-histidina Os exemplos de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia tendo capacidade de produção de L-histidina incluem cepas de bactérias produtoras de L-histidina pertencendo ao gênero Escherichia, como cepa E. coli 24 (VKPM B-5945, RU2003677); cepa E. coli 80 (VKPM B-7270, RU2119536); cepas E coli NRRL B-12116 - B12121 (US4388405); cepas E coli H-9342 (FERM BP-6675) e H-9343 (FERM BP-6676) (US6344347); cepa E. coli H-9341 (FERM BP-Ó674) (EP1085087); cepa E. coli AI80/pFM201 (US6258554) e outros.

Preferivelmente, a bactéria da presente invenção é adicionalmente modificada para intensificar a expressão de operon histidina, que preferivelmente inclui o gene hisG codificador de ATP-fosfo-ribosil-transferase cuja inibição de retroalimentação por L-histidina está dessensibilizada (Patentes Russas 200367 e 2119536), para bactérias produtoras de L-histidina.

Bactérias produtoras de L-treonina Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de L-treonina da presente invenção incluem, mas não se limitam a, bactérias produtoras de L-treonina pertencentes ao gênero Escherichia, como cepa E. coli TDH-ó/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patente U.S. 5.175.107, Patente U.S. 5.705.371), E coli cepaNRRL-21593 (Patente U.S. 5.939.307), cepa E. coli FERM BP-3756 (Patente U.S. 5.474.918), cepas E, coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente U.S. 5.376.538), cepa E coli MG422 (Gusyatiner et ai, Genetika (em russo), 14, 947-956 (1978)), cepas E. coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A), e semelhantes. A cepa TDH-6 é deficiente em gene thrC, também é assimilativa de sacarose, e o gene ilvA possui uma mutação subnormal, Esta cepa também possui uma mutação no gene rhtA, que confere resistência a concentrações altas de treonina ou homosserina. A cepa B-3996 contém o plasmídeo pVIC40 que foi obtido por inserção de um operon thrA*BC que inclui um gene thrA mutante em um vetor derivado de RSF1010. Este gene thrA codifica aspartocinase-homosserina-desidrogenase I que tem substancialmente dessensibilizado inibição de retroalimentação por treonina. A cepa B-3996 foi depositado aos 19 de novembro de 1987 no All-Union Scientifíc Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscou, Federação Russa) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa também foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Dorozhny proezd. 1, Moscou 117545, Federação Russa).

Preferivelmente, a bactéria da presente invenção é adicionalmente modificada para intensificar a expressão de um ou mais dos seguintes genes: - o gene thrA mutante que codifica aspartocinase- homosserina-desidrogenase I resistente à inibição de retroalimentação por treonina; - o gene thrB que codifica homosserina-cinase; - o gene thrC que codifica treonina-sintase; - o gene rhtA que codifica uma proteína de transmembrana putativa; - o gene asd que codifica aspartato-(i-semialdeído- desidrogenase; e - o gene aspC que codifica aspartato-amino-transferase (aspartato-transaminase).

O gene thrA que codifica aspartatocinase-homosserina-desidrogenase I de Escherichia coli tem sido elucidado (números de nucleotídeo 337 a 2799 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.2. gi: 49175990). O gene thrA está localizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K-12. O gene thrB que codifica homosserina-cinase de Escherichia coli tem sido elucidado (números de nucleotídeo 2801 a 3733 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.2. gi: 49175990). O gene thrB está localizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. coli K-12.0 gene thrC que codifica treonina-sintase de Escherichia coli tem sido elucidado (números de nucleotídeo 3734 a 5020 na seqüência de acesso GenBank NCJ300913.2. gi: 49175990). O gene thrC está localizado entre o gene thrAB e a matriz de leitura aberta yaaX no cromossomo de E. coli K-12. Todos os três genes funcionam como um único operon treonina.

Um gene thrA mutante que codifica asparto-cinase-homosserina-desidrogenase I resistente à inibição de retroalimentação por treonina, bem como os genes thrB e thrC, podem ser obtidos como um operon do plasmídeo pVIC40 bem conhecido que está presente na cepa VKPM B-3996 de E. coli produtora de treonina. Plasmídeo pVIC40 é descrito em detalhe na Patente U.S. 5.705.371. O gene rhtA existe a 18 min no cromossomo de E. coli perto do operon glnHPO que codifica componentes do sistema de transporte de glutamina, e o gene rhtA é idêntico a ORF1 (gene ybiF, números 764 a 1651 no número de acesso de GenBank AAA218541, gi: 440181), localizado entre os genes pexB e ompX. A unidade expressando uma proteína codificada por ORF1 tem sido chamada de gene rhtA (rht: resistência a homosserina e treonina). Também, foi verificado que a mutação rhtA23 é uma substituição de G por A na posição-1 com respeito ao códon de iniciação ATG (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology em conjugação com o 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, Califórnia, August 24-29,1997, abstractNo. 457, EP 1013765 A). O gene asd de E. coli já tem sido elucidado (números de nucleotídeo 3572511 a 3571408 na sequência de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 16131307), e pode ser obtido por PCR (reação em cadeia da polimerase: referir a White, T. J. et ai, Trends Genet., 5, 185 (1989)) utilizando iniciadores baseados na sequência de nucleotídeos do gene. Os genes asd de outros microorganismos podem ser obtidos em uma maneira semelhante.

Também, o gene aspC de E, coli já tem sido elucidado (números de nucleotídeo 983742 a 984932 na seqüência de acesso GenBank NC_000913.1, gi: 161298895), e pode ser obtido por PCR. Os genes aspC de outros microorganismos podem ser obtidos em uma maneira semelhante, Bactérias produtoras de L-lisina Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina pertencentes ao gênero Escherichia incluem mutantes possuindo resistência a um análogo de L-lisina. O análogo de L-lisina inibe o crescimento de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, mas esta inibição é total ou parcialmente dessensibilizada quando L-lisina está presente em um meio, Exemplos de análogo de L-lisina incluem, mas não se limitam a, oxalisina, lisina hidroxamato, S-(2-amino-etil)-L-cisteína (AEC), y-metil-lisina, a-cloro-caprolactama, etc. Mutantes possuindo resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidos ao se submeter as bactérias pertencentes ao gênero Escherichia a um tratamento de mutagênese artificial convencional. Exemplos específicos de cepas bacterianas úteis para produzir L-lisina incluem Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; veja Patente U.S. 4.346.170) e Escherichia coli VL1611. Nestes microorganismos, inibição de retroalimentação por L-lisina é dessensibilizada. A cepa WC196 pode ser usada como uma bactéria produtora de L-lisina de Escherichia coli. Esta cepa bacteriana foi procriada ao se conferir resistência a AEC à cepa E3110, que foi derivada de Escherichia coli K-12, A cepa resultante foi chamada de cepa Escherichia coli AJ13069, e foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technologia, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) aos 6 de dezembro de 1994 e recebeu um número de acesso FERM P-14690. Então, foi convertido em um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste aos 29 de setembro de 1995, e recebeu um número de acesso FERM BP-5252 (Patente U.S. 5.827.698). Bactérias produtoras de ácido L-glutâmico Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de ácido L-glutãmico da presente invenção incluem, mas não se limitam a, bactérias produtoras de ácido L-glutâmico pertencentes ao gênero Escherichia, como cepa E. coli VL334thrC+ (EP 1172433), cepa E- coli VL334 (VKPM B-1641) é uma cepa auxotrófica produzindo L-isoleucina e L-treonina possuindo mutações nos genes thrC e UvA (Patente U.S. 4.278.765). Um alelo de tipo selvagem do gene thrC foi transferido pelo método de transdução geral usando um bacteriófago PI crescido em células de cepa E. coli K12 (VKPM B-7). Como um resultado, uma cepa VL334thrC+ (VKPM B-8961) auxotrófica em relação à L-isoleucina foi obtida. Esta cepa é capaz de produzir ácido L-glutâmico.

Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico da presente invenção incluem mutantes que são deficientes em uma atividade de α-ceto-glutarato-desidrogenase ou possuem uma atividade de α-ceto-glutarato-desidrogenase reduzida. Bactérias pertencendo ao gênero Escherichia deficientes em uma atividade de a-ceto-glutarato-desidrogenase ou possuindo uma atividade de a-ceto-glutarato-desidrogenase reduzida e métodos para a obtenção delas são descritos nas Patentes U.S. 5.378.616 e 5.573.945. Especificamente estas cepas incluem as seguintes: E. coli W3110sucA::Kmr E coli AJ12624 (FERM BP-3853) E. coli AJ12628 (FERM BP-3854) E coli AJ12949 (FERM BP-4881) E. coli W3110sucA::Rmr é obtida pela disrupção de um gene de α-ceto-glutarato-desidrogenase (daqui em diante referido como “gene sucA”) de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente em uma a-ceto-glutarato-desidrogenase.

Outros exemplos de bactérias produtoras de ácido L- glutâmico, incluem cepas mutantes pertencendo ao gênero Pantoea que são deficientes em uma atividade de α-ceto-glutarato-desidrogenase ou possuem uma atividade de α-ceto-glutarato-desidrogenase diminuída, e podem ser obtidas como descrito acima. Tais cepas incluem Pantoea ananatis AJ13356 (Patente U.S. 6.331.419), Pantoea ananatis AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technologia, Ministry of International Trade and Industry (correntemente, National Institute of Advances Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-S566, Japão) aos 19 de fevereiro de 199S e recebeu um número de acesso FERM P-16645. Foi então convertido em um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapeste aos 11 de janeiro de 1999, e recebeu um número de acesso FERM BP-6615. Pantoea ananatis AJ13356 é deficiente em uma atividade de a-ceto-glutarato-desidrogenase como um resultado de disrupção de um gene de subunidade KGDH-E1 (sucA). A cepa acima foi identificada como Enterobacter agglomerans quando foi isolada e depositada como Enterobacter agglomerans AJ13356. Contudo, foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis baseando-se no seqüenciamento de nucleotídeos de 16S rRNA e assim por diante. Embora AJ13356 tenha sido depositada no depósito acima mencionado como Enterobacter agglomerans, para os propósitos desta invenção, é descrita como Pantoea ananatis.

Bactérias produtoras de L-triptofano Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de L-triptofano da presente invenção incluem, mas não se limitam a, bactérias produtoras de L-triptofano pertencendo ao gênero Escherichia, como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015 /pMU91 (DSM10123) deficientes em triptofanil-tRNA-sintetase codificada por um gene trpS mutante (Patente U.S. 5.756,345); E. coli SV164 (pGH5) possuindo alelo serA livre de inibição de retroalimentação por serina (Patente U.S. 6.180.373); E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) e AGX (pGX50)aroP (NRRL B-12264) deficiente na enzima triptofanase (Patente U.S. 4.371.614); E. coli AGX17/pGX50,pACK50,pACKG4-pps na qual uma capacidade de produzir fosfoenol-piruvato é intensificada (WO 9708333, Patente U.S. 6,319.696), e semelhantes podem ser usados.

Previamente, foi identificado que o gene yddG codifica uma proteína de membrana que não está envolvida em uma rota biossintética de qualquer L-aminoácido. Também, é sabido que o gene yddG confere ao microorganismo uma resistência a L-fenil-alanina e vários análogos de aminoácido quando o alelo de tipo selvagem do gene é amplificado em um vetor de multicópias no microorganismo. Além disso, o gene yddG pode intensificar a produção de L-fenil-alanina ou L-triptofano quando cópias adicionais são introduzidas em células de cepa produtora respectiva (WO 03044192). Assim é desejável que a bactéria produtora de L-triptofano seja adicionalmente modificada para possuir expressão intensificada de matriz de leitura aberta yddG, Bactérias produtoras de L-arginina Exemplos de cepas originárias para derivação das bactérias produtoras de L-arginina da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, bactérias produtoras de L-arginina, tais como cepa 237 de E.coli (VKPM B-7925) (Pedido de Patente U.S. 2002058315) e suas cepas derivadas acolhendo síntese de N-acetilglutamato mutante (Pedido de Patente Russo No. 2001112869), cepa 382 de E.coli (VKPM B-7926) (Pedido de Patente Europeu EP1170358), uma cepa produtora de arginina na qual o gene argA codificando a N-acetilglutamato sintetase é introduzido (JP 57-5693A), e semelhantes.

Bactérias produtoras de L-fenil-alanina Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de L-feml-alanina da presente invenção incluem, mas não se limitam a, bactérias produtoras de L-fenil-alanina do gênero Escheríchia, como E. coli AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197); E. coli HW1089 (ATCC 55371) hospedando o gene pheA34 (Patente U.S, 5.354.672); E. coli MWEClOl-b (KR8903681); E. coli NRRL B-12141, NRRLB-12145, NRRL B-12146 e NRRL B-12147 (Patente U.S. 4.407.952). Também, como uma cepa parental, E. coli K-12 (W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA/pPHAD] (FERM BP-12659), E, coli K-12 [W3110 (tyrA)/pHATerm] (FERM BP-12662) e E. coli K-12 [W3U0 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] chamada de AJ12604 (FERM BP-3579) podem ser usadas (EP 488424 Bl). Em adição, bactérias produtoras de L-fenil-alanina pertencendo ao gênero Escherichia com atividade intensificada de proteína codificada pelo gene yedA ou gene yddG também podem ser usadas (Pedidos de Patente U.S. 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).

Bactérias produtoras de L-cisteína Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de L-cisteína da presente invenção incluem, mas nao se limitam a, bactérias produtoras de L-cisteína do gênero Escherichia, como cepa E. coli JM14 que é transformada com diferentes alelos cysE codificadores de serina-acil-transferases resistentes à retroalimentação (Patente U.S. 6.218.168, Pedido de Patente Russa 2003121601); cepa E. coli W3110 possuindo genes superexpressados que codificam proteínas adequadas para secreção de substâncias tóxicas para células (Patente U.S. 5.972.663); cepas de E. coli possuindo atividade de cisteína-dessulfo-hidrase diminuída (JP 11-155571 A); cepa E. coli W3110 com atividade aumentada de um regulador transcricional positivo para regulon de cisteína codificado pelo gene cysB (WO 0127307A1), e semelhantes.

Bactérias produtoras de L-leucina Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de L-leucina da presente invenção incluem, mas não se limitam a, bactérias produtoras de L-leucina do gênero Escherichia, como cepas de E. coli resistentes a análogos de leucina incluindo β-2-tienil-alanina, 3-hidróxi-leucina, 4-azaleucina, 5,5,5-trifluoro-leucina (JP 62-34397B e JP 08-70879A); cepas de E. coli obtidas pelo método de engenharia genética descrito em WO 96/06926; cepa E. coli H-9068 (JP 08-70879À), e semelhantes. A bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-leucina. Exemplos incluem genes do operon leuABCD, que são preferivelmente representados por um gene leuA mutante codificador de isopropil-malato-sintase livre de inibição de retroalimentação por L-leucina (Patente U.S. 6.403.342). Em adição, a bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes codificadores de proteínas que excretam L-aminoácido da célula bacteriana. Exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (Pedido de Patente Russa 2001117632).

Bactéria produtora de L-nrolina Exemplos de cepas originárias para derivação de bactérias produtoras de L-prolina da presente invenção incluem, mas não se limitam a, bactérias produtoras de L-prolina do gênero Escherichia, como cepa E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) que é deficiente em gene ilvA, e é capaz de produzir L-prolina (EP 1172433). A bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-prolina. Exemplos de tais genes para bactérias produtoras de L-prolina incluem o gene proB codificador de glutamato-cinase cuja inibição de retroalimentação por L-prolina está dessensibilizada (Patente DE 3127361). Em adição, a bactéria da presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes codificadores de 5U proteínas excretando L-aminoácido de uma célula bacteriana. Tais genes são exemplificados pelos genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP 1239041A2).

Exemplos de bactérias pertencendo ao gênero Escherichia que possuem uma atividade para produzir L-prolina incluem as seguintes cepas de E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente GB 2075056), VKPM B-8012 (Pedido de Patente Russa 2000124295), mutantes de plasmídeo descritos em Patente DE 3127361, mutantes de plasmídeo descritos por Bloom F, R. et aí (The 15* Miami Winter Symposium, 1983, p. 34), e semelhantes. ) As cepas produzindo L-aminoácido acima mencionadas podem ser ainda modificadas para melhora da taxa de assimilação de pentose ou para melhora da capacidade biossintética de L-aminoácido pelo escopo amplo dos métodos bem conhecidos dos versados na técnica. A taxa de utilização para açúcares de pentose pode ser ainda 5 melhorada por amplificação dos genes de assimilação de pentose, genes araFg e araBAD para arabinose, ou por mutações nos sistemas de assimilação de glucose (PTS e não PTS), como mutações ptsG (Nichols N, N. et al, Appl· Microbiol. BiotechnoL, 2001, julho 56:1 - 2,120-5). O processo da presente invenção inclui um processo para 10 produzir um L-aminoácido compreendendo as etapas de cultivar as bactérias produtoras de L-aminoácido em um meio de cultura, deixando o L-aminoácido se acumular no meio de cultura, e coletando o L-aminoácido do meio de cultura, em que o meio de cultura contém uma mistura de açúcares glucose e pentose. Também, o método da presente invenção inclui um método 25 para produzir L-histidina compreendendo as etapas de cultivar a bactéria produtora de L-histidina da presente invenção em um meio de cultura, deixando L-histidina se acumular no meio de cultura, e coletando L-histidina do meio de cultura, em que o meio de cultura contém uma mistura de açúcares glucose e pentose. Também, o método da presente invenção inclui um método para a produção de L-treonina compreendendo as etapas de cultivar a bactéria produtora de L-treonina da presente invenção em um meio de cultura, permitindo que L-treonina se acumule no meio de cultura, e coletar L-treonina do meio de cultura, no qual o meio de cultura contém uma mistura de glicose e açúcares de pentose. Também, o método da presente invenção inclui um método para a produção de ácido L-glutâmico compreendendo as etapas de cultivar a bactéria produtora de ácido L-glutâmico da presente invenção em um meio de cultura, permitindo que ácido L-glutâmico se acumule no meio de cultura, e colhendo ácido L-glutâmico do meio de cultura, em que o meio de cultura contém uma mistura de açúcares de glicose e pentose. Também, o método da presente invenção inclui um método para produzir L-triptofano compreendendo as etapas de cultivar a bactéria produtora de L-triptofano da presente invenção em um meio de cultura, permitindo que L-triptofano se acumule no meio de cultura, e coletar L-lisina do meio de cultura, no qual o meio de cultura contém uma mistura açúcares de glicose e pentose. A mistura de açúcares de pentose, como xilose e arabinose, junto com açúcar hexose, como glucose, pode ser obtida de fontes sub-utilizadas de biomassa. Glucose, xilose, arabinose e outros carboidratos são liberados da biomassa da planta por vapor e/ou hidrólise de ácido concentrada, hidrólise de ácido diluída, hidrólise usando enzimas, como celulase, ou tratamento com álcali. Quando o substrato é um material celulósico, a celulose pode ser hidrolisada em açúcares simultaneamente ou separadamente e também fermentada em L-aminoácido. Porque hemicelulose é geralmente mais fácil de hidrolisar em açúcares do que celulose, é preferível prehidrolisar o material celulósico, separar as pentoses e então hidrolisar a celulose por tratamento com vapor, ácido, álcali, celulases ou combinações dos mesmos para formar glucose.

Uma mistura consistindo de relações diferentes de glucose/ xilose / arabinose foi usada neste estudo para aproximar a composição de mistura de carga de alimentação de glucose e pentoses, que poderíam ser potencialmente derivadas de hidrolisados de plantas (ver seção de exemplo).

Na presente invenção, o cultivo, a coleta e a purificação de L-aminoácido do meio e outros podem ser realizados em um modo similar a um método de fermentação convencional em que o aminoácido é produzido usando um microorganismo. O meio usado para cultura pode ser ou um meio sintético ou um meio natural, desde que o meio inclua uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio e minerais e, se necessário, quantidades apropriadas de nutrientes que o microorganismo requer para o crescimento. A fonte de carbono pode incluir vários carboidratos como glucose, sacarose, arabinose, xilose e outros açúcares de pentose e hexose, que a bactéria produtora de L-aminoácido pode utilizar como uma fonte de carbono. Glucose, xilose, arabinose e outros carboidratos podem ser uma parte da mistura de carga de alimentação de açúcares obtida de biomassa celulósica.

Os açúcares de pentose apropriados para fermentação na presente invenção incluem, mas não são limitados a xilose e arabinose.

Como a fonte de nitrogênio, vários sais de amônio como amônia e sulfato de amônio, outros compostos de nitrogênio como aminas, uma fonte de nitrogênio natural como peptona, hidrolisado de soja e microorganismos fermentativos digeridos são usados. Como minerais, monofosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio, e outros são usados. Nutrientes adicionais podem ser adicionados no meio se necessário. Por exemplo, se o microorganismo requer prolina para crescimento auxotrofia de prolina(, uma quantidade suficiente de prolina pode ser adicionada ao meio para cultivo.

Preferivelmente, o cultivo é realizada sob condições aeróbicas como uma cultura em agitação, e uma cultura em agitação com aeração, a uma temperatura de 20 a 40 °C, preferivelmente 30 a 38 °C. O pH da cultura está geralmente entre 5 e 9, preferivelmente entre 6,5 e 7,2. O pH da cultura pode ser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases, e tampões. Geralmente, um cultivo de 1 a 5 dias leva ao acúmulo de L-aminoácido alvo no meio líquido.

Após cultivo, sólidos como células podem ser removidos do meio líquido por centrifugação ou filtração em membrana, e então o L-aminoácido alvo pode ser coletado e purificado por métodos de troca de íons, concentração e cristalização.

Exemplos A presente invenção será mais concretamente explicada abaixo com referência aos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1. Clonagem do locus xvlABFGHR do cromossomo de cepa E. coli MG1655.

Baseado em análise do genoma da cepa E. coli MG1655, os genes xylABFGHR podem ser clonados como um fragmento HindlII único (13,1 kb) de fragmentos cromossômicos HindlII 556 no total (fig. 1). Para este fim, uma coleção de genes foi construída usando vetor pUC19, que é capaz de sobreviver em E. coli com inserções deste tamanho.

Para construir esta coleção, DNA cromossômico de MG1655 foi digerido com HindlII restrictases e o vetor pUC19 foi digerido com Xbal restrictase. A cepa MG 1655 (ATCC47076, ATCC700926) pode ser obtida de American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA., 20110-2209, U.S.A.).

As extremidades pegajosas em ambas as preparações de DNA foram subsequentemente cheias por fragmento Klenow de modo a evitar a auto-ligação (enchimento com duas bases). Após o procedimento de ligação uma poça de plasmídeos pUC19 recombinantes foi obtida. O tamanho da coleção é maior que 200 mil clones. A coleção de genes foi analisada por PCR usando iniciadores complementes à sequência de plasmídeo e inciadores complementares ao fragmento cromossômíco de clonagem. Os fragmentos de DNA com peso molecular apropriado não foram encontrados dentre os produtos PCR, que foi interpretado como significando que o fragmento correspondendo ao operon xylABFGHR estava faltando da coleção construída. Este resultado pode ser devido à influência negativa do gene malS, e os ORFs yiaA e yiaB (com função desconhecida), que também estão presentes no fragmento HindIII de interesse. Outra razão possível para seleção negativa é o tamanho grande do locus Xyl Para superar este problema, novas coleções de genes foram construídas com base em um plasmídeo pUC19 modificado. A abordagem principal é clonar o locus Xyl como um conjunto de fragmentos sem o gene malS adjacente e ORís e yiaB.

Para este fim, um poliligador de plasmídeo pUC19 foi modificado por inserção de um fragmento de DNA sintético contendo o sítio de restrição Mlul. Duas coleções de genes foram construídas no vetor de clonagem de pUC19 modificado. A primeira coleção foi criada por digestão do DNA cromossômico de cepa MG 165 5 e pUC19 modificado com HindlA e Nlul restrictases seguido por ligação. O volume da coleção foi maior que 4.000 clones. A coleção de genes foi analisada por PCR usando iniciadores complementares à sequência de plasncádeos, e iniciadores 1 (SEQID NO: 13) e 2 (SEQ ID NO: 14) que são complementares ao fragmento xylABFG do locus xyl. Os fragmentos de DNA esperados com o peso molecular apropriado foram encontrados dentre os produtos PCR. A próxima etapa foi saturar a coleção de genes com um fragmento de interesse. Para esta finalidade, DNA da coleção de genes original foi digerido por endonucleases, sítios de restrição dos quais não existem no fragmento de interesse. Existem Eco 1471, Kpnl, Mlsl, Rrill07I, A frequência do plasmídeo de interesse na coleção enriquecida foi de 1/800 clones. A coleção enriquecida foi analisada por PCR, como acima mencionado. Após cinco enriquecimentos sequenciais da coleção, a população de células, somente dez clones contendo genes xylABFG foram encontrados. O polímero resultante contendo fragmento de DNA Hindlll - Mlul com genes xylABFG foi designado como pUC19/xylA-G. Então o fragmento Hinàlll-MphUOll contendo os ORFs yiaA e yiaB foi eliminado do plasmídeo pUC19/xylA-G; as extremidades pegajosas foram tomadas cegas por fragmento Klenow e um ligador sintético contendo um sítio de restrição EcoBl foi inserido por ligação. Assim, o plasmídeo pUC19/xylA-G-2 foi obtido. Então, o plasmídeo pUC19/xylA-G-2 resultante foi cortado por EheI restrictase, as extremidades pegajosas foram tomadas cegas por fragmento Klenow e um ligador sintético contendo um sítio de restrição Hindlll foi inserido por ligação. Assim o plasmídeo pUC19/xylA-G-3 foi obtido. Um sítio de restrição Hindlll foi inserido com o fragmento de DNA restante contendo genes xylHR, resultando no locus xyl completo. A segunda coleção foi criada por digestão do DNA cromossômico de cepa MG1655 e um pUC19 modificado com Pstl e MM restrictases, seguido por ligação, o volume da coleção foi maior que 6.000 clones. A coleção de genes foi analisada por PCR usando iniciadores complementares á seqüência de plasmídeos e iniciadores 3 (SEQID NO: 15) e 4 (SEQ ID NO: 16), que são complementares ao fragmento cromossômico de clonagem. Os fragmentos de DNA com peso molecular apropriado foram encontrados dentre os produtos PCR. A próxima etapa foi uma subdivisão seqüencial da coleção de genes na população de células com tamanho conhecido, acompanhado por análise PCR. Após sete subdivisões seqüenciais da coleção, a população de células contendo genes xylHR continha somente dez clones. Dentre esta população, um fragmento de DNA de interesse foi encontrado por análise de restrição. O plasmídeo resultante contendo fragmento de DNA Pstl- Mlul com genes xylHR foi designado como pUC19/xylHR. Então, o fragmento de DNA Hinâlíl-MM do plasmídeo pUC19/xylHR foi ligado no plasmídeo pUC19/xylA-G-3, que tinha sido previamente tratado com Hináíil e MM restrictases. Finalmente, o locus completo xyl de cepa MG1655 foi obtido. O plasmídeo de múltiplas cópias resultante contendo o locus completo xylABFGHR foi designado pUC19/xylA-R.

Então o fragmento de DNA ifmdlII-EcoRl do plasmídeo pUC19/xylA-R foi reclonado no vetor pMW199mod de baixo número de cópias, que tinha sido previamente digerido com Hinà\ll e EcoRI restrictases, resultando em um plasmídeo pMW119mod-xylA-R que continha o locus xylABFGHR completo. O vetor de baixo número de cópias pMW199mod foi obtido de vetor pMW119 comercialmente disponível por eliminação de fragmento Pvuíl- Pvull. Este fragmento contém o sítio de múltipla clonagem e foi a parte principal do gene lacZ.O gene lacZ contém sítios para repressor lacl seguido por inserção de ligador sintético contendo sítios EcoRl e HinâJll, que são necessários para inserção de locus xylABFGHR do plasmídeo pUC19/xylA-R.

Exemplo 2: Produção de L-histidina por bactéria produtora de L-histidina a partir da fermentação de uma mistura de glucose e pentoses.

Cepa de E. coli 80 produzindo L-histidina foi usada como uma cepa para produção de L-histidina por fermentação de uma mistura de glucose e pentoses. A cepa E. coli 80 (VKPM B-7270) é descrito em detalhes na patente russa número RU2119536 e foi depositada junto ao Russian National Collection of Industrial Microorganisms (Rússia, 113545 Moscow, lst Dorozhny proezd, 1) em 15 de outubro de 1999 sob número de acesso VRPM B-7270. Então, ela foi transferida para um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 12 de julho de 2004. Transformação de cepa 80 com o plasmídeo pMWl 19mod-xylA-R foi realizada por métodos comuns, dando a cepa 80/pMWl 19mod-xylA-R.

Para obter a cultura da semente, ambas cepas 80 e 80/pMWl 19mod-xylA-R foram cultivadas em um agitador rotativo (250 rpm) a 27 °C durante 6 horas em tubos de teste de 40 ml (0 18 mm) contendo 2 ml de L-caldo com 1 g/1 de estreptomicina, Para a cepa 80/pMW119mod-xylA-R, 100 mg/1 ampicilina foram adicionalmente adicionados. Então, 2 ml (5%) de semente de material foram inoculados no meio de fermentação. A fermentação foi realizada em um agitador giratório (250 rpm) a 27 °C durante 65 horas em tubos de teste de 40 ml contendo 2 ml de meio de fermentação.

Após cultivo, a quantidade de L-histidma que tinha acumulado no meio de cultura foi determinada por cromatografia em papel. A composição da fase móvel é a seguinte: butanol: acetato: água = 4:1:1 (v/v), Uma solução (0,5%) de ninhidrína em acetona foi usada como um reagente visualizante. Os resultados são apresentados na tabela 2. A composição do meio de fermentação (g/1): Carboidratos (total) 100,0 Mameno 0,2 de TN (nitrogênio total) (hidrolisado de soja) L-prolina 0,8 (NH4)2S04 25,0 K2HP04 2,0 MgS04-7H20 1,0 FeS04-7H20 0,01 MnS04-5H20 0,01 HCldetiamina 0,001 Betaína 2,0 CaC03 6,0 Estreptomicina 1,0 Carboidratos (glucose, arabinose, xilose), L-prolina, betaína e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaC03 seco por calor é esterilizado a 110 °C durante 30 minutos. O pH é ajustado a 6,0 por KOH antes da esterilização. Como pode ser visto na tabela 2, expressão aumentada do locus de xyLABFGHR melhorou a produtividae da cepa SO de E. Coli produtora de L-histidina, cultivada no meio contendo xilose.

Tabela 2 Exemplo 3. Produção de L-treonina por fermentação de uma mistura de glicose e pentoses usando bactéria produtora de L-treonina Cepa B-3996 de E. coli produzindo L-treonina foi usada para avaliar a produção de L-treonina por fermentação de uma mistura de glicose e pentose. Transformação da cepa B-3996 com o plasmídeo pMW119mod-xylA-R e o vetor pMWl 19 foi realizada por método ordinário usando CaCl2, dando cepas 3996/pMWl 19mod-xylA-R e 3996/pMWl 19, respectivamente.

Ambas as cepas 3996/pMWl 19mod-xylA-R e 3996/pMWl 19 de E. coli foram crescidas por 12-15 horas a 37°C sobre placas de ágar contendo estreptomicina (50 mg/L) e ampicilina (150 mg/L). Então, o meio de fermentação contendo xilose (4%) como uma fonte de carbono foi inoculado com uma alça de cepas. A fermentação foi realizada em 2 mL de meio de fermentação contendo estreptomicina (50 mg/L) em tubos de ensaio de 20 x 200 mm. Células foram crescidas por 25 horas a 32°C com agitação a 250 rpm.

Após cultivo, a quantidade de L-treonina que foi acumulada no meio foi determinada por cromatografia em papel usando a seguinte fase móvel: butanol: ácido acético: água = 4: 1: 1 (v/v). Uma solução (2%) de ninhidrina em acetona foi usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo L-treonina foi cortada. L-treonina foi eluída em solução aquosa de CdCl2 a 0,5%, e a quantidade de L-treonina foi estimada espectrofotometricamente a 540 nm. Os resultados são apresentados na Tabela 3. A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente, CaC03 seco por calor é esterilizado a 180°C por 2 h. O pH é ajustado para 7,0, Antibiótico é introduzido no meio após a esterilização.

Tabela 3 Como pode ser visto da Tabela 3, expressão aumentada do locus xylÁBFGHR melhorou a produtividade da cepa Β-3996/pMWl 19 de E. coli produzindo L-treonina cultivada no meio contendo xilose.

Exemplo 4. Produção de L-lisina nor fermentação de uma mistura de glicose e pentoses usando bactéria produtora de L-lisina Cepa WC196AcadA Aidc foi usada para evaliar a produção de L-lisina por fermentação de uma mistura de glicose e pentose. Cepa WC196AcadA Aldc foi obtida da cepa WX196 por inativação de lisina-descarboxilases codificadas pelo gene UcC e gene cadA como descrito na Patente U.S. 5.827.698. Transformação da cepa WC196AcadA Aldc com o plasmídeo pMWl 19mod-xylA-R e o vetor pMWl 19 foi realizada por método ordinário usando CaCl2, dando cepas WC196AcadA Aldc/pMW119mod-xylA-R e WC196AcadA Aldc/pMW119, respectivamente.

Ambas as cepas WC196AcadA Aldc/pMWl 19 e WC196AcadA Aldc/pMWl 19mod-xylA-R de E. coli foram crescidas por 1215 horas a 37°C sobre placas de ágar contendo ampicilina (150 mg/L). Então, o meio de fermentação contendo quer xilose (4%) quer mistura de xilose (2%) / glicose (2%) como uma fonte de carbono foram inoculadas com uma alça de cepas. A fermentação foi realizada em 2 mL de meio de fermentação em tubos de ensaio de 20x200 mm. Células foram crescidas por 25 horas a 32°C com agitação a 250 rpm.

Após cultivo, a quantidade de L-lisina que foi acumulada no meio foi determinada por cromatografia em papel usando a seguinte fase móvel: butanol: ácido acético: água = 4: 1: 1 (v/v). Uma solução (2%) de ninhidrina em acetona foi usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo L-lisina foi cortada. L-Lisina foi eluída em solução aquosa de CdCl2 a 0,5%, e a quantidade de L-Lisina foi estimada espectrofotometricamente a 540 nm. Os resultados são apresentados na Tabela 4. A composição do meio de fermentação (g/L) é como segue: Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente, CaC03 seco por calor é esterilizado a 180°C por 2 h. O pH é ajustado para 7,0 com KOH. Antibiótico é introduzido no meio após a esterilização.

Tabela 4 Como pode ser visto da Tabela 4, expressão aumentada do locus xylABFGHR melhorou a produtividade da cepa WC196AcadA Aldc/pCABD2/pMWl 19 de E. coli produzindo L-lisina cultivada no meio contendo xilose.

Exemplo 5: Produção de ácido L-glutâmico pela fermentação de uma mistura de glicose e pentoses usando bactéria produtora de ácido L-glutâmico. A cepa AJ12624 de E.Coli produtora de ácido L-glutâmico foi usada para avaliar a produção de ácido L-glutâmico pela fermentação de uma mistura de glicose e pentose. Transformação da cepa AJ12624 com o plasmídeo de pMW119mod-xylA-R e vetor pMW119 foi realizada pelo método ordinário usando CaCl2, produzindo cepas AJ12624/pMW119mod-xylA-R e AJ12624/pMWl 19, respectivamente.

Ambas as cepas de E. coli AJ12624/pMW119 e AJ 12624/ pMW119mod-xylA-R foram crescidas por 12-15 horas a 37°C em placas de L-agar contendo ampicilina (150 mg/1). Então, o meio de fermentação contendo xilose (4%) como uma fonte de carbono foi inoculado com uma alça de cepas. A fermentação foi realizada em 2 ml de meio de fermentação em tubos de ensaio 10x200 mm. Células foram crescidas por 48 horas a 32°C com agitação a 250 rpm.

Após o cultivo, a quantidade de ácido L-glutâmico que foi acumulada no meio foi determinada por cromatografia de papel usando a seguinte fase móvel: butanohácido acético:água = 4:1:1 (v/v). Uma solução (2%) de ninidrina em acetona foi usada como um reagente de visualização. Uma mancha contendo ácido L-glutâmico foi cortada, ácido L-glutãmico foi eluído em uma solução aquosa a 0,5% de CdCl2, e a quantidade de ácido L-glutâmico foi estimada espectrofotometricamente a 540 nm. Os resultados são apresentados na Tabela 5. A composição do meio de fermentação (g/1): Carboidratos 40,0 (NH4)2S04 25,0 KH2P04 2,0 MgS04.7H20 1,0 HCldeTiamina 0,0001 L-isoleucina 0,07 CaC03 25,0 Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaCOa esterilizado por calor a seco a 180°C por 2 h. pH é ajustado para 7,2. Tabela 5 Como pode ser visto da Tabela 5, expressão aumentada do locus xylABFGHR melhorou a produtividade da cepa AJ12624/pMW119 de E. coli produzindo ácido L-glutâmico cultivada no meio contendo xilose. Exemplo 6: Produção de L-triptofano por fermentação de uma misturajje glicose e pentoses usando bactéria produtora de L-triptofano Cepa SV164/pGH5 de E, coli produzindo L-triptofano foi usada para avaliar a produção de L-triptofano por fermentação de uma mistura de glicose e pentose. Transformação da cepa SV164/pGH5 com o plasmídeo pMWl 19mod-xylA-R e o vetor pMWl 19 foi realizada por método ordinário usando CaCl2, dando cepas SV164/pGH5/pMW 119mod-xyl A-R e SV164/pGH5/pMW 119, respectivamente.

Ambas as cepas SV164/pGH5/pMW119 e SV164/pGH5/pMW119mod-xylA-R de E. coli foram crescidas por 12-15 horas a 37°C sobre placas de ágar contendo tetraciclina (30 mg/L) e ampicilina (150 mg/L). Então, o meio de fermentação contendo quer xilose (4%) quer mistura de xilose (2%) / glicose (2%) como uma fonte de carbono foram inoculadas com uma alça de cepas. A fermentação foi realizada em 2 mL de meio de fermentação contendo estreptomicina (50 mg/L) em tubos de ensaio de 20x200 mm. Células foram crescidas por 48 horas a 302°C com agitação a 250 rpm.

Após cultivo, a quantidade de L-triptofano que foi acumulada no meio foi determinada por TLC, placas de TLC de 10 cm x 15 cm revestidas com camadas de 0,11 mm de gel de sílica Sorbfil sem indicador fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Kranosdar, Rússia). As placas Sorbfil podem ser desenvolvidas com uma fase móvel: propan-2-ol: acetato de etila: amônia aquosa 25%: água = 40: 40: 7: 16 (v/v). Uma solução (2%) de ninhidrina em acetona foi usada como um reagente de visualização. Os resultados são apresentados na Tabela 7. Os componentes do meio de fermentação são mostrados na Tabela 5, mas devem ser esterilizados em grupos separados A, B, C, D, E, F, e H, como mostrado, para evitar interações adversas durante a esterilização.

Tabela 6:___________________________ __________________________________ | Solução A teve pH 7,1 ajustado por NH4OH.

Tabela 7______________________________________________________________________ Como pode ser visto da Tabela 7, expressão aumentada do locus xylABFGHR melhorou a produtividade da cepa SV164/pGH5/pMWl 19 de E. coli produzindo L-triptofano cultivada no meio contendo xilose.

Apesar da invenção ter sido descrita em detalhes com referência às formas de realização preferidas da mesma, será evidente para os versados na técnica que várias mudanças podem ser feitas, e equivalentes empregados, sem sair do escopo da invenção. Cada um dos documentos acima mencionados é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Bactéria transgênica produtora de L-aminoãcido do gênero Escherichia, caracterizada pelo falo de que a referida bactéria lem uma expressão aumentada dos genes do locus xylABFGHR por transformação com um vetor compreendendo os genes do locus xylABFGHR que se origina de uma bactéria pertencendo ao gênero Esdwrichkt, ou por modificação de um promotor ou sequência Shine-Dalgamo do locus xylABFGHR, em que os genes do locus xylABFGHR compreendem as sequências de nucleotídcos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 11.

2. Bactéria transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a bactéria é transformada com um vetor de baixo número de cópias hospedando o locus xylABFGHR.

3. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a bactéria transgênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, em um meio de cultura contendo uma mistura de açúcares glucose e pentose, e coletar o L-aminoácido do meio de cultura.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que os açúcares de pentose são arabinose e xilose.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a mistura de açúcares é uma mistura de carga de alimentação de açúcares obtidos da bi o massa celulósica.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato dc que o L-aminoácido a ser produzido c L-histidina.

7. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido a ser produzido é L-treonina.

8. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido a ser produzido é L-lisina.

9. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido a ser produzido é ácido L-glutâmico.

10. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido a ser produzido é L-triptofano.