BRPI1103673A2 - proteÍna de fusço, dna, vetor recombinante, cÉlula transformante, e, mÉtodos para produzir xilanase, uma soluÇço de aÇécar, uma substÂncia alvo, e para decompor um recurso de biomassa contendo xilano - Google Patents

Abstract

PROTEÍNA DE FUSçO, DNA, VETOR RECOMBINANTE, CÉLULA TRANSFORMANTE, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR XILANASE, UMA SOLUÇçO DE AÇéCAR, UMA SUBSTÂNCIA ALVO, E PARA DECOMPOR UM RECURSO DE BIOMASSA CONTENDO XILANO. Uma solução de açúcar é produzida pela reação de uma proteína mostrada no seguinte (A) ou (B) e uma enzima selecionada de uma celulase e de uma hemicelulase corri um recurso de biomassa contendo xilano para a produção de um sacarídeo: (A) uma proteína que tem a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 20, 22 ou 25 ou uma sequência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido da posição 56 para a posição 455 da SEQ ID Nº: 24 e tem uma atividade de xilanase, (B) uma proteína que tem a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 20, 22 ou 25, ou sequência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID Nº: 24, em que a sequência de aminoácido inclui substituições, anulações, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido e tem uma atividade de xilanase.

Description

"PROTEÍNA DE FUSÃO, DNA, VETOR RECOMBINANTE, CÉLULA TRANSFORMANTE, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR XILANASE, UMA SOLUÇÃO DE AÇÚCAR, UMA SUBSTÂNCIA ALVO, E PARA DECOMPOR UM RECURSO DE BIOMASSA CONTENDO XILANO" CAMPO TÉCNICO

A presente invenção diz respeito a xilanases e genes que codificam quanto aos mesmos, bem como ao uso destes. Mais precisamente, a presente invenção diz respeito a proteínas tendo uma atividade de xilanase derivadas de microorganismos que existem em composto de bagaço, que é um ambiente de bagaço altamente decomposto e um gene que codifica quanto à proteína, bem como ao uso destes. FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

A celulose é um polissacarídeo polimérico consistindo de resíduos de glicose ligados por intermédio de ligações 3-1,4-glicosídicas. Portanto, se estas ligações forem hidrolizadas, a glicose poderá ser obtida a partir da celulose e a celulose poderá ser eficazmente usada como uma fonte de fornecimento de glicose. Entretanto, a celulase é uma substância orgânica persistente e a biomassa celulósica não foi praticamente usada ainda. Esta é a celulase que é responsável para a reação que hidroliza eficazmente esta celulose. Portanto, pode ser dito que a melhora das características de celulase ou produção eficiente de celulase constitui a base de técnicas que dizem respeito ao uso eficaz de recursos de celulose e os genes de celulase foram isolados dos microorganismos.

Por exemplo, A Patente Japonesa aberta ao público (KOKAI) N0 8-56663 descreve que uma celulase objetiva é obtida pelo isolamento de um gene de celulase de uma cepa de Humicola insolens e introdução do gene de celulase em um microorganismo hospedeiro para sua expressão. Além disso, a patente japonesa aberta ao público N0 2000-210081 descreve um gene de celulase alcalina resistente ao calor derivado de uma bactéria Bacillus. Na biomassa celulósica, lignina e hemicelulose principalmente consistem de xilano estão circundando as fibras de celulose e a eliminação destes é importante para melhorar a eficiência de sacarificação de celulose por celulase. Nos métodos convencionais de sacarificação de biomassa celulósica, é tentado eliminar a lignina e hemicelulose por um pré-tratamento usando-se uma substância química tal como ácido sulfurico diluído. Entretanto, um tal pré-tratamento químico têm problemas que "este induz facilmente a decomposição excessiva de sacarídeos" e "sacarídeos que constituem hemicelulose não podem ser utilizados". Por outro lado, em estado natural, a biomassa celulósica é eficazmente decomposta pela cooperação de enzimas de decomposição de lignina, tal como manganês peroxidase, lignina peroxidase e lactase e enzimas de decomposição de hemicelulose, tais como xilanase, glucanase e pectinase produzidos por microorganismos com celulase.

Como um dos métodos para utilizar eficazmente a biomassa outros que não sacarificação de celulose, é conhecida a composição pela mistura de biomassa com fezes animais e permitindo a fermentação para produzir composto. Para os compostos, as fontes de nitrogênio, tais como uréia em excreções bem como aqueles derivados de células de microorganismo proliferados ou proteínas vegetais decompostas são importantes e fontes de carbono, tais como celulose são usados como uma fonte de energia para a proliferação de microorganismos e assim por diante. Portanto, para a composição de biomassa, é desejado que os microorganismos decomponham a biomassa de maneira altamente eficaz sejam acumulados e tais microorganismos têm uma enzima de decomposição adequada para decomposição da biomassa.

Entretanto, é dito que 99 % dos microorganismos que existem na terra e são organismos não cultivados, cuja estrutura é difícil e com métodos de avaliação convencionais usando-se um meio de ágar usual, as enzimas e os genes alvos são avaliados pela avaliação de apenas uma parte extremamente pequena de microorganismos que pode se desenvolver em um meio usado. Portanto, em anos recentes, a fim de encontrar enzimas úteis também de microorganismos dificilmente cultiváveis, A avaliação é realizada pelas técnicas de metagenoma (metagenômia), em que o DNA total é diretamente extraído de uma amostra, tal como um solo ambiental e clonado em um vetor para a preparação de uma biblioteca de DNA e a biblioteca é avaliada para um gene alvo. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é fornecer xilanase útil para a sacarificação de recursos de biomassa, tal como bagaço de cana de açúcar útil como biomassa celulósica e um gene destes, bem como métodos para a sua utilização.

A fim de atingir o objetivo mencionado acima, os inventores da presente invenção extraíram o DNA total do composto de bagaço preparado pela fermentação de uma mistura de bagaço de cana de açúcar e fezes bovinas acima de cerca de 6 meses, construiu uma biblioteca do DNA, avaliada na base da atividade de xilanase para obter recombinantes que apresentam a atividade de xilanase e genes de xilanase identificados. Além disso, foi observado que quando a proteína recombinante nova tendo a atividade de xilanase foi produzida usando-se um transformante transformado com um vetor recombinante contendo qualquer um dos genes de xilanase e adicionado a uma enzima de sacarificação de biomassa comercialmente disponível, uma taxa de sacarificação melhorada pode ser obtida em comparação com a taxa de sacarificação obtida com a enzima comercialmente disponível apenas e, desta maneira, realizou a presente invenção. Isto é, a presente invenção é como segue. (1) um DNA que codifica quanto a uma proteína mostrada no seguinte (A) ou (B):

(A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID Ν°: 20, 22 ou 25 ou uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 e tem uma atividade de xilanase,

(B) uma proteína que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24, em que a seqüência de aminoácido inclui substituições, anulações, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido e tem uma atividade de xilanase.

(2) O DNA como descrito acima, em que a seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 é uma seqüência de aminoácido da SEQ IDN°: 24.

(3) O DNA como descrito acima, que é um DNA mostrado no seguinte (a) ou (b):

(a) um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 19 ou 21 ou uma seqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos os resíduos de nucleotídeo de posições 166 a 1368 da SEQ ID N°: 23,

(b) um DNA que é capaz de hibridizar-se com uma sonda tendo uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 19 ou 21 ou uma seqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos os resíduos de nucleotídeo de posições 166 a 1368 da SEQ ID N0: 23 ou uma fonte que pode ser preparada da seqüência de nucleotídeo complementar sob condições estringentes e codifica quanto a uma proteína tendo uma atividade de xilanase.

(4) O DNA como descrito acima, em que a seqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos os resíduos de nucleotídeo de posições 166 a 1368 da SEQ ID N°: 23 é a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 23. (5) uma proteína mostrada no seguinte (A) ou (B):

(A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 e

tem uma atividade de xilanase,

(B) uma proteína que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24, em que a seqüência de aminoácido inclui substituições, anulações, inserções

ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido e tem uma atividade de xilanase.

(6) A proteína como descrita acima, em que a seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 é uma seqüência de aminoácido da SEQ

ID N°: 24.

(7) Uma proteína de fusão que compreende a proteína como descrita acima e um peptídeo selecionado de um peptídeo marcador, um peptídeo tag, um peptídeo de sinal de secreção e uma parte de qualquer um destes ligados juntos.

(8) Um DNA que codifica quanto a um proteína como descrita

acima.

(9) Um vetor recombinante contendo o DNA como descrito

acima.

(10) Uma célula transformante contendo o vetor

recombinante como descrito acima.

(11) Um método para produzir xilanase, que compreende cultivar a célula transformante como descrito acima em um meio e coletar uma proteína tendo uma atividade de xilanase da cultura obtida.

(12) Um método para produzir a xilanase como descrito acima, em que o vetor recombinante como descrito acima pode expressar uma proteína de fusão como descrito acima contendo um peptídeo de sinal de secreção, a célula transformante como descrito acima tem uma capacidade de secretar a proteína de fusão como descrito acima e uma proteína recombinante tendo uma atividade de xilanase é coletado a partir do sobrendante de cultura.

(13) Um método para a produção de uma solução de açúcar, que compreende permitir uma reação da proteína ou proteína de fusão como descrito acima, uma celulase e um recurso de biomassa contendo xilano para a produção de um sacarídeo.

(14) O método para produzir uma solução de açúcar

como descrito acima, em que a reação é realizada de 50 a 75° C.

(15) Um método for produzir uma substância alvo, que compreende cultivar um microorganismo que produz a substância alvo em um meio contendo uma solução de açúcar produzido pelo método como descrito

acima ou um produto de fracionamento deste como uma fonte de carbono e coletar a substância alvo da cultura.

(16) O método for produzir uma substância alvo como descrito acima, em que o microorganismo é uma bactéria escolhida de microorganismos que pertencem a Corynebacterium glutamicum ou

Escherichia coli.

(17) O método for produzir uma substância alvo como descrito acima, em que a substância alvo é um L-aminoácido.

(18) Um método para decompor um recurso de biomassa contendo xilano, que compreende permitir uma reação da proteína ou proteína

de fusão como descrito acima e o recurso de biomassa.

(19) O método para decompor um recurso de biomassa como descrito acima, em que a reação é realizada a 50 a 75° C.

A nova xilanase fornecida pela presente invenção, que é derivada de composto de bagaço, pode melhorar a eficiência de decomposição de recursos de biomassa, tal como bagaço, quando esta é usada junto com a celulase. Portanto, é útil para a produção de açúcares dos recursos de biomassa.

Em particular, visto que a xilanase de uma forma de realização preferida mostra uma temperatura de reação ótima alta e estabilidade ao calor superior, é útil para a sacarificação de bagaço, que requer um tratamento em uma temperatura alta para um período longo de tempo.

Além disso, o DNA da presente invenção é útil para a produção da xilanase como descrito acima. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Fig. 1 mostra as razões de sacarificação de bagaço obtido por xilanases no pH 5. O eixo vertical indica razões de sacarificação relativas de grupos de reação com a adição de xilanase com base naquele grupo de reação sem a adição de xilanase (NC). "NC" indica a adição de 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 5,0) e "Ρ", "XI1 -1", "XI1-2" e "XI1-5" indicam a adição de sobrenadantes de cultura de YDK010 introduzido com pPK4, cepa que expressa Xynl 1-1, cepa que expressa Xynl 1-2 e cepa que expressa Xynl 1-5 aos sistemas de reação, respectivamente. "XI4" indica a adição de NS50014 (Xynl4) e "X30" indica a adição de NS50030 (Xyn30) (o mesmo deve aplicar-se à Fig. 2).

A Fig. 2 mostra as razões de sacarificação de bagaço obtido por xilanases no pH 7.

A Fig. 3 mostra valores de reação de pH ótimos de novas xilanases e uma xilanase comercialmente disponível. O eixo vertical indica atividade específica em vários valores de pH com base na atividade da amostra que mostrou a quantidade de produção de açúcar máxima, que é tomada como 1.

A Fig. 4 mostra temperaturas de reação ótimas de novas xilanases e uma xilanase comercialmente disponível. O eixo vertical indica atividade específica em várias temperaturas de reação com base na atividade da amostra que mostrou a quantidade de produção de açúcar máxima, que é tomada como 1.

A Fig. 5 mostra estabilidade ao calor de novas xilanases e uma xilanase comercialmente disponível por um período curto de tempo (5 minutos). O eixo vertical indica atividade específica após o tratamento por calor em várias temperaturas de tratamento por calor com base na atividade média em amostras às quais uma solução enzimática não submetido ao tratamento por calor foi adicionada, que é tomada como 1. A enzima comercialmente disponível, Xyn 14, foi examinado após um tratamento por calor a 35, 50, 70 e 80° C.

A Fig. 6 mostra estabilidade ao calor de novas xilanases e uma xilanase comercialmente disponível por um período longo de tempo (16 horas). O eixo vertical indica atividade específica após o tratamento por calor em várias temperaturas de tratamento por calor com base na atividade média em amostras às quais uma solução enzimática não submetido ao tratamento por calor foi adicionada, que é tomada como 1.

Formas de Realização para Realizar a Invenção

A proteína da presente invenção é uma proteína tendo uma atividade de xilanase (daqui em diante também referido como "xilanase") e o DNA da presente invenção é um DNA que codifica quanto à proteína (daqui em diante também referido como "gene xilanase"). A xilanase pode ser xilanase por si só ou pode ser uma proteína de fusão que consiste de xilanase e um outro peptídeo ligado junto. Além disso, um gene xilanase pode ser um gene estrutural que codifica quanto à xilanase ou uma proteína de fusão de xilanase e um outro peptídeo e pode consistir de um tal gene estrutural e uma seqüência de controle de expressão, tal como promotor e terminador, ligado junto.

A atividade de xilanase significa uma atividade para decompor hemicelulose clivando-se as ligações P-l,4-glicosídicas entre os sacarídeos de xilose que constituem a estrutura de molécula de hemicelulose. Se a xilanase for deixada atuar em hemicelulose, xilano como o componente principal deste é decomposto e xilo-oligossacarídeos e xilose são gerados. Além disso, se as fibras de celulose que circundam a hemicelulose na biomassa celulósica forem decompostas por xilanase, a celulose se tornará facilmente decomposta por uma celulase.

A seguir, a presente invenção será explicada em detalhes.

<1> Xilanase e codificação de DNA para a mesma Os genes xilanases da presente invenção são DNAs

identificados como DNAs que codificam quanto a proteínas tendo uma atividade de xilanase de composto de bagaço pela clonagem de metagenoma. As seqüências de nucleotídeo de tais genes xilanase são mostrados como SEQ ID N°: 19, 21 e 23. As seqüências de aminoácido codificados por estes genes xilanase são mostrados como SEQID N°: 20, 22 e 24.

A xilanase da presente invenção inclui uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 20, 22 ou 24. Cada uma destas seqüências de aminoácido foi introduzida em SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) para predizer o peptídeo sinalizador. Como um resultado, foi predito que, em uma seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 24, a seqüência na lateral de terminal N do resíduo de aminoácido na posição 55 foi um peptídeo sinalizador. Então, uma proteína de fusão que consiste de um peptídeo dos resíduos de aminoácido de posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 e um peptídeo sinalizador de caminho Sec ou caminho Tat ligados juntos foram expressados em Corynebacterium glutamicum como mostrado nos exemplos, a proteína expressada apresentou uma atividade de xilanase. Portanto, a xilanase da presente invenção inclui uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24. Além disso, quando as proteínas de fusão que consistem de um peptídeo de uma seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 20 ou 22 e um peptídeo sinalizador de caminho Sec ou caminho Tat ligados juntos foram expressados da mesma maneira como descrito acima, ambas as proteínas de fusão apresentaram uma atividade de xilanase.

As seqüências de aminoácido da SEQ ID N°: 22 e 24 apresentam homologia alta uma à outra e a seqüência de consenso destas é mostrada como SEQ ID N°: 25. Entre os 410 resíduos de aminoácido da SEQ ID N°: 25, 336 resíduos de aminoácido são resíduos de aminoácidos comuns. Além disso, entre os 181 resíduos de aminoácido de posições 8 a 188 da SEQ ID N°: 25, 173 resíduos de aminoácido (95,6 %) são resíduos de aminoácido idênticos. Uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: também está incluída dentro do escopo da xilanase da presente invenção.

A xilanase da presente invenção pode ser uma variante conservativa de uma proteína tendo uma seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24, isto é, um homólogo, uma proteína artificialmente modificada ou semelhante de uma proteína tendo a seqüência de aminoácido mencionada acima. Isto é, a xilanase da presente invenção pode ser uma proteína tendo a seqüência de aminoácido já mencionada incluindo substituições, anulações, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido em uma ou diversas posições. Além disso, a primeira metionina (Met) contida nas seqüências de aminoácido já mencionadas pode ser anulada.

Embora o número do "um ou diversos" resíduos de aminoácido podem diferir dependendo da posição na estrutura tri-dimensional ou os tipos de resíduos de aminoácido da proteína, especificamente, pode ser preferivelmente de 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, ainda mais preferivelmente 1 a 5. Os exemplos típicos de mutação conservativa são substituições conservativas. A mutação conservativa em que a substituição acontece mutuamente entre Phe5 Trp e Tyr, se o local de substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, Ile e Vai, se este for um aminoácido hidrofóbico; entre Gln e Asn, se este for um aminoácido polar; entre Lys5 Arg e His, se este for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se este for um aminoácido ácido e entre Ser e Thr, se este for um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Os exemplos de substituições consideradas substituições conservativas incluem, especificamente, substituição de Ser ou Thr for Ala, substituição de Gln, His ou Lys para Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp para Asn, substituição de Asn, Glu ou Gln para Asp, substituição de Ser ou Ala para Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg para Gln, substituição de Gly, Asn, Gln, Lys ou Asp para Glu, substituição de Pro para Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr para His, substituição de Leu, Met, Val ou Phe para lie, substituição de lie, Met, Val ou Phe para Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg para Lys, substituição de lie, Leu, Val ou Phe para Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu para Phe, substituição de Thr ou Ala para Ser, substituição de Ser ou Ala para Thr, substituição de Phe ou Tyr para Trp, substituição de His, Phe ou Trp para Tyr e substituição de Met, Ile ou Leu para Vai.

Além disso, tal xilanase tendo uma mutação conservativa como descrito acima pode ser uma proteína que apresenta uma homologia de 80 % ou mais, preferivelmente 90 % ou mais, mais preferivelmente 95 % ou mais, ainda mais preferivelmente 97 % ou mais, particularmente preferível 99 % ou mais, a uma seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 e tendo uma atividade de xilanase.

Além disso, neste relatório descritivo, o termo "homologia" também significa "identidade". A xilanase da presente invenção preferivelmente tem as seguintes propriedades.

(1) pH da reação ótima: 5,5 a 7,5

valores de pH da reação ótima para Xynl 1-1, Xynl 1-2 e Xynl 1-5 descritos por último estão em torno de 7, em torno de 7,0 a 7,5, e em torno de 5,5 a 7,5, respectivamente.

(2) Temperatura de reação ótima: 65 a 80° C

Temperaturas de reação ótimas de Xynl 1-1, Xynl 1-2 e

Xynl 1-5 estão em torno de 65° C, em torno de 70° C e em torno de 75 a 80° C, respectivamente.

(3) Estabilidade ao calor: estável por cerca de 16 horas a 50° C

Xynl 1-1, Xynl 1-2 e Xynl 1-5 mantêm 80 % ou mais da

atividade após a retenção a 50° C por 16 horas. Em particular, Xynl 1-2 e Xynl 1-5 mantêm cerca de 60 % da atividade após a retenção a 65° C e 70° C, respectivamente, por 16 horas.

A xilanase da presente invenção pode ser uma proteína de fusão com um outro peptídeo. Os exemplos do outro peptídeo incluem um peptídeo marcador (proteína marcadora), um peptídeo tag, um peptídeo de sinal de secreção, e assim por diante. A ligação do peptídeo a uma xilanase pode consistir apenas de um tipo de peptídeo ou dois ou mais tipos de peptídeos. Quando a xilanase é uma proteína de fusão com um peptídeo sinalizador, após esta ser expressada em uma célula hospedeira que pode secretá-la, o peptídeo sinalizador é clivado e apenas uma porção de xilanase pode ser secretada da célula.

O peptídeo marcador não é particularmente limitado contanto que um peptídeo que pode funcionar como um marcador é escolhido e exemplos específicos incluem, por exemplo, fosfatase alcalina, região Fc de anticorpo, HRP, GFP, e assim por diante. Além disso, o peptídeo tag não é particularmente limitado e exemplos específicos incluem rótulos de peptídeo convencionalmente conhecidos, tais como rótulo Myc, rótulo His5 rótulo FLAG e rótulo GST. Além disso, o peptídeo de sinal de secreção não é particularmente limitado de modo que um peptídeo de sinal de secreção que pode funcionar em um hospedeiro em que um gene xilanase é expressado é escolhido e, por exemplo, quando uma bactéria corineforme é usada como o hospedeiro, os exemplos incluem peptídeos de sinal de secreção do caminho secretor do caminho Sec e caminho Tat de bactérias corineformes (refere-se ao WOO1/23591 e W02005/103278). Uma tal proteína de fusão pode ser preparada por métodos convencionais. Por exemplo, o rótulo His é útil para a purificação de uma

proteína tendo uma atividade de xilanase usando-se a afinidade entre Ni-NTA e o rótulo His, etc. ou produção de sobrenadante de cultura contendo uma proteína tendo uma atividade de xilanase em uma concentração alta.

O DNA da presente invenção codifica quanto à xilanase mencionada acima. Especificamente, o DNA da presente invenção inclui um DNA que codifica quanto a uma seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24. Além disso, este pode ser um DNA que codifica quanto a uma variante conservativa de uma proteína tendo qualquer uma destas seqüências de aminoácido.

Mais especificamente, os exemplos incluem um DNA tendo uma seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 19 ou 21 ou uma seqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos os resíduos de nucleotídeo de posições 166 a 1368 da SEQ ID N°: 23. Os exemplos de uma seqüência de nucleotídeo que compreende os resíduos de nucleotídeo de posições 166 a 1368 da SEQ ID N°: 23 incluem a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N0: 23. O DNA da presente invenção não é limitado a estes e este pode ser um DNA que corresponde a qualquer um dos DNAs acima em que um códon que codifica quanto a um certo resíduo de aminoácido é substituído por um outro códon equivalente que codifica quanto ao mesmo resíduo de aminoácido.

Além disso, o DNA da presente invenção também inclui um DNA que é capaz de hibridizar com uma sonda tendo uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 19 ou 21 ou uma seqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos os resíduos de nucleotídeo de posições 166 a 1368 da SEQ ID N°: 23 ou uma fonte que pode ser preparada da seqüência de nucleotídeo complementar sob condições estringentes e codifica quanto a uma proteína tendo uma atividade de xilanase. As "condições estringentes" referem-se à condições sob as quais um denominado híbrido específico é formado e um híbrido não específico não é formado. Os exemplos das condições estringentes incluem aqueles sob os quais os DNAs altamente homólogos hibridizam-se uns ao outros, por exemplo, DNAs não menos do que 80 % homólogos, preferivelmente não menos do que 90 % homólogos, mais preferivelmente não menos do que 95 % homólogos, ainda mais preferivelmente não menos do que 97 % homólogos, particularmente preferível não menos do que 99 % homólogos, hibridizam um ao outro e DNAs menos homólogos do que os acima do não hibridizam um ao outro, por exemplo, condições de hibridização a 42° C e lavagem com um tampão contendo 1 χ SSC e 0,1 % SDS a 42° C, mais preferivelmente, condições de hibridização a 65° C e lavagem com um tampão contendo 0,1 χ SSC e 0,1 % SDS a 65° C. Os fatores que afetam a estringência de hibridização incluem vários fatores além das condições de temperatura mencionadas acima e aqueles habilitados na técnica podem realizar a estringência equivalente à estringência de hibridização exemplificadas acima pela combinação apropriada dos vários fatores.

A sonda usada para a hibridização pode ser uma parte de uma seqüência que é complementar ao gene. Uma tal sonda pode ser preparada por PCR usando-se oligonucleotídeos preparados na base de uma seqüência genética conhecida como iniciadores e um fragmento de DNA contendo a seqüência de nucleotídeo como um padrão. Por exemplo, quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 bp é usado como uma sonda, as condições de lavagem de hibridização podem ser 50° C, 2 χ SSCeOjI % de SDS.

O DNA da presente invenção pode ser preparado por um método conhecido, tal como PCR ou hibridização de um DNA total derivado de, por exemplo, composto de bagaço produzido pela mistura de bagaço de cana de açúcar com vezes de vários animais, solo de terra cultivada aplicado com composto de bagaço, ligar de armazenamento de composto de bagaço, etc., ou semelhante na base da informação de seqüência de DNA divulgada neste relatório descritivo, etc. Além disso, o DNA da presente invenção também pode ser preparado pela síntese química na base da informação de DNA já mencionado.

Além disso, um gene xilanase pode incluir uma mutação de ocorrência natural devido a uma diferença individual ou diferença de espécies de um microorganismo (mutante ou variante) e um gene xilanase tendo uma tal mutação também está incluído dentro do escopo do DNA da presente invenção. Além disso, um gene que codifica quanto à variante conservativa de xilanase já mencionada pode ser obtido, por exemplo, pela modificação de uma seqüência de nucleotídeo de um gene xilanase pela mutagênese específica de local de modo que os resíduos de aminoácido em locais específicos da proteína codificada incluam substituições, anulações, inserções ou adições de resíduos de aminoácido. Além disso, um tal gene também pode ser obtido usando-se um meio de mutação conhecido, por exemplo, um kit de mutagênese comercialmente disponível.

Um DNA que codifica quanto a uma proteína de fusão de uma xilanase e um outro peptídeo pode ser construído pela ligação de um DNA que codifica quanto à xilanase e um DNA que codifica quanto ao outro peptídeo. Pela expressão do DNA, a proteína de fusão pode ser preparada. <2> Vetor recombinante

O vetor recombinante da presente invenção é um vetor recombinante contendo um gene xilanase. Um gene xilanase pode ser um DNA que codifica apenas quanto a xilanase ou pode ser um DNA que codifica quanto a uma tal proteína de fusão como descrito acima. O vetor recombinante não é particularmente limitado de modo que um gene xilanase seja incluído e pode ser construído pela inserção de um gene xilanase em um vetor arbitrário.

O vetor pode ser adequadamente escolhido de acordo com o hospedeiro usado. Os exemplos do hospedeiro inclui bactérias Escherichia, tais como Escherichia coli e bactérias corineformes. Os exemplos de vetor para bactérias corineformes incluem plasmídeos autonomamente replicáveis em bactérias corineformes, por exemplo, plasmídeo pCRY30 descrito na Patente Japonesa aberta ao público N0 3-210184; plasmídeos pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE e pCRY3KX descrito na Patente Japonesa aberta ao público N0 2-72876 e Patente U. S. N0 5,1.85,262; plasmídeos pCRY2 e pCRY3 descrito na Patente Japonesa aberta ao público N0 1-191686; pAM330 descrito na Patente Japonesa aberta ao público N0 58- 67679; pHM1519 descrito na Patente Japonesa aberta ao público N0 58- 77895; pAJ655, pAJ611 e pAJ1844 descrito na Patente Japonesa aberta ao público N0 58-192900; pCGI descrito na Patente Japonesa aberta ao público N0 57-134500; pCG2 descrito na Patente Japonesa aberta ao público N0 58- 35197; pCG4 e pCGll descritos na Patente Japonesa aberta ao público N0 57-183799; e outros.

Como um vetor que pode ser expressado em Escherichia coli, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 e assim por diante podem ser usados.

Embora o vetor não seja particularmente limitado, um vetor contendo um sistema de expressão que permita a expressão de xilanase em uma célula hospedeira é preferido. Os exemplos de um tal sistema de expressão inclui, por exemplo, sistemas de expressão derivados de cromossomos, epissomas e vírus, mais especificamente, vetores derivados de plasmídeos bacterianos e plasmídeos de levedura, os vetores derivados de fagos, transposons e combinação deste, por exemplo, aqueles derivados de elementos genéticos de plasmídeo e bacteriófago, tais como cosmídeo e fagomídeo. O sistema de expressão pode conter uma seqüência de controle que não apenas induz a expressão, mas também controle a expressão. Além disso, o sistema de expressão pode ser um sistema de

expressão de secreção contendo um sinal de secreção. Os exemplos de sistema de expressão de secreção de bactérias corineformes incluem o caminho de secreção geral (caminho Sec, refere-se ao WOO1/23591) com o qual uma proteína é dobrada no exterior da célula e o caminho de translocação de arginina dupla (caminho Tat, refere-se ao W02005/103278) com o qual uma proteína é dobrada no interior da célula e então secretada.

<3> Célula Transformante

A célula transformante da presente invenção contém o DNA ou vetor recombinante da presente invenção. A célula transformante significa uma célula obtida pela introdução do DNA ou vetor recombinante da presente invenção em uma célula hospedeira e o método para a introdução não é limitado.

Os exemplos da célula hospedeira incluem células procarióticas, por exemplo, bactéria Escherichia, tais como Escherichia coli, bactérias corineformes, tais como Corynebacterium glutamicum, actinomycetes, tais como bactérias Streptomyces, bactérias Bacillus, tais como Bacillus subtilis, bactérias Streptoeoeeus e bactérias Staphyloeoeeus, células eucarióticas, tais como e fungos Aspergillus, células de inseto, tais como célula S2 de drosófila, célula Sf9 de spodoptera e células de bicho-da- seda, células vegetais e assim por diante.

Como a célula hospedeira, em particular, várias células microbianas incluindo aquelas de Escherichia coli, bactérias corineformes e actinomycetes podem ser exemplificados.

A Eseheriehia coli em geral inclui aquelas cepas

freqüentemente usadas para a clonagem ou expressão de proteínas heterogêneas, por exemplo, HB101, MC1061, JM109, CJ236, MVl 184, seus derivados e assim por diante. As bactérias corineformes são bacilos de gram- positivo aeróbicos e incluem bactérias que foram previamente classificadas no gênero Brevibaeterium mas são presentemente unidos no gênero Corynebaeterium (Int. J. Syst. Bacteriol. 41:255 (1981)) e as bactárias que pertencem ao gênero Brevibaeterium, que estão intimamente relacionados ao gênero Corynebaeterium. As vantagens do uso de bactérias corineformes incluem o fato que estes secretam inerentemente uma quantidade extremamente pequena de proteínas no exterior das células em comparação com fungos, leveduras e bactérias Baeillus, que são convencionalmente considerados adequados para a secreção de proteínas e, portanto, o processo de purificação de uma proteína alvo produzida pela secreção pode ser simplificado ou eliminado e o fato que estes podem se desenvolver facilmente em um meio simples contendo um sacarídeo, amônia, sais minerais, etc. e, portanto, estes são excelentes em vista do custo de meio, método de cultura e produtividade de cultura.

Os exemplos específicos de tais bactérias corineformes incluem os seguintes: Corynebaeterium acetoaeidophilum

Corynebaeterium aeetogiutamicum Corynebaeterium alkanolytieum Corynebaeterium ealiunae Coiynebaeterium glutamieum Corynebacterium lilium Corynebacterium meiassecola Corynebacterium thermoaminogenes Corynebaeterium hereulis

Brevibaeterium divarieatum Brevibaeterium flavum

Brevibaeterium immariophilum

Brevibaeterium laetofermentum

Brevibaeterium roseum

Brevibaeterium saeeharolyticum

Brevibaeterium thiogenitalis

Corynebaeterium ammonia genes

Brevibaeterium álbum

Brevibaeterium eerinum

Mierobaeterium ammoniaphilum

Os exemplos específicos destas bactérias incluem as seguintes

cepas:

Corynebaeterium aeetoaeidophilum ATCC 13870 Corynebaeterium aeetoglutamieum ATCC 15806 Corynebaeterium alkanolytieum ATCC 21511 Corynebaeterium eallunae ATCC 15991 Corynebaeterium glutamieum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734

Corynebaeterium lilium ATCC 15990 Corynebaeterium meiassecola ATCC 17965 Corynebaeterium effieiens AJ12340 (FERM BP-1539) Corynebaeterium hereulis ATCC 13868 Brevibaeterium divarieatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJl2418 (FERM BP-2205) Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibaeterium roseum ATCC 13825 Brevibaeterium saceharolytieum ATCC 14066 Brevibaeterium thiogenitalis ATCC 19240 Genes Brevibaeterium ammonia ATCC 6871, ATCC 6872 Brevibaeterium álbum ATCC 15111

Brevibaeterium eerinum ATCC 15112 Mierobaeterium ammoniaphilum ATCC 15354 Em particular, a cepa Corynebaeterium glutamieum AJ12036 (refere-se a W002/081694), que foi isolada como uma cepa mutante resistente a estreptomicina (Sm) da cepa do tipo selvagem, Corynebaeterium glutamieum ATCC 13869, é predita ter uma mutação no gene funcional responsável pela secreção de proteínas e apresenta uma capacidade de produção de secreção extremamente alta para proteínas tão altas quanto cerca de 2 a 3 vezes em termos de quantidade acumulada de proteínas sob condições de cultura ótimas, em comparação com a cepa precursora (cepa do tipo selvagem) e portanto é preferido como uma bactéria hospedeira.

Além disso, o uso de uma cepa obtida pela modificação de uma cepa como descrito acima de modo que isto não produz as proteínas de camada de superfície celular quando o hospedeiro torna a purificação da proteína alvo secretada fácil e portanto é particularmente preferido. Tal modificação pode ser realizada pela introdução de uma mutação em uma região codificadora de proteína da camada de superfície celular ou uma região de controle de expressão deste em um cromossomo por mutagênese ou recombinação genética. Os exemplos de bactérias corineforme modificados de modo que estes não produzam proteínas de camada de superfície celular incluem a cepa de Corynebaeterium glutamieum YDKO10, que é uma cepa interrompida e proteína de superfície celular (PS2) da cepa AJ1203 6 (refere- se ao WOOl/23491).

Além disso, a xilanase pode ser produzida em um meio usando-se uma capacidade de secreção de proteína de Bacillus subtilis, levedura, Aspergillus bacterium, actinomycetes ou semelhante.

O método para a introdução do vetor de expressão recombinante na célula hospedeira pode ser um método convencionalmente usado. Os exemplos incluem vários métodos, tais como o método de célula competente, o método de protoplasto, o método de eletroporação, o método de microinjeção, o método de fusão de lipossoma, e assim por diante. Como o método para a introdução em bactérias corineformes, especificamente, por exemplo, o método de protoplasto (Gene, 39, 281-286 (1985)), o método de eletroporação (Bio/Technology, 7, 1067-1070, (1989)) e assim por diante podem ser usados, mas o método não é limitado a estes.

<3> Método para produzir xilanase

A xilanase pode ser produzida pela cultura de uma tal célula transformante como descrito acima em um meio e coletar uma proteína tendo uma atividade de xilanase da cultura obtida.

O meio para a cultura do transformante é conhecido e, por exemplo, para a cultura de E. coli, os meios de nutriente tais como o meio LB e o meio mínimo, tal como o meio M9 ao qual uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de vitamina etc. são adicionadas pode ser usada. O transformante é cultivado usualmente de 16 a 42° C, preferivelmente de 25 a 37° C, por 5 a 168 horas, preferivelmente 8 a 72 horas, dependendo do tipo de hospedeiro. Dependendo do tipo do hospedeiro, tanto a cultura em agitação quanto a cultura estacionária são possíveis e a agitação e a aeração também podem ser realizadas, se necessário. Quando uma bactéria corineforme é escolhida como o hospedeiro de expressão, como o meio, por exemplo, o meio CM2G e assim por diante pode ser usado. Além disso, as condições de cultura para a produção de L-aminoácido pelas bactérias corineformes e outras condições dadas nos métodos para a produção de proteínas usando-se um peptídeo sinalizador do caminho Sec ou do caminho Tat podem ser usados (refere-se ao WOOl/23591 e ao W02005/103278). Além disso, quando um promotor indutível é usado para a expressão de uma xilanase, a cultura também pode ser realizada com a adição de um indutor de promotor ao meio.

O método para coletar a xilanase da cultura não é particularmente limitado e um método conhecido pode ser usado. Quando a xilanase produzida é secretada, o sobrenadante de cultura da cultura também pode ser usado como é.

Os exemplos dos meios para purificar ou isolar a xilanase do sobrenadante de cultura incluem métodos conhecidos, por exemplo, precipitação de sulfato de amônio, precipitação de solvente usando-se etanol ou semelhante, diálise, ultrafiltração, extração de ácido e várias técnicas cromatográficas, tais como cromatografia de filtração em gel, cromatografia de troca de ânion ou cátion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxiapatita e cromatografia de lecitina e os exemplos preferidos incluem cromatografia líquida de alto desempenho e uma combinação destes. Os exemplos de carregador usado para a cromatografia de afinidade já mencionada include, por exemplo, um carregador ligado com anticorpos direcionados a uma xilanase e para o caso de ligação de um peptídeo tag a uma xilanase, um carregador ligado com uma substância que mostra afinidade ao peptídeo tag. Além disso, eletroforese de SDS poliacrilamida, focalização isoelétrica, e assim por diante também podem ser usados. O método para purificar uma xilanase também pode ser usado para a síntese de peptídeo.

Quando a xilanase é acumulada nas células transformantes, a xilanase pode ser purificada ou isolada a partir de um sobrenadante centrífugo de células interrompidas da maneira como descrito acima. Por exemplo, após a finalização da cultura do transformante, as células coletadas por centrifugação podem ser colocadas em suspensão em um tampão para o rompimento celular (20 a 100 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM de EDTA) e rompido por sonificação por cerca de 10 minutos usando-se um microchip de Branson MODEL-Sonifier 250 em um controle de saída de 7 e ciclo de trabalho de 50 %. Esta suspensão celular interrompida pode ser centrifugada a 12000 rpm por 10 minutos para a obtenção de um sobrenadante. Além disso, os precipitados obtidos por centrifugação também podem ser solubilizados com cloridreto de guanidínio ou uréia, se necessário e então purificado.

A atividade enzimática da xilanase obtida pode ser confirmada por um teste de sacarificação usando-se biomassa contendo xilano, tal como bagaço como o substrato. Além disso, a atividade da enzima purificada pode ser medida pelos métodos descritos na Patente Japonesa aberta ao público N0 2007-54050, Patente Japonesa N0 2759209 e Bailey et al., J. Biotech., 23, 257-270 (1992).

<4> Método para produzir solução de açúcar

Um recurso de biomassa contendo xilano pode ser decomposto permitindo uma reação de uma xilanase e o recurso de biomassa. Além disso, uma solução de açúcar pode ser obtida permitindo uma reação de uma xilanase, uma celulase e um recurso de biomassa contendo xilano para a produção de sacarídeos. A xilanase da presente invenção é um tipo de hemicelulase e além disso a uma xilanase da presente invenção, uma outra xilanase ou hemicelulase pode ser usada.

A celulase é uma enzima envolvida na hidrólise da ligação (1 -> 4)-3-glicosídica e inclui endoglucanase (EC3.2.1.4), que cliva a celulose amorfa dentro da molécula, exoglucanase (celobioidrolase, EC3.2.1.91), que cliva a ligação do sacarídeo da extremidade de celulose cristalina para a liberação de celobiose e 3-glucosidase (EC3.2.1.21), que gera glicose da extremidade da celobiose ou celooligosacarídeo. As celulases comercialmente disponíveis são vendidas como misturas de celulases tendo as atividades já mencionadas e as enzimas derivadas de AspergiUus niger ou Trichoderma reesei são freqüentemente usadas. Cellic Ctec (Novozymes), Celluclast (Novozymes A/S) e Novozyme 188 (Novozymes A/S) e Accellerase (Geneneor) são enzimas diásticas comercialmente disponíveis típicas que apresenta desempenho de custo superior. Outras enzimas comercialmente disponíveis incluem Meicelase (Meiji Seika Kaisha, Ltd.), e assim por diante. A atividade de celulase pode ser medida pela referência à Irwin et ai., Biotechnol Bioeng., 42, 1002-1013 (1993).

A hemicelulase é um termo genérico para referir-se a enzimas envolvidas na hidrólise de ligações glicosídicas contidas em hemicelulase. A hemicelulose inclui polissacarídeos que constituem paredes celulares de células vegetais do solo exceto para celulose e pectina. Os componentes de hemicelulose contém abundantemente xilano e os componentes principais de hemicelulase são endo-1,4-p-xilanase (EC 3.2.1.8), p-l,4-xilosidase (EC 3.2.1.37), e assim por diante, mas a hemicelulase também contém outras enzimas de hidrólise de ligação de glicosídeo. Os exemplos de hemicelulase comercialmente disponível incluem Cellic Htec (Novozymes). A hemicelulase também pode ser obtida da Genencore, Amano Enzyme, etc.

Os recursos de biomassa incluem biomassas celulósicas e/ou lignocelulósicas contendo componentes de hemicelulose, que são produzidos por plantas e algas. Os exemplos de tais biomassas incluem, por exemplo, bagaço, madeira, farinha de trigo, palha de trigo, palha de arroz, cascas, farinha de soja, polpa de soja, farinha de café, farinha de arroz, e assim por diante. Na presente invenção, é desejável usar bagaço. O bagaço é obtido como um resíduo após a extração do suco da cana açúcar.

Como o método para decomposição ou sacarificação de recursos de biomassa, métodos conhecidos podem ser usados. Por exemplo, embora o recurso de biomassa usado possa ser um produto seco ou um produto úmido, este é preferivelmente triturados a um tamanho de 100 a 1000 μηι anteriormente para aumentar a eficiência do processamento. Esta trituração pode ser realizada usando-se uma tal máquina como moinho de esferas, moinho de vibração, moinho cortador e moinho de martelos. O recurso de biomassa triturado por der decomposto ou sacarificado colocando- se o recurso de biomassa em suspensão em um meio aquoso, adição de uma xilanase da presente invenção e uma celulase à suspensão e aquecimento da mistura com agitação. A xilanase e a celulase podem ser simultaneamente adicionados ao recurso de biomassa ou após a xilanase ser adicionada ao recurso de biomassa para permitir a reação, a celulase pode ser adicionada para permitir a reação.

No método já mencionado, é suficiente que o pH e a temperatura da mistura de reação estejam em uma tal faixa que a xilanase e a celulase não sejam inativados. Entretanto, visto que a xilanase da presente invenção permita uma temperatura de reação alta ótima e estabilidade ao calor superior como descrito acima, a reação é preferivelmente realizada na temperatura de reação ótima ou uma temperatura em torno desta. Por exemplo, contanto que a reação seja, em geral, realizada sob pressão comum, a temperatura pode ser de 5 a 95° C, preferivelmente de 25 a 80° C, mais preferivelmente de 50 a 75° C, de 50 a 70° C, de 50 a 65° C ou de 50 a 55° C e o pH pode estar na faixa de 1 a 11, preferivelmente de 4 a 9. Por exemplo, no caso de usar Cellic Ctec (Novozymes) como a celulase, as condições são, por exemplo, de 35 a 55° C e pH 4,5 a 6,0. A quantidade da enzimas é, por exemplo, de 0,1 a 0,5 % (p/p TS, sólido total). O tempo de reação pode ser adequadamente ajustado de acordo com a quantidade de enzimas, e assim por diante.

A quantidade de enzima da xilanase da presente invenção não é particularmente limitada e esta pode ser apropriadamente determinada pela realização de um experimento preliminar ou semelhante.

A xilanase e a celulase podem ser simultaneamente deixadas atuar no recurso de biomassa ou após a xilanase ser deixada atuar no recurso de biomassa, a celulase pode ser deixada atuar no recurso de biomassa. Além disso, além disso da xilanase da presente invenção, uma outra xilanase ou hemicelulase também pode ser usada. Durante a reação, um ou mais tipos de uma xilanase da presente invenção, celulase e hemicelulase podem ser adicionalmente adicionadas.

Se o recurso de biomassa for decomposto como descrito acima, a glicose é principalmente gerada, mas tais sacarídeos como xilose, manose e arabinose também são geradas. A solução de açúcar obtida ainda pode ser submetida à isomerização ou decomposição por uma reação química ou uma reação enzimática dependendo do uso.

Dependendo do uso, a solução de açúcar obtida pode ser usada como é ou este também pode ser usado como um produto seco pela remoção de umidade. Os componentes na solução de açúcar também podem ser opcionalmente fracionados e usados.

Os produtos de fracionamento incluem produtos de purificação brutos e produtos de purificação. Os exemplos dos produtos de purificação incluem glicose.

<5> Método para produzir substância alvo

A solução de açúcar ou um produto de fracionamento deste, obtido pelo método já mencionado pode ser usado como, por exemplo, uma fonte de carbono na produção de uma substância alvo por fermentação. Os exemplos de uma substância alvo incluem, por exemplo, alcoóis, tais como metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol e butanodiol. Os exemplos de uma substância alvo também incluem ácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido succínico, ácido cítrico, aminoácidos e ácidos nucléicos.

Em particular, os exemplos do L-aminoácido incluem L-lisina, L-ornitina, L-arginina, L-histidina, L-citrulina, L-isoleucina, L-alanina, L- valina, L-leucina, L-glicina, L-treonina, L-serina, L-prolina, L-fenilalanina, L- tirosina, L-triptofano, L-cisteina, L-cistina, L-metionina, ácido L-glutâmico, ácido L-asparático, L-glutamina e L-asparagina.

Além disso, o L-aminoácido referido na presente invenção inclui derivados obtidos dos aminoácidos já mencionados como materiais de partida e os exemplos incluem GABA, p-hidróxi-D-fenilglicina, DOPA, ácido succínico, ácido málico e ácido pirúvico.

Os exemplos do ácido nucléico incluem nucleosídeos de purina, nucleotídeos de purina fe -assim por diante. Os nucleosídeos de purina incluem inosina, xantosina, guanosina, adenosina e assim por diante e os nucleotídeos de purina incluem 5'-fosfato ésteres dos nucleosídeos de purina, por exemplo, ácido inosínico, (inosino-5-fosfato, daqui em diante também referido como "IMP"), ácido xantílico (xantosino-5'-fosfato, daqui em diante também referido como "XMP"), ácido guanílico (guanosino-5'-monofosfato, daqui em diante também referido como "GMP"), ácido adenílico (adenosino- 5'-monofosfato, daqui em diante também referido como "AMP"), e assim por diante. O ácido nucléico referido na presente invenção inclui os derivados de ácido nucléico obtidos dos ácidos nucléicos já mencionados como materiais de partida e os exemplos incluem Ara- (uracil arabinosida), ZVA (Z- valaciclovir), e assim por diante.

A substância alvo produzida de acordo com a presente invenção pode consistir de um ou dois ou mais tipos de substâncias.

(5-1) Microorganismos utilizáveis para a produção de uma substância alvo

O microorganismo usado para a produção de uma substância alvo não é particularmente limitado, de modo que um microorganismo tenha uma capacidade de utilizar açúcar que pode ser obtido pelo método descrito acima, tal como glicose e uma capacidade para a produção de uma substância alvo e é capaz de acumular uma em um meio líquido ou células microbianas quando estas são cultivadas no meio. A quantidade da substância alvo a ser acumulada não é particularmente limitada de modo que esta possa ser acumulada de uma tal quantidade que esta possa ser coletada do meio.

Como o microorganismo usado para a presente invenção ou uma cepa precursora que é usada para derivar o microorganismo, microorganismos que pertencem à família Enterobacteriaceae, cujos exemplos típicos são bactérias Eseherichia e bactérias Pantoea, bactérias corineformes, e assim por diante podem ser usados. Além disso os exemplos de microorganismos que pertencem à família Enterobaeteriaceae incluem enterobactérias que pertencem às γ-proteobactérias, tais como aquelas que pertencem ao gênero Enterobaeter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella, Morganella, ou semelhante e exemplos de outros microorganismos incluem bactérias Alicyclobacillus, bactérias Bacillus, leveduras que pertencem ao gênero Saccharomyces, Candida ou semelhante, e assim por diante.

Como as bactérias Eseheriehia, aquelas descritas no trabalho de Neidhardt et al. (Neidhardt, F.C. et al., Eseheriehia eoli e Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, tabela 1), tais como Eseheriehia eoli, podem ser utilizados. Os exemplos de cepas do tipo selvagem de Eseheriehia eoli incluem, por exemplo, a cepa Kl2 e seus derivados, a cepa MG1655 de Eseheriehia eoli (ATCC N0 47076), cepa W3110 (ATCC N0 27325), e assim por diante. Estes estão disponíveis a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). Isto é, os números de registro são dados a cada uma das cepas e as cepas podem ser ordenadas usando-se estes números de registro. Os números de registro das cepas são listados no catálogo da American Type Culture Collection (referência a http://www.ATCC.org/).

Além disso, os exemplos das bactérias Enterobacter incluem Enterobacter aggiomerans, Enterobaeter aerogenes e assim por diante e os exemplos das bactérias Pantoea incluem Pantoea ananatis. Algumas espécies de Enterobacter aggiomerans foram recentemente re-classificadas em Pantoea aggiomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii ou semelhante, com base na seqüência de análise de nucleotídeo 16S rRNA, etc. Tanto as bactérias Enterobacter quanto as bactérias Pantoea podem ser usadas contanto que a bactéria escolhida seja classificada na família Enterobacteriaceae. Quando uma cepa Pantoea ananatis for criada por uma técnica de engenharia genética, a cepa AJl 3355 de Pantoea ananatis (FERM BP-6614), cepa AJ13356 (FERM BP-6615), cepa AJ13601 (FERM BP-7207) e seus derivados podem ser usados. Estas cepas foram identificadas como Enterobacter aggiomerans quando estas foram isoladas e depositadas como Enterobacter aggiomerans. Entretanto, estas foram recentemente re- classificadas como Pantoea ananatis na base do sequenciamento de nucleotídeo de 16S rRNA e assim por diante como descrito acima. As bactérias corineformes são um grupo de microorganisms

definidos em Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8o Ed., p.599 (1974) e microorganismos classificados em tais bacilos rápidos de gram- positivo não ácidos aeróbicos que são incapazes de sofre esporulação podem ser usados. As bactérias corineformes incluem bactérias que foram previamente classificadas o gênero Brevibacterium mas são presentemente unidas no gênero Corynebacterium (Int. J. Syst. Bacteriol. 41:255 (1991)) e as bactérias que pertencem ao gênero Brevibacterium ou Microbacterium, que estão intimamente relacionados ao gênero Corynebacterium.

Os exemplos específicos de tais bactérias corineformes incluem o seguinte:

Coiynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium aeetoglutamicum Corynebacterium alkanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebaeterium melasseeola

Corynebaeterium thermoaminogenes (Corynebaeterium

effieiens)

Corynebaeterium hereulis Brevibaeterium divarieatum Brevibaeterium flavum Brevibaeterium immariophilum Brevibaeterium laetofermentum Brevibaeterium roseum Brevibaeterium saeeharolytieum Brevibaeterium thiogenitalis Corynebaeterium ammoniagenes Brevibaeterium álbum Brevibaeterium eerinum Mierobaeterium ammoniaphilum

Os exemplos específicos destas bactérias incluem as seguintes

cepas:

Corynebaeterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebaeterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebaeterium alkanolytieum ATCC 21511 Corynebaeterium eallunae ATCC 15991 Corynebaeterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032,

ATCC 13060

Corynebaeterium lilium ATCC 15990 Corynebaeterium melasseeola ATCC 17965 Corymebaeterium effieiens AJ12340 (FERM BP-1539) Corynebaeterium hereulis ATCC 13868 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJl 2418 (FERM BP-2205)

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 BrevibacteriumlactofermentumATCC 13869

(Corynebaeterium glutamieum ATCC 13869) Brevibaeterium roseum ATCC 13825 Brevibaeterium saceharolytieum ATCC 14066 Brevibaeterium thiogenitalis ATCC 19240 Genes de Brevibaeterium ammonia ATCC 6871, ATCC 6872

Brevibaeterium álbum ATCC 15111 Brevibaeterium eerinum ATCC 15112 Mierobaeterium ammoniaphilum ATCC 15354 Estas cepas estão disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (ATCC) (Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 2010812301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America). A cepa AJ12340 foi depositada em 27 de outubro de 1987 no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry (currently independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), com um número de acessão de FERM BP-1539 sob as cláusulas de Budapest Treaty. A cepa AJ12418 foi depositada em 5 de janeiro de 1989 no National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Economy, Trade and Industry com um número de acessão de FERM BP-2205 sob as cláusulas do Budapest Treaty.

Quando as bactérias de BaciUus são usadas, os exemplos destas incluem Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaeiens, Bacillus pumilus, e assim por diante.

Os exemplos de Bacillus subtilis incluem a cepa Bacillus subtilis 168 Marburg (ATCC 6051), cepa Bacillus subtilis PY79 (Plasmide, 1984, 12, 1-9), e assim por diante. Os exemplos de Bacillus amyloliquefaeiens incluem a cepa Bacillus amyloliquefaeiens T (ATCC 23842), cepa Bacillus amyloliquefaeiens N (ATCC 23845), e assim por diante.

Os exemplos de Bacillus pumilus incluem Bacillus pumilus Gottheil N0 3218 (ATCC 21005) (Patente U.S. N0 3,616,206), e assim por diante.

A seguir, os métodos para comunicar uma capacidade de produzir L-aminoácido ou ácido nucléico a tais cepas precursoras como mencionado acima são descritos.

Para comunicar a capacidade de produzir um L-aminoácido, os métodos convencionalmente utilizados na criação de bactérias corineformes ou bactérias do gênero Eseheriehia (ver "Amino Acid Fermentation", Gakkai Shuppan Center (Ltd.), Io Edição publicada em 30 de maio de 1986, pp. 77- 100) podem ser usados. Tais métodos incluem métodos de adquirir mutantes auxotróficos, cepas resistentes a L-aminoácido ou mutantes de regulação metabólica ou construção de uma cepa recombinante de modo que esta super- expresse uma enzima de biossíntese de L-aminoácido. Aqui, na criação de bactérias produtoras de L-aminoácido, uma ou mais das propriedades descritas acima, tais como auxotrofia, resistência análoga ou mutação de regulação metabólica podem ser prejudicadas. A expressão de uma ou mais enzimas de biossíntese de L-aminoácido podem ser intensificadas. Além disso, os métodos de comunicar propriedades, tais como uma mutação auxotrófica, resistência análoga ou mutação de regulação metabólica podem ser combinados com os métodos de intensificar a biossíntese de enzimas.

Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente ao análogo de L-aminoácido ou cepa mutante de regulação metabólica com uma capacidade de produzir um L-aminoácido pode ser obtido submetendo-se uma cepa precursora ou cepa do tipo selvagem a uma mutagênese convencional, tal como exposição aos raios X ou irradiação UV ou tratamento com um mutagênio, tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, etc. e então selecionar aqueles que apresentam uma autotrofia, resistência análoga ou mutação de regulação metabólica e que também tem a capacidade de produzir um L-aminoácido a partir das cepas mutantes obtidas.

Além disso, a capacidade de produzir L-aminoácido também pode ser comunicada ou intensificada pelo aumento da atividade enzimática pela recombinação genética. Um exemplo do método para aumentar a atividade enzimática inclui modificar a bactéria de modo que a expressão de um gene que codifica quanto a uma enzima envolvida na biossíntese de um L- aminoácido é intensificada. A expressão genética também pode ser aumentada pela introdução de um plasmídeo de amplificação preparado pela introdução de um fragmento de DNA contendo o gene em um plasmídeo apropriado que contém, por exemplo, pelo menos um gene responsável pela replicação e proliferação do plasmídeo no microorganismo, aumentando-se o número de cópias do gene no cromossomo pela conjugação, transferência ou semelhante ou introdução de uma mutação na região promotora do gene (refere-se à Publicação Internacional W095/34672).

Quando um gene de objetivo é introduzido no plasmídeo ou cromossomo de amplificação já mencionado, qualquer promotor pode ser usado para expressar o gene contanto que o promotor escolhido funcione nas bactérias que pertençam às bactérias corineformes. O promotor pode ser o promotor natural para o gene ou um promotor modificado. A expressão de um gene também pode ser controlada adequadamente escolhendo-se um promotor que funcione fortemente nas bactérias que pertencem às bactérias corineformes ou pela realização de regiões -35 e -10 do promotor mais próximo à seqüência de consenso. Estes métodos para intensificar a expressão de genes de enzima são totalmente descritos na Publicação Internacional WOOO/18935, Publicação de Patente Européia N0 1010755, e assim por diante.

Os métodos específicos para comunicar uma capacidade produtora de L-aminoácido à bactérias e bactérias comunicadas com a capacidade de produzir L-aminoácido são exemplificadas abaixo.

Bactéria produtora de L-treonina

Os exemplos preferidos de microorganismos tendo capacidade de produção de L-treonina incluem bactérias em que uma ou mais atividades de enzimas do sistema de biossíntese de L-treonina são intensificadas. Os exemplos de enzimas biossintéticas de L-treonina incluem aspartocinase III (IysC), aspartato semialdeído desidrogenase (asd), aspartocinase I (thrA), homoserina cinase (thrB) e treonina sintase (thrC) codificado pelo operon e aspartato aminotransferase (aspartato transaminase) (aspC). A abreviação dos genes são descritos nos parêteses (o mesmo deve aplicar-se por todo este relatório descritivo). Entre estas enzimas, aspartato semialdeído desidrogenase, aspartocinase I, homoserina cinase, aspartato aminotransferase e treonina sintase são os exemplos particularmente preferidos. Os genes que codificam quanto ao enzimas biossintéticas de L-treonina podem ser itnroduzidos em uma bactéria Escherichia que tem uma capacidade reduzida para decompor a treonina. Um exemplo de uma tal bactéria Eseherichia tendo uma capacidade reduzida para a decomposição da treonina é a cepa TDH6 que é deficiente na atividade de treonina desidrogenase (Patente Japonesa aberta ao público N0 2001-346578).

As atividades enzimáticas das enzimas biossintéticas de L- treonina são inibidas pelo produto final, L-treonina. Portanto, para a construção de cepas produtoras de L-treonina, é desejável que os genes para as enzimas biossintéticas de L-treonina são modificadas de modo que as enzimas são dessensibilizadas para a inibição de regeneração por L-treonina nas cepas produtoras de L-treonina. Os genes de thrA, thrB e thrC já mencionados constituem o operon de treonina que forma uma estrutura atenuadora. A expressão do operon de treonina é inibido pela isoleucina e pela treonina no meio de cultura e também suprimido pela atenuação. A modificação do operon pode ser ligado pela remoção da seqüência líder na região de atenuação ou o atenuador (referência a Lynn, S.P. et al., J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); W002/26993; W02005/049808).

O promotor natural do operon de treonina está presente a montante do operon de treonina e pode ser substituído por um promotor não natural (referência a W098/04715) ou um operon de treonina que foi modificado de modo que a expressão do gene de biossíntese de treonina é controlada pelo repressor e promotor de λ-fago pode ser construído (EP 0593792). Além disso, a fim de modificar uma bactéria de modo que esta seja dessensibilizada para a inibição de regeneração por L-treonina, uma cepa resistente ao ácido a-amino-p-hidroxiisovalérico (AHV) pode ser selecionada.

É preferível que o número de cópia do operon de treonina que é modificado para dessensibilizar quanto à inibição de regeneração por L- treonina seja aumentado ou a expressão do operon de treonina é aumentado pela sua ligação a um promotor potente. O número de cópias também pode ser aumentado, além da amplificação usando-se um plasmídeo, pela transferência do operon de treonina a um genoma usando-se um transposon, Mu-fago ou semelhante.

Outras enzimas que não as biossintéticas de L-treonina, os genes envolvidos no caminho glicolítico, ciclo de TCA ou cadeia respiratória, os genes que regulam a expressão dos genes ou os genes envolvidos na absorção de açúcar também podem ser preferivelmente intensificados. Os exemplos de tais genes incluem os genes que codificam transidrogenase (pntAB, EP 733712 B), fosfoenolpiruvato carboxilase (pepC, W095/06114), fosfoenolpiruvato sintase (pps, EP 877090 B) e um gene que codifica piruvato carboxilase da bactéria corineforme ou bactéria Bacillus (W099/18228, EP 1092776 Α).

Também é preferível intensificar a expressão de um gene que comunica resistência à L-treonina ou L-homoserina ou comunicam resistência à L-treonina ou L-homoserina ao hospedeiro. Os exemplos do gene que comunica tal resistência inclui inclui o gene rhtA (Livshits, V.A. et al., 2003, Res. Microbiol., 154:123-135), rhtB (EP 0994190 A), gene rhtC (EP 1013765 A), genes yfiK e yeaS (EP 1016710 A). Os métodos para comunicar resistência de L-treonina a um hospedeiro descrito na EP 0994190 A e W090/04636.

Os exemplos de bactérias produtoras de L-treonina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar tais bactérias incluem, mas não limitam-se a cepas que pertencem ao gênero Escherichia, tais como E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patente U. S. N0 5,175,107, Patente U. S. N0 5,705,371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (Patente U. S. N0 5,631,157), E. coli NRRL-21593 (Patente U. S. N0 5,939,307), E. coli FERM BP-3756 (Patente U. S. N0 5,474,918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP- 3520 (Patente U. S. N0 5,376,538), E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978)), E. coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A) e assim por diante.

A cepa TDH-6 é deficiente no gene thrC, bm como sendo assimiladora de sacarose e o gene UvA teve uma mutação leaky. Esta cepa também tem uma mutação no gene rhtA, que comunica resistência à concentração alta de treonina ou homoserina. A cepa B-3996 contém o plasmídeo pVIC40, que foi obtido pela inserção do operon thrA*BC, incluindo um gene thrA mutante, no vetor derivado de RSFl010. Este gene thrA mutante codifica aspartocinase homoserina desidrogenase I que é substancialmente dessensibilizado quanto à inibição de regeneração por treonina. A cepa B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 na All- Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Rússia) sob o número de acessão RIA 1867. A cepa também foi depositada at the Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Rússia) on April 7, 1987 sob o número de acessão VKPM B-3996.

E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792 B) também pode ser usado como uma bactéria que produz L-treonina ou uma cepa precursora para a sua derivação. A cepa B-5318 é prototrófico com respeito à isoleucina e um repressor de Cl de lambdafago sensível à temperatura e o promotor de PR substitui a região reguladora do operon treonina no plasmídeo pVIC40. A cepa VKPM B-5318 foi depositada como um depósito internacional na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Rússia) em 3 de maio 1990 sob o número de acessão de VKPM B-5318.

O gene thrA que codifica aspartocinase homoserina desidrogenase I de Escherichia coli é um gene que localiza nos números de nucleotídeo de 337 a 2,799 na seqüência de genoma da cepa de Eseheriehia coli MGl 655 registrada sob o Acessão Genbank N0 U00096 e que codifica quanto à proteína registrada sob Acessão GenBank N0 AAC73113. O gene thrB que codifica homoserina cinase de Escherichia coli é um gene que localiza-se nos números de nuleotídeo de 2.801 a 3.733 na seqüência genômica de Escherichia coli. A cepa MGl655 registrada sob Acessão Genbank N0 U00096 e que codifica quanto à proteína registrada sob Acessão GenBank N0 AAC73114. O gene thrC que codifica treonina sintase de Escherichia coli é um gene que localiza-se nos membros de nucleotídeo 3.734 a 5.020 na seqüência genômica da cepa de Escherichia coli MG1655 registrada sob Acessão GenBank N0 U00096 e que codifica quanto à proteína registrada sob Acessão GenBank N0 AAC73115. Estes três genes são codificados quanto ao operon de treonina que consiste de thrLABC a jusante do gene thrL que codifica quanto ao peptídeo líder. Para intensificar a expressão de operon de treonina, a região atenuadora que afeta a transcrição é desejavelmente removida do operon (W02005/049808, W02003/097839).

Um gene thrA mutante que codifica para a aspartocinase homoserina desidrogenase I resistante à inibição de regeneração por treonina, bem como os genes thrB e thrC podem ser obtidos como um operon do plasmídeo pVIC40 bem conhecido, que está presente na cepa de E. coli produtora de treonina VKPM B-3996. O pVIC40 é descrito em detalhes na Patente U. S. N0 5, 705,371.

O gene rhtA é um gene obtido como um gene que comunica resistência à homoserina e treonina (rht: resistente a treonina/homoserina), que se localizam nos números de nucleotídeo de 848.433 a 849.320 (filamento complementar) na seqüência genômica da cepa de Escherichia coli MGl655 sob Acessão GenBank N0 U00096 e que codifica quanto à proteína registrada sob Acessão GenBank N0 AAC73900. Também, foi revelado que a mutação de rhtA23 é uma substituição A-for-G na posição -1 com respeito ao códon inicial ATG

(Livshits, V.A. et ai., 2003, Res. Microbiol., 154:123-135, EP

1013765 A).

O gene asd de E. coli é um gene que localiza-se nos números de nucleotídeo de 3.571.798 a 3.572.901 (filamento complementar) na seqüência de genoma da cepa Eseheriehia coli MGl655 registrada sob Acessão GenBank N0 U00096 e que codifica quanto à proteína registrada sob Acessão GenBank N0 AAC76458. Isto pode ser obtido por PCR (referência a White, TJ. et al., 1989, Trends Genet, 5:185-189) que utilizam iniciadores preparados com base em uma seqüência de nucleotídeo do gene. Os genes asd para outros microorganismos também podem ser obtidos de uma maneira similar.

O gene aspC de E. coli is a gene locating at the nucleotide numbers 983,742 to 984,932 (filamento complementar) on the genome sequence of the Escherichia coli MG1655 strain registrada sob Acessão GenBank N0 U00096 E que codifica quanto à proteína registrada sob Acessão GenBank N0 AAC74014 e pode ser obtido por PCR. Os genes aspC de outros microorganismos também pode ser obtido de uma maneira similar.

Bactérias Produtoras De L-Lisina

As bactérias produtoras de L-Lisina e métodos para a sua construção são exemplificados abaixo.

Os exemplos de cepas tendo capacidade produtora de L-Iisina incluem, por exemplo, cepas resistentes a análogo de L-Iisina e cepas mutantes de regulação metabólica. Os exemplos de análogo de L-Iisina incluem, mas não limitam-se a, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2- aminoetil)-L-cisteína (também abreviado como "AEC" a seguir), γ- metillisina, α-clorocaprolactam e assim por diante. As cepas mutantes tendo resistência tendo resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidas submetendo-se uma bactéria que pertence à família Enterobaeteriaeeae ou uma bactéria corineforme a um tratamento de mutagênese artificial convencional. Os exemplos específicos de bactérias produtoras de L- lisinaincluem cepa de Eseheriehia coli AJl 1442 (FERM BP-1543, NRRL B- 12185, ver Patente Japonesa aberta ao público N0 56-18596 e Patente U. S. N0 4,346,170), cepa de Eseheriehia coli VL611 (Patente Japonesa aberta ao público N0 2000-189180), e assim por diante. Como um Escherichia coli produtor de L-lisina, a cepa de WC196 também pode ser usada (ver Publicação Internacional W096/17930).

Além disso, uma bactéria produtora de L-lisina também pode ser construída pelo aumento da atividade da enzima de sistema de biossíntese de L-lisina. O aumento de atividade de uma tal enzima pode ser atingida pelo aumento do número de cópia do gene que codifica quanto à enzima em células ou pela modificação de uma seqüência de controle expressão destes.

Um gene pode ser modificado para intensificar a expressão, por exemplo, aumentando-se o número de cópia do gene nas células por meio de técnicas de recombinação genética. Por exemplo, um DNA recombinante pode ser preparado pela ligação de um fragmento de DNA contendo o gene gapA com um vetor, preferivelmente um vetor de multi-cópia, que é capaz de funcionar em um microorganismo hospedeiro e introduzido em uma bactéria para a sua transformação.

O aumento de número de cópias de um gene também pode ser atingido pela introdução de cópias múltiplas do gene em um DNA genômico de uma bactéria. A fim de introduzir cópias múltiplas de um gene em um DNA genômico de uma bactéria, a recombinação homóloga é realizada usando-se uma seqüência cujas cópias múltiplas existem no DNA genômico como alvos. Como seqüências cujas cópias múltiplas existem m DNA genômico, DNA repetitivo e repetições invertidas que existem no final de um elemento cambiável podem ser usadas. Um outro gene pode ser introduzido além do gene gapA gene que existe em um genoma in tandem ou este pode ser introduzido em um gene não necessário em um genoma em um número plural. Tal transferência genética pode ser atingida usando-se um vetor sensível a temperatura ou um vetor e integração.

Alternativamente, como divulgado na Patente Japonesa aberta ao público N0 2-109985, também é possível incorporar o gene em um transposon e o permitem transferência para a introdução de cópias múltiplas dos genes em um DNA genômico. A transferência do gene ao genoma pode ser confirmada pela realização da hibridização de Southern usando-se uma parte do gene como uma sonda. Além disso, além do aumento já mencionado do número de

cópia genética, a expressão de gene pode ser intensificada pela substituição de uma seqüência de controle de expressão, tal como um promotor do gene em um DNA genômico ou plasmídeo por uma mais forte, realizando-se as regiões -35 e -10 do gene mais próximo à seqüência de consenso, pela amplificação de um regulador que aumenta a expressão do gene ou pela anulação ou atenuação de um regulador que diminui a expressão do gene de acordo com os métodos descritos na International Publication WOOO/18935. Por exemplo, o promotor lac, promotor trp, promotor trc, promoor tac, promotor araBA, promotor PR de lambda fago PR e promotor PL, promotor tet, promotor T7, promotor Φ10, e assim por diante são conhecidos como promotores fortes. Um promotor ou região SD do gene gapA também pode ser modificado a fim de tornar-se mais forte pela introdução de uma substituição de nucleotídeo ou semelhante. Os exemplos de método para avaliar a concentração de um promotor e os promotores fortes são descritos no documento de Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128) e assim por diante. Além disso, é conhecido que a substituição de diversos nucleotídeos em um espaçador entre o local de ligação de ribossoma (RBS) e códon de início de tradução, especialmente uma seqüência imediatamente a montante do códon de iniciação, afeta grandemente a eficiência de tradução de mRNA e portanto esta seqüência pode ser modificada. As regiões de controle de expressão, tal como um promotor de um gene também pode ser identificado usando-se um vetor de pesquisa de promotor ou software de análise de gene, tal como GENETYX. Por tal substituição ou modificação de promotor como descrito acima, a expressão de um gene é intensificada. A substituição de uma seqüência de controle de expressão também pode ser atingido, por exemplo, por um método usando-se um plasmídeo sensível à temperatura ou integração conduzida por Red (W02005/010175).

Os exemplos de genes que codificam quanto a enzimas biossintéticas de L-Iisina incluem genes que codificam quanto a enzimas do caminho de diaminopimelato, tais como gene de diidrodipicolinato sintase (dapA), gene de aspartocinase (IysC), gene de diidrodipicolinato redutase (dapB), gene de diaminopimelato descarboxilase (IysA), gene de diaminopimelato desidrogenase (ddh) (W096/40934 para todos os genes precedentes), gene de fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) (Patente Japonesa aberta ao público N0 60-87788), gene de aspartato aminotransferase (aspC) (Patente Japonesa Publication (Kokoku) N0 6-102028), gene de diaminopimelato epimerase (dapF) (Patente Japonesa aberta ao público N0 2003-135066) e gene de aspartato semialdeído desidrogenease (asd) (WOOO/61723) e genes que codificam quanto a enzimas do caminho de ácido aminoadípico, tal como gene de homoaconitato hidratase (Patente Japonesa aberta ao público N0 2000-157276). Além disso, a cepa precursora pode apresentar um nível aumentado de expressão do gene envolvido na eficiência de energia (cyo) (EP 1170376 A), o gene que codifica quanto a nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (pntAB) (Patente U. S. N0 5,830,716), o gene ybjE gene que codifica quanto a uma proteína que tenha atividade de excreção de L- lisina (W02005/073390), o gene que codifica quanto a glutamato desidrogenase (gdhA) (Valle F. et al., 1983, Gene 23:199-209) ou uma combinação arbitrária destes. As abreviaçõs para os genes são mostrados nos parênteses.

É conhecido que a diidrodipicolinato sintase do tipo selvagem derivado de Escherichia coli sofre da inibição da regeneração por L-Iisina e é conhecido que a aspartocinase derivada de Escherichia coli sofre de suppressão e inibição de regeneração por L-lisina. Portanto, quando o gene dapA e o gene IysC são usados, estes genes são, preferivelmente, genes que codificam quanto a enzimas mutantes mutant dessensibilizadas para a inibição de regeneração por L-lisina.

Os exemplos de DNA que codificam uma diidrodipicolinato sintase mutante dessensibilizada para a inibição de regeneração por L-lisina incluem um DNA que codifica uma tal proteína tendo uma seqüência de aminoácido em que o resíduo de histidina na posição 118 é substituída pelo resíduo de tirosina. Os exemplos de DNA que codificam aspartocinase mutante dessensibilizado para a inibição de regeneração por L-lisina inclui um DNA que codifica um AKIII tendo uma seqüência de aminoácido em que o resíduo de treonina na posição 352, o redísuo de glicina na posição 323 e o resíduo de metionina na posição 318 são substituídos por resíduos de isoleucina, asparagina e isoleucina, respectivamente (para estes mutantes, ver Patente U. S. N0 5,661,012 e 6,040,160). Tais DNAs mutantes podem ser obtidos pela mutagênese específica de local usando-se PCR ou semelhante.

Os plasmídeos de faixa de hospedeiro ampla RSFD80, pCABl e pCABD2 são conhecidos como plasmídeos contendo um gene dapA mutanta que codifica uma diidrodipicolinato sintase mutant e um gene IysC mutante que codifica uma aspartocinase mutante (Patente U. S. N0 6,040,160). A cepa de Escherichia coli JMl09 transformada com o plasmídeo foi denominada AJ12396 (Patente U. S. N0 6,040,160) e a cepa foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (correntemente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Organism Depositary) em 28 de outubro de 1993 e determinado um número de acessão de FERM P-13936 e o depósito foi então convertido a um depósito internacional sob as cláusulas do Budapest Treaty on November 1, 1994 e determinado um número de acessão de FERM BP-4859. O RSFD80 pode ser obtido a partir da cepa AJ12396 por um método convencional.

Os exemplos de tais enzimas envolvidas na produção de L-Iisina incluem homoserina desidrogenase, lisina descarboxilase (cadA, IdcC), enzima málica e assim por diante e cepas em que as atividades destas enzimas são divulgadas no W095/23864, W096/17930, W02005/010175, e assim por diante.

E preferido que as expressões tanto dos genes cadA quanto dos IdcC que codificam a lisina descarboxilase são diminuídos a fim de diminuir ou anular a atividade de lisina descarboxilase. A expressão de ambos os genes pode ser diminuída, por exemplo, pelo método descrito no W02006/078039.

A fim de reduzir ou eliminar as atividades destas enzimas, uma mutação pode ser introduzida nos genes das enzimas em um genoma por um método de mutagênese usual ou técnicas de recombinação de gene de modo que as atividades intracelulares das enzimas são reduzadas ou eliminadas. Tal introdução de uma mutação pode ser atingida, por exemplo, pelo uso de recombinação genética para eliminar os genes que codificam quanto às enzimas no genoma ou para modificar uma seqüência de controle expressão, tal como um promotor ou a seqüência de Shine-Dalgarno (SD). Isto também pode ser atingido pela introdução de uma mutação para a substituição de aminoácido (mutação de sentido errado), um códon de interrupção (mutação sem sentido) ou uma mutação de mudança de estrutura para adicionar ou anular um ou dois nucleotídeos em regiões que codificam quanto às enziams no genoma ou anular parcial ou totalmente os genes (Wang, J.P. et ai., 2006, J. Agric. Food Chem., 54:9405-9410; Winkler W.C., 2005, Curr. Opin. Chem. Biol., 9:594-602; Qiu Z. and Goodman M.F., 1997, J. Biol. Chem., 272:8611- 8617; Wente, S.R. and Schachman, H.K., 1991, J. Biol. Chem., 266:20833- 20839). As atividades enzimáticas também podem ser diminuídas ou eliminadas pela construção de um gene que codifica quanto a uma enzima mutante, cuja região codificadora é total ou parcialmente anulada e sua substituição para um gene normal em um genoma pela recombinação homóloga ou semelhante ou pela introdução de um transposon ou fator IS no gene.

Por exemplo, a fim de introduzir uma mutação que diminui ou elimina as atividades das enzimas já mencionadas pela recombinação genética, os seguintes métodos são usados. Um gene mutante é preparado pela modificação de uma seqüência parcial de um gene de objetivo de modo que este não codifica uma enzima que pode funcionar normalmente e então uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae pode ser transformada com um DNA contendo o gene mutante para causar a recombinação de um gene correspondente do genoma com o gene mutante para a substituição do gene mutante para o gene de objetivo no genoma. Os exemplos de tal substituição de gene usando-se a recombinação omóloga inclui métodos de usar um DNA linear, tal como o método denominado integração conduzida por Red (Datsenko, K.A e Wanner5 B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97:6640-6645) e o método que utiliza a integração conduzida por Red em combinação com um sistema excisivo derivado fago λ (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., 2002, J. Bacteriol., 184:5200-5203) (referência ao W02005/010175), um método de usar um plasmídeo contendo uma origem de replicação sensível à temperatura (Patente U. S. N0 6,303,383, Patente Japonesa aberta ao público N0 05-007491), e assim por diante. Além disso, tal mutagênese específica de local com base na

substituição de gene usando-se a recombinação homóloga também pode ser realizada usando-se um plasmídeo que não é capaz de replicar em um hospedeiro.

Os exemplos preferidos de bactérias que produzem de L-Iisina incluem Escherichia coli WC196AcadAAldc/pCABD2 (W02006/078039). A cepa foi construída pela introdução do plasmídeo pCABD2 contendo genes de biossíntese de lisina (Patente U. S. N0 6,040,160) na cepa WC196 tendo genes cadA e IdeC interrompidos, que codificam a lisina descarboxilase. A cepa WC196 foi criada a partir da cepa W3110, que foi derivada de Eseherichia coli K-12, pela substituição do gene iysC do tipo selvagem no cromossomo da cepa W3110 com um gene iysC mutante que codifica uma aspartocinase III mutante em que a treonina na posição 352 foi substituída com isoleucina, resultando na dessensibilização da inibição de regeneração deste por L-Iisina (Patente U. S. N0 5,661,012) e que confere resistência a AEC à cepa resultante (Patente U. S. N0 5,827,698). A cepa WCl96 foi denominada Escheriehia coli AJl3069, depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (correntemente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) em 6 de dezembro de 1994 e denominado um número accessão de FERM P-14690. Então, este foi convertido a um depósito internacional sob as cláusulas do Budapest Treaty em 29 de setembro de 1995 e denominado um número de acessão de FERM BP-5252 (Patente U. S. N0 5,827,698). A própria cepa WC196AcadAAldc é também uma bactéria de produção de lisina preferida. A WC196AcadAAldc foi denominada AJl 10692 e depositado na agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) em 7 de outubro de 2008 como um depósito internacional e denominado um número de acessão de FERM BP-11027.

O plasmídeo pCABD2 contém um gene dapA mutante derivado de Escherichia coli e que codifica quanto a um diidrodipicolinato sintase (DDPS) tendo uma mutação para dessensibilização a inibição de regeneração pela L-lisina, um gene IysC mutante derivado de Eseheriehia coli e que codifica quanto um aspartocinase III tendo uma mutação para dessensibilização a inibição de regeneração pela L-lisina, o gene dapB derivado de Eseheriehia coli e que codifica quanto diidrodipicolinato redutase e o gene ddh derivado de Brevibaeterium laetofermentum e que codifica quanto diaminopimelato desidrogenase (Publicações Internacionais W095/16042 e WOO1/53459).

Os procedimentos descritos acima para intensificação da expressão do gene das enzimas envolvidas na biossíntese de L-lisina e os métodos para redução das atividades enzimáticas podem ser similarmente aplicados aos genes que codifica quanto a outras enzimas de biossíntese de L-aminoácido.

Os exemplos de bactérias corineformes que produzem L-lisina incluem cepas mutantes resistentes a AEC (cepa Brevibaeterium laetofermentum AJl 1082 (NRRL B-11470) etc., refere-se a Publicação da Patente JaponesaN0. 56-1914, 56-1915, 57-14157, 57-14158, 57-30474, 58- 10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 e 7- 112438); cepas mutantes requerem um aminoácido tal como L-homoserina para seu desenvolvimento (refere-se a Publicação da Patente Japonesa N°. 48- 28078 e 56-6499); cepas mutantes que mostram resistência a AEC e ainda requerem um aminoácido tal como L-leucina, L-homoserina, L-prolina, L- serina, L-arginina, L-alanina e L-valina (refere-se a Patente U.S. N°. 3.708.395 e 3.825.472); cepas mutantes que produzem a L-Iisina que mostram resistência a DL-a-amino-E-caprolactam, α-aminolaurilactam, análogo de ácido aspártico, medicamento sulfa, quinóide e N-lauroilleucina; cepas mutantes que produzem L-Iisina que mostra a resistência ao oxaloacetato descarboxilase ou um inibidor de enzima de trato respiratório (Patente Japonesa aberta ao público N°. 50-53588, 50-31093, 52-102498, 53-9394, 53- 86089, 55-9783, 55-9759, 56-32995, 56-39778, Publicação de Patente Japonesa N°. 53-43591 e 53-1833); cepas mutantes que produzem a L-Iisina que requerem inositol ou ácido acético (Patente Japonesa aberta ao público N°. 55-9784 e 56-8692); cepas mutantes que produzem L-Iisina que são susceptíveis ao ácido fluoropirúvico ou uma temperatura de 34° C ou mais (Patente Japonesa aberta ao público N°. 55-9783 e 53-86090); cepas mutantes que produzem a L-Iisina de bactéria Brevibacterium ou Corynebacterium que mostra resistência ao etileno glicol (Patente U.S. N0 4.411.997) e assim por diante.

Bactéria que produz L-Cisteina

Os exemplos de bactéria que produz L-cisteína e cepas precursoras para a derivação destes incluem, mas não limitados a, bactérias Escherichia tais como E. eoli JM15 transformado com grupos múltiplos dos genes alelos cysE que codificam serina acetiltransferase resistentes a inibição de regeneração (Patente U.S. N0 6.218.168, Pedido de Patente Russo N0 2003121601), E. eoli W3110 em que um gene que codifica uma proteína adequada para a excreção das substâncias citotóxicas é super expressados (Patente U.S. N0 5.972.663), cepa E. coli tendo atividade de dessulfidrase de cisteína diminuída (Patente Japonesa aberta ao público N0 11-155571) e E. coli W3110 em que a atividade do fator de controle transcripcional positivo da cisteína regulon codificado pelo gene cysB é aumentado (W001/27307).

Bactéria que produz L-Leucina

Os exemplos de bactéria que produz L-Ieucina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz L-Ieucina incluem, mas não limitado a, cepas bacterianas Escherichia, tal como cepas E. coli resistentes a leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, Patente U.S. N0 6.124.121)) ou análogos de leucina incluindo {3-2-tienilalanina, 3- hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5-trifluoroleucina, e assim por diante (Publicação de Patente Japonesa N0 62-34397 e Patente Japonesa aberta ao público N0 8-70879), cepas E. coli obtidos pelo método de engenharia genética descrito na W096/06926, E. coli H-9068 (Patente Japonesa aberta ao público N0 8-70879), e assim por diante.

A bactéria usada pela presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos em biossíntese de L-leucina. Exemplos preferidos de tais genes incluem os genes de IeuABCD operon, um exemplo típico de que é o gene IeuA mutante que codifica quanto um malato de isopropila sintase que foi mutado a ser dessensibilizado a inibição de regeneração por L-leucina (Patente U.S. N0 6.403.342). Além disso, a bactéria usada pela presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes que codificam quanto a proteínas que exportam L-aminoácido a partir das células bacterianas. Os exemplos de tais genes incluem b2682 e b2683 (os genes yga2H) (EP 1239041 A2).

Os exemplos de cepas que produzem L-isoleucina das bactérias corineformes incluem a bactéria corineforme de que o gene brnE que codifica quanto a uma proteína de excreção do aminoácido de cadeia ramificada é amplificada (Patente Japonesa aberta ao público N0 2001- 169788), a bactéria corineforme comunicada com capacidade de produzir L- isoleucina pela fusão de protoplasto com uma bactéria que produz L-Iisina (Patente Japonesa aberta ao público N0 62-74293), a bactéria corineforme de que homoserina desidrogenase é intensificada (Patente Japonesa aberta ao público N0 62-91193), a cepa resistente ao hidroxamato de treonina (Patente Japonesa aberta ao público No 62-195293), cepa resistente ao ácido a- quetomalônico (Patente Japonesa aberta ao público N0 61-15695) e a cepa resistente a metil lisina (Patente Japonesa aberta ao público N0 61-15696).

Os exemplos de bactéria que produz L-histidina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz L- histidina incluem, mas não limitado a, cepas bacterianas Escherichia, tal como cepa de E. coli 24 (VKPM B-5945, RU2003677), cepa E. coli 80 (VKPM B-7270, RU2119536), E. coli NRRL B-12116 - B 12121 (Patente U.S. N0 4.388.405), E. coli H-9342 (FERN BP-6675), E. coli H-9343 (FERN BP-6676) (Patente U.S. N0 6.344.347), E. coli H-9341 (FERN BP-6674) (EP 1085087 A), E. coli A180/pFM201 (Patente U.S. N0 6.258.554), e assim por diante.

Os exemplos de bactéria que produz L-histidina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz L- histidina também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam as enzimas biossintéticas de L-histidina são intensificados. Os exemplos de tais genes incluem gene ATP fosforibosiltransferase (hisG), gene de cicloidrolase de fosforibosil AMP (hisl), gene de pirofosfoidrolase ATP - fosforobosila (hisl), gene de fosforibosilfonnimino-5-aminoimidazol carboxamida ribotida isomerase (hisA), gene amidotransferase (hisH), gene de histidinol fosfato aminotransferase (hisC), gene de fosfatase histidinol (hisB), gene de histidinol desidrogenase (IazsD), e assim por diante.

É conhecido que as enzimas biossintéticas de L-histidina codificada por hisG e hisBHAFI são inibidas por L-histidina e portanto a capacidade de produzir L-histidina também podem ser eficientemente intensificado pela introdução de uma mutação que confere a resistência a inibição de regeneração no gene que codifica quanto a ATP fosfooribosiltransferase (hisG) (Patente Russa N°. 2003677 e 2119536).

Exemplos específicos de cepas que são capazes de produzir L- histidina incluem E. coli FERN-P 5038 e 5048 que foram transformados com um vetor que realiza um DNA que codifica uma enzima biossintética de L- histidina (Patente Japonesa aberta ao público N0 56-005099), as cepas E. Coli transformadas com um gene que codifica uma proteína envolvida na exportação do aminoácido (EP 1016710 A), a cepais. coli 80 que é resistente a sulfaguanidina, DL-l,2,4-triazol-3-alanina e estreptomicina (VKPM B- 7270, Patente Russa N0 2119536), e assim por diante.

Bactéria que produz ácido L-Glutâmico Os exemplos de bactéria que produz ácido L-glutâmico e cepas

precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz ácido L- glutâmico incluem, mas não limitado a, cepas bacterianas Escherichia, tal como E. coli VL334thrC+ (EP 1172433). E. coli VL334 (VKPM B-1641) é auxotrófica por L-isoleucina e L-treonina e contém genes thrC e ilvA mutantes (Patente U.S. N0 4.278.765). Um alelo de tipo selvagem do gene thrC foi transferido pela transdução do gene usando desenvolvimento de bacteriofago Pl nas células E. coli Kl2 de tipo selvagem (VKPM B-7), resultando na cepa VL334thrC+ que produz ácido L-glutâmico auxotrófico de L-isoleucina (VKPM B-8961). Os exemplos de bactéria que produz ácido L-glutâmico e cepas

precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz ácido L- glutâmico também incluem, mas não limitado a, cepas em que expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética do ácido L- glutâmico é intensificada. Os exemplos de tais genes incluem os genes que codificam glutamato de desidrogenase (gdhA), glutamina sintetase (ginA), glutamato sintetase (gltAB), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), metil citrato sintase (prpC), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato desidrogenase (aceEF, IpdA), piruvato cinase (pykA,pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgmf), fosfoglicerato cinase (pgk), gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (,tpiA), frutose bisfosfato aldolase (flap), fosfofrutocinase (pfkA, pflcB), glicose fosfato isomerase (pgl), e assim por diante. Entre estas enzimas, glutamato desidrogenase, citrato sintase, fosfoenolpiruvato carboxilase e metil citrato sintase são preferidos.

Os exemplos de cepas que foram modificados deste modo que a expressão do gene de citrato sintetase, o gene fosfoenolpiruvato carboxilase e/ou o gene de glutamato desidrogenase é intensificado incluem aquele divulgado em EP 1078989 A, EP 955368 A e EP 952221 A.

Os exemplos de bactéria que produz do ácido L-glutâmico e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz ácido L-glutâmico também incluem cepas em que a atividade de uma ou mais enzimas que catalisam uma ou mais reações que direcionam a síntese de um ou mais compostos outros do que ácido L-glutâmico, por exemplo, pela direção da síntese ausente do caminho biossintético de ácido L-glutâmico, é reduzido ou eliminado. Os exemplos destas enzimas incluem isocitrato líase (aceA), α-quetoglutarato desidrogenase (sueA), fosfotransacetilase (pta), acetato cinase (ack), ácido acetoidróxi sintase (ilvG), acetolactate sintase (UvI)i formato acetiltransferase (pfl), lactato desidrogenase (ldh), glutamato decarboxilase (gadAB), e assim por diante. Bactéria Escherichia sem atividade de α-quetoglutarato desidrogenase ou com atividade de a- quetoglutarato desidrogenase reduzido e métodos para obter tal bactéria são descritos na Patente U.S. N0. 5.378.616 e 5. 573. 945. Especificamente, estas cepas incluem o seguinte: E. coli. W311 OsucA::Kmr

E. coli AJ12624 (FERM BP-3853) E. coli AJ12628 (FERMBP-3854) E. coli AJ12949 (FERMBP-4881)

E. coli W3110sucA::Kmr é contido pelo rompimento do gene de α-quetoglutarato desidrogenase (em seguida referido como o "gene sue A") de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente em um a- quetoglutarato desidrogenase.

Os exemplos de bactérias corineformes com atividade a- quetoglutarato desidrogenase diminuído incluem, por exemplo, as seguintes cepas:

Cepa Brevibacterium lactofermentum L30-2 (Patente Japonesa aberta ao público N0 2006-340603)

Cepa Brevibacterium lactofermentum AS (W095/34672) Brevibacterium lactofermentum AJ12821 (FERM BP-4172, Patente FrancesaN0 9401748)

Brevibacterium flavum AJ12822 (FERM BP-4173, Patente FrancesaN0 9401748)

Corynebaeterium glutamicum AJ12823 (FERM BP-4174, Patente Francesa N0 9401748)

Cepa Corynebacterium glutamicum L30-2 (Patente Japonesa aberta ao público N0 2006-340603)

Outros exemplos de bactéria que produz ácido L-glutâmico incluem bactéria Escherichia que são resistentes a um antimetabólito do ácido aspártico. Estas cepas também podem ser deficientes em a-quetoglutarato desidrogenase e incluem, por exemplo, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (Patente U.S. N0 5,908,768), FFRM P-12379, que adicionalmente é diminuído em uma atividade para desintegrar o ácido L-glutâmico (Patente U.S. N0 5.393.671); AJ13138 (FERM BP-5565) (Patente U.S. N0 6.110.714), e assim por diante.

Um exemplo de uma bactéria que produz o ácido L-glutâmico que pertence ao Pantoea ananatis é a cepa Pantoea ananatis AJl3355. Esta cepa é isolada a partir do solo em Iwata-shi, Shizuoka-ken, Japan e foi identificado como sendo capaz de proliferar em um meio contendo ácido L- glutâmico e uma fonte de carbono em um pH baixo. A cepa Pantoea ananatis AJl3355 foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) em 19 de Fevereiro de 1998 e nomeado um número de acessão de FERM P-16644. Foi então convertido a um depósito internacional sob as provisões de Budapest Treaty em janeiro 11, 1999 e nomeado um número de acessão de FERN BP-6614. Esta cepa foi originalmente identificada como Enterobacter agglomerans quando este isolado e depositado como Enterobacter agglomerans AJl3355. Entretanto, foi recentemente classificado novamente como Pantoea ananatis na base do sequenciamento de 16S rRNA e assim por diante.

Além disso, exemplos de uma bactéria que produz ácido L- glutâmico de Pantoea ananatis também incluem a bactéria Pantoea deficiente em uma atividade α-quetoglutarato desidrogenase (aKGDH) ou tendo a atividade aKGDH reduzida. Os exemplos de uma tal cepa incluem AJ13356 (Patente U.S. N0 6.331.419), que foi derivada pela anulação do gene de subunidade OtKGDH-El (sucA) em AJ13355 e a cepa SC17sucA (Patente U.S. N0 6.596.517) que é a cepa deficiente do gene sucA derivado da cepa SC17 e foi selecionada de AJ13355 para suas propriedades de produção phlegm. A cepa AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human- Technology, Agency of Industrial Science and Technology (correntemente, a agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, código postal: 305-8566)) em 19 de Fevereiro de 1998 e nomeado em um número de acessão de FERM P-16645. Então, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as provisões de Budapest Treaty em 11 de Janeiro de 1999 e nomeado em um número de acessão de FERM BP-6616. Embora as cepas AJ13355 e AJ13356 foram depositadas no depósito anteriormente mencionado como Enterobacter agglomerans, estes são referidos como Pantoea ananatis neste relatório descritivo. A cepa SC17sucA foi nomeada pelo número privado de AJ417 e depositado no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary on 26 de Fevereiro de 2004, sob um número de acessão de FERM BP-08646.

Os exemplos de bactéria que produz ácido L-glutâmico Pantoea ananatis ainda incluem as cepas SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, AJ13601, NP106 e NAl.

A cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi obtida pela introdução do plasmídeo RSFCPG contendo o gene de sintase de citrato (gltA), gene de fosfoenolpiruvato de carboxilase (ppsA) e gene de glutamato de desodrogenase (gdhA) derivado de Escherichia coli e o plasmídeo pSTVCB contendo o gene de sintase de citrato (g/í^)derivado de Brevibacterium laetofermentum, na cepa SC17sucA. A cepa AJl3601 foi selecionada de uma cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB para sua resistência a concentração alta na concentração alta de Ácido L-glutâmico em um pH inferior. Além disso, a cepa NP106 foi derivada da cepa AJ13 601 pela eliminação do plasmídeo RSFCPG+pSTVCB. A cepa AJ13601 foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1- Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, código postal: 305-8566) em 18 de Agosto de 1999 e número de acessão determinado FERM P-17516. Então, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as provisões de Budapest Treaty em 6 de Julho de 2000 e projetado no número de acessão FERM BP-7207.

Além disso, a capacidade de produzir ácido L-glutâmico

também pode ser comunicado a bactéria coryneform por um método pela amplificação do gene yggB codificado pelo canal de mecanosensível (W02006/070944) e um método de introdução de um gene yggB mutante em que uma mutação é introduzido na região codificadora. O gene yggB é um gene localizado nos números de nucleotídeos 1.337.692 a 1.336.091 (filamento complementar) da seqüência de genoma da cepa Corynebacterium giutamicum ATCC 13032 registrada com Acessão Genbank N°. NC 003450 e codifica para uma proteína de membrana também denominado NCgl 1221 e registrado com Acessão Genbank N°. NP 600492. Exemplos de outros métodos para comunicar e intensificar a

capacidade produzindo o ácido L-glutâmico também inclui um método da comunicação da resistência a um análogo do ácido orgânico, um inibidor de cadeia respiratória, etc. e um método de comunicação de sensibilidade a um inibidor de síntese da parede celular. Exemplos de tais métodos incluem o método da comunicação da resistência ao ácido monofluoroacético (Patente Japonesa aberta ao público N°. 50-113209), o método da comunicação da resistência a adenina ou timina (Patente Japonesa aberta ao público N°. 57- 065198), o método de atenuação de urease (Patente Japonesa aberta ao público N°. 52-038088), o método da comunicação da resistência ao ácido malônico (Patente Japonesa aberta ao público N°. 52-038088), o método da comunicação da resistência as benzopironas ou naftoquinonas (Patente Japonesa aberta ao público N°. 56-1889), o método da comunicação da resistência ao BOQNO (Patente Japonesa aberta ao público N°. 56-140895), o método da comunicação da resistência ao ácido α-quetomalônico (Patente Japonesa aberta ao público N°. 57-2689), o método da comunicação da resistência a guanidina (Patente Japonesa aberta ao público N°. 56-35981), o método da comunicação da sensibilidade pela penicilina (Patente Japonesa aberta ao público N°. 4-88994) e assim por diante. Exemplos específicos de tais cepas resistentes inclui as cepas

seguintes:

Brevibacterium flavum AJ3949 (FERM BP-2632; Patente Japonesa aberta ao público N°. 50-113209)

Corynebacterium glutamicum AJl 1628 (FERM P-5736; Patente Japonesa aberta ao público N°. 57-065198)

Brevibacterium flavum AJl 1355 (FERM P-5007; Patente Japonesa aberta ao público N°. 56-1889)

Corynebaeterium glutamzcum AJl 1368 (FERM P-5020; Patente Japonesa aberta ao público N°. 56-1889) Brevibaeterium flavum AJl 1217 (FERM P-4318; Patente

Japonesa aberta ao público N°. 57-2689)

Corynebaeterium glutamzcum AJl 1218 (FERM P-4319; Patente Japonesa aberta ao público N°. 57-2689)

Brevibaeterium flavum AJl 1564 (FERM BP-5472; Patente Japonesa aberta ao público N°. 56-140895)

Brevibacterium flavum AJl 1439 (FERM BP-5136; Patente Japonesa aberta ao público N°. 56-35981)

Corynebaeterium glutamzcum H7684 (FERM BP-3004; Patente Japonesa aberta ao público N°. 04-88994) Brevibaeterium laetofermentum AJl 1426 (FERM P-5123;

Patente Japonesa aberta ao público N°. 56-048890)

Corynebaeterium glutamicum AJl 1440 (FERM P-5137; Patente Japonesa aberta ao público N°. 56-048890)

Brevibaeterium laetofermentum AJl 1796 (FERM P-6402; Patente Japonesa aberta ao público N°. 58-158192)

Bactéria que produz L-fenilalanina

Exemplos de bactéria que produz L-fenilalanina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar Bactéria que produz L- fenilalanina incluem, mas não são limitados a, cepas bacterianas Escherichia, tal como E. coli AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197) que falta mutase de corismato-desidrogenase de prefenato e o repressor de tirosina (W003/044191), E. coli HW1089 (ATCC 55371) que contém o gene pheA34 que codifica para a desidratase de prefenato-corismato mutase que foi mutado ser dessensibilizado a inibição de regeneração (Patente U.S. N°. 5.354.672), E. coli MWEClOl-b (KR8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 e NRRL B-12147 (Patente U.S. N°. 4.407.952). Também, as cepas seguintes podem ser usadas para derivar a bactéria que produz L- fenilalanina: E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566) que contém os genes codificados pela desidratase de prefenato-corismato mutase que foi mutado ser dessensibilizado a inibição de regeneração, E. coli K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAD] (FERM BP-I2659), E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) e E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] projetado como AJ12604 (FERM BP- 3579, EP 488424 BI). Além disso, a bactéria Escherichia que produz L- fenilalanina com atividade intensificada da proteína Codificada pelo gene yedA ou gene yddG também pode ser usado (Pedidos Publicados de Patente U.S. N°. 2003/0148473 e 2003/0157667, W003/044192).

Como bactéria coryneform que produz fenilalanina, as cepas Cornebacterium glutamicum BPS-13 (FERM BP-1777), K77 (FERM BP- 2062) e K78 (FERM BP-2063) (EP 331145 A, Patente Japonesa aberta ao público N°. 02-303495), de que a carboxilase de fosfenolpiruvato ou atividade de piruvato cinase é reduzida, cepa auxotrófica de tirosina (Patente Japonesa aberta ao público N°. 05-049489) e assim por diante podem ser usadas.

A bactéria que eficientemente produz fenilalanina também pode ser obtida pela modificação de uma bactéria de modo que a bactéria incorpora os bioprodutos, por exemplo, pelo aumento da quantidade de expressão do gene de absorção de L-triptofan, tnaB ou mtr, ou o gene de absorção de L-tirosina, tyrP (EP 1484410).

Bactéria que produz L-Triptofano

Exemplos de bactéria que produz L-triptofano e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar as bactérias que produzem L- triptofano incluem, mas não são limitados a, cepas bacterianas Escherichia, tal como E. Coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e E. coli JP6015/pMU91 (DSM10123) que faltam sintetase de triptofanil-tRNA codificada por um gene trpS mutante (Patente U.S. N°. 5.756.345), E. coli SV164 (pGH5) que contém o alelo serA que codifica desidrogenase de fosfoglicerato e o alelo trpE que codifica antranilato sintase, que são dessensibilizado a inibição de regeneração por serina e triptofano, respectivamente (Patente U.S. N°. 6.180.373), E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) e E. coli AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) que faltam triptofanase (Patente U.S. N°. 4.371.614) e E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps em que capacidade de produz fosfoenolpiruvato é intensificado (W097/08333, Patente U.S. N°. 6.319.696). bactéria que produz L-Triptofano pertencente ao gênero Escherichia com atividade intensificada da proteína codificada pelo gene yedA ou gene yddG também pode ser usado (Pedido Publicado de Patente U.S. N0.. 2003/0148473 e 2003/0157667).

Exemplos de bactéria que produz L-triptofano e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz L- triptofano também incluem cepas em que uma ou mais atividades das seguintes enzimas são intensificadas: antranilato sintase (trpE), desidrogenase de fosfoglicerato (serA), 3-desóxi-D-arabinoeptulosonato-7-fosfato sintase (aroG), 3-desidroquinato sintase (aroB), siquimato desidrogenase (aroE), siquimato cinase (aroL), 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintase (aroA), corismato sintase (aroC), prefenato desidratase, corismato mutase e triptofano sintase (trpAB). Prefenato desidratase e corismato mutase são codificados pelo gene pheA como uma enzima bifuncional (corismato mutase/prefenato desidratase, CM/PDH). Entre estas enzimas, desidrogenase de fosfoglicerato, 3-desóxi-D-arabinoeptulosonato-7-fosfato sintase, 3-desidroquinato sintase, siquimato desidratase, siquimato cinase, 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintase, corismato sintase, prefenato desidratase e corismato mutaseprefenato desidratase são particularmente preferidos. Antranilato sintase e desidrogenase de fosfoglicerato ambos sofrem de inibição de regeneração pelo L-triptofano e L-serina e portanto uma inibição de regeneração de dessensibilização de mutação pode ser introduzido nos genes que codifica estas enzimas. Exemplos específicos das cepas tendo uma tal mutação incluem E. coli SV164 tendo uma antranilato sintase de tipo dessensibilizado e uma cepa transformante obtido pela introdução de pGH5 (W094/08031) contendo um gene serA mutante codificado pela desidrogenase de fosfoglicerato dessensibilizado a inibição de regeneração em E. coli SV164.

Exemplos de bactéria que produz L-triptofano e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz L- triptofano também incluem cepas que foram transformados com o triptofano operon, que contém um gene codificado pela antranilato sintase dessensibilizado pela inibição (Patente Japonesa aberta ao público N°s. 57- 71397, 62-244382, Patente U.S. N°. 4.371.614). Além disso, capacidade que produz L-triptofano pode ser comunicado pela expressão de intensificação de um gene que codifica triptofano sintase no triptofano operon (trpBA). Triptofano sintase inclui tanto as subunidades α quanto β, que são codificadas por trpA e trpB, respectivamente. Além disso, capacidade que produzir L- triptofano pode ser melhorado pela intensificação da expressão do isocitrato liase-malato sintase operon (W02005/103275).

As bactéria coryneform, Corynebacterium glutamicum AJ12118 (FERM BP-478, Patente Japonesa N°. 01681002), que é resistente a sulfaguanidina, a bactéria coryneform introduzida com o triptofano operon (Patente Japonesa aberta ao público N°. 63-240794) e a bactéria coryneform introduzida com um gene codificado pelo siquimato cinase derivado de uma bactéria coryneform (Patente Japonesa aberta ao público N°. 01-994749) podem ser usadas.

Bactéria que produz L-Prolina

Exemplos de bactéria que produz L-prolina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar a bactéria que produz L- prolina incluem, mas não são limitados a, cepas bacterianas de Escherichia, tal como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012) que falta o gene ilvA e pode produzir a L-prolina (EP 1172433).

A bactéria usada pela presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-prolina. Exemplos de genes preferidos para a bactéria que produz L-prolina inclui como gene proB codificado pelo glutamato cinase que é dessensibilizado a inibição de regeneração por L-prolina (Patente DE 3127361). Além disso, a bactéria usada pela presente invenção pode ser melhorada pela intensificação da expressão de um ou mais genes codificados pelas proteínas responsáveis pela secreção do L-aminoácidos a partir da célula bacteriana. Exemplos de tais genes são os genes b2682 e b2683 (yga2H genes) (EP 1239041 A2).

A bactéria Escherichia tendo uma capacidade de produzir L- prolina inclui como as seguintes cepas de E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B- 12404 (Patente GB 2075056), VKPM B-8012 (Pedido de Patente Russo 2000124295), mutantes de plasmídeo descritos em Patente DE 3127361, mutantes de plasmídeo descritos por Bloom E.R. et al (The 15th Miami Winter Symposium, 1983, ρ. 34) e assim por diante.

Bactéria que produz L-Arginina

Exemplos de bactéria que produz L-Arginina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz L- Arginina incluem, mas não são limitados a, cepas bacterianas de Escherichia, tal como cepa E. coli 237 (VKPM B-7925) (Pedido Publicado de Patente U.S. N°. 2002/058315 Al) e suas cepas derivadas abrigando N-acetilglutamato sintase mutante (Pedido de Patente Russo N°. 2001112869), cepa de E. coli 382 (VKPM B-7926) (EP 1170358 Al) e uma cepa que produz arginina transformado com um gene argA que codifica N-acetiglutamato sintetase (EP 1170361 Al).

Exemplos de bactéria que produz L-Arginina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz L- Arginina também incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes que codifica uma enzima biosintética de L-Arginina é intensificado. Exemplos de tais genes inclui como gene de redutase de N-acetilglutamil fosfato (argC), ownitina acetil transferase gene (argJ), N-acetiglutamato cinase gene (argB), acetilornitina transaminase gene (argD), ownitina carbamoil transferase gene (argF), gene de sintetase do ácido argininossucínico (argG), gene liase do ácido argininossucínico (argH) e carbamoil fosfato sintetase gene (carAB).

Bactéria que produz L-Valina

Exemplos de bactéria que produz L-valina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz L-valina incluem, mas não são limitados a, cepas que foram modificadas para superexpressar o ilvGMEDA operon (Patente U.S. N°. 5.998.178). é desejável remover a região no operon ilvGMEDA que é requerido para atenuação de modo que a expressão do operon não é atenuado pelo L-valina produzido. Além disso, o gene ilvA no operon é desejavelmente interrompido de modo que a atividade de treonina desaminase é diminuído. Exemplos de bactéria que produz L-valina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz L-valina também incluem mutantes tendo mutações amino-acil t-RNA sintetase (Patente U.S. N°. 5.658.766). Por exemplo, E. coli VLI970, que tem uma mutação no gene ileS que codifica isoleucina tRNA sintetase, pode ser usada. E. coli VL1970 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Rússia) em 24 de Junho de 1988 sob o número de acessão VKPM B-4411.

Além disso, as cepas mutantes que requerem o ácido lipóico para o desenvolvimento e/ou perdem H+-ATPase (W096/06926) também podem ser usados como cepas precursoras para a derivação da bactéria que produz L-valina.

Exemplos de bactéria que produz L-valina da bactéria coryneform incluem, por exemplo, cepas modificadas de modo que a expressão de um gene que codifica uma enzima biosintética de L-valina é intensificado. Exemplos da enzima de biossíntese de L-valina incluem enzimas codificadas pelos genes presentes no ilvBNC operon, isto é, sintetase do ácido acetoidróxi codificado por ilvBN e isomero-redutase codificado por ilvC (WO00/50624). Visto que o ilvBNC operon é submetido a regulação da expressão por L-valina e/ou L-isoleucina e/ou L-leucina, é desejado eliminar a atenuação para evitar a supressão da expressão por L-valina que é produzido.

A comunicação da capacidade de produzir L-valina a bactéria coryneform pode ser realizado pela diminuição ou eliminação da atividade de pelo menos um grupo de enzima que é envolvida em um caminho metabólico que diminui a produção de L-valina. Por exemplo, diminuição da atividade de treonina desidratase envolvida na síntese de L-leucina, ou atividade de uma enzima envolvida na síntese de D-pantotenato é considerado (WO00/50624).

Exemplos de métodos para a comunicação da capacidade de produzir L-valina também incluem comunicação da resistência ao análogo de aminoácido ou outros.

Exemplos incluem, por exemplo, cepas mutantes que são auxotróficas por L-isoleucina e L-metionina e resistentes a D-ribose, ribonucleosídeo de purina ou ribonucleosídeo de pirimidina e tem uma capacidade para produzir L-valina (FERM P-1841, FERM P-29, Publicação de Patente Japonesa N°. 53-025034), cepas mutantes resistentes a poliquetídeos (FERM P-1763, FERM P-1764, Publicação de Patente Japonesa N°. 06-065314) e cepas mutantes resistentes a L-valina em um meio contendo ácido acético como uma fonte de carbono única e sensível aos análogos do ácido pirúvico (ácido fluoropirúvico etc.) em um meio contendo glicose como uma fonte de carbono única (FERM BP-3006, BP-3007, Patente Japonesa N°. 3006929).

Bactéria que produz L-Isoleucina

Exemplos de bactéria que produz L-isoleucina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactéria que produz L- isoleucina incluem, mas não são limitados a, mutantes que são resistentes a 6- dimetilaminopurina (Patente Japonesa aberta ao público N°. 5-304969), mutantes que são resistentes a análogos de isoleucina tal como tiaisoleucina e hidroxamato de isoleucina e mutantes que são adicionalmente resistentes a hidroxamato de DL-etionina e/ou Arginina (Patente Japonesa aberta ao público N°. 5-130882). Além disso, cepas recombinantes transformadas com genes que codificam as proteínas envolvidas na biossíntese de L-isoleucina, tal como treonina desaminase e acetoidroxato sintase, também pode ser usado como cepas precursores para derivação de bactéria que produz L-isoleucina (Patente Japonesa aberta ao público N°. 2-458, FR 0356739 e Patente U.S. N°. 5.998.178).

Exemplos de cepas que produzem L-isoleucina de bactéria coryneform inclui a bactéria coryneform de que o gene brnE codificado para uma proteína de excreção do aminoácido de cadeia ramificada é amplificado (Patente Japonesa aberta ao público N°. 2001-169788), a bactéria coryneform comunicada com capacidade de produzir L-isoleucina pela fusão de protoplasto com uma bactéria que produz L-Iisina (Patente Japonesa aberta ao público N°. 62-74293), a bactéria coryneform de que homoserina desidrogenase é intensificada (Patente Japonesa aberta ao público N°. 62- 91193), a cepa resistente ao hidroxamato de treonina {Patente Japonesa aberta ao público N0 62-195293), cepa resistente ao ácido α-quetomalônico (Patente Japonesa aberta ao público N°. 61-15695) e a cepa resistente a metil lisina (Patente Japonesa aberta ao público N°. 61-15696).

Bactéria que produz L-Metionina

Exemplos de bactéria que produz L-metionina e cepas precursoras para derivação de bactéria que produz L-metionina incluem, mas não são limitados a, cepa mutante auxotrófica L-treonina e cepa mutante resistente a norleucina {Patente Japonesa aberta ao público N°. 2000- 139471). Além disso, a cepa deficiente repressora de metionina e cepas recombinantes transformadas com genes que codificam as proteínas envolvidas em biossíntese de L-metionina tal como homoserina transsuccinilase e cistationina γ-sintase {Patente Japonesa aberta ao público N°. 2000-139471) também pode ser usado como cepas precursores.

Os métodos para a comunicação da capacidade de produzir ácido nucléico a um microorganismo e bactéria que produz ácido nucléico será exemplificado abaixo.

A bactéria tendo uma capacidade de produzir um ácido nucléico pode ser obtido pela comunicação, por exemplo, auxotrofia nucleosídeo de purina ou resistência a um medicamento tal como análogo de purina uma tal bactéria como descrito acima (Publicação de Patente Japonesa N°. 38-23099, 54-17033, 55-45199, 57-14160, 57-41915 e 59-42895). Por exemplo, uma bactéria Bacillus tendo auxotrofia ou resistência ao medicamento pode ser obtido pelo tratamento de uma bactéria com mutatgen que é usada para o tratamento de mutagênese usual tal como N-metil-N'-nitro- N-nitrosoguanidina (NTG) ou EMS (etil metanossulfonato).

Os exemplos de bactérias Bacillus que produzem um nucleosídeo de purina incluem os seguintes.

Como um exemplo específico da cepa que produz inosina pertencente ao gênero Bacillus, a cepa Bacillus subtilis KMBS16 podem ser usadas. Esta cepa é derivada da cepa Bacillus subtilis trpC2 conhecida (168 Marburg), em que o gene purR que codifica o repressor de purina operon (purR::spc), o gene purA que codifica succinil-AMP sintase (purA::erm) e o gene deoD que codifica fosforilase de nucleosídeo de purina (deoD::kan) são interrompidos (Patente Japonesa aberta ao público N°. 2004-242610, Pedido Publicado de Patente U.S. N°. 2004166575 Al). A cepa Bacillus subtilis AJ3772 (FERM P-2555, Patente Japonesa aberta ao público N°. 62-014794) e assim por diante também podem ser usados.

Os exemplos de bactérias Bacillus tendo uma capacidade para produzir guanosina incluem a bactéria Bacillus que tem atividade de desidrogenase IMP aumentada (Patente Japonesa aberta ao público N°. 3- 58787), bactéria Bacillus que é obtida pela introdução de um vetor que inclui um gene que confere a resistência aos análogos de purina ou decoiinina em um mutante auxotrófico de adenina (Publicação de Patente Japonesa N°. 4- 28357) e assim por diante.

Os exemplos de bactérias Baeillus que produz um nucleotídeo de purina inclui o seguinte.

Como bactéria Bacillus que produz ácido inosínico, as cepas de inosina que produzem de Bacillus subtilis que tem atividade de fosfatase atenuada foi relacionada (Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804- 805; Fujimoto, M., Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259). Exemplos de bactéria que produz ácido guanílico incluem mutantes de bactéria Bacillus que tem auxotrofia adenina, resistente ao sulfóxido de decoiinina ou metionina e uma capacidade para produzir ácido 5'-guanílico (guanosina-5'-monofosfato, daqui em diante também referido como "GMP") (Publicação de Patente JaponesaN0. 56-12438).

Além disso, uma bactéria que produz ácido xantílico pode ser construída pelo método usado para criar a bactéria coryneform, um exemplo típico de que é o gene Corynebacterium ammonia. Por exemplo, pela obtenção de uma cepa intensificada PRPP amidotransferase (Patente Japonesa aberta ao público N°. 8-168383), uma cepa resistente ao aminoácido alifático (Patente Japonesa aberta ao público N°. 4-262790), ou uma cepa resistente a desidroprolina {Publicação não examinada de Patente Sul-Coreana N°. 2003- 56490), uma bactéria que produz ácido xantílico pode ser construída.

Além disso, Exemplos de um método para a criação da bactéria Bacillus que tem uma capacidade para produzir uma substância derivada de purina também inclui intensificação da atividade de uma enzima que é envolvida na biossíntese de purina que é comum a biossíntese de nucleosídeos de purina e nucleotídeo de purinas, isto é, biossíntese de enzima de purina, nas célula bacterianas. A atividade da enzima nas células é preferivelmente aumentado a um nível maior do que aquele de uma cepa não modificada de bactéria Baeillus, por exemplo, uma bactéria Bacillus de tipo selvagem. A frase "atividade é aumentada" abrange, por exemplo, quando número de moléculas de enzima por célula é aumentada e quando a atividade específica pela molécula de enzima é aumentada e assim por diante. Por exemplo, a atividade pode ser aumentada pela quantidade de expressão aumentada do gene da enzima. Exemplos da enzima envolvida na biossíntese de purina incluem, por exemplo, fosforibosil pirofosfato amidotransferase, fosforibosil pirofosfato sintetase (PRPP sintetase [EC: 2.7.6.1]) e assim por diante.

Alguns dos catabólitos produzidos pelo metabolismo de fontes de açúcares tal como glicose que fluem no caminho de pentose fosfato são comnvertidos em ribose-5-fosfato por intermédio de ribulose-5-fosfato. A partir do ribose-5-fosfato biossintetizado, fosforibosil pirofosfato (PRPP) é produzido, que é um precursor indispensável pelo nucleosídeo purina, histidina e biossíntese triptofano. Especificamente, ribose-5-fosfato é convertido em PRPP pelo fosforibosil pirofosfato sintetase. Portanto, uma capacidade para produzir substância derivada de purina pode ser comunicado a bactéria Bacillus ou uma tal capacidade de uma bactéria Bacillus pode ser intensificado pela modificação de modo que a atividade de fosforibosil pirofosfato sintetase deste é aumentado.

A frase "atividade de fosforibosil pirofosfato sintetase é aumentado" significa que uma atividade de fosforibosil pirofosfato sintetase aumenta como comparado aquele de uma cepa não modificada tal como uma cepa selvagem ou uma cepa precursora. A atividade de fosforibosil pirofosfato sintetase pode ser medido pelo, por exemplo, o método da Switzer et al. (Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11) ou Roth et al. (Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17). Uma bactéria Bacillus em que a atividade de fosforibosil pirofosfato sintetase é aumentado pode ser produzido por, por exemplo, aumento pela expressão de um gene que codifica o fosforibosil pirofosfato sintetase em uma bactéria Bacillus de acordo com um método ed uso de um plasmídeo ou integração do gene em um cromossomo, que pode ser realizado na mesma maneira como aquele do método descrito em Patente Japonesa aberta ao público N°. 2004-242610.

De outra maneira, quando PRPP que é um precursor indispensável para as biossínteses de nucleosídeo de purina, histidina e triptofano é uma vez produzido, algum deste é convertido em nucleotídeo de purinas e nucleosídeos de purina pelas enzimas envolvidas na biossíntese de purina. Exemplos de genes que codificam tais enzimas inclui os genes de purina operon de Bacillus subtilis, especificamente, genes de purEKB- purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD operon (Ebbole D.J. and Zalkin H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87) (no momento, também denominado purEKBCSQLFMNHD, Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002, Acessão Genbank N°. NC 000964) e os genes de the pur regulon de Escherichia call (Escherichia e Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Consequentemente, pela intensificação da expressão destes genes, uma capacidade para produzir a substância derivada de purina pode ser comunicada ou intensificada. Além disso, genes de purina operon que podem ser usados pela presente invenção não são limitados a estes e genes derivados de outros microorganismos, animais e plantas também podem ser usados.

Exemplos de método para o aumento da expressão de purina operon incluem aumento da expressão dos genes de purina operon em uma bactéria Bacillus por um método de uso de um plasmídeo ou integração do genes em um cromossomo ou outros.

O segundo método para aumento da expressão de purina operon inclui a substituição do promotor natural de purina operon com um promotor mais forte e substituindo região - 35 ou -10 do promotor natural com uma seqüência consenso.

Por exemplo, em Bacillus subtilisicepa. B. subtilis 168 Marburg, ATCC 6051), a seqüência -35 de purina operon é uma seqüência consenso (TTGACA), mas a seqüência -10 é TAAGAT, que difere-se a partir da seqüência consenso TATAAT (Ebbole, D.J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287). Portanto, pela substituição da seqüência -10 (TAAGAT) com uma seqüência consenso, por aproximadamente a seqüência -10 (TAAGAT) próximo a seqüência consenso, ou mudança ao TATAAT, TATGAT ou TAAAAT, a atividade transcripcional de purina operon pode ser aumentada. Uma seqüência promotora pode ser substituída pelo mesmo método como aquele da substituição do gene, que é descrito abaixo.

O terceiro método para aumento da expressão de purina operon incluem a diminuição da expressão de repressor de purina operon (Patente U.S. N°. 6.284.495). A frase "expressão de um repressor de purina operon" inclui tanto a transcrição de um gene de purina operon quanto tradução de um produto de transcrição. Além disso, "diminuição da expressão" incluem diminuição da expressão a ser inferior do que aquele em uma cepa não modificada tal como uma bactéria Bacillus de tipo selvagem e substancialmente eliminando a expressão.

A expressão do repressor de purina operon (repressor de purina) pode ser diminuído por, por exemplo, tratamento de uma bactéria Bacillus com irradiação de raio ultravioleta ou mutagênio usado em um tratamento de mutagênese usual tal como NTG ou EMS e seleção de um mutante que mostra a expressão diminuída do repressor de purina pode ser utilizado.

Além disso, a bactéria Bacillus com expressão diminuída do repressor de purina também pode ser obtido pela, por exemplo, ao lado de um tratamento de mutagênese, substituindo um gene que codifica o repressor de purina em um cromossomo (purR, Acessão Genbank NC 000964, região codificadora correspondente aos números de nucleotídeos 54439 to 55293) com um gene correspondente que não funciona normalmente (depois, também referido como "gene tipo interrompido") pela recombinação homóloga utilizando uma técnica de recombinação de gene (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima3 S., J. Bacteriol, 1985, 162, 1196-1202).

Além disso, uma capacidade para produzir a substância derivada de purina também pode ser intensificada pela atenuação dam absorção da substância derivada de purina nas células. Por exemplo, a absorção de nucleosídeos de purina pelas células pode ser atenuado pelo bloqueamento de uma reação envolvida na absorção de nucleosídeos de purina pelas células. Exemplos da reação envolvida na absorção de nucleosídeos de purina pelas células incluem reações catalisadas pelo nucleosídeo permeases.

Além disso, quando um nucleosídeo de purina é produzido, a atividade de uma enzima que desintegra um nucleosídeo de purina pode ser diminuída a fim de intensificar a capacidade de produzir nucleosídeo de purina. Exemplos de uma tal enzima incluem fosforilase de nucleosídeo de purina.

A nucleotídeo de purina biossintetizada a partir de PRPP pelas enzimas envolvidas na biossíntese de purina são desfosforiladas e portanto convertidas em um nucleosídeo de purina. Para causar eficientemente o acúmulo de um nucleosídeo de purina, é preferível reduzir as atividades de fosforilase de nucleosídeo de purina, que ainda desintegram os nucleosídeos de purina em hipoxantina ou outros. Isto é, é preferível atenuar ou eliminar uma atividade de uma fosforilase de nucleosídeo de purina que utiliza os nucleosídeos de purina tal como inosina, como um substrato.

Especificamente, a atividade de fosforilase de nucleosídeo de purina pode ser diminuída pelo rompimento dos genes deoD e pupG que codifica fosforilase de nucleosídeo de purina na bactéria Bacillus. A bactéria Bacillus da presente invenção pode ser modificada pelo rompimento de um ou tanto do gene deoD quanto pupG. Como os genes deoD e pupG, por exemplo, aqueles genes derivados da bactéria Bacillus (deoD; Acessão Genbank N°. NC 000964, região codificadora: 2134672-2135370,pupG; Acessão Genbank N°. NC_000964, região codificadora: 2445610-2446422) podem ser usadas.

A capacidade para produzir a substância derivada de purina também pode intensificar pela diminuição da atividade de succinil-AMP sintase. Exemplos do gene que codifica succinil-AMP sintase inclui os genes purA. Exemplos do gene purA incluem, por exemplo, aqueles tendo a seqüência de nucleotídeo registrada como Acessão Genbank N°. NC 000964 (região codificadora corresponde aos números de nucleotídeos 4153460 a 4155749 do filamento complementar).

A capacidade para produzir a substância derivada de purina também pode ser intensificada pela diminuição de uma atividade de desidrogenase de inosina monofosfato (IMP). Exemplos do gene que codifica desidrogenase IMP inclui como gene guaB. Exemplos do gene guaB incluem, por exemplo, aquele tendo a seqüência de nucleotídeo registrada como Acessão Genbank N°. NC 000964 (região codificadora corresponde aos números de nucleotídeos 15913 a 17376).

Além disso, como um método para intensificação de uma capacidade para produzir substância derivada de purina, amplificação de um gene que codifica uma proteína tendo uma atividade de excreção de uma substância derivada de purina pode ser considerada. Um exemplo de uma bactéria em que um tal gene foi amplificado é a bactéria Bacillus em que o gene rhtA é amplificado (Patente Japonesa aberta ao público N°. 2003- 219876).

Quando a bactéria que produz L-aminoácido anteriormente mencionada são criadas pela recombinação do gene, os genes que serão usados não são limitados a genes tendo a informação genética descrita acima ou genes tendo as seqüências conhecidas, mas também incluem genes tendo mutações conservativas, tal como homólogos ou genes artificialmente modificados, também podem ser usado contanto que as funções das proteínas codificadoras não seja degradada. Isto é, estas podem ser genes que codificam a seqüência de aminoácido conhecida contendo uma ou mais substituições, anulações, inserções, adições ou outros de um ou diversos resíduos de aminoácido em uma ou diversas posições. A variante conservativa etc. descrita acima são as mesmas como aquelas descritas pela xilanase anteriormente mencionada e gene que codifica este. (5-2) Cultura de microorganismo para produção da substância

alvo

Para usar um solução de açúcar produzida pelo método da presente invenção ou um produto de fracionamento deste (este pode ser daqui em diante também coletivamente referido como "sacarídeo") como uma fonte de carbono, um microorganismo tendo uma capacidade para produzir uma substância alvo é cultivada e a substância alvo é coletada a partir das células médias ou microbianas.

Exceto que o sacarídeo anteriormente mencionado é usado como uma fonte de carbono, o mesmo método como aquele pelos método de fermentação usual podem ser usadas.

Para o método da a presente invenção, cultura de batelada, cultura de alimentação por batelada e cultura contínua pode ser usada. O sacarídeo obtido pela presente invenção pode ser contido no meio de partida ou meio de alimentação, ou pode ser contido em ambos.

A cultura de alimentação por batelada refere-se um método de cultura em que um meio é continuamente ou intermitentemente alimentado em uma recipiente de cultura e o meio não é extraído até o final da cultura. A cultura contínua significa um método em que um meio é continuamente ou intermitentemente alimentado em um recipiente de cultura e o meio é extraído a partir do recipiente (usualmente em um volume equivalente ao volume do meio de alimento) no mesmo período. O meio de partida significa o meio usado na cultura de batelada na cultura de alimentação por batelada ou cultura contínua antes da alimentação do meio de alimentação (meio usado no período de partida da cultura) e meio de alimentação significa um meio que é fornecido a um tanque de fermentação na cultura de alimentação por batelada ou cultura contínua. A cultura de batelada significa um método em que o meio fresco preparado para cada cultura e uma cepa é inoculada no meio, no qual o meio não é mudado até a coleta. O sacarídeo pode ser usada em qualquer concentração de modo que a concentração seja adequada para produzir uma substância alvo. A concentração do sacarídeo no meio é preferivelmente cerca de 0,05 a 50 p/v mais preferivelmente cerca de 0,1 a 40 p/v particularmente preferivelmente cerca de 0,2 a 20 p/v. O sacarídeo produzido pelo método da presente invenção pode ser independentemente usado, ou também pode ser usado em combinação com outras fontes de carbono obtido por outros métodos tal como glicose, frutose, sacarose, melados blackstrap e hidrolisato de amido. Neste caso, o sacarídeo obtido pelo método da presente invenção e outras fontes de carbono podem ser misturados em uma razão arbitrária. Preferido como outras fontes de carbono são sacarídeos tal como frutose, sacarose, lactose, galactose, melados blackstrap, hidrolisados de amido e uma solução de açúcar obtido pela hidrólise de outra biomassa, álcool tal como etanol e glicerol e ácidos orgânicos tal como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico.

Como o meio a ser usado, o meio convencionalmente usado na produção de L-aminoácidos pela fermentação usando microorganismos podem ser usados, fornecidos que o sacarídeo obtido pelo método da presente invenção é usado como a fonte de carbono. Isto é, meio convencional contendo, ao lado da fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, íons inorgânicos e opcionalmente outros componentes orgânicos como requeridos podem ser usados. Como a fonte de nitrogênio, sais de amônio inorgânico tal como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, acetato de amônio e uréia, nitratos, nitrogênio orgânico tal como hidrolisado de soja, gás de amônia, amônia aquosa e assim por diante podem ser usados. Além disso, peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, líquido da maceração do milho, hidrolisado de soja e assim por diante também pode ser utilizado. O meio pode conter um ou mais tipos destas fontes de nitrogênio. Estas fontes de nitrogênio também pode ser usadas tanto para o meio de partida quanto para o meio de alimentação. Além disso, a mesma fonte de nitrogênio pode ser usada tanto para o meio de partida quanto para o meio de alimentação, ou a fonte de nitrogênio do meio de alimentação pode ser diferente daquele do meio de partida.

O meio preferivelmente contém uma fonte de ácido fosfórico e uma fonte de enxofre em adição à fonte de carbono e a fonte de nitrogênio. Como a fonte de ácido fosfórico, diidrogenfosfato de potássio, hidrogenfosfato de dipotássio, polímeros de fosfato tal como ácido pirofosfórico e assim por diante podem ser utilizados. Embora a fonte de enxofre pode ser qualquer substância contendo átomos de enxofre, sais de ácido sulfurico tal como sulfatos, tiossulfatos e sulfitos e aminoácidos contendo enxofre tal como cisteína, cistina e glutationa são desejáveis e sulfato de amônio é especialmente desejável.

Além disso, o meio pode conter um fator que promove o desenvolvimento (nutriente tendo um efeito promotor de desenvolvimento) em adição aos componentes anteriormente mencionados. Como o fator que promove o desenvolvimento, metais traço, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucléicos bem como peptona, casaminoácido, extrato de levedura, produto de degradação de proteína de soja e assim por diante contendo as substâncias precedentes podem ser usadas. Exemplos de metais traço incluem ferro, manganês, magnésio, cálcio e assim por diante. Exemplos de vitaminas incluem vitamina Bb vitamina B2, vitamina B6, ácido nicotínico, nicotinamida, vitamina B12 e assim por diante. Estes fatores que promovem o desenvolvimento podem ser contidos no meio de partida ou no meio de alimentação.

Além disso, quando um mutante auxotrófico que requer um aminoácido ou outros para desenvolvimento destes é usado, é preferível suplementar um nutriente requerido ao meio. Em particular, visto que o caminho biossintético de L-Iisina é intensificado e capacidade de degradação de L-Iisina é freqüentemente atenuado na bactéria que produz L-Iisina que pode ser usada pela presente invenção como descrito abaixo, um ou mais tipos de substâncias selecionadas de L-treonina, L-homoserina, L-isoleucina e L-metionina são preferivelmente adicionados. O meio de partida e o meio de alimentação pode ter o mesmo ou composição média diferente. Além disso, o meio de partida e o meio de alimentação pode ter a mesma ou concentração de enxofre diferentes. Além disso, quando o meio de alimentação é alimentado nos estágios múltiplos, as composições do meio de alimentação que alimenta os estágios podem ser os mesmos ou diferentes.

Além disso, o meio usado na presente invenção pode ser um meio natural ou meio sintético, de modo que este contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e outros componentes como requerido.

A cultura é preferivelmente realizada por 1 a 7 dias sob condições aeróbicas. A temperatura de cultura é 20 a 45° C, preferivelmente 24 a 45° C, particularmente preferivelmente 33 a 42° C. A cultura é preferivelmente realizada como cultura de aeração, com controle da concentração de oxigênio a ser cerca de 5 a 50 %, desejavelmente cerca de 10 %, da concentração de saturação. Além disso, pH é preferivelmente controlado ser 5 a 9 durante a cultura. Para o ajuste de pH, as substâncias alcalinas ou ácidas orgânicas ou inorgânicas, tal como carbonato de cálcio, gás de amônia e amônia aquosa, podem ser usadas.

Se a cultura é realizada sob tais condições como descrito acima preferivelmente por cerca de 10 a 120 horas, uma quantidade marcada de uma substância alvo é acumulada em um meio de cultura.

Quando um aminoácido básico tal como L-Iisina é produzido, a produção pode ser realizada por um método em que a fermentação é realizada pelo controle de pH do meio durante a cultura a ser 6,5 a 9,0 e pH do meio no final da cultura a ser 7,2 a 9,0 e controle da pressão no tanque de fermentação a ser positivo durante a cultura, ou pelo fornecimento do gás de dióxido de carbono ou um gás misturado contendo o gás de dióxido de carbono ao meio para fornecer um período de cultura onde o meio contém 2 g/L ou mais de íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato, de modo que estes íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato servem como íons contadores de cátions principalmente que consiste de um aminoácido básico e o aminoácido básico objetivo é então coletado (Patente Japonesa aberta ao público N°. 2002-65287, Pedido Publicado de Patente U.S. N°. 2002/0025564, EP 1813677 A).

Ainda, na fermentação de ácido L-glutâmico, a cultura pode ser realizada com precipitação do ácido L-glutâmico no meio pelo uso de um meio líquido ajustado para ter uma condição sob o qual o ácido L-glutâmico é precipitado. A condição sob o qual o ácido L-glutâmico é precipitado é, por exemplo, pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particularmente preferivelmente pH 4,0 (EP 1078989 A)

A coleta da substância alvo a partir do meio de cultura pode usualmente ser ligado pela combinação de métodos conhecidos tal como um método de resina trocadora de íon e método de precipitação. Quando a substância alvo acumula-se nas células, as células podem ser interrompidas com, por exemplo, microondas supersênicos ou outros e a substância alvo pode ser coletada pelo método de resina trocadora de íon ou outros a partir do sobrenadante obtido pela remoção das células a partir da suspensão interrompida da célula pela centrifugação. Quando a substância alvo é um aminoácido ou um ácido nucléico, a substância alvo a ser coletada pode ser um composto na forma livre, ou pode ser um sal tal como sulfato, hidrocloreto, carbonato, sal de amônio, sal de sódio e sal de potássio.

A substância alvo coletada de acordo com a presente invenção pode conter células microbianas, componentes médios, umidade e metabólitos de bioprodutos de microorganismo em adição a substância alvo. A pureza da substância alvo coletada é 50 % ou mais, preferivelmente 85 % ou mais, particularmente preferivelmente 95 % ou mais (Patente U.S. N°. 5.431.933, Patente Japonesa N°. 1214636, Patente U.S. N°.4.956.471, 4.777.051, 4.946.654, 5.840.358, 6.238.714, Pedido Publicado de Patente U.S. N°. 2005/0025878).

Exemplos

Em seguida, a presente invenção será mais especificamente explicada com referências aos exemplos. Entretanto, o escopo técnico da presente invenção não é limitado por estes exemplos.

Exemplo 1: Isolamento de genes de xilanase pela clonagem

metagenômica

(1) Isolamento de DNA

O composto principalmente produzido a partir do bagaço da cana-de-açúcar por um fazendeiro de criação de gado em Tanegashima foi coletado. Este composto do bagaço foi produzido pela mistura do bagaço da cana-de-açúcar e fezes bovina e permitindo a fermentação da mistura para diversos meses. O composto foi propriamente produzido em um piso de concreto externo e existe diversos compostos do bagaço que sofre a fermentação por vários de períodos. Quando o estado de decomposição do bagaço foi visualmente observado para os diversos compostos do bagaço que sofre a fermentação por vários de períodos, no composto do bagaço após fermentação de cerca de seis meses, decomposição do bagaço avançando um tal grau que as partes do bagaço não devem ser visualmente confirmadas. Portanto, este composto do bagaço foi coletado como uma fonte do gene para a construção da biblioteca de metagenoma.

Pelo uso das células da cepa E. coli W3110 como uma bactéria gram-negativa, uma cepa isolada de Lactobacillus murinus derivado de ceco de rato como uma bactéria gram-positiva, a cepa Saccharomyces earlsbergensis CBS1513 como levedura e cepa Aspergillus niger JCM2261 como um fungo filamentoso e o composto do bagaço, métodos de extração de DNA foram examinados. Como os métodos de extração de DNA, um método usando kit Blood & Cell culture DNA Midi (QIAGEN) ou kit de isolamento de DNA UltraClean Mega Soil (MO BIO Laboratories, UltraClean é a marca registrada da companhia) e um método de congelamento e descongelamento foram examinados.

A extração de DNA usando os kits anteriormente mencionados

foi realizada de acordo com o protocolo ligado a cada kit, fornecido que, quando o kit de isolamento de DNA UltraClean Mega Soil foi usado, a extração de DNA foi realizada de acordo com o protocolo exceto que antes do rompimento com pérolas, 500 μΐ de uma solução de cloreto de lisozima a 100 mg/ml (Nacalai Tesque Inc.) e 220 μΐ de uma solução de N-acetilmuramidase a 3 mg/ml (Mutanolysin de Streptomyces globisporus ATCC 21553, Sigma- Aldrich Co.) foram adicionados para realizar um pré-tratamento de líse a 37° C por 30 minutos. Ainda, visto que os métodos usando a agitação vigorosa ou agitação branda para a operação de líse foram descritos nos protocolos, ambos os métodos foram examinados.

O método de congelamento e descongelamento foi realizado como seguem. As células ou suspensões da amostra no tampão TE (10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 8,0), cloreto de lisozima (Nacalai Tesque Inc.) e dodecilsulfato de sódio foram adicionados nas concentrações finais de 5 mg/ml e 50 mg/ml, respectivamente, a reação foi deixada a 37° C por 1 hora e então congelamento e descongelamento foram repetidos três vezes para colocar um tubo plástico contendo a mistura de reação e submetido a imersão em etanol esfriado anteriormente em um refrigerador a -80° C por 30 minutos e então aquecido ao tubo plástico em um banho de água a 65° C por 30 minutos. Após o congelamento e descongelamento, Protease K (QIAGEN) foi adicionado a uma mistura de reação em uma concentração final de 1 mg/ml e a reação foi deixada a 60° C por 1 hora. Então, uma operação de adição de uma mistura de fenol saturado por TE:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1} a uma mistura de reação em um volume igual aquele de uma mistura de reação, levemente a agitação da mistura por 30 minutos e então centrifugação da mistura (6000 χ g, 20 minutos) para coletar o sobrenadante foi repetido 3 vezes. Então, a mistura de clorofórmio e álcool isoamílico (24:1) foi adicionado ao sobrenadante coletado em um volume igual aquele do sobrenadante e a mistura foi levemente agitada por 20 minutos e então centrifugada (6000 χ g, 20 minutos) para coletar um sobrenadante. Uma solução de acetato de sódio (Nacalai Tesque Inc.) foi adicionada ao sobrenadante coletado em uma concentração final de 0,3 M, etanol esfriado anteriormente foi adicionado a uma mistura em um volume 2,5 vezes que do sobrenadante, a mistura foi levemente agitado e centrifugado (9400 χ g, 30 minutos) e o sobrenadante foi removido para coletar os precipitados de DNA. Os precipitados de DNA foram lavados pela adição de 70 % de etanol esfriado anteriormente ao DNA coletado, suficientemente misturado, centrifugação da mistura (9400 χ g, 30 minutos) e remoção do sobrenadante. Os precipitados foram secados em ar em temperatura ambiente e então dissolvido em uma solução de TE. Uma solução do DNA total extraído foi submetido a eletroforese em gel de campo pulsado e após a finalização da eletroforese, uma porção em gel contendo um fragmento de DNA de cerca de kbp foi taxada. Para a eletroforese em gel de campo pulsado, sistema CHEF-DR III (Bio-Rad Laboratories, Inc.) foi usado com 1 % de gel de agarose (Lorma Rockland, Inc., Seakem GTG Agarose) e a eletroforese foi realizada em um tampão 0,5 χ TBE sob as seguintes condições: temperatura de tampão: 14° C, ângulo: 120°, tempo de troca: 1 a 30 segundos e voltagem: 6 V/cm.

A extração de DNA usando o kit Blood & Cell culture DNA

Midi fornecido em uma eficiência de extração de DNA inferior como comparado a outros métodos. Além disso, no método de congelamento e descongelamento, a bactéria gram-negativa mostrou uma eficiência de extração de DNA extremamente mais alto como comparado a outros microorganismos e foi julgado que este foi difícil para extrair os DNAs uniformemente dos microorganismos existentes nas amostras por aquele método. Quando o kit de isolamento de DNA UltraClean Mega Soil foi usado, a diferença no efeito da extração de DNA dependendo do tipo de microorganismo foi comparativamente menor e as eficiências de extração de DNA a partir do composto do bagaço para os microorganismos exceto para a bactéria gram-negativa foram substancialmente equivalentes aquele obtido pelo método de congelamento e descongelamento. Ainda, quando a agitação vigorosa foi usada para a operação de Iise na extração de DNA a partir do composto do bagaço, o DNA extraído foi fragmentado e fragmentos de DNA do tamanho preferido (20 a 40 kbp) não deve ser obtido. Em contraste, quando a agitação branda foi usada, a fragmentação do DNA extraído não foi observado e os fragmentos de DNA do tamanho preferido foram obtidos. Portanto, foi determinado usar este método como um método de extração de DNA. Para a construção de uma biblioteca metagenômica, 8 ml de extrato de DNA foi obtido pela extração de DNA de 10 g do composto do bagaço de acordo com o método anteriormente mencionado usando o kit de isolamento de DNA UltraClean Mega Soil. Ao extrato de DNA, 0,32 ml de uma solução de 5 M de NaCl e 16,6 ml de etanol foram adicionados para realizar precipitação de etanol, os precipitados foram secados em ar e então dissolvidos novamente em 0,2 ml de tampão a 10 mM TE (pH 8,0) para concentrar o DNA e a solução foi armazenada a -20° C.

(2) Purificação de DNA e construção da biblioteca de DNA

A fim de examinar a influência dos inibidores de reação de enzima estimado ser contaminado a solução de DNA extraída a partir do composto do bagaço, PCR foi realizada (96° C por 10 segundos, 30 ciclos de [96° C por 30 segundos, 50° C por 30 segundos e 72° C por 2 minutos] e 72° C por 5 minutos e 30 segundos) pelo uso de uma série iniciadora de seqüência consenso pelo gene 16s rRNA (JCM 27f [SEQ ID N°: 28] e JCM 1492R [SEQ ID N°: 29]). Para o PCR, a polimerase de DNA ExTaq (TAKARA) foi usada e a reação foi realizada em uma composição da mistura de reação que consiste de 22,9 μΐ de H2O, 3 μΐ de tampão 10 x, 2,4 μΐ de dNTPs, 0,2 μΐ de polimerase ExTaq DNA, 0,5 μΐ cada um de 20 pmol/μΐ dos iniciadores e 0,5 μΐ de um modelo de solução de DNA com um volume total de 30 μΐ. Como um resultado de PCR, qualquer produto PCR do gene 16S rRNA não foi obtido e portanto foi temido que os inibidores de reação de enzima contaminados também afetariam a construção da biblioteca. Portanto, a fim de remover vários inibidores de reação de enzima na operação da construção de uma biblioteca de DNA, eletroforese de DNA e recuperação de DNA a partir do gel submetido a eletroforese foram realizados. A solução de DNA total isolada a partir do composto do bagaço foi submetido a eletroforese em gel de campo pulsado e após a finalização da eletroforese, uma porção em gel contendo um fragmento de DNA de cerca de 20 kbp foi taxada. Para a eletroforese em gel de campo pulsado, sistema CHEF-DR III (Bio-Rad Laboratories, Inc.) foi usado com 1 % de gel de agarose (Lonza Rockland, Inc., Seakem GTG agarose) e a eletroforese foi realizada em um tampão 0,5 χ TBE sob as seguintes condições: temperatura de tampão: 14° C, ângulo: 120°, tempo de troca: 1 a 30 segundos e voltagem: 6 V/cm.

A porção em gel taxada foi colocada em um tubo de diálise (tubo de diálise Spectra/Pore CE, Funakoshi) enchido com 20 ml de 0,25 χ tampão TBE e aplicado com uma voltagem em uma unidade de eletroforese Mini-gel enchida com 0,25 χ tampão TBE para coletar fragmentos de DNA a partir do gel no tampão 0,25 χ TBE na membrana de diálise. O tampão 0,25 χ TBE contendo os fragmentos de DNA foi coletado, 20 ml de uma solução de fenol/clorofórmio [fenol saturado por TE:clorofórmio:álcool isoamílico = 25:24:1] foi adicionado, a mistura foi suavemente agitada por 30 minutos e então centrifugada (9400 χ g, 20 minutos) e o sobrenadante foi coletado. Ao sobrenadante coletado, 20 ml de uma solução de clorofórmio [clorofórmio:álcool isoamílico = 24:1] foi adicionado, a mistura foi suavemente agitada por 30 minutos e centrifugada (9400 χ g, 20 minutos) e o sobrenadante foi coletado novamente. Ao sobrenadante coletado, 1,9 ml de acetato de sódio 3 M e 15,2 ml de isopropanol foram adicionados para realizar precipitação de álcool e fragmentos de DNA foram coletados. PCR do gene 16s rRNA foi realizado na mesma maneira como descrito acima pelo uso do DNA coletado como um modelo. Como um resultado, um produto de amplificação foi obtida e deste modo a eliminação dos inibidores de reação de enzima foi confirmado. Pelo uso do DNA coletado como um modelo e kit de produção de biblioteca CopyControl Fosmid (EPICENTRE Biotechnologies, CopyControl é uma marca registrada da companhia), um composto do bagaço biblioteca de DNA dos fragmentos de DNA coletados foi construída de acordo com o protocolo ligado ao kit e feito em uma solução de glicerol solution em uma concentração final de 20 % e a solução de glicerol foi armazenada a -80° C.

(3) Avaliação da expressão

O gene alvo foi avaliado para na base da atividade da decomposição de xilano usado como um índice. E. coli contendo o composto do bagaço biblioteca de DNA anteriormente mencionado foi aplicado no meio ágar LB {10,0 g/L de triptona, 5,0 g/L de extrato de levedura Bacto, 10,0 g/L de NaCl, 20 g/L de ágar) contendo 12,5 μg/ml de cloranfenicol (daqui em diante referido como o "meio de ágar LBcm") e cultivado durante a noite a 37° C e então as colônias que parecem serem copiadas ao meio de ágar LBcm contendo 0,6 % de xilano (Sigma-Aldrich Co.) pelo uso de uma membrana de náilon (Amersham, membrana Hybribond-N+) e cultivado durante a noite a 37° C. Após o aparecimento das colônias foi confirmado, 300 μΐ da solução de indução (incluído no kit de produção de biblioteca CopyControl™ Fosmid) diluído 10 vezes foi adicionado ao meio ágar e enquanto a cultura da bactéria novamente a 37° C por uma semana, presença ou ausência da formação halo devido a decomposição de xilano no meio ágar foi observado. A partir das colônias pelo qual a formação halo foi confirmada, as células foram sucessivamente selecionadas. Os clones E. coli selecionados foram purificados e então a formação halo foi confirmado por estes no meio de ágar LBcm contendo 0,6 % de xilano.

(4) Identificação de gene de xilanoase

A partir da cepa E. coli contendo um fosmídeo do composto do bagaço que mostra a atividade de decomposição de xilano, um vetor de fosmídeo foi extraído pelo uso de kit de plasmídeo QIAGEN (QIAGEN GmbH). O vetor de fosmídeo extraído foi digerido com BamHI, HindIII, KpnI, SalI ou Sau3AI (Takara Bio Inc.) de acordo com o protocolo ligado a cada enzima, os fragmentos digeridos foram subclonados no vetor pUC18 (Takara Bio Inc.) e um clone E. coli que mostra a decomposição de xilano foi avaliado pelo meio ágar LB contendo 0,6 % de xilano e 100 μg/ml de ampicilina. Um plasmídeo foi preparado a partir do clone que mostra a decomposição de xilano e determinação da seqüência de nucleotídeo total foi confiado ao Takara Bio Inc. Na base da informação total da seqüência de nucleotídeo determinada total, estruturas de leitura aberta (ORF) foram observadas na seqüência de nucleotídeo pelo uso da versão Genetyx 6.1.2 (GENBTYX CORPORATION) e traduzido na seqüência de aminoácido e as seqüências de aminoácido foram submetidos a busca da homologia no banco de dados da proteína para determinar oito grupos das seqüências de nucleotídeo estimados para codificar para xilanase (incluindo aquele da SEQ ID N°: 19, 21 e 23). Não existe seqüência de aminoácido conhecido que foi o mesmo como aquele da seqüência de aminoácido traduzida e deste modo estes foram considerados seqüências de gene de xilanase novas. As homologias entre a seqüência de aminoácido traduzida e homologia (%) entre esta seqüência de aminoácido e seqüências conhecidas são mostrados na tabela 1. cd t—( α>

•s

H

Homologia da sequencia esquerda descrita cn r-» m Tt- o r- cn Tt CM VO CN OO U-) VO No de acesso da sequencia conhecida mostrando maior homologia gb 1AAZ76373.11 gil556705731pdbllW2V gbIAAD54767.11AF120156 1 reflYP 528530.11 gblAAY64879.il gblA8196991.11 embICAH03685.31 gblAAD54767.11AF120156 1 Xynll- 6 o O Xynll- 5 OOI CO cn Xynll- 4 o O OO CN Os Xynll- 3 o o τ—I os CN os CN 0\ Xynll- 2 o o OO U") ΐ—ι OO Tt- C-- Xynll- 1 i o o *—1 cn Tl- LZ VO CN cn Os CN XynlO- 2 o O Γ- ι—I U~) ΐ—I ID ι—I t> cn ι-1 ô r—< X o O VO CN cn CN OS *—ι U") VO U-) CN ynlO-1 ynlO-2 ynll-1 ynll-2 ynll-3 Xynll-4 Xynll-5 ► ynll-6 Os oito grupos das seqüências de nucleotídeos estimados para codificar pela xilanase foram projetados XynlO-1, XynlO-2, Xynll-I (SEQ ID N°: 19), Xynl 1-2 (SEQ ID N°: 21), Xynl 1-3, Xynl 1-4, Xynl 1-5 (SEQ ID N°: 23) e Xynl 1-6, respectivamente. Os clones que expressam xilanases de Xynl 1-1, Xynl 1-2 e Xynl 1-5, E. coli JM109/Xynll-1, E. coli JM109/Xynll-2 e E. coli JM109/Xynll-5, foram projetados AJl 10764, AJl 10765 e AJl 10769, respectivamente. AJl 10764 e AJl 10765 foram depositados em 29 de Janeiro de 2010 e AJl 10769 foi depositado em 11 de Março de 2010 at the independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depository (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, 305-8566, Japan) e número de acessão projetado de FERN P-21897, FERM P-21898 e FERM P-21939, respectivamente. Os depósitos foram comvertidos nos depósitos internacionais sob as provisões de Budapest Treaty em 25 de Janeiro de 2011 e número de acessão projetado de FERM BP- 11325, FERN BP-11326 e FERM BP-11327, respectivamente.

(5) Clonagem TA do gene de xilanoase em Escherichia coli Na base das seqüências do gene de xilanase determinado como descrito acima, os iniciadores de DNA para a amplificação das regiões de DNA dos ORFs foram preparados e usados para realizar PCR usando uma solução diluída de cada DNA subclonado como um modelo de acordo com o protocolo padrão de KOD-plus-ver.2 (TOYOBO CO., LTD.). Os iniciadores DNA para amplificação das regiões de DNA de Xynll-I (SEQ ID N°: 19), Xynl 1-2 (SEQ ID N°: 21) e Xynl 1-5 (SEQ ID N°: 23) são mostrados como SEQ ID N0.: 1 a 6. Os produtos PCR foram cada um submetido a eletroforese de gel de agarose, um grupo para cada peso molecular esperado foi taxado e purificado de acordo com o protocolo padrão do kit de extração em gel QIAEX II (QIAGEN GmbH). O dA foi adicionado ao produto PCR purificado pelo uso de TaKaRa Ex Taq (Takara Bio Inc.) e dA adicionado ao produto PCR foi ligado ao vetor pGEM-T Easy (Promega Corporation) pelo uso de T4 ligase de acordo com o protocolo padrão do vetor pGEM-T Easy (Promega Corporation). A reação de ligação foi realizada a 4o C por 16 horas. O JM109 competente alto (TOYOBO CO., LTD.) foi transformado pelo uso de 5 μΐ da mistura de ligação obtida em uma maneira convencional. Os transformantes obtidos foram purificados e examinados pela formação halo no meio ágar LB contendo 0,6 % de xilano e 50 μg/ml de ampicilina. Como um resultado, formação halo foi confirmado pelos transformantes em que seis ORES exceto por Xynl 1-3 e Xynl 1-6 foram clonados. Visto que ORFs esperados para codificar outra xilanase também existe nos fragmentos de DNA subclone em que Xynl 1-3 e Xynl 1-6 foram observados, foi considerado que a formação halo mostrado pelos subclones foi fornecido por estes outros ORFs, não por Xynl 1-3 e Xynl 1-6. Portanto, Xynl 1-3 e Xynl 1- 6 foram considerados ser genes que não devem ser expressados ou função em Escherichia coll.

(6) Construção do sistema de expressão com base no Corynebaeterium glutamieum

C. glutamieum foi escolhido como um hospedeiro pela expressão dos genes de xilanase anteriormente mencionados. As características do sistema de secreção de proteína de C. glutamieum inclui a características que originalmente secretam quase nenhuma proteína e proteínas heterogêneas expressadas são acumuladas em um meio de alta pureza. Como o caminho de secreção de proteína, existe conhecido o caminho de secreção geral (caminho Sec, refere-se ao WOOl/23591) com o qual uma proteína é dobrada no exterior da célula e o caminho de translocação twin- Arginina (caminho Tat, refere-se ao W02005/103278) com o qual uma proteína é dobrada no interior da célula e secretado. Visto que as melhores funções do sistema dependem do gene alvo, ambos os sistemas de secreção foram construídos. A seqüência de aminoácido de cada xilanase foi entrado em SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) para predizer o peptídeo de sinal. Como um resultado, a proteína codificada por Xynl 1-5 (SEQ ID N°: 24) foi esperado ser clivado entre os resíduos de aminoácido 55° e o 56° a partir do resíduo de aminoácido de terminal N e portanto de modo que o resíduo de aminoácido 56° e o seguinte resíduo de aminoácido são ligados ao caminho Sec e peptídeos de sinal do caminho Tat existente em um vetor de expressão para a bactéria coryneform, os fragmentos de DNA foram ligados. Visto que qualquer seqüência sinal não foi esperado por Xynll-I (SEQ ID N°: 20) e Xynl 1-2 (SEQ ID N°: 22), o primeiro resíduo de aminoácido e o seguinte resíduo de aminoácido foram ligados ao caminho Sec e peptídeos de sinal de caminho Tat. Como para outros xilanases, seqüências de sinais foram preditos para Xyn 10-1, Xyn 10-2, Xynl 1-4 e Xynl 1-6, semelhante ao Xynl 1-5 e portanto as seqüências seguindo o local de clivagem foram ligados ao caminho Sec e peptídeos de sinal de caminho Tat.

Como um hospedeiro de expressão para a secreção dependente do caminho Sec, a cepa C. glutamicum YDKOlO foi usado. Esta cepa corresponde a cepa mutante C. glutamicum, a cepa YSr, em que um gene codificado para uma proteína de camada de superfície celular (PS2) é interrompida (descrito em Publicação de Patente Internacional WOOl/23591). De outra maneira, como um hospedeiro de expressão para a secreção dependente do caminho Tat, a cepa C. glutamicum WDK010 foi usada. Esta cepa é uma cepa derivada da cepa C. glutamicum 2256 (ATCC 13869), em que um gene codificado pela proteína de camada de superfície celular (PS2) é interrompida.

O WDKOlO foi construído pelo seguinte procedimento.

O DNA genômico foi extraído a partir da cepa C. glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) AJ12036 descrito em W002/081694. A cepa AJ1203 6 é uma cepa obtida pela cura do plasmídeo pAM330 originalmente existente a partir da cepa C. glutamicum 2256. O DNA genômico desta cepa AJ12036 foi usado como um modelo junto com um iniciador YSrpsL5 (5'-AGGTC AGTGGCG AGTTTCTT-3, SEQ ID N°: 26) e um iniciador YSrpsL3 (5'-GGTAGGTAGCGCCACCAACA-3, SEQ ID N°: 27) para realizar a amplificação PCR e portanto obter um fragmento de 1 kbp contendo uma parte do gene codificado por PS2. As condições PCR foram como seguem.

Polimerase Pyrobest DNA (TAKARA) foi usado. H2O: 37,8 μΐ, tampão PCR: 5 μΐ, dNTPs: 4 μΐ, polimerase Pyrobest DNA: 0,2 μΐ, iniciadores 10 μΜ: 1 μΐ cada e 100 ng/μΐ de DNA (modelo): 1 μΐ, volume total: 50 μΐ <condições PCR > Ciclo 1 (χ 1): 98° C por 5 minutos

Ciclo 2 (x 30): 98° C por 10 segundos, 57° C por 0,5 minuto e 72° C por 1 minuto.

Para usar este fragmento de DNA e a cepa C. glutamicum ATCC 13869, uma cepa substituída pelo gene foi produzida na mesma maneira como aquele do método descrito em W002/081694, Exemplo 9. A cepa substituída pelo gene obtida foi confirmada para desenvolver no meio ágar CM2G contendo 100 mg/L de estreptomicina. Além disso, pelo uso desta cepa substituída pelo gene, a proteína de superfície celular (PS2) cepa interrompida completamente pelo gene foi preparado na mesma maneira como aquele do método descrito em W002/081694, Exemplo 9 e esta cepa bacteriana foi a cepa WDKOlO projetada. Os plasmídeos de expressão foram construídos de acordo com

o método descrito em App. Env. Micro., 2003, 69, 358-366. Como pela secreção dependente do caminho Sec, existe iniciadores DNA projetados (SEQ ID N°: 7 e 8) pela amplificação PCR de uma região codificadora para o promotor CspB e um peptídeo sinal (sinal SlpA derivado de Corynebacterium ammoniagenes) usando o plasmídeo pPSPTGl descrito em App. Env. Micro., 2003, 69, 358-366 como um modelo. Como para a secreção dependente do caminho Tat, existe os iniciadores DNA projetados (SEQ ID N°: 7 e 9) pela amplificação de PCR de uma região codificadora para o promotor CspB e um peptídeo sinal (sinal TorA, derivado de Escherichia coli) usando o plasmídeo pPTPPG descrito em Appl. Microbiol. Bioteehnol., 2008, 78:67-74 como um modelo. Além disso, em ambos os sistemas de expressão para o caminho Sec e um sistema de expressão para o caminho Tat, um local BamHI foi fornecido a montante da seqüência promotora nos fragmentos de DNA amplificados destes.

O fragmento de DNA de cada gene de xilanase foi obtida pelo uso de PCR do plasmídeo extraído a partir do clone TA correspondente anteriormente mencionado como um modelo e iniciadores para amplificação de uma seqüência de DNA para uma seqüência de aminoácido a partir do resíduo de aminoácido no caso de Xynll-I (SEQ ID N°: 19) ou Xynl 1-2 (SEQ ID N°: 21), ou de resíduo de aminoácido 56° no caso de Xynl 1-5 (SEQ ID N°: 23) ao resíduo de aminoácido correspondente ao códon imediatamente antes do códon de interrupção (SEQ ID N°: 10 a 18). Para o PCR acima, 20 nucleotídeos homólogos à seqüência para a seqüência sinal do caminho Sec ou o caminho Tat foram adicionados a extremidade final 5' dos iniciadores e os iniciadores foram projetados de modo que o local XbaI foi adicionado a jusante a partir do códon de interrupção. Como também para outros genes de xilanase, iniciadores foram projetados pela amplificação de uma seqüência de DNA para uma seqüência de aminoácido a partir do primeiro resíduo de aminoácido no caso de Xynl 1-3 pelo qual a seqüência sinal não foi predito, ou o resíduo de aminoácido seguindo o local de clivagem no caso de XynlΟ- Ι, Xyn 10-2, Xynl 1-4 e Xynl 1-6 pelo qual uma seqüência sinal foi predita, ao resíduo de aminoácido correspondente ao códon imediatamente antes do códon de interrupção. O fragmento de DNA de cada gene de xilanase foi obtida por PCR usando o plasmídeo extraído a partir do clone TA correspondente anteriormente mencionado como um modelo e iniciadores para amplificação de uma seqüência de DNA para uma seqüência de aminoácido a partir do primeiro resíduo de aminoácido no caso de Xynll-I (SEQ ID N°: 19) ou Xynl 1-2 (SEQ ID N°: 21) ou do 56° resíduo de aminoácido no caso de Xynl 1-5 (SEQ ID N°: 23) ao resíduo de aminoácido correspondente ao códon imediatamente antes do códon de interrupção (SEQ ID N°: 10 a 18).

Para o PCR acima, 20 nucleotídeos homólogos à seqüência para a seqüência sinal do tipo Sec ou o tipo Tat foram adicionados a extremidade de final 5' dos iniciadores e os iniciadores foram projetados de modo que o local XbaI foi adicionado a jusante a partir do códon de interrupção.

O PCR foi realizado de acordo com o protocolo padrão de KOD-plus-ver.2 (TOYOBO CO., LTD.). O produto PCR do promotor e a seqüência para o peptídeo sinal foi purificado de acordo com o protocolo padrão de AMpure (Beckmann Coulter Co.). O produto de PCR foi submetido a eletroforese de gel de agarose, um grupo do peso molecular esperado foi taxada e o produto foi purificado de acordo com o protocolo padrão do kit de extração em gel QIAEXII (QIAGEN GmbH).

Então, o PCR de passagem foi realizado pelo uso de uma mistura do produto de PCR do promotor e o peptídeo sinal e o produto de PCR do gene de xilanase obtido (1:1, razão de volume) como um modelo, um iniciador correspondente a seqüência promotora (SEQ ID N°: 7) e um iniciador correspondente ao códon de interrupção (SEQ ID N°: 16 [correspondente ao Xynll-I (SEQ ID N°: 19)], SEQ ID N°: 17 [correspondente ao Xyn11-2 (SEQ ID N°: 21)], SEQ ID N°: 18 [con-espondente ao Xynl 1-5 (SEQ ID N°: 23)] etc.), um fragmento de DNA codificado pelo promotor, a seqüência sinal e a xilanase foi portanto amplificada.

Esta passagem do produto de PCR foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e XbaI e então submetida a eletroforese de gel de agarose, um grupo de DNA do peso molecular alvo foi taxado e o DNA foi purificado de acordo com o protocolo padrão de kit de extração em gel QIAEX II (QIAGEN GmbH). Cada fragmento de DNA foi inserido no local BamHI-Xbal de pPK4, que é um vetor de shuttle Corynebacterium-E. coli descrito na Patente Japonesa aberta ao público N°. 9-322774 (EP0841395), para obter um plasmídeo pela expressão secretório da xilanase obtida do caminho Sec ou o caminho Tat. O plasmídeo foi introduzido na cepa YDKOlO no caso do caminho Sec, ou a cepa WDK010 no caso do caminho Tat pela eletroporação e um desenvolvimento da cepa no meio ágar CM2G (10 g de extrato de levedura, 10 g de triptona, 5 g de glicose, 5 g de NaCl, 15 g de ágar, feito 1 L com água e ajustado ao pH 7,2) contendo 25 mg/l de camanicina foi selecionado.

A cepa selecionada foi inoculada no meio CM2G líquido (10 g do extrato de levedura, 10 g de triptona, 5 g de glicose, 5 g de NaCl, feito 1 L com água e ajustado a pH 7,2) e pré-cultivado durante a noite a 30° C. Ao meio líquido MMTG (120 g de glicose, 3 g de heptaidrato de sulfato de magnésio, 30 g de sulfato de amônio, 1,5 g de diidrogenfosfato de potássio, 0,03 g de heptaidrato de sulfato de ferro, 0,03 g de tetraidrato de sulfato de manganês, 0,45 mg de cloridreto de tiamina, 0,45 mg de biotina, 0,15 g de DL- metionina, 50 g de carbonato de cálcio, feito 1 L com água e ajustado ao pH 7,0), mg/l de camanicina foi adicionado, 4 mL de uma mistura foi colocado em um tubo de teste de tamanho amplo, a solução de pré-cultura foi inoculada em uma razão de 5 % (v/v) e cultura foi realizada a 30° C por 72 horas.

Após a finalização de uma cultura, um sobrenadante de cultura foi submetido às gotas em uma placa de agarose contendo xilano e a atividade de decomposição de xilano foi confirmado na base da formação de halo. Como um resultado, para Xynl 1-3 e Xynl 1-5 pelo qual a atividade não deve ser confirmada nos clones Escherichia call descritos em (5) descritos acima, a atividade não deve ser confirmada também com o sistema de expressão da bactéria coryneform. Ainda, para Xyn 10-2 pelo qual a atividade deve ser confirmada no clone Eseheriehia eoli, a atividade não deve ser confirmado com o sistema de expressão da bactéria coryneform. Para Xynll-I (SEQ ID N°: 19), Xynl 1-2 (SEQ ID N°: 21), Xynl 1-5 (SEQ ID N°: 23), XynlO-I e Xynl 1-4, pelo qual a atividade foi confirmada, um sobrenadante de cultura foi submetido ao SDS-PAGE para confirmar que a expressão de uma proteína foi observado em uma posição do peso molecular esperado. Na base da atividade de enzima e a quantidade de proteína expressada, o caminho Tat foi selecionado pelo Xynll-I e o caminho Sec foi selecionado por Xynl 1-2, Xynl 1-5, XynlO-I e Xynl 1-4.

Exemplo 2: Sacarificação do bagaço com xilanase

A fim de avaliar a função de cada xilanase para promover a sacarificação do bagaço da cana-de-açúcar, o seguinte teste de melhoramento da capacidade de sacarificação do bagaço foi realizado.

O bagaço foi obtido de Tanegashima Island e o bagaço foi desenvolvido sob as seguintes condições.

Secagem: secagem solar

Entidade no qual a trituração foi confiada: Nara Machinery

Co., Ltd.

Triturador: Nara system automatic mill, Model M-4

Condições de trituração: velocidade de rotação: 5500/min, avaliação: Dia da avaliação 0,9 mm

Peneiração: peneiras tendo o tamanho dos poros de 0,15 mm e 0,355 mm foram usados para coletar o bagaço tendo um tamanho de 0,15 a 0,355 mm e foi usado para o teste.

O sobrenadante de cultura C. glutamicum preparado pelo método descrito em Exemplo 1 foi concentrado 10 vezes pelo uso de uma membrana de ultrafiltração, Vivaspin 20 (corte: 10 kDa, Sartorium Stedim Biotech GmbH) e substituído com 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 5,0). Para a avaliação, existe uma preparação de xilanase usada NS50030 (Xyn30) e NS50014 (Xynl4) incluído no kit Novozymes Biomass (Novozymes A/S) como controle positivo, 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 5,0) como controle negativo e um sobrenadante de cultura de YDKOlO introduzido com ρΡΚ4. A avaliação foi realizada em triplicata (N = 3).

A quantidade das proteínas em cada amostra foi quantificada de acordo com o protocolo padrão de Protein Assay CBB Solution (Nacalai Tesque Inc.). Ainda, pelo uso da ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/), a razão do grupo alvo das proteínas totais na imagem de SDS-PAGE foi calculado e usado pelo cálculo da concentração de enzima. Uma mistura de celulase foi preparada pela dissolução de 0,143 g/ml de Celluclast (Novozymes A/S), 0,033 g/ml de Novozyme 188 (Novozymes A/S) e 5 mg/ml de geneticina como um antibiótico em 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 5,0).

Para um frasco de vidro com um rompedor de borracha de isobutileno-isopropeno, 0,1 g do bagaço seco e 4 ml de um tampão de acetato de sódio a 50 mM (pH 5,0) ou um tampão de fosfato de 50 mM (pH 8,0) foram adicionados, a mistura foi esterilizada pela autoclave a 121° C por 20 minutos, 0,5 ml da mistura de celulase esterilizada pelo uso de um filtro de PES MILLEX GP tendo um diâmetro de poro de 0,22 μιη (Millipore) e 0,5 ml de uma amostra testada foram adicionados a uma mistura e a reação de sacarificação foi deixada a 50° C por quatro dias com agitação branda. A quantidade das enzimas foi ajustada ser 65 a 150 mg por 5 mL de um sistema de reação. Após a finalização da reação, o sobrenadante da mistura de reação obtido pela centrifugação (14000 rpm, 10 minutos) foi coletado e a concentração de glicose deste foi medido com analisador Biotech AS310 (Sakura SI). Um sistema de reação não contendo o bagaço foi preparado para todos os grupos do experimento, a quantidade de glicose deste foi subtraído como um vácuo a partir da quantidade de glicose medida da amostra para obter um valor considerado a quantidade da glicose livre derivado do bagaço e razão da quantidade de glicose livre à quantidade de glicose contendo o bagaço foi obtido como uma razão de sacarificação. Quando o tampão de fosfato de 50 mM (pH 8,0) foi adicionado, o valor de pH final da amostra foi cerca de 7 e portanto o teste de sacarificação do bagaço foi realizado sob a

condição de pH 7,0.

A concentração da glicose produzida como um resultado da reação de sacarificação no grupo de adição de xilanase (50 mM de tampão de acetato de sódio, indicado como "NC" nestes gráficos) foi usado como o padrão. A razão de sacarificação para este padrão foi tirado como 1, valores relativos de razões de sacarificação das amostras com base neste e foram calculados e as médias destes são mostrados na Fig. 1 (pH 5) e Figs. 2 (pH 7). Para o grupo de adição NS50014 (Xynl4) (indicado como "X14" nos gráficos) e o grupo de adição NS50030 (Xyn30) (indicado como "X30" nos gráficos), os dados por três vezes do experimento foram medidos e portanto N foi 9 e para os grupos de adição Xynl 1-1, Xynl 1-2 e Xynl 1-5 (indicado como "XI1-1", "XI1-2" e "XI1-5" nos gráficos), os dados de duas vezes do experimento foram medidos e portanto N foi 6. Ainda, as barras de erro mostra os desvios padrões.

Como um resultado, sob a condição de pH 7, a adição de todos da xilanases da presente invenção fornecido em uma razão de sacarificação mais alta como comparado a adição da xilanase comercialmente disponível e o efeito deste para a promoção da sacarificação pela celulase foi clarificada. Ainda, foi observado que, sob as condições de pH 5, estes também tende-se a promover a sacarificação, embora o grau deste seja menor que do aquele observado em pH 7. O mesmo teste foi realizado por outros xilanases (XynlO-1 e Xynl 1-4) e estes ambos não mostraram a diferença significante como comparado as xilanases comercialmente disponíveis.

Exemplo 3: Caracterização enzimológica de xilanases

A fim de avaliar as características enzimológicas de xilanases, os seguintes testes foram realizados.

(1) pH de reação ótima

Uma solução de substrato a 1 % (p/v) foi preparada a partir de xilano derivado de bétula (xilano de Birchwood, Sigma) e tampão de fosfato- citrato (pH 3,5 a 8,0, variando em unidades do pH 0,5) e submetido a autoclave para dispersar suficientemente xilano na solução.

Como uma solução de enzima, um sobrenadante de cultura C. glutamicum preparado pelo método descrito em Exemplo 1 foi concentrado vezes pelo uso de uma membrana de ultrafiltração, Vivaspin 20 (corte: 10 kDa, Sartorium Stedim Biotech GmbH) e substituído com 50 mM de tampão de acetato de sódio (pH 5,0) foi usado.

A reação enzimática foi realizada de acordo com o método da Berrin et al. (Protein Expression and Purification, 19, 179-187, 2000) pela mistura 180 ^L da solução de substrato a 1 % e 20 μΙ, da solução de enzima em uma bandeja microtituladora e deixando uma reação a 50° C por 5 minutos usando um ciclizador térmico. A reação foi realizada em triplicata (N = 3) para cada enzima e cada valor pH. A solução foi levada em um volume de 50 μΙ, após a reação e misturado com 100 \\L de uma solução de 1 % DNS e a reação foi deixada a 95° C por 5 minutos. A solução de 1 % DNS refere-se a uma solução contendo 1 % de ácido dinitrossalicílico, 0,05 % de sulfeto de sódio, 1 % de hidróxido de sódio e 20 % tartrato de potássio e esta solução de DNS é geralmente usado para medição para redução da quantidade de açúcar.

A absorbância (540 nm) da mistura de reação foi medida e a quantidade dos xilo-oligossacarídeos produzidos foi calculado pelo uso de uma curva de calibração preparada com as soluções de xilose. No teste preliminar, qualquer sacarídeo contido na solução de eznima não foi detectado, mas não reduzindo os açúcares considerados ser produtos de acidolise foram detectados na solução de substrato, em particular, naquela faixa de dosagem. Portanto, para as soluções de substrato em todos os valores de pH, um vácuo em que a água destilada foi adicionado em vez da solução de enzima foi preparado e os valores obtidos pela subtração da quantidade do açúcar de fundamento derivado da solução de substrato foram quantidades consideradas de sacarídeos produzidos. As quantidades relativas de sacarídeos produzidos em cada valor de pH com base na quantidade máxima dos sacarídeos produzidos, que foi tirado como 1, foram calculados como

atividades específicas.

Um gráfico indicando um pH de reação ótima é mostrado mostrado na Fig. 3. Todas as xilanases novas mostraram modelos de pH ótimos similares e o pH ótimo foi de cerca de 7,0. De outra maneira, o pH ótimo de xilanase comercialmente disponível, Xynl4 (Novozymes, NS50014), foi de cerca de 6,5.

(2) Temperatura de reação ótima

Uma solução de substrato 1 % (p/v) foi preparado a partir do xilano de Birchwood (Sigma) e um tampão de citrato-fosfato (pH 7,0) e submetido a autoclave para dispersar suficientemente xilano na solução. Uma solução de enzima foi preparada pelo método descrito na seção precedente. A reação enzimática foi realizada na mesma maneira como aquele do método descrito na seção precedente pela mistura 90 \\L da solução de substrato a 1 % e 10 μΙ. da solução de enzima diluída com água destilada em uma bandeja de microlitro e permitindo a reação a 35 a 85° C (variando nas unidades de 5o C) por 5 minutos usando um thermal cycler. A reação foi realizada em triplicata (N = 3) para cada temperatura e cada enzima, fornecido que a reação foi realizada em duplicata (N = 2) por apenas a enzima comercialmente disponível Xyn 14. A solução foi tirado em um volume de 50 μΐ, após a reação e misturado com 100 \xL da solução DNS, uma reação de cor foi deixada a 95° C por 5 minutos e absorbância (540 nm) de uma mistura de reação foi medida. Para as amostras para todas as temperaturas, um vácuo em que a água destilada foi adicionado em vez da solução de enzima foi preparado e os valores obtidos pela substração da quantidade do açúcar de fundamento derivado da solução de substrato foram quantidades consideradas dos sacarídeos produzidos. As quantidades relativas de sacarídeos produzidos em cada temperatura com base na quantidade máxima dos sacarídeos produzidos, que foi tirado como 1, foram calculados como atividades específicas.

Um gráfico que indica a temperatura de reação ótima é mostrada na Fig. 4. A atividade mais alta foi mostrada a 65° C por Xynl 1-1, 70° C por Xynl 1-2 e a enzima comercialmente disponível Xyn 14 e 75° C por Xynl 1-5.

(3) Estabilidade de calor no período curto de tempo

Uma solução de enzima preparada pelo método descrito na seção precedente foi diluída com um tampão de citrato-fosfato (pH 7,0) e foi confirmado que o pH da solução diluída foi 7. As soluções de enzima tratadas a 50 a 75° C (variação nas unidades de 5o C) por 10 minutos foram usados como soluções de enzima tratadas por calor. A solução de substrato a 1 % (pH 7,0) em um volume de 90 pL e a solução de enzima tratada por calor ou solução de enzima não tratada por calor em um volume de 10 μΐ, foram misturadas dentro de uma bandeja microtituladora e a reação foi deixada a 50° C por 5 minutos usando um thermal cycler. A reação foi realizada em triplicata (N = 3) para cada temperatura de tratamento de calor e cada enzima. A solução foi tirada em um volume de 50 \xL após a reação e misturada com 100 \\L da solução DNS, uma reação de cor foi deixada a 95° C por 5 minutos e absorbância (540 nm) da mistura de reação foi medida. Para as amostras para todas as temperaturas, um vácuo em que o tampão usada para diluição foi adicionado em vez da solução da enzima foi preparado e os valores obtidos pela subtração da quantidade do fundamento derivado da solução de substrato foram quantidades consideradas de sacarídeos produzidos. As quantidades relativas de sacarídeos produzidos em cada temperatura com base na média dos resultados para a amostra em que a solução de enzima não tratada por calor foi adicionado, que foi tirado como 1, são mostrados como atividades específicas. Para a enzima comercialmente disponível Xynl4, o teste foi realizado pelas temperaturas de 35, 50, 70 e 80° C.

Um gráfico que mostra a estabilidade de calor em um período curto de tempo é mostrado como Fig. 5. A enzima nova Xynl 1-2 e a enzima comercialmente disponível Xyn 14 mostrou os perfis de atividade substancialmente similar. De outra maneira, Xynl 1-5 mostrou atividade relativamente alta, ainda após foi tratado na temperatura alta e ainda se este foi tratada a 75° C por 10 minutos, mostrou 78 % da atividade.

(4) Estabilidade por calor em longo período de tempo Visto que a reação de sacarificação do bagaço é uma reação de longo período realizada a 50° C em quatro dias, estabilidade de calor foi examinada pelo tratamento de calor do período mais longo. O teste foi realizado na mesma maneira como aquele do método descrito na seção precedente, exceto que o período de tratamento de calor da solução de enzima foi extendido de 10 minutos a 16 horas. As quantidades relativas de sacarídeos produzidos em cada temperatura com base na média dos resultados para a amostra no qual a solução de enzima não tratada por calor foi adicionada, que foi tirada como 1, são mostrados como atividades específicas.

Um gráfico que mostra a estabilidade de calor em um longo período de tempo é mostrado como Fig. 6. As enzimas novas mantidas a 86 a 97 % da atividade, ainda após o tratamento a 50° C por 16 horas, considerando a atividade da enzima comercialmente disponível foi reduzido a 69 %. Em particular, Xynl 1-5 mantém a atividade comparativamente alta ainda após o tratamento em temperatura alta, isto é, ainda após o tratamento a 70° C por 16 horas, este mantém 61 % da atividade. O fato aquela xilanase nova mantendo a atividade em um grau mais alto como comparado a enzima comercialmente disponível Xynl4 após o tratamento a 50° C por 16 horas suporta os resultados relativos a capacidade de sacarificação do bagaço melhorando o efeito demonstrado no Exemplo 2. Visto que o processo de sacarificação do bagaço é uma reação de longo tempo, é uma propriedade industrialmente preferida que a estabilidade do calor das enzimas novas é altamente mantida em um longo período de tempo.

Claims (22)

1. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína mostrada no seguinte (A) ou (B) e um peptídeo selecionado de um peptídeo marcador, um peptídeo tag, um peptídeo de sinal de secreção e uma parte de qualquer um destes ligados juntos: (A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 e tem uma atividade de xilanase, (B) uma proteína que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24, em que a seqüência de aminoácido inclui substituições, anulações, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido e tem uma atividade de xilanase.

2. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 é uma seqüência de aminoácido da SEQID N°: 24.

3. DNA, caracterizado pelo fato de codificar para uma proteína de fusão como definida na reivindicação 1 ou 2.

4. DNA de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 é uma seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 24.

5. DNA de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende um DNA mostrado no seguinte (a) ou (b): (a) um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 19 ou 21 ou uma seqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos os resíduos de nucleotídeo de posições 166 a 1368 da SEQ ID N°: 23, (b) um DNA que é capaz de hibridizar-se com uma sonda tendo uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 19 ou 21 ou uma seqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos os resíduos de nucleotídeo de posições 166 a 1368 da SEQ ID N°: 23 ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência de nucleotídeo complementar sob condições estringentes e codifica quanto a uma proteína tendo uma atividade de xilanase,

6. DNA de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos os resíduos de nucleotídeo de posições 166 a 1368 da SEQ ID N°: 23 é a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 23.

7. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que contém um DNA que codifica quanto a uma proteína mostrada no seguinte (A) ou (B): (A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 e tem uma atividade de xilanase, (B) uma proteína que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24, em que a seqüência de aminoácido inclui substituições, anulações, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido e tem uma atividade de xilanase. DNA.

8. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°:24 é uma seqüência de aminoácido da SEQID N°: 24.

9. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o DNA que codifica quanto à proteína é um DNA mostrado no seguinte (a) ou (b): (a) um DNA tendo a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 19 ou 21 ou uma seqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos os resíduos de nucleotídeo de posições 166 a 1368 da SEQ ID N°: 23, (b) um DNA que é capaz de hibridizar-se com uma sonda tendo uma seqüência de nucleotídeo complementar à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°: 19 ou 21 ou uma seqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos os resíduos de nucleotídeo de posições 166 a 1368 da SEQ ID N°: 23 foi uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüência de nucleotídeo complementar sob condições estringentes e codifica quanto a uma proteína tendo uma atividade de xilanase.

10. Vetor recombinante de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeo que compreende pelo menos os resíduos de nucleotídeo de posições 166 a 1368 da SEQ ID N°:23 é a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°:23.

11. Célula transformante, caracterizada pelo fato de que contém o vetor recombinante como definido na reivindicação 9.

12. Método para produzir xilanase, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula transformante como definida na reivindicação 11 em um meio e coletar uma proteína tendo uma atividade de xilanase da cultura obtida.

13. Método para produzir a xilanase de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o vetor recombinante pode expressar uma proteína de fusão como definida na reivindicação 1 ou 2 contendo um peptídeo de sinal de secreção, a célula transformante tem uma capacidade de secretar a proteína de fusão e uma proteína recombinante tendo uma atividade de xilanase é coletada a partir do sobrendante de cultura.

14. Método para produzir uma solução de açúcar, caracterizado pelo fato de que compreende permitir uma reação de uma proteína mostrada no seguinte (A) ou (B) ou a proteína de fusão como definida na reivindicação 1 ou 2, a celulase e um recurso de biomassa contendo xilano para a produção de um sacarídeo: (A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 e tem uma atividade de xilanase, (B) uma proteína que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24, em que a seqüência de aminoácido inclui substituições, anulações, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido e tem uma atividade de xilanase.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 é uma seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 24.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a reação é realizada a 50 a 75° C.

17. Método para produzir uma substância alvo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microorganismo que produz a substância alvo em um meio contendo uma solução de açúcar produzido pelo método como definido nas reivindicações de 14 a 16 ou um produto de fracionamento do mesmo como uma fonte de carbono e coletar a substância alvo da cultura.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é uma bactéria escolhida de microorganismos que pertencem a Corynebacterium glutamíeum ou Escherichia eoli.

19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que a substância alvo é um L-aminoácido.

20. Método para decompor um recurso de biomassa contendo xilano, caracterizado pelo fato de que compreende permitir uma reação da proteína mostrada no seguinte (A) ou (B) ou a proteína de fusão como definida na reivindicação 1 ou 2 e o recurso de biomassa: (A) uma proteína que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou uma seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 e tem uma atividade de xilanase, (B) uma proteína que tem a seqüência de aminoácido de SEQ ID N°: 20, 22 ou 25 ou seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24, em que a seqüência de aminoácido inclui substituições, anulações, inserções ou adições de um ou diversos resíduos de aminoácido e tem uma atividade de xilanase.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácido que compreende pelo menos os resíduos de aminoácido das posições 56 a 455 da SEQ ID N°: 24 é uma seqüência de aminoácido da SEQ ID N°: 24.

22. Método de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a reação é realizada de 50 a 75° C.