JP2003102490A - Ｌ−アルギニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等の微
生物のＬ−アルギニン生産能を向上させ、Ｌ−アルギニ
ンを効率よく製造する方法を提供する。 【解決手段】 Ｌ−アルギニン生産能を有し、かつ、ｌ
ｙｓＥ遺伝子の発現が増強されるように改変された微生
物、さらにアルギニンリプレッサーが正常に機能しない
ように改変された微生物、又はさらに細胞内のＬ−アル
ギニン生合成系酵素の活性が増強されるように改変され
た微生物を、培地で培養し、培地中にＬ−アルギニンを
生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することによ
り、Ｌ−アルギニンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−アルギニン生
産能を有する微生物及び同微生物を用いたＬ−アルギニ
ンの製造法に関する。Ｌ−アルギニンは、肝機能促進
薬、アミノ酸輸液及び総合アミノ酸製剤等の成分とし
て、産業上有用なアミノ酸である。

【０００２】

【従来の技術】従来、発酵法によるＬ−アルギニンの製
造は、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾー
ルアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の
薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラ
ニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまた
はＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特
開昭５４−４４０９６号）；ケトマロン酸、フルオロマ
ロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細
菌（特開昭５７−１８９８９号）；アルギニノールに耐
性を有するコリネ型細菌（特開昭６２−２４０７５
号）；または、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖
の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平２−１
８６９９５号）等を用いて行われている。

【０００３】一方、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アルギ
ニンの生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アルギ
ニンの生産能を増加させる種々の技術が開示されてい
る。例えば、エシェリヒア属に属する微生物由来のアセ
チルオルニチンデアセチラーゼ、Ｎ−アセチルグルタミ
ン酸−γ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｎ−アセ
チルグルタモキナーゼ、及びアルギニノサクシナーゼの
遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体
ＤＮＡを保有せしめたコリネバクテリウム属又はブレビ
バクテリウム属に属する微生物（特公平５−２３７５０
号）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性が増強された
コリネ型細菌等の微生物（EP 1057 893 A1）、及び、Ｎ
−アセチルグルタミン酸シンセターゼ遺伝子(argA)を導
入されたエシェリヒア・コリ（特開昭57-5693号参照）
を用いてＬ−アルギニンを製造する方法等が開示されて
いる。

【０００４】また、コリネ型細菌では、いくつかのＬ−
アルギニン生合成系酵素の生成が、Ｌ−アルギニンによ
り抑制されていることが調べられている。さらに、Ｌ−
アルギニン生合成系酵素のいくつかは、Ｌ−アルギニン
による抑制を受けるが、Ｌ−アルギニン蓄積量が向上し
たコリネ型細菌の変異株では、これらの酵素のＬ−アル
ギニンによる抑制が解除されていることが報告されてい
る（Agric. Biol. Chem., 43(1), 105, 1979）。

【０００５】一方、エシェリヒア・コリでは、Ｌ−アル
ギニン生合成系のリプレッサー及びリプレッサーをコー
ドする遺伝子が特定されており（Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. (1987), 84(19), 6697-701）、またリプレッ
サータンパクと各種Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子との
結合相互作用についても調べられている（Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. (1987), 84(19), 6697-701、J. Mo
l. Biol. (1992), 226,367-386）。

【０００６】しかしながら、コリネ型細菌では、Ｌ−ア
ルギニン生合成系のリプレッサータンパクは同定されて
いない。リプレッサータンパク遺伝子（argR）について
は、遺伝子データベースGenBankに、その塩基配列とそ
れによってコードされると想定されるアミノ酸配列が登
録されているが（AF049897）、これは前記アミノ酸配列
と公知のアルギニンリプレッサーとの相同性からargRと
命名されたものと考えられる。

【０００７】ところで、近年、Ｌ−アミノ酸を特異的に
微生物の菌体の外部に排出する機能を持つタンパク質お
よび遺伝子が同定され、特にVrlijcらは、コリネバクテ
リウム属細菌からＬ−リジンの菌体外への排出に関与す
る遺伝子を同定した（VrlijcM., Sahm H., Eggeling L.
Molecular Microbiology 22:815-826(1996)）。この遺
伝子はlysEと名付けられ、同遺伝子をコリネバクテリウ
ム属細菌において増強させることによって、コリネバク
テリウム属細菌のＬ−リジン生産能が向上することが報
告されている（WO 97/23597）。また、エシェリヒア・
コリにおいてアミノ酸排出タンパク質の発現量を上昇さ
せることにより、いくつかのＬ−アミノ酸の生産性を向
上させることができることが知られている（特開平2000
-189180号）。例えば、yggA遺伝子を多コピーでエシェ
リヒア・コリに導入することにより、リジン及びアルギ
ニンの生産性が向上することが報告されている（特開20
00-189180号）。また、エシェリヒア・コリにおいて
は、ORF306遺伝子の発現を増強することによって、シス
チン、システイン等の生産性が向上することが報告され
ている(EP885962)。しかし、lysE遺伝子がＬ−リジン以
外のアミノ酸を排出する機能を有することは知られてい
ない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、コリネ型細
菌及びエシェリヒア属細菌等の微生物のＬ−アルギニン
生産能を向上させ、Ｌ−アルギニンを効率よく製造する
方法を提供することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｌ−アル
ギニン生産菌に関する研究の過程で、lysE遺伝子の発現
を増強することによって、Ｌ−アルギニン生産能を向上
させることができることを見い出した。さらに、lysEの
増強と、argR遺伝子の破壊又はＬ−アルギニン生合成系
酵素の活性の増強とを組み合わせることにより、Ｌ−ア
ルギニン生産能を顕著に向上させることができることを
見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は
以下のとおりである。

【００１０】（１）Ｌ−アルギニン生産能を有し、か
つ、ｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強されるように改変され
た微生物。 （２）ｌｙｓＥ遺伝子の発現の増強が、ｌｙｓＥ遺伝子
のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内のｌｙｓ
Ｅ遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節
配列を改変することによるものである(1)の記載の微生
物。 （３）さらに、アルギニンリプレッサーが正常に機能し
ないように改変されたことを特徴とする(1)又は(2)の微
生物。 （４）染色体上のアルギニンリプレッサーをコードする
遺伝子が破壊されたことにより、アルギニンリプレッサ
ーが正常に機能しないことを特徴とする(3)の微生物。 （５）さらに、細胞内のＬ−アルギニン生合成系酵素の
活性が増強されるように改変された(1)〜(4)のいずれか
の微生物。 （６）コリネ型細菌である請求項(1)〜(5)のいずれかの
微生物。 （７）エシェリヒア属細菌である請求項(1)〜(5)のいず
れかの微生物。 （８）(1)〜(7)のいずれかのコリネ型細菌を培地で培養
し、培地中にＬ−アルギニンを生成蓄積せしめ、これを
該培地から採取することを特徴とするＬ−アルギニンの
製造法。

【００１１】本発明において、「Ｌ−アルギニン生産
能」とは、本発明の微生物を培養したときに、培地中に
Ｌ−アルギニンを蓄積する能力をいう。このＬ−アルギ
ニン生産能は、微生物の野生株の性質として有するもの
であってもよく、育種によって付与または増強された性
質であってもよい。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 ＜１＞本発明の微生物 本発明の微生物は、Ｌ−アルギニン生産能を有し、か
つ、ｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強された微生物である。
本発明の微生物は、Ｌ−アルギニン生産能を有する微生
物のｌｙｓＥ遺伝子の発現を増強したものであってもよ
いし、微生物のｌｙｓＥ遺伝子の発現を増強した後に、
Ｌ−アルギニン生産能を付与したものであってもよい。

【００１３】本発明の微生物としては、ｌｙｓＥ遺伝子
又はｌｙｓＥ遺伝子ホモログを持つ微生物、具体的には
コリネ型細菌、バチルス属細菌、セラチア属細菌、エシ
ェリヒア属細菌、サッカロマイセス属又はキャンディダ
属に属する酵母が挙げられる。これらの中ではコリネ型
細菌及びエシェリヒア属細菌が好ましい。

【００１４】バチルス属細菌としてはバチルス・サブチ
リスが、セラチア属細菌としてはセラチア・マルセッセ
ンスが、エシェリヒア属細菌としてはエシェリヒア・コ
リが、サッカロマイセス属酵母としてはサッカロマイセ
ス・セレビシエが、キャンディダ属酵母としてキャンデ
ィダ・トロピカリスが挙げられる。

【００１５】アルギニン生産能を有する微生物として
は、5-アザウラシル、6-アザウラシル、2-チオウラシ
ル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-アザシ
トシン、6-アザシトシン等に耐性なバチルス・サブチリ
ス、アルギニンヒドロキサメート、2-チオウラシルに耐
性なバチルス・サブチリス、アルギニンヒドロキサメー
ト及び6-アザウラシルに耐性なバチルス・サブチリス
（特開昭49-1268191号参照）、ヒスチジンアナログ又は
トリプトファンアナログに耐性なバチルス・サブチリス
（特開昭52-114092号参照）、メチニオン、ヒスチジ
ン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、
アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前
駆体）の少なくとも一つに要求性を有するバチルス・サ
ブチリス変異株（特開昭52-99289号参照）、アルギニン
ヒドロキサメートに耐性なバチルス・サブチリス（特公
昭51-6754号参照）、コハク酸要求性又は核酸塩基アナ
ログに耐性なセラチア・マルセッセンス（特開昭58-969
2号）、アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアン
タゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求
するセラチア・マルセッセンス（特開昭52-8729号参
照）、argA遺伝子を導入されたエシェリヒア・コリ（特
開昭57-5693号参照）、アルギニン、アルギニンヒドロ
キサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、カナバ
ニン耐性、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウ
ラシル耐性のサッカロマイセス・セレビシエ（特開昭53
-143288号参照）、及びカナバニン耐性のキャンディダ
・トロピカリス（特開昭53-3586号参照）、が挙げられ
る。

【００１６】コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合
された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 25
5 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁な
ブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型
細菌の例として以下のものが挙げられる。

【００１７】 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム

【００１８】Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細
菌としては、Ｌ−アルギニン生産能を有するものであれ
ば特に制限されないが、例えば、コリネ型細菌野生株；
サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−
β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型
細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒス
チジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイ
シン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性
を有するコリネ型細菌（特開昭５４−４４０９６号）；
ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸
に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭５７−１８９８９
号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特
開昭６２−２４０７５号）；Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪
酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌
（特開平２−１８６９９５号）等が挙げられる。

【００１９】具体的には、下記のような菌株を例示する
ことができる。 ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM P-4161） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（F
ERM P-7273） ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM P-4939） ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM P-4948） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（F
ERM BP-2228）

【００２０】AJ11169は、1977年８月３日付けで独立行
政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒
305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中
央第６）にFERM P-4161の受託番号で寄託され、1999年
９月２７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管さ
れ、FERM BP-6892として寄託されている。

【００２１】AJ12092は、1983年９月２９日付けで独立
行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに
FERM P-7273の受託番号で寄託され、1999年１０月１日
にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM B
P-6906として寄託されている。

【００２２】AJ11336は、1979年４月２５日付けで独立
行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに
FERM P-4939の受託番号で寄託され、1999年９月２７日
にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM B
P-6893として寄託されている。

【００２３】AJ11345は、1979年４月２５日付けで独立
行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに
FERM P-4948の受託番号で寄託され、1999年９月２７日
にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM B
P-6894として寄託されている。

【００２４】AJ12430は、1988年１２月２６日付けで独
立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
にFERM BP-2228の受託番号で、ブダペスト条約に基いて
国際寄託されている。

【００２５】また、エシェリヒア属細菌としては、ナイ
トハルトらの著書（Neidhardt,F.C.et.al.,Escherichia
coli and Salmonella Typhimurium,American Society
forMicrobiology,Washington D.C.,1208, table 1）に
挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用で
きる。Ｌ−アルギニン生産能を有するエシェリヒア属細
菌としては、エシェリヒア・コリ237株（ロシア特許出
願第２０００１１７６７７号）等が挙げられる。本発明
の微生物の第１の形態は、上記のようなＬ−アルギニン
生産能を有する微生物において、ｌｙｓＥ遺伝子の発現
が増強されるように改変された細菌である。本発明の微
生物の第２の形態は、さらにアルギニンリプレッサーが
正常に機能しないように改変された微生物である。本発
明の微生物の第３の形態は、前記第１又は第２の形態の
微生物において、さらに細胞内のＬ−アルギニン生合成
系酵素の活性が増強されるように改変された微生物であ
る。以下、各形態について説明する。

【００２６】（１）ｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強された
微生物 微生物のｌｙｓＥ遺伝子の発現の増強は、Ｌ−リジン排
出系に関与するタンパク質の活性が上昇するように前記
タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入するか、又
は同遺伝子を用いた遺伝子組換え技術を利用することに
よって、行うことができる。前記遺伝子として具体的に
は、lysE遺伝子（Vrlijc M., Sahm H.,Eggeling L. Mol
ecular Microbiology 22:815-826(1996)、WO 97/2359
7）が挙げられる。

【００２７】以下に、lysE遺伝子を例に説明する。lysE
遺伝子によってコードされるタンパク質（LysEタンパク
質）の活性が上昇するような変異としては、lysE遺伝子
の転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及
び、LysEタンパク質の比活性が高くなるようなlysE遺伝
子のコード領域内の変異が挙げられる。

【００２８】また、遺伝子組換え技術を利用してLysE活
性を高めるには、例えば、細胞中のlysE遺伝子のコピー
数を高めることによって達成される。例えば、lysE遺伝
子を含むＤＮＡ断片を、微生物で機能するベクター、好
ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDN
Aを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよ
い。

【００２９】lysE遺伝子は、コリネ型細菌もしくはエシ
ェリヒア属細菌由来の遺伝子、又は他の生物由来の遺伝
子のいずれも使用することができる。このうち、発現の
容易さの観点からは、コリネ型細菌又はエシェリヒア属
細菌由来の遺伝子が好ましい。

【００３０】コリネ型細菌のlysE遺伝子は既に配列が明
らかにされている（GenBank accession X96471）ので、
その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば配
列表配列番号２３および２４に示すプライマーを用い
て、コリネ型細菌の染色体DNAを鋳型とするPCR法（PC
R：polymerase chain reaction； White,T.J. et al.,
Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、lysE遺
伝子を取得することができる。コリネバクテリウム・グ
ルタミカムlysGおよびlysE遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩
基配列（GenBank accession X96471）を配列番号２５
に、LysEのアミノ酸配列を配列番号２６に示す。尚、Ly
sGは、配列番号２５の塩基番号1723〜2352に相当する位
置の相補鎖にコードされている。

【００３１】他の微生物のlysE遺伝子も、その微生物に
おいて公知のlysE遺伝子もしくは他種の微生物のlysE遺
伝子又はLysEタンパク質の配列情報に基づいて作製した
オリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又
は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチ
ドをプローブとするハイブリダイゼーション法によっ
て、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリ
ーから、取得することができる。

【００３２】また、本発明に用いられるlysE遺伝子は、
野生型遺伝子には限られず、コードされるLysEタンパク
質の機能が損なわれない限り、１若しくは複数の位置で
の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付
加等を含む変異体又は人為的な改変体であってもよい。
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立
体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的
には２から３０個、好ましくは、２から２０個、より好
ましくは２から１０個である。また、上記のようなLysE
タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤ
ＮＡとしては、配列番号２５の塩基番号１０２５〜１７
２３からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得る
プローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつLysEと同様の活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェント
な条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成さ
れ、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をい
う。この条件を明確に数値化することは困難であるが、
一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％
以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、
それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしな
い条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーション
の洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤ
Ｓ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相
当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。

【００３３】染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miu
ra, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。

【００３４】PCR法により増幅されたlysE遺伝子は、エ
シェリヒア・コリ及び／またはコリネ型細菌等の細胞内
において自律複製可能なベクターDNAに接続して組換えD
NAを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておく
と、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞
内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、p
UC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322,
pACYC184, pMW219等が挙げられる。

【００３５】コリネ型細菌で機能するベクターとは、例
えばコリネ型細菌で自律複製できるプラスミドである。
具体的に例示すれば、以下のものが挙げられる。 pAM330 特開昭58-67699号公報参照 pHM1519 特開昭58-77895号公報参照 pSFK6 特開2000-262288号公報参照 また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミ
ドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出
し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入する
と、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律
複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用するこ
とができる。

【００３６】このようなシャトルベクターとしては、以
下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持
する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示
した。 これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得
られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及び
ＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して
溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加
し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密
度勾配遠心分離により分別精製する。

【００３７】lysE遺伝子とコリネ型細菌で機能するベク
ターを連結して組換えDNAを調製するには、lysE遺伝子
の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連
結はT4DNAリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通
である。

【００３８】上記のように調製した組換えDNAを微生物
に導入するには、これまでに報告されている形質転換法
に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ
−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩
化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Ma
ndel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）
があり、バチルス・ズブチリスについて報告されている
ような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製し
てＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.an
d Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるい
は、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について
知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤ
ＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプ
ラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入
する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec. Gen. Gene
t., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwoo
d,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.
B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 192
9 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質転
換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）
によっても行うことができる。

【００３９】lysE遺伝子のコピー数を高めることは、ly
sE遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させる
ことによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にlys
E遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コ
ピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行
う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レ
ペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバー
テッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-10
9985号公報に開示されているように、lysE遺伝子をトラ
ンスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に
多コピー導入することも可能である。

【００４０】lysE遺伝子の発現の増強は、上記の遺伝子
増幅による以外に、染色体DNA上またはプラスミド上のl
ysE遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なも
のに置換することによっても達成される（WO00/1893
5）。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trc
プロモーター等が強力なプロモーターとして知られてい
る。また、lysE遺伝子のプロモーター領域に塩基置換等
を導入し、より強力なものに改変することも可能であ
る。これらのプロモーター置換または改変によりlysE遺
伝子の発現が強化される。これら発現調節配列の改変
は、lysE遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせて
もよい。

【００４１】発現調節配列の置換は、例えば後述の温度
感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行う
ことができる。例えば、コリネ型酸菌の温度感受性プラ
スミドとしては、p48K及びpSFKT2（以上、特開2000-262
288号公報参照）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667
875号公報、特開平5-7491号公報参照）等が挙げられ
る。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくと
も25℃では自律複製することができるが、37℃では自律
複製できない。後記実施例では、GDH遺伝子のプロモー
ター配列を置換する際にpSFKT2を用いたが、pSFKT2の代
わりにpHSC4を用いて、同様にして遺伝子置換を行うこ
とができる。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ125
71は、1990年10月11日に独立行政法人 産業技術総合研
究所 特許生物寄託センター（〒305-5466 日本国茨城県
つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM
P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト
条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託
番号で寄託されている。

【００４２】（２）アルギニンリプレッサーが正常に機
能しない微生物 本発明において「アルギニンリプレッサー」とは、Ｌ−
アルギニン生合成を抑制する作用を有するタンパク質で
あり、微生物において同タンパク質をコードする遺伝子
の発現量が増加するとＬ−アルギニン生産能が低下し、
発現量が低下又は消失するとＬ−アルギニン生産能が向
上する。以下、アルギニンリプレッサーをコードする遺
伝子をargR遺伝子ともいう。「アルギニンリプレッサー
が正常に機能しない」とは、野生株又は非改変株に比べ
て、アルギニンリプレッサーの活性が低下又は消失して
いることをいう。

【００４３】リプレッサーが正常に機能しない微生物
は、argR遺伝子が、該遺伝子産物であるアルギニンリプ
レッサーの活性が低下又は消失するか、又はargR遺伝子
の転写が低下または消失するように、改変することによ
って得られる。このような微生物は、例えば、遺伝子組
換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecul
ar Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press
(1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacter
iol., 162, 1196(1985)）により、染色体上のargR遺伝
子を、正常に機能しないargR遺伝子（以下、「破壊型ar
gR遺伝子」ということがある）で置換することによって
行うことができる。

【００４４】染色体上の配列と相同性を有する配列を持
つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相
同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入された
プラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後さら
に染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こ
すと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、こ
の時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が
染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと
一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような
菌株を選択することにより、染色体上の正常なargR遺伝
子が破壊型argR遺伝子と置換された菌株を取得すること
ができる。

【００４５】このような相同組換えによる遺伝子破壊技
術は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法、温度
感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、
薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたargR遺
伝子を含み、かつ、目的とする微生物細胞内で複製でき
ないプラスミドを用いることによっても、argR遺伝子の
破壊を行うことができる。すなわち、前記プラスミドで
形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体は、染色
体ＤＮＡ中にマーカー遺伝子が組み込まれている。この
マーカー遺伝子は、その両端のargR遺伝子配列と染色体
上のargR遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可
能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択すること
ができる。

【００４６】遺伝子破壊に用いる破壊型argR遺伝子は、
具体的には、制限酵素消化及び再結合によるargR遺伝子
の一定領域の欠失、argR遺伝子への他のＤＮＡ断片（マ
ーカー遺伝子等）の挿入、または部位特異的変異法（Kr
amer, W. and Frits, H. J.,Methods in Enzymology, 1
54, 350 (1987)）や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシル
アミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nath
ans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(19
78)）によって、argR遺伝子のコーディング領域または
プロモーター領域等の塩基配列の中に１つまたは複数個
の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせ
ることにより、コードされるリプレッサーの活性を低下
又は消失させるか、又はargR遺伝子の転写を低下または
消失させることにより、取得することができる。これら
の態様の中では、制限酵素消化及び再結合によりargR遺
伝子の一定領域を欠失させる方法、又はargR遺伝子へ他
のＤＮＡ断片を挿入する方法が、確実性及び安定性の点
から好ましい。

【００４７】また、argR遺伝子とその周辺領域を含むプ
ラスミドを鋳型とし、argR遺伝子の末端部又は周辺領域
に相当するプライマーを用いてPCR（ポリメラーゼ・チ
ェイン・リアクション）を行い、argR遺伝子の内部又は
全体を除く部分を増幅し、得られる増幅産物を環状化す
ることによって、argR遺伝子破壊用プラスミドを作製す
ることができる。後記実施例では、この方法によってar
gR遺伝子を破壊した。

【００４８】argR遺伝子は、微生物の染色体ＤＮＡか
ら、既知のargR遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオ
リゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によって
取得することができる。また、微生物の染色体ＤＮＡラ
イブラリーから、既知のargR遺伝子の塩基配列に基づい
て作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブ
リダイゼーション法によって、argR遺伝子を取得するこ
とができる。尚、本発明においては、argR遺伝子は破壊
型argR遺伝子の作製に用いるため、必ずしも全長を含む
必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有し
ていればよい。

【００４９】argR遺伝子は、目的の微生物のargR遺伝子
と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば、由
来を特に制限されない。例えば、コリネ型細菌のargR遺
伝子として具体的には、配列番号１７に示す塩基配列を
有するブレビバクテリウム・フラバムのargR遺伝子、及
び、コリネバクテリウム・グルタミカムのargR遺伝子
（GenBank accession AF049897）が挙げられる。これら
のargR遺伝子は相同性が高く、argR遺伝子を破壊するコ
リネ型細菌と種又は属が異なるコリネ型細菌又は他の微
生物のargR遺伝子であっても、遺伝子破壊に用いること
ができると考えられる。

【００５０】本発明において、配列番号１８に示すアミ
ノ酸配列又は同アミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸
配列とは、配列番号１８に示すアミノ酸配列をコードす
るargR遺伝子（例えば配列番号１７に示す塩基配列を有
するargR遺伝子）と相同組換えを起こす程度の相同性を
有するargG遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を
意味する。前記相同性は、例えば、好ましくは７０％以
上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０
％以上である。上記のようなargG遺伝子としては、例え
ば、配列番号１７の塩基番号１８５２〜２３６４からな
る塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮ
Ａが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」
とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特
異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条
件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せ
ば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同
性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あ
るいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条
件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好まし
くは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃
度でハイブリダイズする条件が挙げられる。

【００５１】PCRに用いるプライマーとしては、argR遺
伝子を増幅することができるものであればよく、具体的
には配列番号１９及び配列番号２０に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

【００５２】また、マーカー遺伝子としては、カナマイ
シン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。カナ
マイシン耐性遺伝子は、ストレプトコッカス・フェカリ
スのカナマイシン耐性遺伝子を含む公知のプラスミド、
例えばpDG783（Anne-Marie Guerout- Fleury et al., G
ene, 167, 335-337(1995)）からPCRにより増幅すること
により取得することができる。

【００５３】マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用
いる場合は、該遺伝子をプラスミド中のargR遺伝子の適
当な部位に挿入し、得られるプラスミドで微生物を形質
転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択すれば、ar
gR遺伝子破壊株が得られる。染色体上のargR遺伝子が破
壊されたことは、サザンブロッティングやPCR法によ
り、染色体上のargR遺伝子又はマーカー遺伝子を解析す
ることによって、確認することができる。前記カナマイ
シン耐性遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれたことの確
認は、カナマイシン耐性遺伝子を増幅することができる
プライマー（例えば配列番号１及び２に示す塩基配列を
有するオリゴヌクレオチド）を用いたPCRにより、行う
ことができる。

【００５４】（３）Ｌ−アルギニン生合成系酵素活性の
増強 Ｌ−アルギニン生合成系酵素活性の増強は、細胞内のＬ
−アルギニン生合成系酵素の活性が上昇するように同酵
素をコードする遺伝子に変異を導入するか、又は同遺伝
子を用いた遺伝子組換え技術を利用することによって、
行うことができる。Ｌ−アルギニン生合成系酵素として
は、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（arg
C）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（arg
J）、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（argB）、ア
セチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、オルニ
チンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギ
ニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸
リアーゼ（argH）から選ばれる１種又は２種以上が挙げ
られる。これらの酵素名の後のカッコ内は、各酵素をコ
ードする遺伝子名である。また、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ活性を増強することによっても、Ｌ−アルギニ
ン生産能を上昇させることができる（EP 1057 893 A
1）。

【００５５】遺伝子組換え技術を利用したＬ−アルギニ
ン生合成系酵素活性の増強は、前記LysE活性を高めるの
と同様にして、各遺伝子のコピー数を高めること、又は
各遺伝子の発現が増強されるようにそれらの遺伝子の発
現調節配列を改変することにより、行うことができる。

【００５６】コリネバクテリウム・グルタミカムの各遺
伝子の塩基配列は、GenBankにaccession AF049897とし
て登録されている。これらの遺伝子は、コリネバクテリ
ウム・グルタミカムでは、argC、argJ、argB、argD、ar
gF、argR、argG、argHの順に、染色体ＤＮＡ上に並んで
おり、例えば配列番号２７および配列番号２８に示すプ
ライマーを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカム
又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色
体ＤＮＡを鋳型とするPCRにより取得することができ
る。尚、本発明においては、正常なargRを他のＬ−アル
ギニン生合成系酵素遺伝子とともにコリネ型細菌に導入
すると、Ｌ−アルギニン生産性の向上を妨げるので、得
られたPCR増幅断片中のargRを破壊又は欠失させておく
ことが好ましい。これは、例えば、PCR増幅断片を含む
プラスミドを鋳型とし、配列番号２９および配列番号３
０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライ
マーとしてPCRを行うことによって、行うことができ
る。

【００５７】本発明においては、Ｌ−アルギニン生合成
系酵素活性の増強は、染色体上のargR遺伝子の破壊と組
み合わせてもよい。

【００５８】＜２＞Ｌ−アルギニンの製造法 上記のようにして得られるｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強
され、かつ、Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物を培
地で培養し、該培養物中にＬ−アルギニンを生成蓄積せ
しめ、該培養物からＬ−アルギニンを採取することによ
り、Ｌ−アルギニンを効率よく製造することができる。

【００５９】使用する培地は、微生物を用いたアミノ酸
の発酵生産に従来より用いられてきた周知の培地を用い
てかまわない。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及
び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地で
ある。

【００６０】炭素源としては、グルコース、シュクロー
ス、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷ
んの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトー
ルなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク
酸等の有機酸類を用いることができる。

【００６１】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。

【００６２】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ₁、
Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適
量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応
じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、
マンガンイオン等が少量添加される。

【００６３】培養は好気的条件下で１〜７日間実施する
のがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは
５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸
性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使
用することができる。発酵液からのＬ−アルギニンの採
取は通常イオン交換樹脂法その他の公知の方法を組み合
わせることにより実施できる。

【００６４】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【実施例１】エシェリヒア・コリとコリネ型細菌のシャ
トルベクター及び温度感受性ベクターの構築 はじめに、コリネ型細菌にargR遺伝子を導入するための
ベクター、及びコリネ型細菌のargR欠失株を作製するた
めの温度感受性ベクターを構築した。

【００６５】＜１＞ストレプトコッカス・フェカリスの
薬剤耐性遺伝子を持つベクターの構築 ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺
伝子を、同遺伝子を含む公知のプラスミドからPCRによ
り増幅した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマ
イシン耐性遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている
（Trieu-Cuot,P. and Courvalin,P.:Gene 23（3）, 331
-341（1983））。この配列を基に配列番号１および２に
示すプライマーを合成し、pDG783（Anne-Marie Guerout
- Fleuryet al., Gene, 167, 335-337(1995)）を鋳型と
してPCRを行ない、カナマイシン耐性遺伝子とそのプロ
モーターを含むDNA断片を増幅した。

【００６６】上記DNA断片を宝酒造社製のSUPREC02にて
精製した後、制限酵素HindIIIとHincIIで完全分解し平
滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製のBlunting Kit
により行なった。このDNA断片と、配列番号３および４
に示すプライマーを用いてpHSG399(S.Takeshita et al
: Gene 61,63-74(1987)参照)を鋳型としてPCRを行って
得られた増幅産物を精製し平滑末端化したDNA断片と
を、混合し連結した。連結反応は宝酒造社製 DNA ligat
ion kit ver2にて行なった。連結したDNAを用いて、エ
シェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社
製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラ
クトピラノシド）10μg/ml、X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ
-3-インドリル-β-D−ガラクトシド）40μg/ml及びカナ
マイシン25μg/mlを含むL培地（バクトトリプトン10g/
L、バクトイーストエキストラクト5g/L、NaCl 5g/L、寒
天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した青色
のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株
を得た。

【００６７】形質転換株からアルカリ法（生物工学実験
書、日本生物工学会編、105頁、培風館、1992年）を用
いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図１
に示す制限酵素地図と同等であるものをpK1と名付け
た。このプラスミドはエシェリヒア・コリ中にて安定に
保持され、宿主にカナマイシン耐性を付与する。また、
lazZ'遺伝子を含むため、クローニングベクターに適し
ている。

【００６８】＜２＞シャトルベクターpSFK6の構築 温度感受性複製制御領域の取得の材料として、エシェリ
シア・コリと、コリネ型細菌の双方の菌体中で自律複製
可能なプラスミドベクターを作製した。ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムATCC13869より抽出したプ
ラスミドpAM330(特開昭58-67699号公報参照)を制限酵素
HindIIIで完全分解したのち平滑末端化し、これと、上
記pK1を制限酵素BsaAIで完全分解したものを、連結し
た。連結後のDNAを用いてブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムATCC13869を形質転換した。形質転換の
方法は、電気パルス法（特開平2-207791号参照）を用い
た。形質転換体の選択は、カナマイシン25μg/mlを含む
M-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/L、酵母エキス10g/
L、NaCl 5g/L、ビオチン10μg/L、寒天15g/L、pH7.2)に
て行った。二晩培養後、コロニーを釣り上げ単コロニー
分離し、形質転換体とした。形質転換体からプラスミド
DNAを調製し、制限酵素地図を作成し、図２に示す制限
酵素切断地図と同一の制限酵素地図を持つものをpSFK6
と命名した。このプラスミドは、エシェリシア・コリと
コリネ型細菌中で自律複製でき、宿主にカナマイシン耐
性を付与する。

【００６９】＜３＞温度感受性複製制御領域をもつプラ
スミドの取得 pSFK6をインビトロでヒドロキシルアミン処理した。ヒ
ドロキシルアミン処理は、公知の方法（G. O. Humphery
s et al., Molec. Gen. Genet., 145, 101-108(1976)等
参照）によった。処理後のDNAを回収し、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869株を形質転換
した。形質転換体は、カナマイシン25μg/mlを含むCM2B
プレート上で低温(25℃)にて選択した。出現した形質転
換体を、同様の選択プレートにレプリカし、高温(34℃)
にて培養した。高温でカナマイシンを含む選択プレート
上で生育できない株１株を取得した。この株から、プラ
スミドを回収しp48Kと命名した。

【００７０】＜４＞温度感受性複製制御領域の塩基配列
の決定 野生型の複製制御領域を持つプラスミドpSFK6、および
温度感受性型の複製制御領域を持つプラスミドp48Kにつ
いて、それぞれの複製制御領域部分の塩基配列を決定し
た。塩基配列は、ABI社のDNA Sequencing Kitを用いてA
BI社の全自動シーケンサーABI310にて決定した。その結
果、野生型複製制御領域と、温度感受性変異型複製制御
領域の間には、６個の塩基置換があることが判明した。
pSFK6に含まれるコリネ型細菌中で機能する複製制御領
域部分（pAM330由来の全配列）の塩基配列を配列番号５
に、p48Kに含まれるコリネ型細菌中で機能する温度感受
性複製制御領域部分の塩基配列を配列番号７に示す。ま
た、これらの塩基配列中に存在するＯＲＦによってコー
ドされ得るアミノ酸配列を配列番号６及び８に示す。温
度感受性複製制御領域では、配列上の1255番目のCがT
に、1534番目のCがTに、1866番目のGがAに、2058番目の
GがAに、2187番目のCがTに、 3193番目のGがAに変異し
ている。このうちアミノ酸変異を伴うものは1534番目の
変異点のみであり、プロリンからセリンへの置換を引き
起こす。

【００７１】＜５＞温度感受性変異を有するシャトルベ
クターの構築 p48Kが持つ６個の変異を、一点ずつシャトルベクターpS
FK6に導入した（図３参照）。変異の導入は、公知の方
法（Mikaelian, I., Sergeant, A. Nucleic Acids Re
s., 20, 376 (1992)）によって行った。具体的方法を以
下に示す。3193番目のG→Aの変異を導入するために、配
列番号９および１０に示すプライマーの組み合わせと、
配列番号１１および１２に示すプライマーの組み合わせ
を用いて、pAM330を鋳型としてPCRを行なった。得られ
た増幅産物はそれぞれアガロースゲルで電気泳動後、ゲ
ルから回収することにより精製した。ゲルからのDNA断
片の回収は宝酒造社製のEASYTRAP Ver.2にて行なった。
精製したDNAを1:1のモル比となるように混合し、これを
鋳型として配列番号１３および１４に示すプライマーを
用いてPCR反応を行なった。増幅産物は制限酵素MluIで
完全分解し、アガロースゲルにて電気泳動後、およそ3.
2KbのDNA断片を回収した。pSFK6も同様に制限酵素MluI
で完全分解し、アガロースゲルにて電気泳動後、およそ
3.8KbのDNA断片を回収した。得られたDNA断片を混合し
て連結し、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセ
ル（宝酒造社製）を用いて形質転換を行い、カナマイシ
ン25μg/mlを含むL培地に塗布し、一晩培養後、出現し
たコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株
を得た。形質転換株からアルカリ法を用いてプラスミド
を調製し、塩基配列を決定し、配列番号１７に示す配列
の1534番目のCがTに変異していることを確認した。この
プラスミドをpSFKT2と名付けた（図３）。

【００７２】

【実施例２】argR遺伝子のクローニングとコリネ型細菌
での増幅効果 ブレビバクテリウム・フラバム野生株2247（AJ14067）
の染色体DNAを鋳型とし、配列番号１５（配列番号１７
の塩基番号1717から1741の配列）および配列番号１６
（配列番号１７の塩基番号2386から2362の配列に相補的
な配列）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
（プライマー１，２）をプライマーとしてPCRを行っ
た。PCRは、Pyrobest DNA polymerae（宝酒造）を用
い、９８℃ １０秒、５８℃ １分、７２℃ ３分を１サ
イクルとして３０サイクル行った。得られた増幅断片
を、実施例１で得たシャトルベクターpSFK6のSmaIサイ
トに挿入し、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミド
pWRを得た。

【００７３】コリネ型細菌のＬ−アルギニン生産菌での
argR遺伝子の増幅効果を調べるため、pWRをＬ−アルギ
ニン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345株（F
ERM BP-6894）に導入した。プラスミドの導入は、電気
パルス法（特開平2-207791号）を用いた。形質転換体
は、カナマイシン25μg/mlを含むCM2G寒天培地（グルコ
ース5g、NaCl 5g、寒天15gを純水1Lに含む。pH7.2）に
てカナマイシン耐性株として選択し、AJ11345/pWRを得
た。対照として、AJ11345株にpSFK6を同様にして導入
し、形質転換体AJ11345/pSFK6を得た。

【００７４】上記各菌株を、グルコース0.5g/dl、ポリ
ペプトン 1g/dl、酵母エキス 1g/dl、NaCl 0.5g/dlを含
む寒天培地にぬりつけ、31.5℃で20時間培養した。得ら
れた菌体１エーゼを、グルコース4g/dl、硫酸アンモニ
ウム6.5g/dl、KH₂PO₄ 0.1g/dl、MgSO₄ 0.04g/dl、FeSO₄
0.001g/dl、MnSO₄ 0.001g/dl、ビタミンB₁ 5μg/dl、
ビオチン5μg/dl、大豆加水分解物（N量として45mg/d
l）を含む培地に植菌し、フラスコにて31.5℃で50時間
振とう培養を行った。各々の培養液中のＬ−アルギニン
蓄積量（濃度(g/dl)）を測定した結果を表１に示す。そ
の結果、argR増幅株では、ほとんどＬ−アルギニンを蓄
積しなくなった。このことから、argR遺伝子産物がアル
ギニンリプレッサーとして機能していることが示され
た。

【００７５】

【表１】表１ ───────────────────── 菌株 L-アルキ゛ニン蓄積量（g/dl） ───────────────────── AJ11345/pSFK6 1.3 AJ11345/pWR 0.2 ─────────────────────

【００７６】pWRにクローニングされた挿入断片の塩基
配列を決定した結果を配列番号１７に示す。同塩基配列
によってコードされ得るアミノ酸配列を配列番号１８に
示す。

【００７７】

【実施例３】コリネ型細菌のargR破壊株の構築及びアル
ギニンリプレッサー欠失の効果 ＜１＞argR破壊用プラスミドの作製 ブレビバクテリウム・フラバム野生株2247株（AJ1406
7）の染色体DNAを鋳型とし、配列番号１９（配列番号１
７の塩基番号４から28の配列）および配列番号２０（配
列番号１７の塩基番号4230から4211の配列に相補的な配
列）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プラ
イマー３，４）をプライマーとしてPCRを行った。PCR
は、Pyrobest DNA polymerae（宝酒造）を用い、９８℃
１０秒、５８℃１分、７２℃３分を１サイクルとして３
０サイクル行った。得られた増幅断片を、クローニング
ベクターpHSG399のマルチクローニングサイト内のSmaI
サイトに挿入した。

【００７８】挿入されたDNA断片からアルギニンリプレ
ッサーをコードしていると思われるORF全てを欠失させ
るために、配列番号２１（配列番号１７の塩基番号2372
から2395の配列）および配列番号２２（配列番号１７の
塩基番号1851から1827の配列に相補的な配列）に示す塩
基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー５，
６）をプライマーとし、増幅断片が挿入されたpHSG399
を鋳型をしてPCRを行った。PCR産物をセルフライゲーシ
ョンすることにより、pssERを構築した。

【００７９】次に、pssERを制限酵素SmaIおよびSalIで
消化して得た断片と、実施例１で得た温度感受性プラス
ミドpSFKT2をSmaI、SalIで消化したものを連結すること
により、コリネ型細菌で自律複製能が温度感受性になっ
たargR破壊用プラスミドpssERTを得た。

【００８０】＜２＞相同組換えによるコリネ型細菌のア
ルギニンリプレッサー欠失株の取得 上記のようにして得たプラスミドpssERTを、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムの野生株2256（ATCC13
869）に導入した。プラスミドの導入は電気パルス法
（特開平2-207791号）を用いた。本プラスミドは、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタム中で自律複製能
が温度感受性であるため、本プラスミドが相同組換えに
よって染色体に組み込まれた株のみが、プラスミド複製
の非許容温度である34℃でカナマイシン耐性株として選
択できる。argR破壊用プラスミドが染色体に組み込まれ
た株は、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2G培地プレー
ト（ポリペプトン10g、酵母エキス10g、グルコース5g、
NaCl 5g、寒天15ｇを純水1Lに含む。pH7.2）にて、カナ
マイシン耐性株として選択した。この段階では、染色体
由来の正常なargR遺伝子と、プラスミド由来のORFが欠
失したargG遺伝子とが、プラスミド部分を挟んで染色体
上にタンデムに存在する。

【００８１】次に、組換え株を、再度相同組換えを起こ
させ、プラスミド複製の非許容温度34℃でカナマイシン
感受性になった株を選択することにより、プラスミド部
分とともにargR遺伝子の一方が脱落した株を選択した。
これらの株は、染色体上に正常なargR遺伝子が残された
株と、破壊型argR遺伝子が残された株とが存在する。こ
れらの中から、破壊型argR遺伝子のみを保持する株を選
択した。染色体上のargR遺伝子が破壊型であるかどうか
は、34℃でカナマイシン感受性になった株の染色体を調
製し、これを鋳型とし、配列番号１９および配列番号２
０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(プライ
マー３，４) をプライマーとしてPCRを行い、親株由来
の染色体を鋳型にして同様にPCRを行ったものよりも、P
CR産物が約600bp短くなることで確認することができ
る。

【００８２】上記のようにして選択されたargR破壊株の
PCR産物のダイレクトシークエンスを行い、目的どおりa
rgR遺伝子が破壊されていることを確認し、2256ΔR株を
得た。

【００８３】＜３＞argR破壊株によるＬ−アルギニンの
生産 2256ΔR株を、グルコース0.5g/dl、ポリペプトン 1g/d
l、酵母エキス 1g/dl、NaCl 0.5g/dlを含む寒天培地に
ぬりつけ、31.5℃で20時間培養した。得られた菌体１エ
ーゼを、グルコース3g/dl、硫酸アンモニウム6.5g/dl、
KH２PO₄ 0.1g/dl、MgSO₄ 0.04g/dl、FeSO₄ 0.001g/dl、
MnSO₄ 0.001g/dl、ビタミンB₁ 300μg/dl、ビオチン200
μg/dl、大豆加水分解物（N量として165mg/dl）を含
み、NaOHでpH7.0に調整した培地に植菌し、31.5℃で24
時間シード培養を行った。

【００８４】上記シード培養液1mlを、グルコース4g/d
l、硫酸アンモニウム6.5g/dl、KH₂PO ₄ 0.5g/dl、MgSO₄
0.04g/dl、FeSO₄ 0.001g/dl、MnSO₄ 0.01g/dl、ビ
タミンB₁ 5μg/dl、ビオチン5μg/dl、大豆加水分解物
（N量として45mg/dl）を含み、KOHでpHを7.0に調整した
培地に植菌し、フラスコにて31.5℃で50時間振とう培養
を行った。各菌株の培養液中のＬ−アルギニン蓄積量
（濃度(mg/dl)）を測定した結果を表２に示す。その結
果、argR破壊株は、親株に比べて著量のＬ−アルギニン
を生成した。

【００８５】

【表２】表２ ───────────────────── 菌株 L-アルキ゛ニン蓄積量（mg/dl） ───────────────────── 2256 0 2256ΔR 200 ─────────────────────

【００８６】

【実施例４】lysEのコリネ型Arg生産菌における増幅効
果 ＜１＞lysE遺伝子搭載プラスミドの作製 上記菌株においてlysE遺伝子の増幅効果を確認するた
め、lysE遺伝子とコリネ型細菌の複製制御領域を有する
プラスミドの構築を行なった。

【００８７】既に取得されているコリネ型細菌で自律複
製可能なプラスミドpHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901
-2903(1984))由来の複製制御領域を持つプラスミドpHK4
（特開平5‐7491号公報参照）を制限酵素BamHIおよびKp
nIで消化して、複製制御領域を含む遺伝子断片を取得し
た。得られた断片をDNA平滑末端化キット(宝酒造)を用
いて平滑末端化した後、KpnIリンカーを用いてpHSG399
のKpnIサイトに挿入し、エシェリヒア・コリとコリネ型
細菌とのシャトルベクターpKCを得た。

【００８８】次に、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム野生株2256株の染色体DNAを鋳型とし、配列番
号２３（配列番号２５の塩基番号６８１から７０３の配
列）および配列番号２４（配列番号２５の塩基番号１８
４１から１８６３の配列に相補的な配列）に示す塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR
を行い、lysE遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。PCR
は、DNA PolymeraseとしてTaKaRa Ex Taq（宝酒造）を
用い、98℃ 30秒、55℃ 15秒、72℃ 2分を1サイクルと
して30サイクル行なった。得られた増幅断片を、TAクロ
ーニングベクターpCR2.1（Invitrogen社製）に挿入し、
pCRlysEを得た。さらに、この挿入断片を含むように制
限酵素BamHIおよびXbaIで遺伝子断片を切り出し、pKCの
BamHIおよびXbaI サイトに連結して、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタム由来のlysE搭載プラスミドpl
ysEを構築した。この構築の過程を図４に示す。

【００８９】＜２＞2256株および2256ΔR株におけるlys
E遺伝子増幅効果の確認 上記のようにして得られたプラスミドplysEを、ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタム2256株および2256
ΔR株に導入した。プラスミドの導入は電気パルス法
（特開平2-207791号）を用いた。形質転換体は、5μg/m
lのクロラムフェニコールを含むCM2G培地プレート（ポ
リペプトン10g、酵母エキス10g、グルコース5g、NaCl 5
g、寒天15ｇを純水1Lに含む。pH7.2）にて、クロラムフ
ェニコール耐性株として選択した。これらの形質転換体
を、前記と同様にしてフラスコ培養し、Ｌ−アルギニン
蓄積量を測定した。結果を表３に示す。

【００９０】

【表３】 表３ ────────────────────────── 菌株 L-アルキ゛ニン蓄積量（mg/dl） ────────────────────────── 2256 0 2256/plysE 0 2256ΔR 200 2256ΔR/plysE 600 ──────────────────────────

【００９１】

【実施例５】Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子との組合せ
増幅効果の確認 ＜１＞Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子搭載plasmidの作
製 さらに、上記菌株においてＬ−アルギニン生合成系遺伝
子argC,J,B,F,G,Hの増幅効果を確認するため、argCJBDF
GH遺伝子とコリネ型細菌の複製制御領域を有するプラス
ミドの構築を行なった。

【００９２】pHK4（特開平5-7491号）を制限酵素BamHI
およびKpnIで消化して、コリネ型細菌における複製制御
領域を含む遺伝子断片を取得した。得られた断片をDNA
平滑末端化キット(宝酒造)を用いて平滑末端化した後、
SalIリンカーを用いてpHSG399のSalIサイトに挿入し、
エシェリヒア・コリとコリネ型細菌とのシャトルベクタ
ーpSAC4を得た。

【００９３】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム野生株2256株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号２７
および配列番号２８に示す塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドをプライマーとしてPCRを行い、argCJBDFRGHを
含むＤＮＡ断片を増幅した。PCRは、DNA Polymeraseと
してTaKaRa LA Taq（宝酒造）を用い、98℃ 30秒、55℃
15秒、72℃ 6分を1サイクルとして30サイクル行なっ
た。得られた増幅断片を平滑末端後、pSAC4のSmaIサイ
トに挿入し、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム由来のargCJBDFRGH搭載プラスミドpargCJBDFRGHを構
築した。さらに本プラスミドを鋳型とし、配列番号２９
および配列番号３０に示す塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドをプライマーとしてargR遺伝子ORFの外側を増
幅するためのPCRを行った。PCRは、DNA Polymeraseとし
てTaKaRa LA Taq（宝酒造）を用い、98℃ 20秒、68℃ 1
5分を1サイクルとして30サイクル行なった後、72℃で10
分反応させた。得られた増幅断片を平滑末端後、TaKaRa
Ligation Kit ver.2を用いてセルフライゲーションを
行うことにより、argR遺伝子を搭載しないプラスミドpa
rgCJBDFGHを構築した。この構築の過程を図５に示す。

【００９４】＜２＞Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子増幅
効果の確認 pargCJBDFGHを2256株に導入し、形質転換体2256/pargCJ
BDFGHを得た。2256株、および2256/pargCJBDFGH株を前
記と同様にしてフラスコ培養し、Ｌ−アルギニン蓄積量
を測定した。結果を表４に示す。

【００９５】

【表４】 表４ ────────────────────────── 菌株 L-アルキ゛ニン蓄積量（mg/dl） ────────────────────────── 2256 0 2256/pargCJBDFGH 300 ──────────────────────────

【００９６】＜３＞Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子およ
びlysE遺伝子を組合せて増幅したときの効果の確認 Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子およびlysE遺伝子を組合
せて増幅したときの効果を確認するため、上述のプラス
ミドpCRlysEをBamHI消化してlysE遺伝子を含むＤＮＡ断
片を切り出し、DNA平滑末端化キット(宝酒造)を用いて
平滑末端化した後、XbaIリンカーを用いてプラスミドpa
rgCJBDFGHのXbaIサイトに挿入し、プラスミドpargCJBDF
GH-Eを構築した。この構築の過程を図５に示す。本プラ
スミドを2256株へ導入し、前記と同様にしてフラスコ培
養し、Ｌ−アルギニン蓄積量を測定した。結果を表５に
示す。

【００９７】

【表５】 表５ ────────────────────────── 菌株 L-アルキ゛ニン蓄積量（mg/dl） ────────────────────────── 2256 0 2256/pargCJBDFGH 200 2256/plysE 0 2256/pargCJBDFGH-E 400 ──────────────────────────

【００９８】

【実施例６】lysEのエシェリヒア・コリArg生産菌にお
ける増幅効果 ＜１＞lysE遺伝子搭載プラスミドpRSlysEの構築 公知のプラスミドpRS（特表平3-501682号公報参照）を
用いて、lysE発現用プラスミドpRSlysEを構築した（図
６）。pRSは、RSF1010の誘導体である広宿主域ベクター
プラスミドpAYC32（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov,
Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167）に由来するpVIC40
プラスミド（WO90/04636国際公開パンフレット、特表平
3-501682号公報）より、同プラスミドが持つスレオニン
オペロンをコードするDNA領域を削除してベクター部分
のみを持つプラスミドである。

【００９９】まず、pRSより、tacプロモーターを持つプ
ラスミドpRStacを図６に示す方法で構築した。pRSベク
ターを制限酵素EcoRIおよびPstIで消化し、フェノール
・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させ
た。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノー
ル沈殿にてDNAを回収後、0.8%アガロースゲルにて分離
し、約8キロベースペア（以下、「kbp」と記載）のDNA
断片をEASY TRAP Ver.2（DNA回収キット、宝酒造社製）
を用いて回収した。一方、tacプロモーター領域を、pRK
223-3プラスミド（発現用ベクター、Pharmacia社製）を
鋳型とし、配列番号３１および３２に示すプライマーを
用いて、PCRにより増幅した（変性94℃-20秒、アニーリ
ング55℃-30秒、伸長反応72℃-60秒のサイクルを30サイ
クル行った）。PCR反応にはPyrobest DNA polymerase
（宝酒造社製）を使用した。増幅されたtacプロモータ
ーを含むDNA断片をPCRprep（Promega社製）にて精製し
た後、あらかじプライマー中にデザインしておいた制限
酵素サイト、すなわちEcoRIおよびEcoT22Iで消化し、フ
ェノール・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停
止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エ
タノール沈殿にてDNAを回収した後、0.8%アガロースゲ
ルにて分離し、約0.15kbpのDNA断片をEASY TRAP Ver.2
を用いて回収した。

【０１００】上記のように調製したpRSベクター消化物
と、tacプロモーター領域断片を、DNA Ligation Kit Ve
r.2（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶
液でエシェリヒア・コリ（E.coli JM109 competent cel
ls、宝酒造製）を形質転換し、20mg/Lのストレプトマイ
シンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。
寒天培地上に出現したコロニーを20mg/Lのストレプトマ
イシンを含むLB液体培地に接種し、37℃で8時間振盪培
養した。アルカリ−SDS法にて各培養液からプラスミドD
NAを抽出し、制限酵素で消化して構造を確認し、pRStac
を得た。pRSベクター上のストレプトマイシン耐性遺伝
子の転写方向とtacプロモーターの転写方向が同じ向き
になっているものを、pRStacとして選択した。

【０１０１】上記のようにして得たpRStacを、Sse8387I
（宝酒造製）およびSapI（ニューイングランドバイオラ
ボ社製）で消化し、フェノール・クロロホルム溶液を加
えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した
後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収後、
0.8%アガロースゲルで分離し、約9.0kbpのDAN断片を回
収した。

【０１０２】また、ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム２２５６株（ATCC13869）より抽出した染色体
を鋳型として、配列番号３３および３４に示すプライマ
ーを用いたPCR法（変性94℃-20秒、アニーリング55℃-3
0秒、伸長反応72℃-90秒）によりlysE遺伝子断片を増幅
した。PCR反応には、Pyrobest DNA polymerase（宝酒造
社製）を使用した。得られた断片をPCRprep（Promega社
製）にて精製した後、制限酵素Sse8387IおよびSapIで消
化した。フェノール・クロロホルム溶液を加えて混合
し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層
を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収し、0.8%アガ
ロースゲルで回収した。

【０１０３】上記のように調製したpRStacベクター消化
物と、lysE遺伝子領域断片を、DNALigation Kit Ver.2
（宝酒造製）を用いて連結させた。この連結反応溶液で
エシェリヒア・コリ（E.coli JM109 competent cells、
宝酒造製）を形質転換し、20mg/Lのストレプトマイシン
を含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩保温した。寒天
培地上に出現したコロニーを20mg/Lのストレプトマイシ
ンを含むLB液体培地に接種し、37℃で8時間振盪培養し
た。アルカリ−SDS法にて各培養液からプラスミドDNAを
抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により
構造を確認して、pRSlysEを得た。pRSlysEは、tacプロ
モーターの転写方向に対して、lysE遺伝子の転写方向が
同じ向きになるように配置されている。

【０１０４】＜２＞yggA遺伝子搭載プラスミドpGEM5の
構築 エシェリヒア・コリK-12株の染色体ＤＮＡの全塩基配列
が決定されている（Science, 277, 1453-1474, 199
7）。この報告されている塩基配列に基づいて、配列番
号３５、３６に示すプライマーを用いて、エシェリヒア
・コリMG1655株染色体ＤＮＡを鋳型とするPCRにより、y
ggA遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。配列番号３５
に示すプライマーは、GenBankにaccession No. AE00037
5で登録されている塩基配列の塩基番号9606〜9626の相
補的な配列を有しており、配列番号３６に示すプライマ
ーは、塩基番号8478〜8498の配列を有している。

【０１０５】エシェリヒア・コリMG1655株の染色体ＤＮ
Ａは、常法により調製した。PCRは、PCR protocols. Cu
rrent Methods and applications, White, B. A., ed.
Humana Press, Totowa, New Jersey, 1993に記載の標準
的な条件により実施した。得られたPCR産物は常法によ
り精製し、pGEM-Tベクター（Promega社）にクローニン
グした。得られたプラスミドは、pGEM5と命名した。

【０１０６】＜３＞エシェリヒア・コリArg生産菌にお
けるlysE遺伝子増幅効果の確認 上記のように構築したプラスミドpRSlysE、pGEM5をE.
coliのArg生産株である237株に導入した。237株は、エ
シェリヒア・コリK12 ilvA::Tn5から１−メチル−３−
ニトロ−１−ニトロソグアニジンにより誘導された、ピ
リミジンアナログである６−アザウラシルに耐性な変異
株である。同株は、VKPM B-7925の名でAll-Russian Col
lection for Industrial Microorganisms (VKPM)（1, D
orozhnyProezd., 1, 113545, Moscow, Russia）に寄託
されている。形質転換は、定法によって実施した。

【０１０７】得られた形質転換株についてＬ−アルギニ
ン生産性を確認するため培養評価を行った（３２℃、3
日、振盪培養）。用いた培地の組成を以下に示す（単位
g/L）。グルコース 60g/L、(NH₄)₂SO₄ 35g/L、酵母エキ
ス 5g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄・7H₂O 1g/L、CaCO₃ 25g/
L。培地中に蓄積したＬ−アルギニンの量を公知の方法
により測定した結果を表６に示す。

【０１０８】

【表６】 表６ ────────────────────────── 菌株 L-アルキ゛ニン蓄積量（mg/dl） ────────────────────────── 237 450 237/pRSlysE 890 237/pGEM5 600 ──────────────────────────

【０１０９】lysEを増幅したプラスミドpRSlysEの導入
によってＬ−アルギニン蓄積量が向上した。また、その
向上幅は、従来Ｌ−アルギニン排出因子として報告され
ていたyggAを増幅するpGEMに比べて、より高いレベルで
あった。

【０１１０】（配列表の説明） 配列番号１：ストレプトコッカス・フェカリスのカナマ
イシン耐性遺伝子増幅用プライマー 配列番号２：ストレプトコッカス・フェカリスのカナマ
イシン耐性遺伝子増幅用プライマー 配列番号３：pHSG399のベクター部分増幅用プライマー 配列番号４：pHSG399のベクター部分増幅用プライマー 配列番号５：pSFK6の複製制御領域部分の塩基配列 配列番号６：pSFK6中のORFによってコードされ得るアミ
ノ酸配列 配列番号７：p48Kの複製制御領域部分の塩基配列 配列番号８：p48K中のORFによってコードされ得るアミ
ノ酸配列 配列番号９：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入する
ための第１回目PCR用プライマー 配列番号10：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入する
ための第１回目PCR用プライマー

【０１１１】配列番号11：pSFK6に1534番目のC→Tの変
異を導入するための第１回目PCR用プライマー 配列番号12：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入する
ための第１回目PCR用プライマー 配列番号13：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入する
ための第２回目PCR用プライマー 配列番号14：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入する
ための第２回目PCR用プライマー 配列番号15：argR遺伝子増幅用プライマー 配列番号16：argR遺伝子増幅用プライマー 配列番号17：argR遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列 配列番号18：前記ＤＮＡ断片がコードし得るアミノ酸配
列 配列番号19：argR遺伝子増幅用プライマー 配列番号20：argR遺伝子増幅用プライマー

【０１１２】配列番号21：argR遺伝子を含むプラスミド
のargR遺伝子ORF以外の部分を増幅するためのプライマ
ー 配列番号22：argR遺伝子を含むプラスミドのargR遺伝子
ORF以外の部分を増幅するためのプライマー 配列番号23：lysE遺伝子増幅用プライマー 配列番号24：lysE遺伝子増幅用プライマー 配列番号25：コリネバクテリウム・グルタミカムlysGお
よびlysE遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列（GenBank
X96471） 配列番号26：lysEによってコードされるアミノ酸配列 配列番号27：argCからargH遺伝子を含むDNA断片増幅用
プライマー 配列番号28：argCからargH遺伝子を含むDNA断片増幅用
プライマー 配列番号29：argRのORFの外側増幅用プライマー 配列番号30：argRのORFの外側増幅用プライマー

【０１１３】配列番号31：tacプロモーター増幅用プラ
イマー 配列番号32：tacプロモーター増幅用プライマー 配列番号33：lysE遺伝子増幅用プライマー 配列番号34：lysE遺伝子増幅用プライマー 配列番号35：yggA遺伝子増幅用プライマー 配列番号36：yggA遺伝子増幅用プライマー

【０１１４】

【発明の効果】本発明により、Ｌ−アルギニン生産能を
有するコリネ型細菌及びエシェリヒア属細菌等の微生物
のＬ−アルギニン生産能を向上させることができる。

【０１１５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Method for Producing L-Arginine <130> P-B0142 <140> <141> 2002-07-24 <150> JP 2001-224586 <151> 2001-07-25 <160> 36 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying kanamycin resistant gene of Streptococcus faecalis <400> 1 cccgttaact gcttgaaacc caggacaata ac 32 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying kanamycin resistant gene of Streptococcus faecalis <400> 2 cccgttaaca tgtacttcag aaaagattag 30 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Escherichia coli cloning vector pHSG399 <400> 3 gatatctacg tgccgatcaa cgtctc 26 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Escherichia coli cloning vector pHSG399 <400> 4 aggccttttt ttaaggcagt tattg 25 <210> 5 <211> 4447 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (1318)..(2598) <400> 5 aagcttgtct acgtctgatg ctttgaatcg gacggacttg ccgatcttgt atgcggtgat 60 ttttccctcg tttgcccact ttttaatggt ggccggggtg agagctacgc gggcggcgac 120 ctgctgcgct gtgatccaat attcggggtc gttcactggt tcccctttct gatttctggc 180 atagaagaac ccccgtgaac tgtgtggttc cgggggttgc tgatttttgc gagacttctc 240 gcgcaattcc ctagcttagg tgaaaacacc atgaaacact agggaaacac ccatgaaaca 300 cccattaggg cagtagggcg gcttcttcgt ctagggcttg catttgggcg gtgatctggt 360 ctttagcgtg tgaaagtgtg tcgtaggtgg cgtgctcaat gcactcgaac gtcacgtcat 420 ttaccgggtc acggtgggca aagagaacta gtgggttaga cattgttttc ctcgttgtcg 480 gtggtggtga gcttttctag ccgctcggta aacgcggcga tcatgaactc ttggaggttt 540 tcaccgttct gcatgcctgc gcgcttcatg tcctcacgta gtgccaaagg aacgcgtgcg 600 gtgaccacga cgggcttagc ctttgcctgc gcttctagtg cttcgatggt ggcttgtgcc 660 tgcgcttgct gcgcctgtag tgcctgttga gcttcttgta gttgctgttc tagctgtgcc 720 ttggttgcca tgctttaaga ctctagtagc tttcctgcga tatgtcatgc gcatgcgtag 780 caaacattgt cctgcaactc attcattatg tgcagtgctc ctgttactag tcgtacatac 840 tcatatttac ctagtctgca tgcagtgcat gcacatgcag tcatgtcgtg ctaatgtgta 900 aaacatgtac atgcagattg ctgggggtgc agggggcgga gccaccctgt ccatgcgggg 960 tgtggggctt gccccgccgg tacagacagt gagcaccggg gcacctagtc gcggataccc 1020 cccctaggta tcggacacgt aaccctccca tgtcgatgca aatctttaac attgagtacg 1080 ggtaagctgg cacgcatagc caagctaggc ggccaccaaa caccactaaa aattaatagt 1140 ccctagacaa gacaaacccc cgtgcgagct accaactcat atgcacgggg gccacataac 1200 ccgaaggggt ttcaattgac aaccatagca ctagctaaga caacgggcac aacacccgca 1260 caaactcgca ctgcgcaacc ccgcacaaca tcgggtctag gtaacactga aatagaa 1317 gtg aac acc tct aag gaa ccg cag gtc aat gag ggt tct aag gtc act 1365 Val Asn Thr Ser Lys Glu Pro Gln Val Asn Glu Gly Ser Lys Val Thr 1 5 10 15 cgc gct agg gcg tgg cgt agg caa aac gtc atg tac aag atc acc aat 1413 Arg Ala Arg Ala Trp Arg Arg Gln Asn Val Met Tyr Lys Ile Thr Asn 20 25 30 agt aag gct ctg gcg ggg tgc cat agg tgg cgc agg gac gaa gct gtt 1461 Ser Lys Ala Leu Ala Gly Cys His Arg Trp Arg Arg Asp Glu Ala Val 35 40 45 gcg gtg tcc tgg tcg tct aac ggt gct tcg cag ttt gag ggt ctg caa 1509 Ala Val Ser Trp Ser Ser Asn Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gly Leu Gln 50 55 60 aac tct cac tct cgc tgg ggg tca cct ctg gct gaa ttg gaa gtc atg 1557 Asn Ser His Ser Arg Trp Gly Ser Pro Leu Ala Glu Leu Glu Val Met 65 70 75 80 ggc gaa cgc cgc att gag ctg gct att gct act aag aat cac ttg gcg 1605 Gly Glu Arg Arg Ile Glu Leu Ala Ile Ala Thr Lys Asn His Leu Ala 85 90 95 gcg ggt ggc gcg ctc atg atg ttt gtg ggc act gtt cga cac aac cgc 1653 Ala Gly Gly Ala Leu Met Met Phe Val Gly Thr Val Arg His Asn Arg 100 105 110 tca cag tca ttt gcg cag gtt gaa gcg ggt att aag act gcg tac tct 1701 Ser Gln Ser Phe Ala Gln Val Glu Ala Gly Ile Lys Thr Ala Tyr Ser 115 120 125 tcg atg gtg aaa aca tct cag tgg aag aaa gaa cgt gca cgg tac ggg 1749 Ser Met Val Lys Thr Ser Gln Trp Lys Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gly 130 135 140 gtg gag cac acc tat agt gac tat gag gtc aca gac tct tgg gcg aac 1797 Val Glu His Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Val Thr Asp Ser Trp Ala Asn 145 150 155 160 ggt tgg cac ttg cac cgc aac atg ctg ttg ttc ttg gat cgt cca ctg 1845 Gly Trp His Leu His Arg Asn Met Leu Leu Phe Leu Asp Arg Pro Leu 165 170 175 tct gac gat gaa ctc aag gcg ttt gag gat tcc atg ttt tcc cgc tgg 1893 Ser Asp Asp Glu Leu Lys Ala Phe Glu Asp Ser Met Phe Ser Arg Trp 180 185 190 tct gct ggt gtg gtt aag gcc ggt atg gac gcg cca ctg cgt gag cac 1941 Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Gly Met Asp Ala Pro Leu Arg Glu His 195 200 205 ggg gtc aaa ctt gat cag gtg tct acc tgg ggt gga gac gct gcg aaa 1989 Gly Val Lys Leu Asp Gln Val Ser Thr Trp Gly Gly Asp Ala Ala Lys 210 215 220 atg gca acc tac ctc gct aag ggc atg tct cag gaa ctg act ggc tcc 2037 Met Ala Thr Tyr Leu Ala Lys Gly Met Ser Gln Glu Leu Thr Gly Ser 225 230 235 240 gct act aaa acc gcg tct aag ggg tcg tac acg ccg ttt cag atg ttg 2085 Ala Thr Lys Thr Ala Ser Lys Gly Ser Tyr Thr Pro Phe Gln Met Leu 245 250 255 gat atg ttg gcc gat caa agc gac gcc ggc gag gat atg gac gct gtt 2133 Asp Met Leu Ala Asp Gln Ser Asp Ala Gly Glu Asp Met Asp Ala Val 260 265 270 ttg gtg gct cgg tgg cgt gag tat gag gtt ggt tct aaa aac ctg cgt 2181 Leu Val Ala Arg Trp Arg Glu Tyr Glu Val Gly Ser Lys Asn Leu Arg 275 280 285 tcg tcc tgg tca cgt ggg gct aag cgt gct ttg ggc att gat tac ata 2229 Ser Ser Trp Ser Arg Gly Ala Lys Arg Ala Leu Gly Ile Asp Tyr Ile 290 295 300 gac gct gat gta cgt cgt gaa atg gaa gaa gaa ctg tac aag ctc gcc 2277 Asp Ala Asp Val Arg Arg Glu Met Glu Glu Glu Leu Tyr Lys Leu Ala 305 310 315 320 ggt ctg gaa gca ccg gaa cgg gtc gaa tca acc cgc gtt gct gtt gct 2325 Gly Leu Glu Ala Pro Glu Arg Val Glu Ser Thr Arg Val Ala Val Ala 325 330 335 ttg gtg aag ccc gat gat tgg aaa ctg att cag tct gat ttc gcg gtt 2373 Leu Val Lys Pro Asp Asp Trp Lys Leu Ile Gln Ser Asp Phe Ala Val 340 345 350 agg cag tac gtt cta gat tgc gtg gat aag gct aag gac gtg gcc gct 2421 Arg Gln Tyr Val Leu Asp Cys Val Asp Lys Ala Lys Asp Val Ala Ala 355 360 365 gcg caa cgt gtc gct aat gag gtg ctg gca agt ctg ggt gtg gat tcc 2469 Ala Gln Arg Val Ala Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Asp Ser 370 375 380 acc ccg tgc atg atc gtt atg gat gat gtg gac ttg gac gcg gtt ctg 2517 Thr Pro Cys Met Ile Val Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Ala Val Leu 385 390 395 400 cct act cat ggg gac gct act aag cgt gat ctg aat gcg gcg gtg ttc 2565 Pro Thr His Gly Asp Ala Thr Lys Arg Asp Leu Asn Ala Ala Val Phe 405 410 415 gcg ggt aat gag cag act att ctt cgc acc cac taaaagcggc ataaaccccg 2618 Ala Gly Asn Glu Gln Thr Ile Leu Arg Thr His 420 425 ttcgatattt tgtgcgatga atttatggtc aatgtcgcgg gggcaaacta tgatgggtct 2678 tgttgttgac aatggctgat ttcatcagga atggaactgt catgctgtta tgtgcctggc 2738 tcctaatcaa agctggggac aatgggttgc cccgttgatc tgatctagtt cggattggcg 2798 gggcttcact gtatctgggg gtggcatcgt gaatagattg cacaccgtag tgggcagtgt 2858 gcacaccata gtgggcatga gtaataccta cgcgcgcgtg ggctagggct taacgcgcgt 2918 tttgccgtgc tgcggggcat acgttagcgc atacgctttt ttctgtgaaa cctttttgtg 2978 ttgttgtttc gtgttggttt cctttctgtt ggcggggcaa cttaacgcct gcgggggtgg 3038 ttgttgacgt taacgggggt agtttttatt cccctagtgg tttttcagta cgacaatcga 3098 gaaagacctg tttcagccag ttcgggtcat gttcgtcggt atggccacgt gcatagcgac 3158 cagttttcga gttcactggg atttttggtg catcgaacaa gatgtaggac aatgcggttt 3218 ctaggtctac tttttgcttt atgccgtaca agccccgtgg gtattcagcg attgattcca 3278 aggcggcttc ccagtcctgt tttgtgaagg actggcttag ttctaggtct gtgtctgggt 3338 agtactgctt gtttgtgtaa gcgccgttgg tgctcattga tgattccttt gaagtgtttg 3398 gagttcggct agtagtgcgg cgtatggtgc tgctttttgc tcgtgatagc tcgccttggc 3458 tatgaggtcg gctaggtagg tttccggggt gcctaggttg cgtaggtcta gcaaatcccg 3518 gtatgtggcc tgtgcgctgc gctggtggtg catacagtcg ttaagctggg cttttacgtc 3578 tgcgatgcgg tggcggttag gcatgttggt gtgcttcttc caagtactca cgggcgggtt 3638 ttgtgtatgc ctggcgtgat gcttctttga gctgttggag ttccgcttgg agtgcgggta 3698 gttcgtccgc gaactgcttg tggtactcgt atttctcttg ttcctgggcg atagcatttg 3758 cgttgaattg cagggcggtg agttcgtcca cgcgtcgttt tgctgcgttg gtcatggtgg 3818 cgtgccattt gcggttgtgg acgcggggtt caaggttgcg cacggctgct tcggctaggt 3878 tggtggctgc ttttttcagt gctcgggctt cccgttcctc gtccaacgag agcacctttg 3938 gtttgttggc ttcggctagt ttttgcttct ccgctttgat gagttggtca acttcgtgtt 3998 gggagaggtc gtttttcacg atgcgtcgaa tgtggtcgtt gtgggtgctg agttggtgtg 4058 agaggtagtg gggttctggg atttcggcga gttggtcgag gttggtgtag tgcgggttgc 4118 ggcctggttg gttgggttcg ctggggaggt cgatgtatcc ggttgagtct ccggcgtggt 4178 tgaagtgaat taggcgttgg tagccgtatt cctggttggg gaggtacgac agaatgagga 4238 agtttggtgc ttctcctgca atgagtcgtg cgtgttcgta gttcggtact gggtcgtgct 4298 cggggagaat gttcttttgg gtcatggctt ctctttctgt tgctctgtaa gtccgtatgt 4358 gggcatggga aagccccggc aaccctttgg gtcaaccggg gctagatagt cgcttagaat 4418 ggcttctagg ctgcgtctcg gggtgtggc 4447 <210> 6 <211> 427 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 6 Val Asn Thr Ser Lys Glu Pro Gln Val Asn Glu Gly Ser Lys Val Thr 1 5 10 15 Arg Ala Arg Ala Trp Arg Arg Gln Asn Val Met Tyr Lys Ile Thr Asn 20 25 30 Ser Lys Ala Leu Ala Gly Cys His Arg Trp Arg Arg Asp Glu Ala Val 35 40 45 Ala Val Ser Trp Ser Ser Asn Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gly Leu Gln 50 55 60 Asn Ser His Ser Arg Trp Gly Ser Pro Leu Ala Glu Leu Glu Val Met 65 70 75 80 Gly Glu Arg Arg Ile Glu Leu Ala Ile Ala Thr Lys Asn His Leu Ala 85 90 95 Ala Gly Gly Ala Leu Met Met Phe Val Gly Thr Val Arg His Asn Arg 100 105 110 Ser Gln Ser Phe Ala Gln Val Glu Ala Gly Ile Lys Thr Ala Tyr Ser 115 120 125 Ser Met Val Lys Thr Ser Gln Trp Lys Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gly 130 135 140 Val Glu His Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Val Thr Asp Ser Trp Ala Asn 145 150 155 160 Gly Trp His Leu His Arg Asn Met Leu Leu Phe Leu Asp Arg Pro Leu 165 170 175 Ser Asp Asp Glu Leu Lys Ala Phe Glu Asp Ser Met Phe Ser Arg Trp 180 185 190 Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Gly Met Asp Ala Pro Leu Arg Glu His 195 200 205 Gly Val Lys Leu Asp Gln Val Ser Thr Trp Gly Gly Asp Ala Ala Lys 210 215 220 Met Ala Thr Tyr Leu Ala Lys Gly Met Ser Gln Glu Leu Thr Gly Ser 225 230 235 240 Ala Thr Lys Thr Ala Ser Lys Gly Ser Tyr Thr Pro Phe Gln Met Leu 245 250 255 Asp Met Leu Ala Asp Gln Ser Asp Ala Gly Glu Asp Met Asp Ala Val 260 265 270 Leu Val Ala Arg Trp Arg Glu Tyr Glu Val Gly Ser Lys Asn Leu Arg 275 280 285 Ser Ser Trp Ser Arg Gly Ala Lys Arg Ala Leu Gly Ile Asp Tyr Ile 290 295 300 Asp Ala Asp Val Arg Arg Glu Met Glu Glu Glu Leu Tyr Lys Leu Ala 305 310 315 320 Gly Leu Glu Ala Pro Glu Arg Val Glu Ser Thr Arg Val Ala Val Ala 325 330 335 Leu Val Lys Pro Asp Asp Trp Lys Leu Ile Gln Ser Asp Phe Ala Val 340 345 350 Arg Gln Tyr Val Leu Asp Cys Val Asp Lys Ala Lys Asp Val Ala Ala 355 360 365 Ala Gln Arg Val Ala Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Asp Ser 370 375 380 Thr Pro Cys Met Ile Val Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Ala Val Leu 385 390 395 400 Pro Thr His Gly Asp Ala Thr Lys Arg Asp Leu Asn Ala Ala Val Phe 405 410 415 Ala Gly Asn Glu Gln Thr Ile Leu Arg Thr His 420 425 <210> 7 <211> 4447 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (1318)..(2598) <400> 7 aagcttgtct acgtctgatg ctttgaatcg gacggacttg ccgatcttgt atgcggtgat 60 ttttccctcg tttgcccact ttttaatggt ggccggggtg agagctacgc gggcggcgac 120 ctgctgcgct gtgatccaat attcggggtc gttcactggt tcccctttct gatttctggc 180 atagaagaac ccccgtgaac tgtgtggttc cgggggttgc tgatttttgc gagacttctc 240 gcgcaattcc ctagcttagg tgaaaacacc atgaaacact agggaaacac ccatgaaaca 300 cccattaggg cagtagggcg gcttcttcgt ctagggcttg catttgggcg gtgatctggt 360 ctttagcgtg tgaaagtgtg tcgtaggtgg cgtgctcaat gcactcgaac gtcacgtcat 420 ttaccgggtc acggtgggca aagagaacta gtgggttaga cattgttttc ctcgttgtcg 480 gtggtggtga gcttttctag ccgctcggta aacgcggcga tcatgaactc ttggaggttt 540 tcaccgttct gcatgcctgc gcgcttcatg tcctcacgta gtgccaaagg aacgcgtgcg 600 gtgaccacga cgggcttagc ctttgcctgc gcttctagtg cttcgatggt ggcttgtgcc 660 tgcgcttgct gcgcctgtag tgcctgttga gcttcttgta gttgctgttc tagctgtgcc 720 ttggttgcca tgctttaaga ctctagtagc tttcctgcga tatgtcatgc gcatgcgtag 780 caaacattgt cctgcaactc attcattatg tgcagtgctc ctgttactag tcgtacatac 840 tcatatttac ctagtctgca tgcagtgcat gcacatgcag tcatgtcgtg ctaatgtgta 900 aaacatgtac atgcagattg ctgggggtgc agggggcgga gccaccctgt ccatgcgggg 960 tgtggggctt gccccgccgg tacagacagt gagcaccggg gcacctagtc gcggataccc 1020 cccctaggta tcggacacgt aaccctccca tgtcgatgca aatctttaac attgagtacg 1080 ggtaagctgg cacgcatagc caagctaggc ggccaccaaa caccactaaa aattaatagt 1140 tcctagacaa gacaaacccc cgtgcgagct accaactcat atgcacgggg gccacataac 1200 ccgaaggggt ttcaattgac aaccatagca ctagctaaga caacgggcac aacatccgca 1260 caaactcgca ctgcgcaacc ccgcacaaca tcgggtctag gtaacactga aatagaa 1317 gtg aac acc tct aag gaa ccg cag gtc aat gag ggt tct aag gtc act 1365 Val Asn Thr Ser Lys Glu Pro Gln Val Asn Glu Gly Ser Lys Val Thr 1 5 10 15 cgc gct agg gcg tgg cgt agg caa aac gtc atg tac aag atc acc aat 1413 Arg Ala Arg Ala Trp Arg Arg Gln Asn Val Met Tyr Lys Ile Thr Asn 20 25 30 agt aag gct ctg gcg ggg tgc cat agg tgg cgc agg gac gaa gct gtt 1461 Ser Lys Ala Leu Ala Gly Cys His Arg Trp Arg Arg Asp Glu Ala Val 35 40 45 gcg gtg tcc tgg tcg tct aac ggt gct tcg cag ttt gag ggt ctg caa 1509 Ala Val Ser Trp Ser Ser Asn Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gly Leu Gln 50 55 60 aac tct cac tct cgc tgg ggg tca tct ctg gct gaa ttg gaa gtc atg 1557 Asn Ser His Ser Arg Trp Gly Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Val Met 65 70 75 80 ggc gaa cgc cgc att gag ctg gct att gct act aag aat cac ttg gcg 1605 Gly Glu Arg Arg Ile Glu Leu Ala Ile Ala Thr Lys Asn His Leu Ala 85 90 95 gcg ggt ggc gcg ctc atg atg ttt gtg ggc act gtt cga cac aac cgc 1653 Ala Gly Gly Ala Leu Met Met Phe Val Gly Thr Val Arg His Asn Arg 100 105 110 tca cag tca ttt gcg cag gtt gaa gcg ggt att aag act gcg tac tct 1701 Ser Gln Ser Phe Ala Gln Val Glu Ala Gly Ile Lys Thr Ala Tyr Ser 115 120 125 tcg atg gtg aaa aca tct cag tgg aag aaa gaa cgt gca cgg tac ggg 1749 Ser Met Val Lys Thr Ser Gln Trp Lys Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gly 130 135 140 gtg gag cac acc tat agt gac tat gag gtc aca gac tct tgg gcg aac 1797 Val Glu His Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Val Thr Asp Ser Trp Ala Asn 145 150 155 160 ggt tgg cac ttg cac cgc aac atg ctg ttg ttc ttg gat cgt cca ctg 1845 Gly Trp His Leu His Arg Asn Met Leu Leu Phe Leu Asp Arg Pro Leu 165 170 175 tct gac gat gaa ctc aag gca ttt gag gat tcc atg ttt tcc cgc tgg 1893 Ser Asp Asp Glu Leu Lys Ala Phe Glu Asp Ser Met Phe Ser Arg Trp 180 185 190 tct gct ggt gtg gtt aag gcc ggt atg gac gcg cca ctg cgt gag cac 1941 Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Gly Met Asp Ala Pro Leu Arg Glu His 195 200 205 ggg gtc aaa ctt gat cag gtg tct acc tgg ggt gga gac gct gcg aaa 1989 Gly Val Lys Leu Asp Gln Val Ser Thr Trp Gly Gly Asp Ala Ala Lys 210 215 220 atg gca acc tac ctc gct aag ggc atg tct cag gaa ctg act ggc tcc 2037 Met Ala Thr Tyr Leu Ala Lys Gly Met Ser Gln Glu Leu Thr Gly Ser 225 230 235 240 gct act aaa acc gcg tct aaa ggg tcg tac acg ccg ttt cag atg ttg 2085 Ala Thr Lys Thr Ala Ser Lys Gly Ser Tyr Thr Pro Phe Gln Met Leu 245 250 255 gat atg ttg gcc gat caa agc gac gcc ggc gag gat atg gac gct gtt 2133 Asp Met Leu Ala Asp Gln Ser Asp Ala Gly Glu Asp Met Asp Ala Val 260 265 270 ttg gtg gct cgg tgg cgt gag tat gag gtt ggt tct aaa aac ctg cgt 2181 Leu Val Ala Arg Trp Arg Glu Tyr Glu Val Gly Ser Lys Asn Leu Arg 275 280 285 tcg tct tgg tca cgt ggg gct aag cgt gct ttg ggc att gat tac ata 2229 Ser Ser Trp Ser Arg Gly Ala Lys Arg Ala Leu Gly Ile Asp Tyr Ile 290 295 300 gac gct gat gta cgt cgt gaa atg gaa gaa gaa ctg tac aag ctc gcc 2277 Asp Ala Asp Val Arg Arg Glu Met Glu Glu Glu Leu Tyr Lys Leu Ala 305 310 315 320 ggt ctg gaa gca ccg gaa cgg gtc gaa tca acc cgc gtt gct gtt gct 2325 Gly Leu Glu Ala Pro Glu Arg Val Glu Ser Thr Arg Val Ala Val Ala 325 330 335 ttg gtg aag ccc gat gat tgg aaa ctg att cag tct gat ttc gcg gtt 2373 Leu Val Lys Pro Asp Asp Trp Lys Leu Ile Gln Ser Asp Phe Ala Val 340 345 350 agg cag tac gtt cta gat tgc gtg gat aag gct aag gac gtg gcc gct 2421 Arg Gln Tyr Val Leu Asp Cys Val Asp Lys Ala Lys Asp Val Ala Ala 355 360 365 gcg caa cgt gtc gct aat gag gtg ctg gca agt ctg ggt gtg gat tcc 2469 Ala Gln Arg Val Ala Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Asp Ser 370 375 380 acc ccg tgc atg atc gtt atg gat gat gtg gac ttg gac gcg gtt ctg 2517 Thr Pro Cys Met Ile Val Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Ala Val Leu 385 390 395 400 cct act cat ggg gac gct act aag cgt gat ctg aat gcg gcg gtg ttc 2565 Pro Thr His Gly Asp Ala Thr Lys Arg Asp Leu Asn Ala Ala Val Phe 405 410 415 gcg ggt aat gag cag act att ctt cgc acc cac taaaagcggc ataaaccccg 2618 Ala Gly Asn Glu Gln Thr Ile Leu Arg Thr His 420 425 ttcgatattt tgtgcgatga atttatggtc aatgtcgcgg gggcaaacta tgatgggtct 2678 tgttgttgac aatggctgat ttcatcagga atggaactgt catgctgtta tgtgcctggc 2738 tcctaatcaa agctggggac aatgggttgc cccgttgatc tgatctagtt cggattggcg 2798 gggcttcact gtatctgggg gtggcatcgt gaatagattg cacaccgtag tgggcagtgt 2858 gcacaccata gtgggcatga gtaataccta cgcgcgcgtg ggctagggct taacgcgcgt 2918 tttgccgtgc tgcggggcat acgttagcgc atacgctttt ttctgtgaaa cctttttgtg 2978 ttgttgtttc gtgttggttt cctttctgtt ggcggggcaa cttaacgcct gcgggggtgg 3038 ttgttgacgt taacgggggt agtttttatt cccctagtgg tttttcagta cgacaatcga 3098 gaaagacctg tttcagccag ttcgggtcat gttcgtcggt atggccacgt gcatagcgac 3158 cagttttcga gttcactggg atttttggtg catcaaacaa gatgtaggac aatgcggttt 3218 ctaggtctac tttttgcttt atgccgtaca agccccgtgg gtattcagcg attgattcca 3278 aggcggcttc ccagtcctgt tttgtgaagg actggcttag ttctaggtct gtgtctgggt 3338 agtactgctt gtttgtgtaa gcgccgttgg tgctcattga tgattccttt gaagtgtttg 3398 gagttcggct agtagtgcgg cgtatggtgc tgctttttgc tcgtgatagc tcgccttggc 3458 tatgaggtcg gctaggtagg tttccggggt gcctaggttg cgtaggtcta gcaaatcccg 3518 gtatgtggcc tgtgcgctgc gctggtggtg catacagtcg ttaagctggg cttttacgtc 3578 tgcgatgcgg tggcggttag gcatgttggt gtgcttcttc caagtactca cgggcgggtt 3638 ttgtgtatgc ctggcgtgat gcttctttga gctgttggag ttccgcttgg agtgcgggta 3698 gttcgtccgc gaactgcttg tggtactcgt atttctcttg ttcctgggcg atagcatttg 3758 cgttgaattg cagggcggtg agttcgtcca cgcgtcgttt tgctgcgttg gtcatggtgg 3818 cgtgccattt gcggttgtgg acgcggggtt caaggttgcg cacggctgct tcggctaggt 3878 tggtggctgc ttttttcagt gctcgggctt cccgttcctc gtccaacgag agcacctttg 3938 gtttgttggc 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introducing mutation to pAM330 <400> 10 ttggtgcatc aaacaagatg tag 23 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 11 ttttcccggg agcttgccac accccgag 28 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 12 tgtcctacat cttgtttgat gcaccaa 27 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 13 gaggttttca ccgttctgca tgcc 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 14 aactcaccgc cctgcaattc aac 23 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 15 gcctaccgcg gcaaagaagt ggcag 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 16 gccttgaact aggggcgctt taagt 25 <210> 17 <211> 4235 <212> DNA <213> Brevibacterium flavum <220> <221> CDS <222> (1852)..(2364) <400> 17 aaacccgggt tttcttctgc aactcgggcg ccgaagcaaa cgaggctgct ttcaagattg 60 cacgcttgac tggtcgttcc cggattctgg ctgcagttca tggtttccac ggccgcacca 120 tgggttccct cgcgctgact ggccagccag acaagcgtga agcgttcctg ccaatgccaa 180 gcggtgtgga gttctaccct tacggcgaca ccgattactt gcgcaaaatg gtagaaacca 240 acccaacgga tgtggctgct atcttcctcg agccaatcca gggtgaaacg ggcgttgttc 300 cagcacctga aggattcctc aaggcagtgc gcgagctgtg cgatgagtac ggcatcttga 360 tgatcaccga tgaagtccag actggcgttg gccgtaccgg cgatttcttt gcacatcagc 420 acgatggcgt tgttcccgat gtggtgacca tggccaaggg acttggcggc ggtcttccca 480 tcggtgcttg tttggccact ggccgtgcag ctgaattgat gaccccaggc aagcacggca 540 ccactttcgg tggcaaccca gttgcttgtg cagctgccaa ggcagtgctg tctgttgtcg 600 atgacgcttt ctgcgcagaa gttacccgca agggcgagct gttcaaggta cttcttgcca 660 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gtggccagga aaccggcgcg aaggttgttg tcaccgacag cctcgacgag 1560 gttgccggcg ccgatgttgt catcaccgat acctgggtat ccatgggtat ggaaaacgac 1620 ggcatcgatc gcaccacacc tttcgttcct taccaggtca acgatgaggt catggcgaaa 1680 gctaacgacg gcgccatctt cctgcactgc cttcctgcct accgcggcaa agaagtggca 1740 gcctccgtga ttgatggacc agcgtccaaa gttttcgatg aagcagaaaa ccgcctccac 1800 gctcagaaag cactgctggt gtggctgctg gccaaccagc cgaggtaaga c atg tct 1857 Met Ser 1 ctt ggc tca acc ccg tca aca ccg gaa aac tta aat ccc gtg act cgc 1905 Leu Gly Ser Thr Pro Ser Thr Pro Glu Asn Leu Asn Pro Val Thr Arg 5 10 15 act gca cgc caa gct ctc att ttg cag att ttg gac aaa caa aaa gtc 1953 Thr Ala Arg Gln Ala Leu Ile Leu Gln Ile Leu Asp Lys Gln Lys Val 20 25 30 acc agc cag gta caa ctg tct gaa ttg ctg ctg gat gaa ggc atc gat 2001 Thr Ser Gln Val Gln Leu Ser Glu Leu Leu Leu Asp Glu Gly Ile Asp 35 40 45 50 atc acc cag gcc acc ttg tcc cgg gat ctc gat gaa ctc ggt gca cgc 2049 Ile Thr Gln Ala Thr Leu Ser Arg Asp Leu Asp Glu Leu Gly Ala Arg 55 60 65 aag 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gcaggctatt gaagagctga accgtcgtgc aggcgcacag 3284 ggcgttggcc gccttgacat ggttgaggac cgtctcgtgg gcatcaagtc ccgcgaaatc 3344 tacgaagcac caggcgcaat cgcactgatt aaggctcacg aggctttgga agatgtcacc 3404 atcgagcgcg aactggctcg ctacaagcgt ggcgttgacg cacgttgggc tgaggaagta 3464 tacgacggcc tgtggttcgg acctctgaag cgctccctgg acgcgttcat tgattccacc 3524 caggagcacg tcaccggcga tatccgcatg gttctgcacg caggttccat caccatcaat 3584 ggtcgtcgtt ccagccactc cctgtacgac ttcaacctgg ctacctacga caccggcgac 3644 accttcgacc agaccctggc taagggcttt gtccagctgc acggtctgtc ctccaagatc 3704 gctaacaagc gcgatcgcga agctggcaac aactaagcca ccttttcaag catccagact 3764 agaacttcaa gtatttagaa agtagaagaa caccacatgg aacagcacgg aaccaatgaa 3824 ggtgcgctgt ggggcggccg cttctccggt ggaccctccg aggccatgtt cgccttgagt 3884 gtctccactc atttcgactg ggttttggcc ccttatgatg tgttggcctc caaggcacac 3944 gccaaggttt tgcaccaagc agagctactt tctgatgaag atctagccac catgctggct 4004 ggtcttgatc agctgggcaa ggatgtcgcc gacggaacct tcggtccgct gccttctgat 4064 gaggatgtgc acggcgcgat 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agcgggcagc cctcctccgc catgaactca gccgcctccg ctgtgagctc 2283 tggaccgtag gaagaaatac ccacgtaaag agcctttcca gacgcaacaa tgtcacgcaa 2343 tgcgtacatg gtttcttcca aaggagtatc t 2374 <210> 26 <211> 233 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 26 Met Glu Ile Phe Ile Thr Gly Leu Leu Leu Gly Ala Ser Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Ile Gly Pro Gln Asn Val Leu Val Ile Lys Gln Gly Ile Lys Arg 20 25 30 Glu Gly Leu Ile Ala Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Val Phe 35 40 45 Leu Phe Ile Ala Gly Thr Leu Gly Val Asp Leu Leu Ser Asn Ala Ala 50 55 60 Pro Ile Val Leu Asp Ile Met Arg Trp Gly Gly Ile Ala Tyr Leu Leu 65 70 75 80 Trp Phe Ala Val Met Ala Ala Lys Asp Ala Met Thr Asn Lys Val Glu 85 90 95 Ala Pro Gln Ile Ile Glu Glu Thr Glu Pro Thr Val Pro Asp Asp Thr 100 105 110 Pro Leu Gly Gly Ser Ala Val Ala Thr Asp Thr Arg Asn Arg Val Arg 115 120 125 Val Glu Val Ser Val Asp Lys Gln Arg Val Trp Val Lys Pro Met Leu 130 135 140 Met Ala Ile Val Leu Thr Trp Leu Asn Pro Asn Ala Tyr Leu Asp Ala 145 150 155 160 Phe Val Phe Ile Gly Gly Val Gly Ala Gln Tyr Gly Asp Thr Gly Arg 165 170 175 Trp Ile Phe Ala Ala Gly Ala Phe Ala Ala Ser Leu Ile Trp Phe Pro 180 185 190 Leu Val Gly Phe Gly Ala Ala Ala Leu Ser Arg Pro Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Lys Val Trp Arg Trp Ile Asn Val Val Val Ala Val Val Met Thr Ala 210 215 220 Leu Ala Ile Lys Leu Met Leu Met Gly 225 230 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 27 gcgcggtacc agctccagtt caggaagcac 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 28 gcgctctaga aaatggcctgt gcaactccc 30 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 29 gtcttacctc ggctggtggg ccag 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 30 cccctagttc aaggcttgtt aatc 24 <210> 31 <211> 39 <212> DNA 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【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドpK1の構築過程を示す図。

【図２】 プラスミドpSFK6の構築過程を示す図。

【図３】 プラスミドpSFKT2の構築過程を示す図。

【図４】 lysE搭載プラスミドplysEの構築の過程を示
す図。

【図５】 Ｌ−アルギニン生合成酵素遺伝子を搭載し、
argR遺伝子を含まないプラスミドpargCJBDFGH、及びlys
E及びＬ−アルギニン生合成酵素遺伝子を搭載したプラ
スミドpargCJBDFGH-Eの構築の過程を示す図。

【図６】 tacプロモーターを持つプラスミドpRStac、
及びpRStacにlysE遺伝子が挿入されたプラスミドpRSlys
Eの構築を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 郡司 義哉 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社内 (72)発明者 安枝 寿 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA71 CA01 CA06 DA05 DA06 DA10 EA04 FA10 FA13 FA15 FA17 GA14 GA19 4B064 AE24 CA02 CA19 CC24 DA01 DA10 4B065 AA22X AA22Y AA26X AA49Y AB01 AC01 AC10 AC14 BA02 BA03 BA25 CA17 CA41 CA44

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｌ−アルギニン生産能を有し、かつ、ｌ
   ｙｓＥ遺伝子の発現が増強されるように改変された微生
   物。
2. 【請求項２】 ｌｙｓＥ遺伝子の発現の増強が、ｌｙｓ
   Ｅ遺伝子のコピー数を高めること、又は前記細菌細胞内
   のｌｙｓＥ遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の
   発現調節配列を改変することによるものである請求項１
   記載の微生物。
3. 【請求項３】 さらに、アルギニンリプレッサーが正常
   に機能しないように改変されたことを特徴とする請求項
   １又は２に記載の微生物。
4. 【請求項４】 染色体上のアルギニンリプレッサーをコ
   ードする遺伝子が破壊されたことにより、アルギニンリ
   プレッサーが正常に機能しないことを特徴とする請求項
   ３記載の微生物。
5. 【請求項５】 さらに、細胞内のＬ−アルギニン生合成
   系酵素の活性が増強されるように改変された請求項１〜
   ４のいずれか一項に記載の微生物。
6. 【請求項６】 コリネ型細菌である請求項１〜５のいず
   れか一項に記載の微生物。
7. 【請求項７】 エシェリヒア属細菌である請求項１〜５
   のいずれか一項に記載の微生物。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか一項に記載の微
   生物を培地で培養し、培地中にＬ−アルギニンを生成蓄
   積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とする
   Ｌ−アルギニンの製造法。