CN1504577A

CN1504577A - L-蛋氨酸的生产工艺、氨基酰化酶菌株及氨基酰化酶

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Publication number: CN1504577A
Application number: CNA021537151A
Authority: CN
Inventors: 东魏; 魏东; 帕; 杨新平; 王炜; 崔卫东; 石玉瑚; 穆斯坦帕; 冯蕾; 张慧涛; 李晨华; 冯怀蓉
Original assignee: XINJIANG WEISHIDA BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: XINJIANG WEISHIDA BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2002-12-02
Filing date: 2002-12-02
Publication date: 2004-06-16
Anticipated expiration: 2022-12-02
Also published as: CN1279176C

Abstract

本发明涉及利用大肠杆菌基因工程菌(保藏号CGMCC.No.0368)的氨基酰化酶进行酶解反应，生成L－蛋氨酸的生产工艺。本发明还涉及该大肠杆菌氨基酰化酶菌株及其制备方法，及来源于该大肠杆菌基因工程菌的氨基酰化酶。本发明的L－蛋氨酸的生产工艺，其包括以N－乙酰－D，L－蛋氨酸为原料，该氨基酰化酶、培养菌体或该菌体处理物作为酶源，进行酶解反应步骤生成L－蛋氨酸。采用该方法制造的L－蛋氨酸可用作医药品及化妆品的组成原料，以及广泛作为食品和饲料中的重要添加物等。

Description

L-蛋氨酸的生产工艺、氨基酰化酶菌株及氨基酰化酶

技术领域：

本发明涉及一种L-蛋氨酸的生产工艺、氨基酰化酶菌株及其制备方法，及氨基酰化酶。具体的说，本发明涉及利用大肠杆菌氨基酰化酶酶解反应，生成L-蛋氨酸的生产工艺，大肠杆菌氨基酰化酶菌株及其制备方法，及氨基酰化酶。

背景技术：

氨基酸是构成生物体蛋白质的基本单位，是维持生命的基本物质，而L-蛋氨酸是含硫的“人体必需八种氨基酸”之一，对人类健康有着极其重要作用，已被广泛应用于医药卫生，食品添加剂、日用化妆品等领域。D，L-蛋氨酸(D，L-Met)的化学合成工艺技术十分成熟，生产成本较低，世界年产量可达20万吨以上。主要用于饲料添加剂，97年进口到岸价每吨4000美元左右，这有利于以D，L-蛋氨酸为原料，采用酶法拆分生产L-蛋氨酸。

采用酶法拆分生产L-蛋氨酸，其化学原理如图1所示，主要包括以下步骤：

1.酰化反应步骤：D，L-蛋氨酸和乙酸酐在水存在的条件下，70℃发生酰化反应生成N-乙酰-D，L-蛋氨酸。

2.酶解反应步骤：N-酰-D，L-蛋氨酸在钴离子参与下，经酰化酶特异的水解反应，水解N-乙酰-L-蛋氨酸N端的乙酰基，生成L-蛋氨酸，反应物中还剩下N-乙酰-D-蛋氨酸。

3.消旋反应步骤：N-乙酰-D-蛋氨酸和乙酸酐在70℃，乙酸存在的条件下发生消旋反应，生成等量的N-乙酰-D，L-蛋氨酸。

4.酶解反应步骤：同2，水解消旋后的N-乙酰-D，L-蛋氨酸。

5和6重复3和4的步骤。

由D，L-蛋氨酸经酶拆分生产L-蛋氨酸的酰化酶广泛存在于动植物和生物中，可实际应用的主要有猪胃的酰化酶I和米曲霉产生的酰化酶。前者因来源有限，不适用于大规模工业化生产，后者简称米曲酰化酶，因其是胞外酶，且可通过发酵法大量生产，所以适用于固定化酶技术。日本及其它国家均采用此酶进行生产。米曲酰化酶在提纯和固定化过程中，酶活损失大，酶的收率较低，制备成本高。早在1957年，日本的Tchiro和Chibata等对大肠杆菌酰化酶的性质进行过研究，但由于野生菌株产生的酶活力很低，不适用于工业化生产，并且，由于代谢途径等原因产生菌的高产菌株筛选十分困难，到目前为止国内外都不能用微生物发酵技术生产L-蛋氨酸。因此，至今日本等国仍主要采用米曲酰化酶进行生产，我国也有利用米曲酰化酶制备丙氨酸的研究报道。

发明内容

本发明克服了上述缺陷，提出了一种利用微生物发酵技术，采用高产大肠杆菌酰化酶，适用于工业化生产的L-蛋氨酸的生产工艺。

本发明同时提供了一种高产大肠杆菌菌株，其具有高效生成氨基酰化酶的能力。

本发明还提供了一种高产大肠杆菌菌株的制备方法。

本发明进一步提供了一种大肠杆菌氨基酰化酶。

本发明提供一种L-蛋氨酸的生产工艺，包括以N-乙酰-D，L-蛋氨酸为原料，以来源于大肠杆菌基因工程菌XW9707(保藏号CGMCC.No.0368)的氨基酰化酶为酶源，进行酶解反应步骤生成L-蛋氨酸。

本发明的N-乙酰-D，L-蛋氨酸可以使用本领域熟知的方法制备，例如通过酰化反应步骤：D，L-蛋氨酸和乙酸酐在水存在的条件下，70℃发生酰化反应生成N-乙酰-D，L-蛋氨酸。为了更好地提高L-蛋氨酸的产量，优选在温度60℃，真空度0.1P.M.。添加N-乙酰-D，L-蛋氨酸的浓度为25-100g/l。

作为酶源的酶可以为本发明的大肠杆菌基因工程菌XW9707培养物，培养菌体，菌体中提取的酶或该菌体处理物。优选培养菌体。更优选采用酰化酶工程菌固定化菌体细胞生产L-蛋氨酸。其中菌体中提取的酶可以为该菌体中提取得到的具有氨基酰化酶活性的酶，或该酶的精制标准的固化物。从菌体蓄积了很高的氨基酰化酶的微生物中，利用通常的酶分离、精制法能单独分离并精制出氨基酰化酶。例如，通过离心分离该微生物的培养液，收集培养液中的菌体，清洗该菌体后，再用超声波破碎机、压榨机、匀浆器、球磨机或有机溶剂等破碎菌体，得到无细胞提取液。再将无细胞提取液进行离心分离得到上清液，再用硫铵进行盐析，DEAE、琼脂糖等阴离子交换柱，分子筛凝胶过滤法，等电点电泳法等方法，可获得精制酶标准品。

作为菌株处理物，可举出有菌体干燥物，菌体冻结干燥物、菌体的表面活性剂处理物、菌体的酶处理物、菌体的超声波处理物、菌体的机械磨碎处理物、菌体的溶剂处理物、菌体的蛋白质分化物、菌体和菌体处理的固化物等。

本发明的生产工艺包括将从培养物中分离获得的具有很高氨基酰化酶活性的培养物，培养菌体，利用培养菌体、菌体中提取的酶或该菌体处理物用作酶源，在适宜酶反应的水性介质中，添加N-乙酰-D，L-蛋氨酸，水解生成蓄积L-蛋氨酸，再从该水性介质中提取L-蛋氨酸，照此可制得L-蛋氨酸。

作为水性介质，可举出有水、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐等缓冲液，甲醇、乙醇等醇类，醋酸酯、醋酸丁酯等酯类，丙酮等酮类，乙酰胺等酰胺类等。在氨基酰化酶制造中所获得的培养液，可用它的原液或稀释液，也可用作水性介质。

在酶作用的反应液中，其酶活性可根据底物量等来确定，通常为600-60000u/l，最好是3000-18000u/l。利用氨基酰化酶制备中获得的培养物时，要稀释1-10倍，最好稀释2-5倍后使用。

用NaOH调整pH值约为5.6-7.5，在10-54℃左右反应大约0.5-20小时。

反应结束后，用硫酸、盐酸等酸将水性介质的pH调整为5.0，通过离子交换柱吸附，洗脱，可从洗脱水性介质中回收L-蛋氨酸。

在本发明的一个优选实施例中，参见(实施例3)采用酰化酶工程菌固定化细胞生产L-蛋氨酸工艺技术，所述固定化酶解反应在酶柱中进行，所述酶柱的制备方法如下：菌体悬浊液中加入4-6倍等体积的3％海藻酸钠溶胶中搅拌均匀，再缓慢滴加入至0.2-0.7M氯化钙溶液中使之成凝固小球，并放置于0-4℃冰箱中过夜，除去氯化钙溶液，加水洗2-3次，然后将固定好的酶装入玻璃管中，做成酶柱。固定化细胞技术的使用省去了酰化酶的提纯、制备过程，酶的活力损失小，制备成本低。酶的半衰期在20天以上。此工艺技术较米曲酰化酶固定化酶技术生产氨基酸节约生产成本20-40％。在实验室利用此技术经数十批次试验，获得了以D，L-蛋氨酸为原料，采用固定化XW9707细胞技术酶拆分生产的L-蛋氨酸，经新疆药检所检测，全部指标符合日本和美国的药典规定标准，经二次酶拆分其L-蛋氨酸产率达70％以上。

将酶解反应后的N-乙酰-D-蛋氨酸溶液利用本发明的结晶法消旋生成等量的N-乙酰-D，L-蛋氨酸，方法如下：N-乙酰-D-蛋氨酸溶液用浓盐酸调pH约为1.5-2.5之间，优选2.0，然后真空浓缩至干，优选条件为P＝0.1p.m，t＝60℃。结晶法消旋工艺的采用，节省了大量的化工原料，并使消旋工艺中几步复杂过程简化为一个步骤，生产成本得到大幅度降低。

为了获得更高的产率，可以利用本发明的方法，重复进行酶解反应和消旋工艺步骤，经过两次酶解，其产率可达70％以上，经过三次酶解，产率可达75％以上。

通过本发明获得的溶液中的L-蛋氨酸可以通过本领域已知的方法获得，例如通过脱色，减压浓缩，结晶等步骤获得。采用本发明的方法制造的L-蛋氨酸制剂可用作医药品及化妆品的组成原料，以及作为食品和饲料中的添加物等。

据测算，按照本发明的方法以D，L-蛋氨酸为原料，利用酶拆分生产L-蛋氨酸，每吨成本3万美元左右，而1996-1997年日本进口L-蛋氨酸到岸价(不包括关税)8.9-9.5万美元/吨，以8万美元计，每吨纯利5万美元，而且可节约大量外汇，社会和经济效益十分可观。

另一方面，本发明同时提供了一种氨基酰化酶高产菌株XW9707，已于申请日前保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080。保藏日期为1998年11月20日，保藏号是CGMCC.No.0368，其生产酰化酶可达100-200u/ml，最高可达500u/ml，是原始菌株酰化酶酶活的10-20倍。在本发明的一个优选实施方案中，利用酰化酶工程菌固定化细胞生产L-蛋氨酸，此工艺技术较米曲酰化酶固定化酶技术生产氨基酸节约生产成本30％以上。

该高产氨基酰化酶菌株是利用基因重组技术获得，氨基酰化酶的具体遗传特性参见附图。

根据本发明提供制造L-蛋氨酸的方法，在培养基中培养具有生成氨基酰化酶能力的埃希氏大肠杆菌，在培养基中添加琥珀酸，使培养基中生成并积累氨基酰化酶。

作为本发明的微生物培养基，可含有微生物所需的碳源、氮源、无机盐类、抗生素等，只要该微生物能良好地生长，可使用天然培养基、合成培养基中的任何一种。

作为碳源，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉分解物等碳水化合物，醋酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、丙酸等有机酸，乙醇、丙三醇、丙醇等醇类。

作为氮源，可使用氨、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等各种无机酸和有机酸的铵盐，胺类、其它含氮化合物及胨、肉的提取物，酵母提取物，玉米淀粉，酪蛋白水分解物，大豆粕及大豆粕水分解物，各种发酵菌体及它的消化物等。

作为其它营养元素，可使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、磷酸镁、氯化钠、硫酸亚铁等。

培养温度为20-40℃，最好是30℃-37℃。培养基的pH为5-9，最好是PH6-8。培养基的PH调整可利用无机或有机酸碱溶液、氨、PH缓冲液等。通常在正常条件培养10-24小时，就能在菌体积累很高的氨基酰化酶。

本发明还提供一种氨基酰化酶高产菌株XW9707的制备方法。为使本发明的埃希氏大肠杆菌高产氨基酰化酶，使用琥珀酸作为营养源，在应用基因重组获得高产氨基酰化酶菌株中，为保持重组菌株的稳定性，使用向培养基中添加抗生物质，例如氨苄青霉素的方法。

本发明进一步提供一种氨基酰化酶，其来源于大肠杆菌基因工程菌XW9707(保藏号CGMCC.No.0368)，其可以为从该菌体中提取得到的具有氨基酰化酶活性的酶，或该酶的精制标准的固化物。从菌体蓄积了很高的氨基酰化酶的微生物中，利用通常的酶分离、精制法能单独分离并精制出氨基酰化酶。例如，通过离心分离该微生物的培养液，收集培养液中的菌体，清洗该菌体后，再用超声波破碎机、压榨机、匀浆器、球磨机或有机溶剂等破碎菌体，得到无细胞提取液。再将无细胞提取液进行离心分离得到上清液，再用硫铵进行盐析，DEAE、琼脂糖等阴离子交换柱，分子筛凝胶过滤法，等电点电泳法等方法，可获得精制酶标准品。酶特征：分子量55000，等电点5.31，KM值0.08，最适温度65℃。

附图说明：

图1显示L-蛋氨酸生产的化学原理图。

图2显示L-蛋氨酸生产工艺流程图。

图3显示制取氨基酰化酶高活性菌体工艺流程图。

图4显示氨基酰化酶菌株的遗传特性。

具体实施方式：

实施例1、氨基酰化酶的制备

(一)高活性氨基酰化酶的制备

1.本发明的基因工程菌种XW9707的遗传特性：

生物素、琥珀酸钠双重缺陷型，氨苄青霉素抗性(Apri)，带有pALM118质粒，携带Arg^-L基因。

2.培养基的配伍。

1号琼脂培养基

2号细菌培养基

成份与培养基1相同，但不需琼脂。氨苄青霉素的最后浓度为0.05g/l。

3)钠钾磷酸缓冲液

1摩尔KH₂PO₄ pH＝6.8-7.0

用10摩尔NaOH溶液调pH值。

4)硼酸缓冲液

0.1摩尔H₃BO₃ pH＝9.7。

5)氯化钴溶液

将0.02摩尔CoCl₂溶于蒸馏水。

6号酶悬浮缓冲液

钠钾磷缓冲液 0.1摩尔

二硫苏糖醇(DTT) 1毫摩尔

Pheuylmethylsulfonyl fluoride(PMSF) 1毫摩尔

CoCl₂ 0.1毫摩尔，pH＝6.8-7.0。

7号反应混合液(RM)

N-Ac D，L-Met 0.06摩尔

钠钾磷酸缓冲液 0.05摩尔

CoCl₂ 0.1毫摩尔，pH＝6.8-7.0

8号邻苯二甲醛试剂(OPA)

60毫升硼酸缓冲液

5微升甲硫醇

10毫克邻苯二甲醛(溶剂为乙醇)

注：OPA试剂需当日配制。

9号三氯乙酸试剂(TCA)

将30％三氯乙酸溶于水。

3.筛选方法如下：

如图3所示，基因工程菌种XW9707保存在1号培养斜面上；平时保藏在1号培养斜面上，上敷一层石蜡油或凡士林，置于琼脂柱中。在发酵前，先准备好酰化氨基酸水解酶的有活力的斜面菌种。制备方法如图3所示，先挑20-25个菌落，再接种到另一个装有培养基1的干净的培养皿上。用酰化氨基酸水解酶活力质量分析法从这40-50个菌落中选出4-6个最有活性的菌种。

酰化氨基酸水解酶的活力的质量分析照下面方法进行。拿个干净的培养皿，每个皿中放两张滤纸，其中放在下面的滤纸用甲苯浸过，上面的滤纸用7号反应混合液浸过。用接种针在皿中按标线点20-22个点，在另一个皿中点同样的20-22个点，加盖，在37℃温箱中培养30分钟。将皿中上面一层有菌落印迹的滤纸在50-60℃条件下烘干，用茚三酮显色，如果酶有活力，那么在菌落周围会显紫色。为做进一步验证，选出那些在两个皿中点同样大的菌，将这些菌接种到斜面2上，进一步测试它们的活性。为分析酰化氨基酸水解酶酶活的单位，将从两个皿中筛选出的菌在两个摇瓶中发酵。先给500毫升瓶中加入100-125毫升2号细菌培养基并接种。在37-38℃条件下培养18-20小时，转速120转/分钟，然后离心沉淀，将不沉淀液体分离后，用60毫升6号缓冲液将250毫升酶溶解为悬浮液。

酶活不低于5000单位/毫升的菌种可看作是有活力的。

这样的菌种可用于制取生产用的酰化氨基酸水解酶。在4℃条件下这种斜面可保持1-2月的活性，用这种斜面第一次、第二次接种得到的菌也同样有活性。但活性随接种次数的增加而逐渐降低。斜面在两次接种后，需按上面所讲方法重新筛选有活性的菌种。

4.高活性酶的制取和保存

高活性酶在3所讲述的条件下，用实验室摇瓶生产。酶活可达150000单位/升以上。在上述保存条件下一周后酶活为初始酶活的80-90％。

5.酶的激活

激活酶采用甲苯处理的方法。甲苯与酶液的比例为2∶100。加入甲苯后，旋涡搅拌1-2分钟。

(二)氨基酰化酶的扩增和活性测定

将CGMCC.No.0368菌株移植到母种培养基中(葡萄糖0.3％，琥珀酸钠0.3％，KH₂PO₄0.3％，Na₂HPO₄0.6％，NaCl0.05，NH₄Cl0.1，MgSO₄0.025％，VB10.001％，氨苄青霉素0.01％)，37℃下供氧振荡培养16小时。再将50ml获得的种子培养液移植到5l培养基(葡萄糖0.6％，琥珀酸钠0.6％，KH₂PO₄0.3％，Na₂HPO₄0.6％，NaCl0.05，NH₄Cl0.1，MgSO₄0.025％，VB10.001％，氨苄青霉素0.01％)的7升小型发酵罐内，于37℃下，以每分钟484转进行搅拌培养。在培养过程中，保持5升/分的通气量。在培养基中葡萄糖消耗完时结束培养。测定所得菌体的氨基酰化酶活性。测得氨基酰化酶活性不低于6000u/g菌体可认为是可以实际应用。上述氨基酰化酶的活性按如下步骤进行测试：

将被检测液加入到含N-乙酰-D，L-蛋氨酸(10g/l)、CoCl₂(0.1mM)、磷酸缓冲液(0.05M，pH6.8-7.0)的水溶液中，37℃下酶解5分钟。用邻苯二甲醛比色法定量测定产生的L-蛋氨酸。将1小时内生成1μmol的L-蛋氨酸的活性，以1(u)单位表示，方法如下：

在两个试管中各加入0.5毫升7号反应混合液。第一个试管加入0.01毫升酶液，放入37℃恒温箱中；第二个试管作为对照，立即加入0.1毫升9号TCA溶液。第一个试管加热5分钟后，然后加入0.1毫升TCA，使反应中止。给第二个试管中加入0.01毫升经甲苯处理过的菌液。

反应停止后，给两个空试管中各加入1.25毫升H₂O、0.03毫升试管1或试管2中的溶液及1.25毫升8号OPA试剂，剧烈搅拌后，于室温下放置5-6分钟。5-6分钟后取空白(只需加水和8号试剂)和含有已知浓度蛋氨酸(如0.01毫升1克/升蛋氨酸和0.01毫升22克/升蛋氨酸)的样品在波长340nm比色测定。1毫升经甲苯处理后的菌液的酶活用下列公式计算：

其中：D₁₃₄₀为处理样的OD值；

D₂₃₄₀为对照样的OD值；

2.53为被测混合液的体积数，单位：毫升；

60为分钟与小时的转换系数；

∑为与样品一同检测的蛋氨酸的克分子吸收数(在上述反应

中为1毫摩尔蛋氨酸)；

5为反应时间，单位：分钟；

0.000492为2.53毫升被测液中酶液的量，单位：毫升。

实施例2、L-蛋氨酸的生成反应

将实施例1中获得的CGMCC.No.0368株的培养物用甲苯(2％)处理30分钟以上后可以获得激活的氨基酰化酶，在1升反应液中添加1000单位菌株处理物或氨基酰化酶，50g N-乙酰-D，L-蛋氨酸，加入氢氧化钠调整pH为6.5。充分搅拌该反应液，在37℃条件下，进行酶解反应。酶解时间控制在酶解液中L-蛋氨酸的含量不再增加为止，大约需要12-16小时。离心除去水不溶物，然后在减压下浓缩使之为原体积的1/20(50ml)。用等体积(50ml)冷的无水乙醇加入浓缩液中并将所得混合液在4℃条件下放置过夜。过滤收集析出的结晶并干燥之，得到18g L-蛋氨酸，其熔点为280至281℃，[α]^D ₂₅＝-24.3°(c＝1，6NHCl)。根据具体实验中生成蛋氨酸需要确定酶解次数。

实施例3、L-蛋氨酸的生成反应

将实施例1中获得的培养液进行离心，得到菌体。将该菌体在磷酸缓冲液(0.1M磷酸钾、钠，pH6.8)中进行悬浮。利用超声波或2％的甲苯处理悬浊液，以激活酶的活性。然后将激活的悬浊液加入5倍等体积的3％海藻酸钠溶胶中搅拌均匀，再缓慢滴加入至0.5M氯化钙溶液中使之成凝固小球，并放置于4℃冰箱中过夜，除去氯化钙溶液，加水洗2-3次，然后将固定好的酶装入玻璃管中，做成酶柱。再在37℃下将N-乙酰-D，L-蛋氨酸溶液(50g/l用氢氧化钠调整pH6.5)通过酶柱，得到20g/l的L-蛋氨酸溶液。然后减压浓缩至原体积的1/20，再加入等体积的无水乙醇并混匀，将所得混合液在4℃下过滤。过滤收集析出的结晶并烘干，得到17.8g L-蛋氨酸结晶，回收率为89％。

实施例4、L-蛋氨酸生产工艺

流程图参见附图2。

1.合成N-乙酰-D，L-蛋氨酸：

容积为1升的三颈瓶(一边装冷凝管，一边装温度计)中加入200克D，L-蛋氨酸(D，L-蛋氨酸的含量不低于96％)(1.28摩尔)，0.34升蒸馏水，在50℃下充分搅拌，搅拌状态下滴加0.24升(2.5摩尔)乙酸酐，在70℃下搅拌反应2小时。

反应进程用薄板层析法观察。展层剂为正丁醇∶H₂O∶乙酸＝3∶1∶1；显色用茚三酮显色法；层析板用二氧化硅层析板(SiO₂)。蛋氨酸浓度随反应的进行不断减少。加入乙酸酐2小时后，反应液中蛋氨酸浓度应＜10克/升，酰化产率97％，反应液共0.58升。第1步酰化的产率为理论值的94-97％。

2.浓缩N-乙酰-D，L-蛋氨酸溶液

将第1步的0.58升浓缩(真空度0.1p.m，温度60℃)至稠状物。在稠状物中加入少许水并蒸干，重复两次(去除乙酸酐)。最后一次蒸干的稠状物中加入1.5升水。第2步产率为99％(仅有机械性损失)。

3.用阳离子树脂吸附未反应的D，L-蛋氨酸

将上一步得到的1.7升溶液过装有0.5升强酸性732阳离子树脂的离子交换柱，方向为自上而下，流速0.5-0.7升/小时。待溶液过完柱后，再加0.5升水过柱，获得下柱流出液2升。

用层析法观察吸附情况，分析法同第1步。收集的溶液中蛋氨酸的含量不超过0.1％。

注：离子交换柱可多次使用。树脂饱含氨基酸时，用8％氨水洗脱，蒸发浓缩，将得到的D，L-蛋氨酸投入第1步。

4.酶解N-乙酰-D，L-蛋氨酸

第3步的2升N-乙酰-D，L-蛋氨酸溶液用10摩尔NaOH中和到pH＝6.8，加入蒸馏水至体积为5升；然后加入25毫升0.02摩尔氯化钴溶液和经甲苯处理过的酶液(其中含有133000单位活性酰基转移酶)。反应12-14小时，待蛋氨酸浓度稳定后中止反应。加入乙酸将pH调至4-4.5。

反应液为5.2升，蛋氨酸浓度15-16克/升(计80.5克)，为初始反应溶液N-乙酰-L-蛋氨酸量的87％。

5.L-蛋氨酸的吸附与解吸：

将第4步得到的5.2升溶液以0.8升/小时的速度自上而下过装有732树脂的离子交换柱(树脂量1.8升)。根据流出液中蛋氨酸的含量检查吸附的情况。待全部溶液过完后，再用1升水过柱，得到的6.2升流出液(蛋氨酸浓度小于0.1克/升)投入5-1步。随后用蒸馏水洗柱，直至流出液pH＝6-7；再用1.5升8％氨水洗脱吸附的L-蛋氨酸。氨水过柱后，用蒸馏水洗树脂至流出液pH＝7-8。收集的洗脱液1.2升(L-蛋氨酸浓度不超过6-7克/升)投入第6步。

第5步的产率为94-96％。

6.浓缩L-蛋氨酸溶液

将1.2升洗脱液真空浓缩(p＝0.1p.m.，t＝50℃)。赶氨完毕后，将浓缩液0.4升L-蛋氨酸溶液转入第7步。第6步的产率为99％(仅为机械性损失)。

7.脱色

在0.4升L-蛋氨酸溶液中加水至2升。然后加50克活性炭，在50℃下搅拌0.5小时，将混合物投入第8步。

8.抽滤

将混合液用滤纸真空抽滤。用200ml热水洗抽滤漏斗上的炭。滤液2.2升投入第9步。

产率为97-98％。

9.超滤

将上一步的2.2升L-蛋氨酸溶液用0.22微米的微孔滤膜真空抽滤。抽完后用100毫升水洗滤膜。得到2.3升滤液。第9步产率为99％(仅有机械性损失)。

10.浓缩

将2.3升滤液真空浓缩(p＝0.1p.m，t＝50℃)至0.6升。

第10步产率为99％(机械性损失)。

11、12.结晶和分离结晶

将0.6升悬浮液加入等体积乙醇，在5-10℃下放置6-12小时。真空抽滤(P＝0.1p.m，用玻璃漏斗)，得到75克L-蛋氨酸的晶体。两步产率为80％。

真空浓缩(P＝0.1p.m，t＝50℃)母液，使乙醇蒸发；余下溶液中L-蛋氨酸含量为蒸发前溶液的20％，将其转入第七步。

13.烘干：

将湿晶体置于真空干燥箱中烘干，温度50℃，气压P＝0.08Mpa，烘干4-6小时。产率99％(机械性损失)。

5-1.浓缩和消旋N-乙酰-D-蛋氨酸溶液

将第5步的6.2升N-乙酰-D-蛋氨酸溶液用浓盐酸调pH＝2.0，然后真空浓缩(P＝0.1p.m，t＝60℃)至干。

将得到的固体投入5-2步。

产率为99％(机械性损失)。

5-2.洗涤：

将固体用少量水洗涤，收集滤液投入5-1步。

收集固体，加蒸馏水至1.4升，用10摩尔NaOH调pH＝6-6.5。将此溶液投入第4步中再次酶解。

三次酶解后，L-蛋氨酸的总产量为150克，产率为75％。

上述步骤4优选通过固定化菌体细胞的形式，具体方法如下：酶解N-乙酰-D，L-蛋氨酸用10摩尔NaOH调节pH＝6.8，加入蒸馏水至5升，再加入25毫升0.02摩尔氯化钴溶液。在37℃下，以0.5升/小时的流速自下而上过酶柱(酶柱体积0.8升，含133000单位活性酰基转移酶)。

流出液蛋氨酸浓度15-16克/升。

注：酶柱使用半衰期20天。其中，酶的固定化方法参见实施例3。

Claims

1.一种L-蛋氨酸的生产工艺，其包括以N-乙酰-D，L-蛋氨酸为原料，以来源于大肠杆菌基因工程菌(CGMCC.No.0368)的氨基酰化酶进行酶解反应步骤。

2.如权利要求1所述的L-蛋氨酸的生产工艺，其进一步包括将酶解反应步骤中剩余的N-乙酰-D-蛋氨酸进行结晶消旋反应：将N-乙酰-D-蛋氨酸溶液调pH＝1.5-2.5，然后真空浓缩至干。

3.如权利要求1或2所述的生产工艺，其特征在于酶解反应步骤采用固定化细胞，包括N-乙酰-D，L-蛋氨酸在钴离子参与下，在水性介质中，通过含有氨基酰化酶的固定化菌体细胞酶解过程，生成L-蛋氨酸，酶解时间控制在酶解液中L-蛋氨酸的含量不再增加为止。

4.如权利要求3所述的生产工艺，其特征在于所述固定化酶解反应在酶柱中进行，所述酶柱填充物由菌体悬浊液与3％海藻酸钠溶胶经氯化钙溶液固化而成。

5.如权利要求4所述的生产工艺，其特征在于酶解反应步骤中酶活性为600-60000u/l。

6.如权利要求5所述的生产工艺，其特征在于酶解反应步骤中pH值为5.6-7.5，在10-54℃下反应进行0.5-20小时。

7.如权利要求6所述的生产工艺，其特征在于酶解反应步骤中钴离子的终浓度为5×10^-5-1.5×10^-4摩尔。

8.如权利要求1或2所述的生产工艺，其特征在于酶解反应步骤采用酶活为600-60000u/l氨基酰化酶或菌株处理物。

9.如权利要求8所述的生产工艺，其中氨基酰化酶为该菌体中提取得到的具有氨基酰化酶活性的酶，或该酶的精制标准的固化物；菌株处理物包括菌体干燥物，菌体冻结干燥物、菌体的表面活性剂处理物、菌体的酶处理物、菌体的超声波处理物、菌体的机械磨碎处理物、菌体的溶剂处理物、菌体的蛋白质分化物、菌体和菌体处理的固化物。

10.如权利要求1或2所述的生产工艺，其特征在于在酶解反应前大肠杆菌氨基酰化酶经2％甲苯激活，其激活在30分钟以上。

11.一种具有生成氨基酰化酶的能力大肠杆菌基因工程菌(CGMCC.No.0368)。

12.一种权利要求11所述的大肠杆菌基因工程菌的制备方法，其特征在于培养所述基因工程菌时添加硫辛酸，琥珀酸和氨苄青霉素。

13.一种氨基酰化酶，其来源于权利要求12所述的大肠杆菌基因工程菌。