CN113853429B - 产生嘌呤核苷酸的微生物以及使用其产生嘌呤核苷酸的方法 - Google Patents

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提供了产生嘌呤核苷酸的棒杆菌属的微生物，以及使用所述微生物产生嘌呤核苷酸的方法。

Description

产生嘌呤核苷酸的微生物以及使用其产生嘌呤核苷酸的方法
发明背景
1.发明领域
本公开涉及产生嘌呤核苷酸的棒杆菌属的微生物，以及使用所述微生物产生嘌呤核苷酸的方法。
2.相关技术的描述
嘌呤核苷酸，例如5'-肌苷一磷酸(下文中称为IMP)、5'-黄苷一磷酸(下文中称为XMP)和5'-鸟苷一磷酸(下文中称为GMP)(其为核酸生物合成代谢系统的中间体)，在机体中具有重要的生理作用，并且被广泛用于食品、药品等中。具体地，已知IMP本身赋予牛肉风味，而已知衍生自XMP的GMP赋予蘑菇风味。已知两种材料均增强谷氨酸一钠(MSG)的味道强度，且因此已经作为一种富含风味的基于核酸的调味品引起广泛的关注。
作为嘌呤核苷酸的组分的磷酸，提供微生物生长所必需的能量，并且对于细胞膜的磷脂、核酸和蛋白的生物合成至关重要。它在细胞信号传导过程中也具有主要作用。
磷酸主要以无机正磷酸(下文中称为Pi)的形式吸收至细胞中。Pi流入微生物取决于细胞膜中存在的输入蛋白的功能。先前已知的Pi输入蛋白包括Pst系统，其为高亲和力的Pi输入蛋白系统，并且其表达通过识别细胞外Pi浓度来调节；Pit系统，无论Pi浓度如何，其都表达，并以与金属离子混合的形式引入Pi；以及反向转运蛋白转运系统，其引入以有机磷酸的形式的甘油-3-磷酸和葡萄糖-6-磷酸等。
已经报道了通过控制Pi输入蛋白系统中的Pst系统而在氨基酸生产中使用的几种类型的方法(PCT专利号WO 2015-050276和WO 2003-008607)，但Pst系统的影响根据待使用的微生物或期望的产物而不同。
本发明人发现关键组分磷酸的流入在通过微生物发酵产生嘌呤核苷酸期间是重要的。因此，本发明人证明可以通过控制微生物中磷酸输入蛋白的表达水平来提高嘌呤核苷酸的产生，由此完成本公开。
发明概述
本公开的一个目标是提供产生嘌呤核苷酸的棒杆菌属的微生物，其中磷酸输入蛋白的活性增强。
本公开的另一个目标是提供产生嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：在培养基中培养产生嘌呤核苷酸的棒杆菌属的微生物，其中磷酸输入蛋白的活性增强。
优选实施方案的详述以下将详细描述本公开。同时，本公开中公开的每个描述和实施方案也可以应用于其他描述和实施方案。即，本公开中公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。进一步，本公开的范围不受以下描述的具体描述的限制。
为了实现上述目标，本公开的一个方面提供了产生嘌呤核苷酸的棒杆菌属的微生物，其中磷酸输入蛋白的活性增强。
如本文所用，术语“磷酸输入蛋白”是指在磷酸的细胞内摄取中具有作用的蛋白。磷酸主要以无机正磷酸盐(下文中称为Pi)的形式吸收至细胞中，并且已知其依赖于细胞膜中存在的输入蛋白的功能。具体地，先前已知的Pi输入蛋白包括Pst系统、Pit系统和反向转运蛋白转运系统，其引入以有机磷酸的形式的甘油-3-磷酸和葡萄糖-6-磷酸等，但不限于此。
关于本公开的目的，磷酸输入蛋白可以是Pst系统，但不限于此。
如本文所用，术语“Pst系统”是指磷酸腺苷三磷酸-结合盒转运系统，其为磷酸输入蛋白，即Pi输入蛋白，并且对Pi具有高亲和力。已知Pst系统由pst操纵子表达，所述pst操纵子由以下组成：磷酸结合蛋白(下文中称为PstS)，磷酸腺苷三磷酸-结合盒转运蛋白的内膜亚基(磷酸ATP-结合盒转运蛋白；下文中称为PstC)，磷酸腺苷三磷酸-结合盒转运蛋白的通透酶蛋白(磷酸ATP-结合盒转运蛋白；下文中称为PstA)，和磷酸腺苷三磷酸–结合盒转运蛋白的腺苷三磷酸-结合蛋白(ATP-结合蛋白)(磷酸ABC转运蛋白；下文中称为PstB；Aguena等人，2002)。具体地，已知PstS通过识别细胞外Pi浓度而在Pi的细胞内摄取中具有作用(Surin等人，2002)，PstC和PstA(其为跨膜蛋白)被用作Pi通过其移动进入细胞的途径，并且PstB结合腺苷三磷酸以获得Pi摄取的能量(Webb等人,1992；Chan和Torriani,1996)。已经报道，当Pi的细胞外浓度丰富时，pst操纵子仍然被抑制，而当Pi的细胞外浓度低在微摩尔(μM)水平或以下时，其表达增强(Surin等人,1985；Magota K等人,1982)。
在本公开中，PstS可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，PstC可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，PstA可以包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，且PstB可以包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。具体地，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7可以各自是具有由pstS、pstC、pstA或pstB基因编码的PstS、PstC、PstA或PstB的活性的蛋白序列。SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列可以获得自NCBIGenBank，其为公共数据库。例如，氨基酸序列可以源自停滞棒杆菌(Corynebacteriumstationis)，但不限于此，并且可以包含具有与上述氨基酸序列相同的活性的任何序列而没有限制。另外，尽管本公开的具有PstS、PstC、PstA或PstB的活性的蛋白被定义为包含SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的蛋白，但不排除在SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的上游或下游添加无意义的序列，天然存在的突变或其中的沉默突变，并且对于本领域技术人员而言将显而易见的是，只要蛋白具有与包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的蛋白的活性相同或对应的活性，其就可以属于本公开的具有PstS、PstC、PstA或PstB活性的蛋白。具体地，本公开的具有PstS、PstC、PstA或PstB的活性的蛋白可以是由SEQID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与其具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高同源性或同一性的氨基酸序列组成的蛋白。还将显而易见的是，具有在序列的部分中具有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白也可以被包括在本公开的蛋白的范围内，只要所述氨基酸序列具有这种同源性或同一性，并表现出与所述蛋白的效力对应的效力。
换句话说，尽管在本公开中被描述为“具有特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白或多肽”或“包含特定SEQ ID NO的氨基酸序列的蛋白或多肽”，但显而易见的是在本公开中还可以使用具有在序列的部分中具有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白，只要所述蛋白可以具有与由对应的SEQ ID NO的氨基酸序列组成的多肽的活性相同或对应的活性。例如，显而易见的是，任何多肽都可以属于“由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽”，只要其具有与“由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽”的活性相同或对应的活性。
在本公开中，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列可以例如分别由包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的核苷酸序列的多核苷酸编码。
如本文所用，术语“多核苷酸”(其是指通过经由共价键连接核苷酸单体而形成的核苷酸的长链聚合物)是指具有预定长度或更长的DNA或RNA链。在本公开中，所述多核苷酸可以编码表现出分别具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的PstS、PstC、PstA或PstB的活性的多肽，但不限于此。
所述多核苷酸可以包含任何多核苷酸而没有限制，只要其为编码根据本公开的具有PstS、PstC、PstA或PstB的活性的多肽的多核苷酸。在本公开中，编码PstS、PstC、PstA或PstB的氨基酸序列的基因可以分别是pstS、pstC、pstA或pstB基因，并且，所述基因可以源自停滞棒杆菌，但不限于此。
具体地，编码具有PstS、PstC、PstA或PstB的活性的多肽的多核苷酸可以包含编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的核苷酸序列。由于密码子简并性或考虑到其中待表达多肽的生物体中优选的密码子，多核苷酸可以经历编码区中的各种修饰而不改变多肽的氨基酸序列。所述多核苷酸可以包含例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的核苷酸序列，并且可以包含与其具有80％、特别是90％或更高同源性的核苷酸序列，但不限于此。
进一步，可以包括可以由已知基因序列、例如在严格条件下与和所述多核苷酸序列的全部或部分互补的序列杂交以编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:7的氨基酸序列的任何多核苷酸序列制备的探针，但不限于此。“严格条件”是指允许多核苷酸之间的特异性杂交的条件。此类条件在文献(例如，J.Sambrook等人,同上)中详细描述。例如，严格条件可以包括这样的条件，在所述条件下，具有高同源性或同一性的基因、具有40％或更高、特别是90％或更高、更特别是95％或更高、更加特别是97％或更高且尤其特别是99％或更高同源性或同一性的基因彼此杂交，而同源性或同一性低于上述同源性或同一性的基因彼此不杂交；或可以包括Southern杂交的常规洗涤条件，即在对应于60℃、1ХSSC、0.1％SDS，特别是60℃、0.1ХSSC、0.1％SDS，和更特别地68℃、0.1ХSSC、0.1％SSD的盐浓度和温度下洗涤一次，特别是两次或三次。
杂交需要两个多核苷酸具有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。术语“互补”用于描述可以彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可以包括与整个序列互补的分离的多核苷酸片段以及与其实质上相似的多核苷酸序列。
具体地，可以在上述条件下使用包括在55℃的Tm值下的杂交步骤的杂交条件来检测具有同源性或同一性的多核苷酸。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以根据其目的由本领域技术人员适当地控制。
用于杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补性程度，并且这些变量是本领域众所周知的(参见Sambrook等人,同上,9.50–9.51,11.7–11.8)。
如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指在两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关性程度，并且可以表示为百分比。术语“同源性”或“同一性”经常可以彼此可互换使用。
保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且可以与通过所使用的程序建立的默认空位罚分一起使用。基本上，通常期望同源或相同的序列在中等或高度严格的条件下与序列全长的全部或至少约50％、约60％、约70％、约80％或约90％或更多杂交。也可以考虑含有简并密码子而不是杂交多核苷酸中的密码子的多核苷酸。
任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以通过已知的计算机算法(诸如“FASTA”程序)使用默认参数如Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444中进行确定。或者，其可以通过Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443–453)确定，所述Needleman-Wunsch算法使用EMBOSS软件包的Needleman程序(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276–277)(5.0.0版或后来的版本)(GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人,J MOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide to HugeComputers,Martin J.Bishop,编,Academic Press,San Diego,1994,和CARILLO等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)执行。例如，同源性、相似性或同一性可以使用国家生物技术信息中心的BLAST或ClustalW来确定。
多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通过使用例如GAP计算机程序、诸如Needleman等人(1970),J Mol Biol.48:443、如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中所公开比较序列信息来确定。总之，GAP程序将此定义为通过将相似性比对的符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短者中的符号总数而获得的值。GAP程序的默认参数可以包括(1)Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14:6745的二进制比较矩阵(对于同一性，含有1的值，且对于非同一性，含有0的值)和加权比较矩阵(或EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵)，如Schwartz和Dayhoff,编,Atlas Of Protein SequenceAnd Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353–358(1979)中所公开；(2)每个空位的罚分是3.0，且每个空位中的每个符号额外罚分0.10(或空位开放罚分是10，且空位延伸罚分是0.5)；和(3)末端空位没有罚分。
进一步，任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以通过在限定的严格条件下经由Southern杂交实验比较序列来确定，并且待限定的适当的杂交条件可以经由本领域技术人员已知的本公开的范围内的方法来确定(例如，J.Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratorypress,Cold Spring Harbor,New York,1989；F.M.Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,New York)。
在本公开中，磷酸输入蛋白系统的活性的增强可以是由选自pstS、pstC、pstA和pstB的任何一种或多种基因编码的蛋白的活性的增强，但不限于此。
由pstS基因编码的蛋白可以包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但不限于此。
由pstC基因编码的蛋白可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，但不限于此。
由pstA基因编码的蛋白可以包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，但不限于此。
由pstB基因编码的蛋白可以包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，但不限于此。
如本文所用，术语“蛋白活性的增强”意味着与其内源活性相比，蛋白活性增加。“内源活性”是指当通过由于天然或人工因素导致的遗传变异转化微生物时，转化前的亲本菌株或未修饰微生物最初具有的特定蛋白的活性。内源活性也可以与“修饰前的活性”互换使用。与内源性活性相比，术语蛋白活性的“增加”意味着，与转化前的亲本菌株或未修饰微生物最初具有的特定蛋白的活性相比，蛋白的活性增强。
“活性的增加”可以通过引入外源蛋白或增强内源蛋白的活性来实现，但其可以通过增强内源蛋白的活性来具体地实现。蛋白的活性是否增强可以从相应蛋白的活性或表达水平或由相应蛋白产生的产物的量的增加来确定。
在本公开中，待作为活性增强的靶标的蛋白，即靶蛋白，可以是磷酸输入蛋白，特别是Pst系统，并且更特别是选自PstS、PstC、PstA和PstB的任何一种或多种，但不限于此。关于本公开的目标，待作为活性增强的靶标的磷酸输入蛋白可以是选自以下的任何一种或多种：i)PstS，ii)PstC，或iii)PstS和PstC的组合，并且除此以外还可以进一步包括PstA或PstB，但不限于此。
进一步，在本公开中，由相应蛋白产生的产物可以是嘌呤核苷酸，但不限于此。
可以将本领域众所周知的各种方法应用于蛋白的活性增强，并且所述方法不受限制，只要与修饰前的微生物的靶蛋白的活性相比，它们可以增强靶蛋白的活性即可。所述方法可以是但不限于使用基因工程改造或蛋白工程改造的方法。
使用基因工程改造增强蛋白活性的方法可以例如通过以下方法进行：
1)增加编码该蛋白的基因的细胞内拷贝数的方法，
2)用具有强活性的序列替换染色体上编码该蛋白的基因的表达调节序列的方法，
3)修饰该蛋白的起始密码子或5'-UTR区域的核苷酸序列的方法，
4)修饰染色体上的多核苷酸序列以增强蛋白的活性的方法，
5)引入具有蛋白的活性的外源多核苷酸或所述多核苷酸的密码子优化的变体多核苷酸的方法，或
6)所述方法的组合，但不限于此。
使用蛋白工程改造来增强蛋白活性的方法可以例如经由以下方法进行：分析蛋白的三级结构以选择暴露的位点，且然后对其进行修饰或化学修饰，但不限于此。
1)编码蛋白的基因的细胞内拷贝数的增加可以经由本领域已知的任何方法来进行，例如，通过将载体引入宿主细胞，其中该载体可操作地连接至编码相应蛋白的基因，并且可以复制和发挥功能，而与宿主无关；或通过将载体引入宿主细胞中，其中所述载体可操作地连接所述基因并且可以将基因整合至宿主细胞的染色体中，但不限于此。
如本文所用，术语“载体”是指这样的DNA构建体，其含有编码靶蛋白的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列可操作地连接至合适的调节序列，从而能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白。所述表达调节序列可以包括能够起始转录的启动子，用于调节转录的任何操纵子序列，编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和用于调节转录和翻译的终止的序列。一旦转化至适当的宿主细胞中，所述载体可以独立于宿主基因组复制或发挥功能，或者可以整合至其基因组中。
本公开中使用的载体没有特别限制，只要其可以在宿主细胞中复制。可以使用本领域已知的任何载体。常用载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和细菌噬菌体。例如，pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等可用作噬菌体载体或粘粒载体。基于pDZ、pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的载体可用作质粒载体。在本公开中适用的载体没有特别限制，并且可以使用已知的表达载体。
如本文所用，术语“转化”意指将包含编码靶蛋白的多核苷酸的重组载体引入宿主细胞中，其方式使得由所述多核苷酸编码的蛋白在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸可以在宿主细胞中表达，它就可以插入并位于宿主细胞的染色体中或者在染色体外存在，或者其可以处于所述情况的任一者。
进一步，术语“可操作连接”意指启动子序列和多核苷酸序列之间的功能性连接，所述启动子序列起始和介导编码本公开的靶蛋白的多核苷酸的转录。
2)用具有强活性的序列替代染色体上编码蛋白的基因的表达调节序列的方法可以经由本领域已知的任何方法来进行，例如通过经由缺失、插入、非保守或保守取代或其任何组合诱导序列中的变异，以进一步增强表达调节序列的活性；或者通过用具有更强活性的核苷酸序列替代该序列。所述表达调节序列可以包括但不特别限于启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、用于调节转录和翻译终止的序列等。具体地，该方法可以连接强异源启动子、而不是原始启动子，但不限于此。
已知的强启动子的实例可以包括cj7启动子(韩国专利号10-0620092)，cj1启动子(韩国专利号10-0620092)，lac启动子，Trp启动子，trc启动子，tac启动子，λ噬菌体PR启动子，PL启动子和tet启动子，但不限于此。
3)修饰蛋白的起始密码子或5'-UTR区域的核苷酸序列的方法可以经由本领域已知的任何方法来进行，例如，通过用比内源起始密码子具有更高的蛋白表达率的另一种起始密码子替代蛋白的内源起始密码子，但不限于此。
4)修饰染色体上的多核苷酸序列以增强蛋白活性的方法可以经由本领域已知的任何方法来进行，例如，通过经由缺失、插入、非保守或保守取代或其任何组合诱导表达调节序列中的变异，以进一步增强多核苷酸序列的活性；或通过用经改进以具有更强活性的多核苷酸序列替代该序列。替代可以具体地是通过同源重组将基因插入染色体，但不限于此。
本文所用的载体可进一步包括选择标记以证实染色体插入。选择标记用于选择被载体转化的细胞，即证实是否插入期望的基因。可以使用提供可选择表型的标记，诸如抗药性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抗性或表面蛋白表达，但不限于此。仅表达选择标记的细胞能够在用选择剂处理的环境下存活或显示出不同的表型，且因此可以选择转化的细胞。
5)引入具有蛋白活性的外源多核苷酸的方法可以经由本领域已知的任何方法来进行，例如，通过引入编码具有与蛋白的活性相同/相似的活性的蛋白的外源多核苷酸，或者通过将其密码子优化的变体多核苷酸引入宿主细胞。外源多核苷酸可以是任何多核苷酸，而在其来源或序列的方面不受限制，只要其具有与蛋白的活性相同/相似的活性。另外，可以将其优化的密码子引入宿主细胞，以在宿主细胞中进行引入的外源多核苷酸的优化的转录和翻译。所述引入可以通过本领域普通技术人员合适地选择的任何已知的转化方法进行。当引入的多核苷酸在宿主细胞中表达时，产生蛋白，并且其活性可以增加。
最后，可以通过组合应用1)至5)中的任何一种方法来进行6)方法的组合。
蛋白活性的增强可以意味着，基于野生型或修饰前的微生物中表达的蛋白的活性或浓度，相应蛋白的活性或浓度增加，或由相应蛋白产生的产物的量增加，但不限于此。如本文所用，术语“修饰前的菌株”或“修饰前的微生物”不排除包括可能在微生物中天然存在的突变的菌株，并且可以指天然菌株本身，或由于由天然或人工因素引起的基因修饰导致的性状改变前的菌株。在本公开中，性状改变可以是磷酸输入蛋白的活性增强。“修饰前的菌株”或“修饰前的微生物”可以与“非变体菌株”、“非修饰菌株”、“非变体微生物”、“非修饰微生物”或“参考微生物”互换使用。
在本公开中，参考微生物可以是已知产生嘌呤核苷酸的野生型微生物，例如，停滞棒杆菌ATCC6872。或者，参考微生物可以是已知产生嘌呤核苷酸的微生物，例如，CJX1664(KCCM12285P，韩国专利号10-1950141)，CJX1665(CJX1664::purA(G85S)，KCCM12286P，韩国专利号10-1950141)和CJI2335(KCCM12278P，韩国专利号10-1956510)，但不限于此。
如本文所用，术语“产生嘌呤核苷酸的微生物”是指通过为具有天然弱嘌呤核苷酸产生能力的微生物或由于天然或人工基因修饰而不具有嘌呤核苷酸产生能力的亲本菌株提供嘌呤核苷酸产生能力而制备的微生物。当在培养基中培养微生物时，嘌呤核苷酸可以在微生物中产生和积累，或者可以分泌至培养基中或积累在培养基中。嘌呤核苷酸产生能力可以是棒杆菌属的野生型微生物所具有的性状，或者可以通过遗传改进来提供或增强。在本公开中，“产生嘌呤核苷酸的微生物”可以与“具有嘌呤核苷酸产生能力的微生物”或“嘌呤核苷酸产生菌株”互换使用。
关于本公开的目标，产生嘌呤核苷酸的微生物可以包含表现出本公开的磷酸输入蛋白活性的多肽、编码其的多核苷酸以及包含其的载体中的任何一种或多种，并且可以与野生型或修饰前的微生物相比具有增加的嘌呤核苷酸生产率，因为经由上述增强蛋白活性的方法，与内源活性相比，多肽的活性得以增强。这是重要的，因为野生型微生物不能产生嘌呤核苷酸，或者即使它产生嘌呤核苷酸，其也只能够产生非常痕量的嘌呤核苷酸，而本公开的微生物可以通过引入表现出本公开的磷酸输入蛋白活性的多肽并增强其活性而具有增加的嘌呤核苷酸生产率。
磷酸输入蛋白可以具体为选自PstS、PstC、PstA和PstB的任何一种或多种，并且更具体地，选自PstS、PstC以及PstS和PstC的组合的任何一种或多种，但不限于此。
本公开的产生嘌呤核苷酸的微生物没有特别限制，只要其能够产生嘌呤核苷酸，并且其可以是棒杆菌属的微生物。棒杆菌属的微生物可以包括热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、Corynebacteriumcrudilactis、沙漠棒杆菌(Corynebacterium deserti)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、美棒杆菌(Corynebacterium callunae)、停滞棒杆菌(Corynebacterium stationis)、Corynebacterium singulare、耐盐棒杆菌(Corynebacterium halotolerans)、纹带棒杆菌(Corynebacterium striatum)、Corynebacterium pollutisoli、Corynebacterium imitans、Corynebacteriumtestudinoris、Corynebacterium flavescens、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)和通过使用上述菌株作为亲本菌株制备的菌株，例如停滞棒杆菌KCCM12285P和KCCM12286P(韩国专利号10-1950141)，停滞棒杆菌KCCM12278P(韩国专利号10-1956510)，停滞棒杆菌KCCM12280P(韩国专利号10-1950141)，但不限于此。具体地，所述微生物可以是停滞棒杆菌或谷氨酸棒杆菌。产生嘌呤核苷酸的微生物可以意指与野生型微生物例如ATCC6872相比通过包含天然或人工基因修饰而产生大量嘌呤核苷酸的微生物，但不限于此。
如本文所用，术语“嘌呤核苷酸”可以具体地是选自5'-肌苷一磷酸(下文中称为IMP)、5'-黄苷一磷酸(下文中称为XMP)、5'-鸟苷一磷酸(下文中称为GMP)的任何一种或多种核苷酸。IMP是脱氨基的腺嘌呤化合物，并且是指由一个分子的次黄嘌呤、核糖和磷酸中的每一者构成的核苷酸。IMP可以由5'-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)生物合成，并且具体地，其可以通过用氮原子取代与PRPP的1'碳键合的焦磷酸基团并通过经由九个阶段构成咪唑环和嘧啶环而形成。XMP是指由IMP的脱氢而产生的核苷酸，并且可以通过肌苷-5'-一磷酸脱氢酶由IMP合成。GMP是指具有其中磷酸基团在鸟苷分子的核糖中形成酯键的结构的核苷酸。可以通过经由5'-鸟苷酸生物合酶(GMP合酶)将氨分子添加至XMP来合成GMP。从XMP制备GMP的方法和/或该方法中使用的手段可以选自已知的技术。
本公开的另一个方面提供了产生嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：在培养基中培养产生嘌呤核苷酸的棒杆菌属的微生物，其中磷酸输入蛋白的活性增强。
磷酸输入蛋白、微生物和嘌呤核苷酸与上述相同。
如本文所用，术语“培养”意味着微生物在适当控制的环境条件下生长。本公开的培养过程可以根据本领域已知的适当的培养基和培养条件来实现。根据所选择的菌株，本领域技术人员可以通过容易地调节条件来使用这种培养过程。具体地，所述培养可以以分批过程、连续过程或补料分批过程进行，但不限于此。
如本文所用，术语“培养基”是指作为主要组分的培养微生物所需的营养物的混合物，并且提供营养和生长因子以及存活和生长所必需的水。具体地，用于培养本公开的微生物的培养基和其他培养条件没有特别限制，只要该培养基是培养微生物中通常使用的培养基，但本公开的微生物可以在含有适当的碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等的常用培养基中在有氧条件下在调节温度、pH等的同时进行培养。
在本公开中，所述碳源可以包括碳水化合物，诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等；糖醇，诸如甘露醇、山梨糖醇等；有机酸，诸如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；以及氨基酸，诸如谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等。另外，可以使用天然有机营养物来源，诸如淀粉水解物、糖蜜、黑糖蜜、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浆。具体地，可以使用碳水化合物，诸如葡萄糖、无菌的预处理的糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)等，并且可以使用合适量的其他碳源，而没有限制。这些碳源可以单独使用或以其两种或更多种的组合使用，但不限于此。
所述氮源可以包括无机氮源，诸如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；氨基酸，诸如谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺等；和有机氮源，诸如蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼粉或其消化产物、脱脂豆饼或其消化产物等。这些氮源可以单独使用或以其两种或更多种的组合使用，但不限于此。
磷源可以包括磷酸氢二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐。无机化合物可以包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。此外，可以包括氨基酸、维生素和/或适当的前体。这些组分或前体可以以分批或连续的方式添加至培养基中，但不限于此。
在本公开中，培养基的pH可以通过如下进行调节：在微生物的培养期间以适当的方式将化合物、诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸等添加至培养基中。进一步，可以使用消泡剂，诸如脂肪酸聚乙二醇酯，以防止在培养期间生成泡沫。此外，可以通过将氧气或含氧气体混合物引入培养基中来维持培养基的有氧条件，或者可以在不注入气体的情况下或通过引入氮气、氢气或二氧化碳气体来维持厌氧和微需氧状态，但不限于此。
培养基的温度可以为20℃至50℃，并且具体地为30℃至37℃，但不限于此。可以继续培养，直至有用产物的产生达到期望的水平。具体地，培养可以持续10小时至100小时，但不限于此。
通过培养产生的嘌呤核苷酸可以被排放至培养基中或可以不被排放并且可以保留在细胞中。
所述方法可以包括将酶添加至培养基中的步骤或添加表达该酶的微生物的步骤。例如，所述方法可以进一步包括在培养产生XMP的微生物的步骤之后，添加将XMP转化为GMP的酶的步骤或添加表达该酶的微生物的步骤，和/或培养该微生物的步骤。
所述方法可以包括从经培养的培养基或微生物中回收嘌呤核苷酸的步骤。
回收在本公开的培养步骤中产生的嘌呤核苷酸的方法可以是根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养液收集嘌呤核苷酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物回收嘌呤核苷酸。所述培养液也可以称为发酵液。
此外，回收步骤可以包括纯化过程，并且可以使用本领域已知的适当方法来进行。因此，收集的嘌呤核苷酸可以呈纯形式，或者可以是含有嘌呤核苷酸的微生物发酵液(Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering,A.J.Nair.,2008)。
本公开的又另一个方面提供了用于产生嘌呤核苷酸的组合物，所述组合物包含棒杆菌属的微生物，其中磷酸输入蛋白的活性增强。
磷酸输入蛋白、微生物和嘌呤核苷酸与上述相同。
用于产生嘌呤核苷酸的组合物可以包括能够增强蛋白活性的组合物，而没有限制，其中所述蛋白由选自pstS、pstC、pstA和pstB(其为由pstSCAB操纵子编码的磷酸输入蛋白系统)的任何一种或多种基因编码，作为磷酸输入蛋白，并且其描述与上述相同。
在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅用于举例说明本公开，并且对于本公开所属领域的技术人员显而易见的是，本公开的范围并不旨在由这些实施例限制。
实施例1：制备pstS起始密码子改变的菌株并评估XMP生产率
1-1.制备用于pstS起始密码子改变的重组载体和产生XMP的菌株
为了通过增强作为产生XMP的菌株(停滞棒杆菌ATCC6872-衍生的产生XMP的菌株，KCCM12285P，韩国专利号10-1950141)的CJX1664以及作为其purA(G85S)变体菌株(KCCM12286P，韩国专利号10-1950141)的CJX1664::purA(G85S)中的内源性pstS基因的活性来制备菌株，进行实验，以便用ATG(其为显示较高的蛋白表达率的起始密码子)替代GTG(其为pstS的内源性起始密码子)。
使用G-spin总DNA提取微型试剂盒(目录号17045，Intron)根据试剂盒中提供的方案，分离作为野生型停滞棒杆菌的ATCC6872菌株的染色体基因，并且分别使用一对SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10的引物以及一对SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的引物进行聚合酶链式反应，以获得一对基因片段(pstS(ATG)-A和pstS(ATG)-B)。PCR如下进行：在94℃下变性5分钟，随后在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟的20个循环，以及在72℃下聚合7分钟。作为结果，获得769bp的多核苷酸和766bp的多核苷酸。
使用两种片段作为模板进行二级PCR，以获得1.5kbp的多核苷酸模板。获得的基因片段用限制性酶XbaI(New England Biolabs,Beverly,MA)消化。其后，使用T4连接酶(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)来连接基因片段和已经用XbaI限制性酶消化的线性pDZ载体。制备的载体被命名为pDZ-pstS(ATG)。
通过电穿孔将pDZ-pstS(ATG)载体转化至产生XMP的CJX1664和CJX1664::purA(G85S)各自中，且然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基上选择其中变体基因和载体两者均被插入染色体的菌株作为主要候选物。其后，通过使用染色体上存在的基因和通过载体插入的基因之间的同源性的二次交换过程，将染色体上pstS的内源起始密码子改变为ATG。获得最终菌株，从其中除去含有卡那霉素抗性基因的载体。首先，其中起始密码子被改变的基因通过使用SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：12以及SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：12的引物的错配PCR来检查，并最终通过测序来证实。通过上述方法获得的pstS起始密码子改变的菌株被命名为CJX1664_pstS(g1a)和CJX1664：：purA(G85S)_pstS(g1a)。
上面使用的引物的序列如下。
[表1]
SEQ ID NO： 名称 序列
9 pstS(ATG)-A-F GGGTCTAGACCACAAACAGAATTAATGGTA
10 pstS(ATG)-A-R GCTTAAAGTTGCGAATCATGGGGAAAC
11 pstS(ATG)-B-F CCGGAAAGGTTTCCCCATGATTCGCAA
12 pstS(ATG)-B-R GGGTCTAGAGACGTAGGTGATGCCACCGTT
13 pstS(ATG)-错配-wt-F GAAAGGTTTCCCCG
14 pstS(ATG)-错配-mut-F GAAAGGTTTCCCCA
。
1-2.评估pstS起始密码子改变的菌株的XMP生产率
为了测量制备的菌株的XMP生产率，进行烧瓶测试。将CJX1664、CJX1664_pstS(g1a)、CJX1664：：purA(G85S)和CJX1664：：purA(G85S)_pstS(g1a)各自接种于含有2.5mL以下种子培养基的14mL管中，并在30℃下且以170rpm摇动培养24小时。将0.7mL种子培养液接种于含有32mL(24mL的主要培养基+8mL分开的无菌培养基)以下生产培养基的250mL角挡板烧瓶中，并在30℃下且以170rpm摇动培养75小时。
种子培养基、主要培养基和分开的无菌培养基的组成如下。
XMP烧瓶种子培养基
30g/L葡萄糖，15g/L蛋白胨，15g/L酵母提取物，2.5g/L氯化钠，3g/L尿素，150mg/L腺嘌呤，150mg/L鸟嘌呤，pH 7.0(基于1L培养基)
XMP烧瓶生产培养基(主要培养基)
50g/L葡萄糖，10g/L硫酸镁，100mg/L氯化钙，20mg/L硫酸铁，10mg/L硫酸锰，10mg/L硫酸锌，0.8mg/L硫酸铜，20mg/L组氨酸，15mg/L半胱氨酸，15mg/L β-丙氨酸，100μg/L生物素，5mg/L硫胺素，50mg/L腺嘌呤，25mg/L鸟嘌呤，15mg/L烟酸，pH 7.0(基于1L培养基)
XMP烧瓶生产培养基(分开的无菌培养基)
18g/L磷酸二氢钾，42g/L磷酸氢二钾，7g/L尿素，5g/L硫酸铵(基于1L培养基)
终止培养后经由使用HPLC的方法测量XMP产生的结果如下表2中所示。
[表2]
如表2中所示，与其亲本菌株CJX1664和CJX1664::purA(G85S)相比，其中替代pstS的起始密码子的CJX1664_pstS(g1a)和CJX1664::purA(G85S)_pstS(g1a)分别显示XMP浓度增加19％和15％。
这些结果表明，产生XMP的棒杆菌属菌株中的pstS的起始密码子的改变在XMP产生中是有效的。
实施例2：制备pstC起始密码子改变的菌株并评估IMP生产率
2-1.制备用于pstC起始密码子改变的重组载体和产生IMP的菌株
分离作为产生IMP的菌株(停滞棒杆菌ATCC6872-衍生的产生IMP的菌株，KCCM12278P，韩国专利号10-1956510)的CJI2335的染色体基因，并分别使用一对SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16的引物以及一对SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的引物进行聚合酶链式反应，以获得基因片段(pstC(ATG)-A和pstC(ATG)-B)。PCR如下进行：在94℃下变性5分钟，随后在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟的20个循环，以及在72℃下聚合7分钟。作为结果，获得771bp的多核苷酸和766bp的多核苷酸。
使用两种片段作为模板进行二级PCR，以获得1.5kbp的多核苷酸模板。用XbaI限制性酶消化获得的基因片段。其后，使用T4连接酶来连接基因片段和已经用XbaI限制性酶消化的线性pDZ载体。制备的载体被命名为pDZ-pstC(ATG)。
通过电穿孔将pDZ-pstC(ATG)载体转化至产生IMP的CJI2335和CJI2332::purA(G85S)(停滞棒杆菌ATCC6872–衍生的产生IMP的菌株的purA(G85S)变体菌株，KCCM12280P，韩国专利号10-1950141)中，且然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基上选择其中变体基因被插入染色体的菌株作为主要候选物。其后，以与实施例1中相同的方式进行二次交换过程，以获得其中染色体上的pstC的内源性起始密码子被改变为ATG的菌株。首先，其中起始密码子被改变的基因通过使用SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:18以及SEQ ID NO：20和SEQID NO：18的引物的错配PCR来检查，并最终通过测序来证实。通过上述方法获得的pstC起始密码子改变的菌株被命名为CJI2335_pstC(g1a)和CJI2332：：purA(G85S)_pstC(gla)。
上面使用的引物的序列如下。
[表3]
SEQ ID NO： 名称 序列
15 pstC(ATG)-A-F GGGTCTAGACATCAACCTGAGCACCGAAAC
16 pstC(ATG)-A-R TCAGGAGTGTCGTAAACATACCATACA
17 pstC(ATG)-B-F CGCTGGCTTGTATGGTATGTTTACGAC
18 pstC(ATG)-B-R GGGTCTAGAACCGGTAAACAGGTTACGGCC
19 pstC(ATG)-错配-wt-F TGGCTTGTATGGTG
20 pstG(ATG)-错配-mut-F TGGCTTGTATGGTA
。
2-2.评估pstC起始密码子改变的菌株的IMP生产率
为了检查作为实施例2-1中制备的pstC起始密码改变的菌株的CJI2335_pstC(g1a)和CJI2332：：purA(G85S)_pstC(gla)的IMP生产率的提高，进行以下实验。
将该菌株接种于直径为18mm的高压灭菌试管中的5mL种子培养基中，并在30℃的温度下摇动培养24小时，并用作种子培养液。将29mL的发酵培养基分配在250mL摇动的Erlenmeyer烧瓶中，且然后在121℃的温度下高压灭菌15分钟。在其中接种2mL的种子培养液，并培养3天。培养条件控制在170rpm、30℃和pH 7.8。
种子培养基和发酵培养基的组成如下。
IMP种子培养基
1％葡萄糖，1％蛋白胨，1％肉提取物，1％酵母提取物，0.25％氯化钠，100mg/L腺嘌呤，100mg/L鸟嘌呤，pH 7.2(基于1L培养基)
IMP烧瓶发酵培养基
0.1％谷氨酸钠，1％氯化铵，1.2％硫酸镁，0.01％氯化钙，20mg/L硫酸铁，20mg/L硫酸锰，20mg/L硫酸锌，5mg/L硫酸铜，23mg/L L-半胱氨酸，24mg/L丙氨酸，8mg/L烟酸，45μg/L生物素，5mg/L硫胺素-HCl，30mg/L腺嘌呤，1.9％磷酸(85％)，4.2％葡萄糖，2.4％粗糖(基于1L培养基)
终止培养后，经由使用HPLC的方法测量IMP产生。培养CJI2335_pstC(g1a)和CJI2332：：purA(G85S)_pstC(g1a)的结果如下表4中所示。
[表4]
如表4中所示，当将培养基中的IMP积累与作为亲本菌株的CJI2335和CJI2332::purA(G85S)进行比较时，在相同条件下，与其亲本菌株相比，CJI2335_pstC(g1a)和CJI2332::purA(G85S)_pstC(g1a)显示产率增加21％和22％。
实施例3：制备pstC起始密码子改变的菌株并评估XMP生产率
3-1.制备用于pstC起始密码子改变的重组载体和产生XMP的菌株
通过电穿孔将实施例2-1中制备的pDZ-pstC(ATG)载体转化至具有XMP生产率的CJX1664和CJX1664::purA(G85S)菌株各自中，且然后在含有25mg/L卡那霉素的选择培养基上选择其中变体基因被插入染色体的菌株作为主要候选物。其后，进行二次交换过程，以获得其中染色体上的pstC的内源性起始密码子被改变为ATG的菌株。以与实施例2-1中相同的方式检查其中起始密码子被改变的基因。通过上述方法获得的pstC起始密码子改变的菌株分别被命名为CJX1664_pstC(g1a)和CJX1664::purA(G85S)_pstC(g1a)。
3-2.评估pstC起始密码子改变的菌株的XMP生产率
为了检查CJX1664_pstC(g1a)和CJX1664::purA(G85S)_pstC(g1a)菌株的XMP生产率，以与实施例1-2中相同的方式进行烧瓶测试，并且培养的结果显示于下表5中。
[表5]
如表5中所示，与亲本菌株相比，CJX1664_pstC(g1a)和CJX1664::purA(G85S)_pstC(g1a)分别显示XMP产率提高8％和10％。
实施例4：制备pstS和pstC起始密码子共同改变的菌株并评估IMP生产率
4-1.制备产生IMP的pstS和pstC起始密码子共同改变的菌株
为了制备其中显示高活性的起始密码子(ATG)被引入pstS和pstC基因两者中的菌株，分别将以与实施例1-1中相同的方式制备的pDZ-pstS(ATG)载体引入实施例2-1中制备的CJI2335_pstC(g1a)和CJI2332::purA(G85S)_pstC(g1a)菌株中。以与实施例1-1中相同的方式选择载体引入的菌株。通过该程序，选择用具有pstS和pstC的改变的起始密码子的重组载体转化的菌株，并通过二级选择完成菌株的制备。制备的菌株分别被命名为CJI2335_pstS(g1a)_pstC(g1a)和CJI2332::purA(G85S)_pstS(g1a)_pstC(g1a)。
4-2.评估pstS和pstC起始密码子共同改变的菌株的IMP生产率
为了检查CJI2335_pstS(g1a)_pstC(g1a)和CJI2332::purA(G85S)_pstS(g1a)_pstC(g1a)菌株的IMP生产率，以与实施例2-2中相同的方式进行烧瓶测试。
终止培养后，经由使用HPLC的方法测量IMP产生。培养CJI2335_pstS(g1a)_pstC(g1a)和CJI2332::purA(G85S)_pstS(g1a)_pstC(g1a)的结果如下表6中所示。
[表6]
如表6中所示，与亲本菌株相比，CJI2335_pstS(g1a)_pstC(g1a)和CJI2332::purA(G85S)_pstS(g1a)_pstC(g1a)分别显示IMP产生提高13％和18％。
实施例5：制备和评估用于pstSC增强的pstSCAB操纵子-增强的产生IMP的菌株
5-1.制备具有增加拷贝数的pstSCAB操纵子用于增强停滞棒杆菌-衍生的pstSC的载体和制备产生IMP的菌株
制备其中拷贝数增加以增强pstSC活性的微生物，并评估IMP生产率。
使用与实施例1中相同的试剂盒分离野生型停滞棒杆菌ATCC6872菌株的染色体，并使用该染色体作为模板进行PCR。作为聚合酶，使用Maxime PCR PreMix(i-pfu)高保真DNA聚合酶(Intron)，并且PCR如下进行：在95℃下变性5分钟，随后在95℃下变性30秒，在54℃下退火30秒，和在72℃下聚合9分30秒的24个循环。作为结果，获得一对包括启动子区域的pstSCAB基因(pstSCAB-A和pstSCAB-B)。pstSCAB-A具有4960bp的大小，并使用SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:22的引物进行扩增，且pstSCAB-B具有4960bp的大小，并使用SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：23的引物进行扩增。将基因片段通过三片段连接克隆至pDZ载体中，所述pDZ载体通过用XbaI和SpeI限制性酶(pstSCAB-A：XbaI，pstSCAB-B：XbaI和SpeI)处理而线性化，其中位点被包括在pstSCAB-A和pstSCAB-B的每个末端。最后，制备了pDZ-2pstSCAB重组载体，其中连续克隆两个pstSCAB基因。
通过电穿孔将pDZ-2pstSCAB载体转化至产生IMP的菌株CJI2335和CJI2332：：purA(G85S)各自中。通过二次交换方法获得各自具有总共两个pstSCAB基因(其中一个pstSCAB基因在染色体上的内源性pstSCAB基因旁边另外插入)的菌株。最后通过使用能够扩增两个pstSCAB基因的连接位点的SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25的引物的PCR证实连续插入的pstSCAB基因。通过该程序，选择用具有增加拷贝数的pstSCAB操纵子的载体转化的菌株，并且制备的菌株分别被命名为CJI2335_2pstSCAB和CJI2332：：purA(G85S)_2pstSCAB。
上面使用的引物的序列如下。
[表7]
SEQ ID NO： 名称 序列
21 pstSCAB-Xba-F TGCTCTAGAGAAGTGGCACGATGAAGTATCGCC
22 pstSCABXbal-R TGCTCTAGAGCAGTCGATATTGCGCTGCTATCAC
23 pstSCAB Spel-R ACGACTAGTGCAGTCGATATTGCGCTGCTATCAC
24 pstSCAB-2拷贝-检查-F CACCATCGTGATCGTTACCCACAA
25 pstSCAB-2拷贝-检查-R GAATCATCTGCGGAATCAGAGCAAG
。
5-2.评估具有增加拷贝数的停滞棒杆菌-衍生的pstSCAB操纵子的菌株的IMP生产率通过实施例2-2的烧瓶测试的方式，使用具有增加拷贝数的停滞棒杆菌-衍生的pstSC以具有增强活性的CJI2335_2pstSCAB和CJI2332：：purA(G85S)_2pstSCAB菌株及其亲本菌株CJI2335和CJI2332：：purA(G85S)评估IMP的生产率，并且结果显示于下表8中。
[表8]
如表8中所示，上述烧瓶发酵测试的结果显示，与亲本菌株相比，CJI2335_2pstSCAB和CJI2332：：purA(G85S)_2pstSCAB分别显示IMP生产率提高26％和27％。
实施例6：制备和评估用于pstSC增强的pstSCAB操纵子-增强的产生XMP的菌株
6-1.制备具有增加拷贝数的停滞棒杆菌-衍生的pstSCAB操纵子的产生XMP的菌株
通过电穿孔将实施例5-1中制备的pDZ-2pstSCAB载体转化至产生XMP的菌株CJX1664和CJX1664::purA(G85S)中，并且通过二次交换方法获得具有总共两个pstSCAB基因(其中一个pstSCAB基因在染色体上的内源性pstSCAB基因旁边另外插入)的菌株。最后通过使用能够扩增两个pstSCAB基因的连接位点的SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的引物的PCR证实连续插入的pstSCAB基因。通过上述方法获得的具有增加拷贝数的pstSCAB的菌株分别被命名为CJX1664_2pstSCAB和CJX1664::purA(G85S)_2pstSCAB。
6-2.评估具有增加拷贝数的停滞棒杆菌-衍生的pstSCAB操纵子的菌株的XMP生产率为了测量CJX1664_2pstSCAB和CJX1664::purA(G85S)_2pstSCAB菌株的XMP生产率，以与实施例1-2中相同的方式进行烧瓶测试。
终止培养后，经由使用HPLC的方法测量XMP产生。培养CJX1664、CJX1664::purA(G85S)、CJX1664_2pstSCAB和CJX1664::purA(G85S)_2pstSCAB的结果如下表9中所示。
[表9]
如表9中所示，与亲本菌株相比，CJX1664_2pstSCAB和CJX1664::purA(G85S)_2pstSCAB分别显示XMP生产率提高9％和7％。
实施例7：制备和评估用于pstSC增强的pstSCAB启动子取代的产生IMP的菌株
7-1.制备用于pstSCAB启动子取代的重组载体和制备产生IMP的菌株
为了增加编码磷酸输入蛋白Pst系统的组成蛋白的pstSC的表达水平，将染色体中的pstS启动子本身用已知具有强活性的cj7启动子(韩国专利号10-0620092)取代。
首先，制备包含cj7启动子并且在启动子的两个末端具有染色体上的原始序列的同源重组载体。
详细地，为了制备用于将cj7启动子插入pstS基因的载体，经由实施例1的方法分离野生型停滞棒杆菌ATCC6872菌株的染色体，并使用作为模板的该染色体和Maxime PCR预混合物(i-pfu)高保真DNA聚合酶(Intron)进行PCR。PCR如下进行：在95℃下变性5分钟，随后在95℃下变性30秒，在54℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分30秒的24个循环。作为结果，获得两种不同的PCR产物(PstSpro-A和PstSpro-B)。PstSpro-A具有981bp的大小，并且使用SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27作为引物进行扩增。PstSpro-B具有2026bp的大小，并且使用SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29作为引物进行扩增。通过缝制PCR技术，使用两种扩增产物作为模板进行二级PCR。在与上述相同的条件下进行PCR，并且获得在其中间包括BamHI和NdeI限制性位点的2988bp的pstS基因的PCR产物。其后，使用其两个末端的限制性位点(PstSpro-A和PstSpro-B：XbaI)消化扩增产物，且然后通过T4连接酶活性将其克隆至pDZ载体中，并且作为结果，获得pDZ-PstSpro载体。
将获得的载体用于制备能够用cj7启动子取代CJI2335或CJI2332::purA(G85S)的染色体上的pstS基因的启动子的载体。
详细地，将野生型停滞棒杆菌ATCC6872的基因组用作模板以如下进行PCR。作为聚合酶，使用Maxime PCR PreMix(i-pfu)高保真DNA聚合酶(Intron)。PCR如下进行：在95℃下变性5分钟，随后在95℃下变性30秒，在54℃下退火30秒，和在72℃下聚合2分30秒的24个循环。作为结果，获得在cj7启动子基因的两个末端具有BamHI和NdeI限制性位点的基因。使用SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:31作为引物扩增该基因，并且其大小为491bp。该基因和pDZ-PstSpro载体用BamHI和NdeI限制性酶处理，并经由使用T4连接酶的方法克隆，以获得pDZ-pCJ7/PstSCAB载体。
通过电穿孔将制备的pDZ-pCJ7/PstSCAB载体转化至产生IMP的停滞棒杆菌CN01-1811菌株中，并且通过二次交换过程，制备其中用cj7启动子取代染色体上的内源性pstSCAB启动子的菌株。最后，通过使用能够连接和扩增cj7启动子和pstS基因的一部分的SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33的一对引物的PCR证实cj7启动子取代。通过上述方法获得的菌株分别被命名为CJI2335_Pcj7/pstS和CJI2332::purA(G85S)_Pcj7/pstS。
上面使用的引物的序列如下。
[表10]
SEQ ID NO： 名称 序列
26 PstSpro-A-F TGCTCTAGAGAAGCAGTTGCCGCAAGCG
27 PstS-pro-A-R CATATGGAATTCCGGATCCGGGGAAACCTTTCCGGTTAATTTCAG
28 PstSpro-B-F GGATCCGGAATTCCATATGATTCGCAACTTTAAGCGCTCC
29 PstSpro-B-R TGCTCTAGACAGACAGGCCCTCATCCTGG
30 CJ7pro-F CGCGGATCCTTCCTTCAGGCTAATCTTTTCCGGG
31 CJ7pro-R GGAATTCCATATGCATATGTGTTTCCTTTCGTTGGGTACG
32 CJ7pro-检查-F CTACGACCTCAGCGTGATTGGTTTG
33 PstS-检查-R CAGGAAGTCCTTGACCAAGTTTGCC
。
7-2.评估具有pstSCAB启动子取代的菌株的IMP生产率
通过实施例2-2的烧瓶测试，使用通过采用停滞棒杆菌-衍生的pstSC的cj7启动子而具有增强的活性的CJI2335_Pcj7/pstS和CJI2332：：purA(G85S)_Pcj7/pstS菌株及其亲本菌株CJI2335和CJI2332：：purA(G85S)评估IMP生产率，并且结果显示于下表11中。
[表11]
如表11中所示，与亲本菌株相比，各自具有增强的pstSCAB启动子的CJI2335_Pcj7/pstS和CJI2332：：purA(G85S)_Pcj7/pstS菌株分别显示烧瓶发酵中的IMP生产率提高21％和28％。
实施例8：制备和评估用于pstSC增强的pstSCAB启动子取代的产生XMP的菌株
8-1.制备pstSCAB启动子取代的产生XMP的菌株
通过电穿孔将实施例7-1中制备的pDZ-pCJ7/PstSCAB载体转化至产生XMP的CJX1664和CJX1664：：purA(G85S)菌株各自中。通过二次交换过程，制备其中用cj7启动子取代染色体上的内源性pstSCAB启动子的菌株。最后，通过使用能够连接和扩增cj7启动子和pstS基因的一部分的SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的一对引物的PCR证实cj7启动子取代。经由上述方法获得的菌株分别被命名为CJX1664_Pcj7/pstS和CJX1664：：purA(G85S)_Pcj7/pstS。
8-2.评估pstSCAB启动子取代的菌株的XMP生产率
通过实施例1-2的烧瓶测试的方式，使用通过采用停滞棒杆菌-衍生的pstSC的cj7启动子而具有增强的活性的CJX1664_Pcj7/pstS和CJX1664：：purA(G85S)_Pcj7/pstS菌株和亲本菌株CJX1664和CJX1664::purA(G85S)评估XMP生产率，并且结果显示于下表12中。
[表12]
如表12中所示，与亲本菌株相比，各自具有增强的pstSCAB启动子的CJX1664_Pcj7/pstS和CJX1664::purA(G85S)_Pcj7/pstS菌株分别显示烧瓶发酵中的XMP生产率提高14％和12％。
CJX1664_Pcj7/pstS被命名为CJX1911，且CJX1664::purA(G85S)_Pcj7/pstS被命名为CJX1912，并且这些根据布达佩斯条约在2019年12月20日保藏在国际保藏机构韩国微生物培养中心(the Korean Culture Center of Microorganisms)，登录号分别为KCCM12647P和KCCM12648P。
基于以上描述，本领域技术人员将理解，本公开可以以不同的特定形式实现，而不改变其技术精神或本质特征。在这方面，应当理解，上述实施方案不是限制性的，而是在所有方面都是说明性的。本公开的范围由所附权利要求限定，而不是由它们之前的说明书限定，且因此，落入权利要求的界限范围内的所有变化和修改，或者此类界限范围的等同方案因此旨在由权利要求涵盖。
发明效果
通过根据本公开增强磷酸输入蛋白的活性，可以提高作为嘌呤核苷酸生产中的关键组分的磷酸的细胞内摄取。因此，产生嘌呤核苷酸的微生物可以有效地产生嘌呤核苷酸。在嘌呤核苷酸的工业规模生产中，所述微生物可以大大有助于降低成本。
/>
/>
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 产生嘌呤核苷酸的微生物以及使用其产生嘌呤核苷酸的方法
<130> OPA21062-CN
<150> KR 10-2020-0021383
<151> 2020-02-21
<160> 33
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 372
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> PstS
<400> 1
Met Ile Arg Asn Phe Lys Arg Ser Ala Ala Ile Ile Gly Ala Val Ala
1 5 10 15
Ala Ser Ser Val Ala Leu Val Ala Cys Ser Asp Ser Ala Asp Asp Ser
20 25 30
Ala Asn Gly Gly Glu Ala Ala Ala Glu Leu Pro Gly Gly Tyr Ala Leu
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Ser Gly Ala Thr Gly Gly Leu Val Ala Glu Gly Ala Ser Ser Gln Gln
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Asn Ala Met Asp Tyr Phe Gly Ala Met Tyr Gln Glu Ala Thr Gly Gly
65 70 75 80
Asp Ala Tyr Leu Glu Tyr Asn Pro Thr Gly Ser Gly Ser Gly Arg Thr
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Asn Phe Val Ala Gly Gln Val Val Phe Ala Gly Ser Asp Ser Pro Leu
100 105 110
Glu Glu Asp Gln Val Glu Ala Ala Ala Glu Arg Cys Gly Gly Asn Asp
115 120 125
Ala Trp His Leu Pro Phe Val Ile Gly Pro Val Ala Ile Ala Tyr Asn
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Leu Glu Gly Val Glu Glu Ser Ile Asn Leu Ser Thr Glu Thr Leu Gly
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Lys Ile Phe Ala Gly Asp Ile Thr Lys Trp Asn Asp Asp Ala Ile Ala
165 170 175
Ser Glu Asn Glu Gly Val Glu Leu Pro Asp Thr Asp Ile Ser Val Val
180 185 190
Tyr Arg Ser Asp Glu Ser Gly Thr Ser Asp Asn Phe Gln Lys Phe Leu
195 200 205
Ser Ala Ser Thr Gly Asp Trp Glu Gly Glu Gly Thr Asn Phe Pro Thr
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Ala Val Gly Glu Gly Ala Asn Gly Ser Ser Gly Val Ala Thr Gln Val
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Gln Gln Ile Asn Gly Gly Ile Thr Tyr Val Glu His Ser His Ala Ala
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Asp Ser Gly Leu Asp Ile Ala Asn Ile Asp Phe Gly Asn Gly Pro Thr
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Glu Leu Asn Glu Glu Ser Val Gly Ala Ala Leu Glu Ala Met Glu Phe
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Thr Thr Glu Gly Asn Asp Met Val Val Asp Ser Asp Ala Leu Phe Ala
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Ser Asp Ala Gly Tyr Pro Leu Ile Leu Thr Thr Tyr Glu Ile Val Cys
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Ser Gly Gly Tyr Ser Glu Asp Glu Ala Asn Leu Val Lys Asp Phe Leu
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Met Thr Ala Leu Ala Tyr Gln Asp Glu Gly Leu Ser Glu Ala Gly His
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Ile Pro Val Thr Gly Gly His Tyr Asp Arg Leu Val Glu Ala Val Glu
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Ala Ile Asn Ser
370
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<211> 1119
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> pstS
<400> 2
gtgattcgca actttaagcg ctccgctgcc atcatcggtg ccgtcgcagc ttcctctgtc 60
gcactggtag cttgctctga ttccgcagat gattctgcaa acggcggcga agcagcagca 120
gagctgcctg gcggttacgc gctctctggc gcaaccggcg gcctagttgc tgaaggtgcg 180
tcctctcagc aaaacgccat ggactacttc ggtgcgatgt accaggaagc cactggtggc 240
gacgcttact tggagtacaa cccaactggt tccggttccg gccgtaccaa cttcgtcgct 300
ggccaggtag tctttgcagg ttctgactcc cctctggagg aggaccaggt agaggcagct 360
gcagagcgct gtggcggcaa cgatgcatgg cacctgccat tcgttattgg cccagttgca 420
atcgcctaca accttgaggg cgttgaagag tccatcaacc tgagcaccga aaccctgggc 480
aagattttcg ctggcgacat caccaagtgg aacgatgacg caatcgcttc tgagaacgaa 540
ggcgttgaac tgccagatac tgacatctcc gtggtttacc gttccgacga gtccggtacc 600
tcggacaact tccagaagtt cctgagcgct tccaccggtg actgggaagg cgaaggcacc 660
aacttcccaa ccgcagttgg tgaaggcgca aacggttctt ccggtgttgc tacccaggtt 720
cagcagatca acggtggcat cacctacgtc gagcactctc acgcagcaga ctccggtctg 780
gacattgcga acatcgactt cggcaacggc ccaaccgagc tgaacgaaga gtccgtgggt 840
gcggcacttg aggctatgga gttcaccacc gagggcaacg acatggttgt cgactccgat 900
gcactcttcg cttccgatgc aggttaccca ctcatcctga ccacttacga gattgtttgc 960
tccggtggat acagcgaaga tgaggcaaac ttggtcaagg acttcctgat gaccgcactg 1020
gcttaccagg atgagggcct gtctgaggct ggccacattc cagtaaccgg tggccactat 1080
gaccgcctcg ttgaggctgt tgaagcaatc aacagctaa 1119
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<212> PRT
<213> 未知
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<223> PstC
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Met Ala Asp Tyr Asn Ser Thr Ser Gly Asp His Val Lys Leu Glu Asp
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Asn Arg Thr Val Asp Thr His Pro Val Thr Val Asn Ser Ser Gly Ala
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Ala Ala Pro Ala Gly Val Asp Asn Gly Ala Thr Pro Lys Ala Val Arg
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Arg Ile Gly Asp Arg Val Phe Glu Thr Leu Ser Thr Ala Ser Ala Thr
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Leu Ile Thr Val Phe Ile Ala Ala Ile Gly Ile Phe Leu Val Leu Arg
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Ala Ile Pro Ala Leu Asn Arg Asn Ala Asn Gly Phe Leu Gly Phe Phe
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Thr Tyr Thr Asp Thr Trp Asn Thr Ser Asp Val Glu Asn Met Tyr Phe
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Gly Ile Pro Asn Leu Phe Ala Ala Thr Val Met Met Ser Val Leu Ala
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Leu Ile Ile Ala Met Pro Ile Ala Leu Gly Val Ala Ile Phe Leu Ser
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Asn Tyr Ala Pro Lys Ser Ile Val Lys Pro Met Gly Tyr Leu Val Asp
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Met Leu Ala Ala Val Pro Ser Ile Val Tyr Gly Leu Trp Gly Trp Leu
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Gly Ser Gly Phe Phe Leu Phe Ala Thr Tyr Ser Asn Ser Pro Ser Phe
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Pro Lys Gly Gln Val Glu Ser Ala Leu Ala Leu Gly Ala Thr Arg Trp
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Glu Val Val Arg Met Thr Val Leu Pro Phe Gly Met Ser Gly Tyr Ile
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Ser Gly Ser Met Leu Gly Leu Gly Arg Ala Leu Gly Glu Thr Met Ala
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Leu Tyr Met Val Val Ser Pro Ser Thr Ala Phe Arg Gly Ser Leu Phe
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Asp Gly Gly Thr Thr Phe Ala Thr Ala Ile Ala Asn Ala Ala Pro Glu
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Phe Asn Asn Asp Ile Lys Ala Gly Ala Tyr Ile Ala Ala Gly Leu Val
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Ala Gly Lys Lys
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<212> DNA
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<220>
<223> pstC
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gtggctgact acaactcgac ctcgggcgac cacgtcaaac tggaagataa ccgaaccgtt 60
gatacccatc cggtgaccgt aaactccagc ggtgccgcgg cacctgcagg tgtagataac 120
ggtgccactc cgaaagccgt tcgtcgcatc ggcgaccgcg ttttcgaaac gctatccact 180
gcatccgcaa cactgattac ggtattcatt gccgccatcg gtatcttcct tgtcctccgt 240
gcaattcctg cacttaaccg aaacgccaac ggattcctag gattctttac gtacaccgat 300
acgtggaata cctccgatgt tgagaacatg tacttcggca ttccgaacct gttcgcagca 360
accgtcatga tgtcagtctt ggcgttgatc atcgctatgc caattgcttt gggcgttgcg 420
atcttcttgt ccaactacgc accaaagtcc atcgttaagc caatgggcta cttggtcgac 480
atgctagctg cagttccttc catcgtttac ggcctgtggg gctggctggt gcttggccca 540
ttcctatctg gcttctacaa gtggattgaa agctggggga gcggcttctt cctgtttgcg 600
acctacagca acagcccatc gtttgaaacc ggccgtaacc tgtttaccgg tggcattgtt 660
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<223> PstA
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Lys Tyr Leu Ile Tyr Phe Cys Met Gly Leu Ala Val Ile Pro Leu Ile
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Leu Val Leu Trp Glu Leu Ile Ser Lys Gly Leu Pro Pro Val Leu Asn
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Gly Gly Gly Ala Ile His Ala Ile Ile Gly Thr Leu Val Gln Ser Val
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Leu Ala Ser Ile Ile Ala Ile Pro Ile Gly Ile Phe Thr Ala Ile Tyr
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Met Val Asp Ile Leu Ser Gly Val Pro Ser Ile Val Ala Ala Leu Phe
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Val Tyr Ala Ala Trp Ile Thr Val Leu Gly Phe Asp Arg Ser Gly Leu
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Ala Val Ala Trp Ser Leu Leu Leu Leu Met Ile Pro Ile Val Val Arg
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Asn Thr Glu Glu Met Leu Arg Val Val Pro Met Asp Leu Arg Glu Ala
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Leu Pro Thr Ala Leu Ser Gly Ile Ala Thr Gly Ile Met Leu Ala Ile
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Ala Arg Ile Met Gly Glu Ser Ala Pro Val Leu Ile Leu Val Gly Thr
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Thr Pro Ala Leu Lys Trp Asp Pro Thr Gly Gly Pro Met Ser Ser Leu
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Pro Leu Met Met Leu Asp Met Phe Lys Ala Gly Leu Asn Pro Asn Val
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Leu Asp Lys Met Trp Gly Ala Ala Phe Thr Leu Val Leu Ile Ile Ala
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Gln
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<212> DNA
<213> 未知
<220>
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ccagtgctca acgctgaatg gtggaccgat gacatgctgg gtacccgcta cgcccaagaa 240
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gcagcactgt tcgtctacgc ggcctggatt acggtcctag gtttcgaccg ctccggcttg 480
gccgtggctt ggtccctgtt gctgttgatg attccaattg tggttcgcaa caccgaagaa 540
atgctgcgcg ttgttccaat ggacttgcgc gaggctgcct acgctcttgg cgttccaaag 600
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accccggcgc tgaagtggga ccccaccggt ggcccaatgt cttccttgcc gttgatgatg 780
ctcgatatgt tcaaggccgg tttgaacccg aatgttcttg acaagatgtg gggcgcagca 840
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<212> PRT
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<220>
<223> PstB
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Pro Thr Met Ser Ile Glu Asp Asn Val Val Ala Gly Leu Lys Leu Ser
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Arg Gly Ala Asn Leu Trp Asp Glu Val Lys Asp Arg Leu Asp Lys Pro
130 135 140
Gly Gly Gly Leu Ser Gly Gly Gln Gln Gln Arg Leu Cys Ile Ala Arg
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Ala Ile Ala Val Glu Pro Glu Val Leu Leu Met Asp Glu Pro Cys Ser
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Ala Leu Asp Pro Ile Ser Thr Leu Ala Val Glu Asp Leu Ile His Glu
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Ala Ala Arg Val Ser Asp Lys Thr Gly Phe Phe Ser Leu Glu Ala Thr
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Gly Arg Pro Gly His Leu Val Glu Phe Asn Glu Thr Lys Lys Ile Phe
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Gly
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<223> pstB
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gtcaagggtg aaatcctgct cgacggtgaa aacatctacg gctcaaagat tgacccagtc 240
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ctggataagc caggcggcgg cctctccggt ggtcagcagc agcgtctgtg catcgctcgc 480
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gggtctagag acgtaggtga tgccaccgtt 30
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gggtctagac atcaacctga gcaccgaaac 30
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pstC(ATG)-A-R
<400> 16
tcaggagtgt cgtaaacata ccataca 27
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pstC(ATG)-B-F
<400> 17
cgctggcttg tatggtatgt ttacgac 27
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pstC(ATG)-B-R
<400> 18
gggtctagaa ccggtaaaca ggttacggcc 30
<210> 19
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pstC(ATG)-mismatch-wt-F
<400> 19
tggcttgtat ggtg 14
<210> 20
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pstC(ATG)-mismatch-mut-F
<400> 20
tggcttgtat ggta 14
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pstSCAB-Xba-F
<400> 21
tgctctagag aagtggcacg atgaagtatc gcc 33
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pstSCAB XbaI-R
<400> 22
tgctctagag cagtcgatat tgcgctgcta tcac 34
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pstSCAB SpeI-R
<400> 23
acgactagtg cagtcgatat tgcgctgcta tcac 34
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pstSCAB-2copy-check-F
<400> 24
caccatcgtg atcgttaccc acaa 24
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pstSCAB-2copy-check-R
<400> 25
gaatcatctg cggaatcaga gcaag 25
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PstSpro-A-F
<400> 26
tgctctagag aagcagttgc cgcaagcg 28
<210> 27
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PstS-pro-A-R
<400> 27
catatggaat tccggatccg gggaaacctt tccggttaat ttcag 45
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PstSpro-B-F
<400> 28
ggatccggaa ttccatatga ttcgcaactt taagcgctcc 40
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PstSpro-B-R
<400> 29
tgctctagac agacaggccc tcatcctgg 29
<210> 30
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CJ7pro-F
<400> 30
cgcggatcct tccttcaggc taatcttttc cggg 34
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CJ7pro-R
<400> 31
ggaattccat atgcatatgt gtttcctttc gttgggtacg 40
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CJ7pro-check-F
<400> 32
ctacgacctc agcgtgattg gtttg 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PstS-check-R
<400> 33
caggaagtcc ttgaccaagt ttgcc 25

Claims (9)

1.停滞棒杆菌菌株，其具有与未修饰的停滞棒杆菌菌株相比增加的嘌呤核苷酸生产率，其经修饰以使得由pstSCAB操纵子编码的磷酸输入蛋白系统的活性增强，
其中所述活性增强通过如下实现：
a)增加编码所述磷酸输入蛋白系统的基因的细胞内拷贝数的方法；
b)用具有强活性的序列替换染色体上编码所述磷酸输入蛋白系统的基因的表达调节序列的方法；
c)连接强异源启动子而不是原始启动子的方法；
d)修饰所述磷酸输入蛋白系统的起始密码子或5'-UTR区域的核苷酸序列的方法，其中通过用比内源起始密码子具有更高的蛋白表达率的另一种起始密码子替代蛋白的内源起始密码子；
e)修饰染色体上的多核苷酸序列以增强所述磷酸输入蛋白系统的活性的方法，其中通过用经改进以具有更强活性的多核苷酸序列替代该序列；或
f)所述方法的组合。
2.权利要求1的停滞棒杆菌菌株，其中所述磷酸输入蛋白系统的活性的增强是由选自pstS、pstC、pstA和pstB的任何一种或多种基因编码的蛋白的活性的增强。
3.权利要求2的停滞棒杆菌菌株，其中由pstS基因编码的蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
4.权利要求2的停滞棒杆菌菌株，其中由pstC基因编码的蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
5.权利要求1的停滞棒杆菌菌株，其中所述嘌呤核苷酸是选自5'-肌苷一磷酸IMP、5'-黄苷一磷酸XMP和5'-鸟苷一磷酸GMP的任何一种或多种。
6.产生嘌呤核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：在培养基中培养停滞棒杆菌菌株，其具有与未修饰的停滞棒杆菌菌株相比增加的嘌呤核苷酸生产率，其经修饰以使得由pstSCAB操纵子编码的磷酸输入蛋白系统的活性增强，
其中所述活性增强通过如下实现：
a)增加编码所述磷酸输入蛋白系统的基因的细胞内拷贝数的方法；
b)用具有强活性的序列替换染色体上编码所述磷酸输入蛋白系统的基因的表达调节序列的方法；
c)连接强异源启动子而不是原始启动子的方法；
d)修饰所述磷酸输入蛋白系统的起始密码子或5'-UTR区域的核苷酸序列的方法，其中通过用比内源起始密码子具有更高的蛋白表达率的另一种起始密码子替代蛋白的内源起始密码子；
e)修饰染色体上的多核苷酸序列以增强所述磷酸输入蛋白系统的活性的方法；或
f)所述方法的组合。
7.权利要求6的方法，其包括从经培养的培养基或停滞棒杆菌菌株中回收嘌呤核苷酸的步骤。
8.权利要求7的方法，其中所述嘌呤核苷酸是选自5'-肌苷一磷酸、5'-黄苷一磷酸和5'-鸟苷一磷酸的任何一种或多种。
9.用于产生嘌呤核苷酸的组合物，所述组合物包含停滞棒杆菌菌株，其具有与未修饰的停滞棒杆菌菌株相比增加的嘌呤核苷酸生产率，其经修饰以使得由pstSCAB操纵子编码的磷酸输入蛋白系统的活性增强，
其中所述活性增强通过如下实现：
a)增加编码所述磷酸输入蛋白系统的基因的细胞内拷贝数的方法；
b)用具有强活性的序列替换染色体上编码所述磷酸输入蛋白系统的基因的表达调节序列的方法；
c)连接强异源启动子而不是原始启动子的方法；
d)修饰所述磷酸输入蛋白系统的起始密码子或5'-UTR区域的核苷酸序列的方法，其中通过用比内源起始密码子具有更高的蛋白表达率的另一种起始密码子替代蛋白的内源起始密码子；
e)修饰染色体上的多核苷酸序列以增强所述磷酸输入蛋白系统的活性的方法，其中通过用经改进以具有更强活性的多核苷酸序列替代该序列；或
f)所述方法的组合。
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