CN105861405A - 一种高转化率的枯草芽孢杆菌及其构建方法 - Google Patents

一种高转化率的枯草芽孢杆菌及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高转化率的枯草芽孢杆菌及其制备与应用。本发明首先通过质粒表达的方法解决了枯草芽孢杆菌A164转化效率低的问题，然后通过诱导转化的方法将含有comk表达框的线性片段整合到A164基因组上，借助cre/lox特异重组系统消除抗性，得到了不含抗性标记的、易于操作的、高转化效率和高分泌能力的枯草芽孢杆菌A164S。本发明的枯草芽孢杆菌A164S，研究结果表明，其转化效率为A164的1000倍以上；A164S能有效摄取同源DNA，高效分泌外源蛋白，在外源基因的重组表达方面有着较大的应用潜力。

Description

一种高转化率的枯草芽孢杆菌及其构建方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高转化率的枯草芽孢杆菌及其制备与应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌被认定为是一般安全(GRAS，Generally Recognized as Safe)的生物，因其无致热源、高分泌、易培养，其产物可直接用于人们的日常使用等优点，成为工业多肽类产品、药剂和酶制剂分泌表达的首选。枯草芽孢杆菌A164(ATCC 6051a)相比于模式菌株A168，其生长特性、分泌能力等生化特征非常优异，是发酵工业生产菌构建的理想出发菌株。但是A164由于DNA转化效率极抵，基因操作困难，使得A164工程菌改造的工作限制大，影响了其在工业生产应用的前景。
枯草芽孢杆菌的摄取外源DNA的能力，即感受态效率受到信号转导网络严密的调控。感受态转录因子Comk在其中扮演着重要的作用，Comk的编码基因comk的表达也在转录和转录后水平上受到严格调控。comk的表达受到至少三个转录因子，包括AbrB、Rok(Ykuw)和CodY的抑制，同时也受到DeqSu双组分调控系统及Comk本身的正向调控。因此，提高枯草芽孢杆菌的感受态效率，可以从两个方面着手，其一是敲除comk基因的抑制因子，其二就是过表达Comk正向调控因子。事实证明，这两种方式均切实可行，通过失活Rok的编码基因rok，可以使枯草芽孢杆菌BD630的转化效率提高5倍；而通过将含有木糖启动子xylA的comk基因导入枯草芽孢杆菌1A751，得到的枯草芽孢杆菌1A976对DNA的转化效率可以提高1000倍。
另一方面，经基因工程改造的微生物通常含有抗生素基因以用于遗传操作筛选，但用于多肽、工业酶生产的领域对抗生素的添加及抗生素基因的存在十分敏感，因此，一般要求生产菌株不含抗生素基因。因此，在对枯草芽孢杆菌进行分子改造时，通常会使用反向筛选标记，利用细胞自身的同源重组系统将抗性基因敲除，但这种方式下的重组效率不高，菌株二次筛选时的工作量比较大，也比较耗时；因此近年来多利用位点特异性重组系统，比如cre/lox系统，通过外源重组酶的催化，大大提高重组效率，使得基因无痕敲除/敲入的操作省时高效。
但是即使是利用现代的遗传操作工具，虽然它们对枯草芽孢杆菌A168、1A976等模式菌株十分有效，但是对于有生产应用前景的A164而言，依旧十分困难，因为A164的转化效率极低，几乎不接受外源DNA的转化。同时，为了保证外源基因在枯草芽孢杆菌的遗传稳定性，会通过同源重组整合到宿主的染色体中，利用线性DNA往往可以一次性完成这种分子改造，但对于A164而言，这种由线性DNA介导的分子改造工作十分困难，耗时耗力。
发明内容
为了克服目前野生型枯草芽孢杆菌转化效率低的问题，本发明的目的在于提供一种高转化率的枯草芽孢杆菌及其制备与应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌的基因组中含有xylR-PxylA-comk表达单元，所述xylR-PxylA-comk表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的xylR基因序列、xylA启动子基因序列、comk基因序列。
优选地，所述枯草芽孢杆菌的基因组中整合有xylR-PxylA-comk表达单元，所述xylR-PxylA-comk表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的xylR基因序列、xylA启动子基因序列、comk基因序列。
优选地，所述xylR-PxylA-comk表达单元的基因序列如SEQ ID NO.12所示。
优选地，所述枯草芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌A164改造获得。
优选地，所述枯草芽孢杆菌是将枯草芽孢杆菌A164中的中性蛋白酶基因nprE敲除并替换为xylR-PxylA-comk表达单元构建获得。
优选地，被敲除的中性蛋白酶基因nprE的基因序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步地，所述枯草芽孢杆菌除了中性蛋白酶基因nprE被敲除和替换之外，还可经过其他基因改造。
基因改造具体是指通过生物或化学或物理的手段使基因相比改造前在结构上发生变化。这种变化主要是指碱基对组成的变化，包括但不限于一个或多个碱基对的替换、增添、缺失引起的改变。
本发明的第二方面，提供了前述枯草芽孢杆菌的制备方法，包括步骤：将枯草芽孢杆菌A164中的中性蛋白酶基因nprE敲除，并替换为xylR-PxylA-comk表达单元。
相比中性蛋白酶基因nprE未被敲除替换的枯草芽孢杆菌，本发明的枯草芽孢杆菌转化效率更高。
优选地，采用基因重组介导的基因操作敲除和替换中性蛋白酶基因nprE。
可以采用现有的基因重组方法敲除和替换所述中性蛋白酶基因nprE。在优选地实施例中，采用Cre-LoxP重组酶系统介导的基因重组方法敲除和替换所述中性蛋白酶基因nprE。还可采用其他方法实现基因敲除和替换，并不限于实施例所列举的方式。
基于中性蛋白酶基因nprE的敲除和替换，nprE的完整序列从染色体DNA中去除和被替换。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌还经过其他基因改造。
所述的其他基因改造是指除中性蛋白酶基因nprE的敲除和替换以外的基因改造。所述其他基因改造可以是单个目标基因的改造或者为多个感兴趣目标基因的改造。感兴趣目标基因并不特指，可以根据研究需要设定并改造。例如，可以是一个、两个、三个以上目标基因的改造。由于本发明中性蛋白酶基因nprE被敲除和替换的苦草芽孢杆菌可在体外传代，因此理论上可以不断对其进行基因改造，对于目标基因的改造数量可以按照需要操作，没有特别限制。
所述基因改造包括但不限于目标基因的敲入、目标基因的敲除、目标基因的替换等。目标基因的敲入、目标基因的敲除、目标基因的替换可以采用基因打靶、同源重组等技术来完成，包括但不限于基于Cre-LoxP重组酶系统、ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活样效应因子核酸酶)和CRISPR/Cas9(成簇规律间隔短回文重复技术)等的基因操作。
凡是可以实现中性蛋白酶基因nprE被敲除和替换及其他基因突变的其他生物技术手段均可用于构建中性蛋白酶基因nprE被敲除和替换且经其他基因改造的枯草芽孢杆菌。
优选地，还包括对所述枯草芽孢杆菌进行了单个或者多个感兴趣目标基因的改造。
本发明的第三方面，提供了前述枯草芽孢杆菌的用途，为将所述枯草芽孢杆菌作为表达宿主。
进一步地，将所述枯草芽孢杆菌作为表达宿主用于外源基因的高效表达。
进一步地，还可将所述枯草芽孢杆菌作为表达宿主用于工业多肽类产品、蛋白类产品、药剂和酶制剂等的高效表达。
本发明的第四方面，提供了一种表达外源基因的方法，包括如下步骤：
1)构建含有外源基因的重组表达载体；
2)将步骤1)获得的重组表达载体转染本发明前述枯草芽孢杆菌，并在合适表达所述外源基因的条件下培养所述宿主。
通过常规的重组DNA技术即可构建含有外源基因的重组表达载体，例如将目的外源基因片段插入所述表达载体的多克隆位点。所述目的外源基因片段应当至少包含所要表达的外源基因的完整编码区。
获得的转有重组表达载体的枯草芽孢杆菌可以用常规方法培养，表达外源基因。根据所用的枯草芽孢杆菌的具体情况，培养中所用的培养基可选用已知的各种合适的培养基或培养液，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养并表达外源基因。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性或添加纯化标签通过各种分离方法分离和纯化外源基因表达所得产品。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破壁、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首先通过质粒表达的方法解决了枯草芽孢杆菌A164转化效率低的问题，然后通过诱导转化的方法将含有comk表达框的线性片段整合到A164基因组上，借助cre/lox特异重组系统消除抗性，得到了不含抗性标记的、易于操作的、高转化效率和高分泌能力的枯草芽孢杆菌A164S。本发明的枯草芽孢杆菌A164S，研究结果表明，其转化效率为A164的1000倍以上；A164S能有效摄取同源DNA，高效分泌外源蛋白，在外源基因的表达方面有着较大的应用潜力。
附图说明
图1：重组质粒pMK4-cre的质粒图谱。
图2：重组质粒pGSNE-nprlR-comk的质粒图谱。
图3：重组质粒pMK4-comk的质粒图谱。
图4：枯草芽孢杆菌164S的构建流程图。
图5：枯草芽孢杆菌164S淀粉酶基因的敲的功能鉴定。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1 表达质粒pMK4-cre、表达质粒pMK4-comk和重组质粒pGSNE-nprlR-comk的构建
1.pMK4-cre的构建
pMK4-cre是在pMK4载体的基础上连接了含有一个Pspac启动子的Cre酶表达基因cre，用于在苦草芽孢杆菌中表达Cre酶。pMK4-cre的序列如SEQ NO.1所示，具体为：
gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttggctgcaggtcgacggatccccgggaattctacacagcccagtccagactattcggcactgaaattatgggtgaagtggtcaagacctcactaggcaccttaaaaatagcgcaccctgaagaagatttatttgaggtagcccttgcctacctagcttccaagaaagatatcctaacagcacaagagcggaaagatgttttgttctacatccagaacaacctctgctaaaattcctgaaaaattttgcaaaaagttgttgactttatctacaaggtgtggcataatgtgtggaattgtgagcggataacaattaagcttaaggaggaagcaggtatgtccaatttactgaccgtacaccaaaatttgcctgcattaccggtcgatgcaacgagtgatgaggttcgcaagaacctgatggacatgttcagggatcgccaggcgttttctgagcatacctggaaaatgcttctgtccgtttgccggtcgtgggcggcatggtgcaagttgaataaccggaaatggtttcccgcagaacctgaagatgttcgcgattatcttctatatcttcaggcgcgcggtctggcagtaaaaactatccagcaacatttgggccagctaaacatgcttcatcgtcggtccgggctgccacgaccaagtgacagcaatgctgtttcactggttatgcggcggatccgaaaagaaaacgttgatgccggtgaacgtgcaaaacaggctctagcgttcgaacgcactgatttcgaccaggttcgttcactcatggaaaatagcgatcgctgccaggatatacgtaatctggcatttctggggattgcttataacaccctgttacgtatagccgaaattgccaggatcagggttaaagatatctcacgtactgacggtgggagaatgttaatccatattggcagaacgaaaacgctggttagcaccgcaggtgtagagaaggcacttagcctgggggtaactaaactggtcgagcgatggatttccgtctctggtgtagctgatgatccgaataactacctgttttgccgggtcagaaaaaatggtgttgccgcgccatctgccaccagccagctatcaactcgcgccctggaagggatttttgaagcaactcatcgattgatttacggcgctaaggatgactctggtcagagatacctggcctggtctggacacagtgcccgtgtcggagccgcgcgagatatggcccgcgctggagtttcaataccggagatcatgcaagctggtggctggaccaatgtaaatattgtcatgaactatatccgtaacctggatagtgaaacaggggcaatggtgcgcctgctggaagatggcgattaggcatgcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatccatatccttctttttctgaaccgacttctcctttttcgcttctttattccaattgctttattgacgttgagcctcggaacccttaacaatcccaaaacttgtcgaatggtcggcttaatagctcacgctatgccgacattcgtctgcaagtttagttaagggttcttctcaacgcacaataaattttctcggcataaatgcgtggtctaatttttatttttaataaccttgatagcaaaaaatgccattccaatacaaaaccacatacctataatcgataaccacataacagtcataaaaccactcctttttaacaaactttatcacaagaaatatttaaattttaaatgcctttattttgaattttaaggggcattttaaagatttaggggtaaatcatatagttttatgcctaaaaacctacagaagcttttaaaaagcaaatatgagccaaataaatatattctaattctacaaacaaaaatttgagcaaattcagtgtcgattttttaagacactgcccagttacatgcaaattaaaattttcatgattttttatagttcctaacagggttaaaatttgtataacgaaagtataatgtttatataacgttagtataataaagcattttaacattatacttttgataatcgtttatcgtcgtcatcacaataacttttaaaatactcgtgcataattcaacagctgacctcccaataactacatggtgttatcgggaggtcagctgttagcacttatattttgttattgttcttcctcgatttcgtctatcattttgtgattaatttctcttttttcttgttctgttaagtcataaagttcactagctaaatactctttttgtttccaaatataaaaaatttgatagatatattcggttggatcaatttcttttaagtaatctaaatccccattttttaatttctttttagcctctttaaataatcctgaataaactaatacctgtttacctttaagtgatttataaaatgcatcaaagactttttgatttattaaataatcactatctttaccagaatacttagccatttcatataattctttattattattttgtcttattttttgaacttgaacttgtgttatttctgaaatgcccgttacatcacgccataaatctaaccattcttgttggctaatataatatcttttatctgtgaaatacgatttatttactgcaattaacacatgaaaatgaggattataatcatctctttttttattatatgtaatctctaacttacgaacatatccctttataacactacctactttttttctctttataagttttctaaaagaattattataacgttttatttcattttctaattcatcactcattacattaggtgtagtcaaagttaaaaagataaactcctttttctcttgctgcttaatatattgcatcatcaaagataaacccaatgcatcttttctagcttttctccaagcacagacaggacaaaatcgatttttacaagaattagctttatataatttctgtttttctaaagttttatcagctacaaaagacagaaatgtattgcaatcttcaactaaatccatttgattctctccaatatgacgtttaataaatttctgaaatacttgatttctttgttttttctcagtatacttttccatgttataacacataaaaacaacttagttttcacaaactatgacaataaaaaaagttgctttttcccctttctatgtatgttttttactagtcatttaaaacgatacattaataggtacgaaaaagcaactttttttgcgcttaaaaccagtcataccaa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其中的Pspac-cre片段以质粒pDGC为模板，以Pcre-F(SEQ ID NO.5)为上游引物，以Pcre-R(SEQ ID NO.6)为下游引物PCR扩增得到。
Pcre-F(SEQ ID NO.5)，具体为：taccgaattctacacagcccagtccaga。
Pcre-R(SEQ ID NO.6)，具体为：ctaggaattcgcatgcctaatcgccatcttccag。
PCR反应体系如下：
在Mastercycler普通PCR仪(Eppendorf)上运行以下程序：
(1)98℃，2min；(2)98℃，15sec；(3)55℃，15sec；(4)72℃，1min 30sec；(5)循环从(2)到(4)，30次；(6)72℃，10min；(7)4℃，保存。
PCR产物经Axygen PCR清洁试剂盒回收纯化后，以限制性内切酶Eco RI酶切，与经Eco RI和去磷酸化处理的线性质粒pMK4以T4DNA连接酶连接，连接液转入大肠杆菌DH5α，从大肠杆菌中分离得到重组质粒pMK4-cre。所述重组质粒pMK4-cre的结构示意图如图1所示。
2.pMK4-comk的构建
pMK4-comk是在pMK4载体的基础上连接了含有启动子xylA及其抑制基因xylR的comk表达基因，pMK4-comk用于在枯草芽孢杆菌中表达Comk。
pMK4-comk的序列如SEQ NO.3所示，具体为：
gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttggctgcagtcgcgatgattaattaattcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatcaataacgatagaaaccgctcctaaagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaaatgagaatggactctagaagaaacttcgtttttaatcgtatttaaaacaatgggatgagattcaattatatgatttctcaagataacagcttctatatcaaatgtattaaggatattggttaatccaattccgatataaaagccaaagttttgaagtgcatttaacatttctacatcatttttatttgcgcgttccacaatctcttttcgagaaatattcttttcttctttagagagcgaagccagtaacgctttttcagaagcatataattcccaacagcctcgatttccacagctgcatttgggtccattaaaatctatcgtcatatgacccatttccccagaaaaaccctgaacacctttatacaattcgttgttaataacaagtccagttccaattccgatattaatactgatgtaaacgatgttttcatagttttttgtcataccaaatactttttcaccgtatgctcctgcattagcttcattttcaacaaaaaccggaacattaaactcactctcaattaaaaactgcaaatctttgatattccaatttaagttaggcatgaaaataatttgctgatgacgatctacaaggcctggaacacaaattcctattccgactagaccataaggggactcaggcatatgggttacaaaaccatgaataagtgcaaataaaatctcttttacttcactagcggaagaactagacaagtcagaagtcttctcgagaataatatttccttctaagtcggttagaattccgttaagatagtcgactcctatatcaataccaatcgagtagcctgcattcttattaaaaacaagcattacaggtcttctgccgcctctagattgccctgccccaatttcaaaaataaaatctttttcaagcagtgtatttacttgagaggagacagtagacttgtttaatcctgtaatctcagagagagttgccctggagacaggggagttcttcaaaatttcatctaatattaatttttgattcattttttttactaaagcttgatctgcaatttgaataataaccactcctttgtttatccaccgaactaagttggtgttttttgaagcttgaattagatatttaaaagtatcatatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattgaaataaacatttattttgtatatgatgagataaagttagtttattggataaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaagggggaaatgacaaatggtccaaactagtgatatctaaaaatcaaagggggaaatgggatccaaaggaggccataatatgagtcagaaaacagacgcacctttagaatcgtatgaagtgaacggcgcaacaattgccgtgctgccagaagaaatagacggcaaaatctgttccaaaattattgaaaaagattgcgtgttttatgtaaacatgaagccgctgcaaattgtcgacagaagctgccgattttttggatcaagctatgcgggaagaaaagcaggaacttatgaagtgacaaaaatttcacacaagccgccgatcatggtggacccttcgaaccaaatctttttattccctacactttcttcgacaagaccccaatgcggctggatttcccatgtgcatgtaaaagaattcaaagcgactgaattcgacgatacggaagtgacgttttccaatgggaaaacgatggagctgccgatctcttataattcgttcgagaaccaggtataccgaacagcgtggctcagaaccaaattccaagacagaatcgaccaccgcgtgccgaaaagacaggaatttatgctgtacccgaaagaagagcggacgaagatgatttatgattttattttgcgtgagctcggggaacggtattagaaaaatagccgcgggcggccgcactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaagaattgatcctctagcacaaaagaaaaacgaaatgatacaccaatcagtgcaaaaaaagatataatgggagataagacggttcgtgttcgtgctgacttgcaccatatcctgcaggtcgacggatccccgggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatccatatccttctttttctgaaccgacttctcctttttcgcttctttattccaattgctttattgacgttgagcctcggaacccttaacaatcccaaaacttgtcgaatggtcggcttaatagctcacgctatgccgacattcgtctgcaagtttagttaagggttcttctcaacgcacaataaattttctcggcataaatgcgtggtctaatttttatttttaataaccttgatagcaaaaaatgccattccaatacaaaaccacatacctataatcgataaccacataacagtcataaaaccactcctttttaacaaactttatcacaagaaatatttaaattttaaatgcctttattttgaattttaaggggcattttaaagatttaggggtaaatcatatagttttatgcctaaaaacctacagaagcttttaaaaagcaaatatgagccaaataaatatattctaattctacaaacaaaaatttgagcaaattcagtgtcgattttttaagacactgcccagttacatgcaaattaaaattttcatgattttttatagttcctaacagggttaaaatttgtataacgaaagtataatgtttatataacgttagtataataaagcattttaacattatacttttgataatcgtttatcgtcgtcatcacaataacttttaaaatactcgtgcataattcaacagctgacctcccaataactacatggtgttatc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其中的xylR-PxylA-comk片段以质粒pMD19T-kan-comk-lacA(SEQ ID NO.4)为模板，以Comk-psF(SEQ ID NO.7)为上游引物，以Comk-psR(SEQ ID NO.8)为下游引物PCR扩增得到。
pMD19T-kan-comk-lacA(SEQ ID NO.4)具体为：
gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgacgatcaggtcgcctgacaatatgtctcctgtcattatgtccttcacactctgatcaaacgtgaccagctgtttttcttccgtgaaattcatgacaaaaatataatcattgtcctgatcctgcctcgcttgtacggagacgccttttccgtgccgaaccggaaaaactggagagagagacaggtctgtgatcagaccctcatagaaatcacgctgaaattgatcctccaaacgcgcgccgataaaatacgccttgccctgctgatactcatggcttgtgaccgctggcgtgcgcgcataaaaatcttcttgatacaccgcttccactgaagctgtctttacatcaatcacggttgcataatccttcatttcatatatttggctgcggtagctgacagcgtttcgatccttcggatacagggtgtccgtttcaagaggctcaactccaaatatagcttgaaatcgatatctctgcagtcgcgatgattaattaattcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatcaataacgatagaaaccgctcctaaagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaaatgagaatggactctagaagaaacttcgtttttaatcgtatttaaaacaatgggatgagattcaattatatgatttctcaagataacagcttctatatcaaatgtattaaggatattggttaatccaattccgatataaaagccaaagttttgaagtgcatttaacatttctacatcatttttatttgcgcgttccacaatctcttttcgagaaatattcttttcttctttagagagcgaagccagtaacgctttttcagaagcatataattcccaacagcctcgatttccacagctgcatttgggtccattaaaatctatcgtcatatgacccatttccccagaaaaaccctgaacacctttatacaattcgttgttaataacaagtccagttccaattccgatattaatactgatgtaaacgatgttttcatagttttttgtcataccaaatactttttcaccgtatgctcctgcattagcttcattttcaacaaaaaccggaacattaaactcactctcaattaaaaactgcaaatctttgatattccaatttaagttaggcatgaaaataatttgctgatgacgatctacaaggcctggaacacaaattcctattccgactagaccataaggggactcaggcatatgggttacaaaaccatgaataagtgcaaataaaatctcttttacttcactagcggaagaactagacaagtcagaagtcttctcgagaataatatttccttctaagtcggttagaattccgttaagatagtcgactcctatatcaataccaatcgagtagcctgcattcttattaaaaacaagcattacaggtcttctgccgcctctagattgccctgccccaatttcaaaaataaaatctttttcaagcagtgtatttacttgagaggagacagtagacttgtttaatcctgtaatctcagagagagttgccctggagacaggggagttcttcaaaatttcatctaatattaatttttgattcattttttttactaaagcttgatctgcaatttgaataataaccactcctttgtttatccaccgaactaagttggtgttttttgaagcttgaattagatatttaaaagtatcatatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattgaaataaacatttattttgtatatgatgagataaagttagtttattggataaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaagggggaaatgacaaatggtccaaactagtgatatctaaaaatcaaagggggaaatgggatccaaaggaggccataatatgagtcagaaaacagacgcacctttagaatcgtatgaagtgaacggcgcaacaattgccgtgctgccagaagaaatagacggcaaaatctgttccaaaattattgaaaaagattgcgtgttttatgtaaacatgaagccgctgcaaattgtcgacagaagctgccgattttttggatcaagctatgcgggaagaaaagcaggaacttatgaagtgacaaaaatttcacacaagccgccgatcatggtggacccttcgaaccaaatctttttattccctacactttcttcgacaagaccccaatgcggctggatttcccatgtgcatgtaaaagaattcaaagcgactgaattcgacgatacggaagtgacgttttccaatgggaaaacgatggagctgccgatctcttataattcgttcgagaaccaggtataccgaacagcgtggctcagaaccaaattccaagacagaatcgaccaccgcgtgccgaaaagacaggaatttatgctgtacccgaaagaagagcggacgaagatgatttatgattttattttgcgtgagctcggggaacggtattagaaaaatagccgcgggcggccgcactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaagaattgatcctctagcacaaaagaaaaacgaaatgatacaccaatcagtgcaaaaaaagatataatgggagataagacggttcgtgttcgtgctgacttgcaccatatcataaaaatcgaaacagcaaagaatggcggaaacgtaaaagaagttatggaaataagacttagaagcaaacttaagagtgtgttgatagtgcagtatcttaaaattttgtataataggaattgaagttaaattagatgctaaaaatttgtaattaagaaggagtgattacatgaacaaaaatataaaatattctcttggatccaaagtcatatgtaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatcccgggccagtttgttgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagtattagtaattatcatggctgtcatcccgggataacttcgtatagcatacattatacgaacggtagagctagcaaattctcgagttgccgccgggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgttgctctagagcggccgcatcgattcacagtggcaatctcccccgtattcgtttgaaatgtgccacattaacagcgccgggtgatgtccgtatcgttctgctaataagcggttgatgtgccgtgttttttctcggtagactttagatgtgaggcagtggttgtgccttccgccgtgcagctgtttgacgcgggaggcattgacgcgcaaaacttccggataggtttgcgacagccaggccggacgggctccgctcggcgttgctaatatgacccggccgcctatactgtgaatccgctcaaaaatatcatccagccattcaaattgatatacgccctcctccggctcaagtgcgctccatgcaaaaatgccgacagaaaacgtattcgtatgagaaagcttcatcagtttgatatcgtcagctaaaatatcgggccgatccagccactgatcggggttgtagtctc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Comk-psF(SEQ ID NO.7)具体为：cgatatctctgcagtcgcgatgattaattaattcag。
Comk-psR(SEQ ID NO.8)具体为：cagtctgcaggatatggtgcaagtcagcacgaac。
PCR反应体系如下：
在Mastercycler普通PCR仪(Eppendorf)上运行以下程序：
(1)98℃，2min；(2)98℃，15sec；(3)55℃，15sec；(4)72℃，2min；(5)循环从(2)到(4)，30次；(6)72℃，10min；(7)4℃，保存。
PCR产物经Axygen PCR清洁试剂盒回收纯化后，以限制性内切酶Pst I酶切，与经PstI和去磷酸化处理的线性质粒pMK4以T4DNA连接酶连接，连接液转入大肠杆菌DH5α，从大肠杆菌中分离得到重组质粒pMK4-comk。所述重组质粒pMK4-comk的质粒图谱如图3所示。
3.pGSNE-nprlR-comk的构建
pGSNE-nprlR-comk是在pGSNE-nprlR载体的基础上连接了含有启动子xylA及其抑制基因xylR、Kan基因表达框、Comk编码基因和两个lox位点，pGSNE-nprlR-comk是一种整合型重组质粒。
pGSNE-nprlR-comk的序列如SEQ NO.2所示，具体为：
agctctcgagaagatgatagctcatcaaaaatcccgccattgccaaataaatcgtatatggcattactgcaccataatcttttgagatttgattgggatatggcgcaagcagcaagacaagcagtccgataatcagcgtataaaataagcctagtaagatcttatccgttctccaatacagcttgaaaaacactacattcaacgcaatgggaagagtgatgatgaaaaacagaaacacgaatgcaatcggctccatcccatccgggtattccttccaatacgaaaagaaactaaaaatcatttgtacgatcggcaaactgacaacagcaaggtcgaacgtataaaacttaccctttccgccatgatcacgcggcatcagcatatagtgaaaagccgtcagcagcacatatccgtataacaaaaaatgcagcagcggcagcagttcttttccgtcctctcttaagtaagcgctggtgaagtttgttgattgcacctggtgaataagttcaacagacactcccgccagcagcacaatccgcaatataacacccgccaagaacattgtgcgctgccggtttattttgggatgatgcaccaaaagatataagcccgccagaacaacaattgaccattgaatcagcagggtgctttgtctgcttaatataaaataacgttcgaaatgcaatacataatgactgaataactccaacacgaacaacaatcctttacttcttattaaggcctcattcggttagacagcggacttttcaaaaagtttcaagatgaaacaaaaatatctcatcttccccttgatatgtaaaaaacataactcttgaatgaaccaccacatgacacttgactcatcttgatattattcaacaaaaacaaacacaggacaatactatcaattttgtctagttatgttagtttttgttgagtattccagaatgctagtttaatataacaatataaagttttcagtattttcaaaaagggggatttattgtgggtgctagctctaccgttcgtataatgtatgctatacgaagttatcccgggatgacagccatgataattactaatactaggagaagttaataaatacgtaaccaacatgattaacaattattagaggtcatcgttcaaaatggtatgcgttttgacacatccactatatatccgtgtcgttctgtccactcctgaatcccattccagaaattctctagcgattccagaagtttctcagagtcggaaagttgaccagacattacgaactggcacagatggtcataacctgaaggaagatctgattgcttaactgcttcagttaagaccgaagcgctcgtcgtataacagatgcgatgatgcagaccaatcaacatggcacctgccattgctacctgtacagtcaaggatggtagaaatgttgtcggtccttgcacacgaatattacgccatttgcctgcatattcaaacagctcttctacgataagggcacaaatcgcatcgtggaacgtttgggcttctaccgatttagcagtttgatacactttctctaagtatccacctgaatcataaatcggcaaaatagagaaaaattgaccatgtgtaagcggccaatctgattccacctgagatgcataatctagtagaatctcttcgctatcaaaattcacttccaccttccactcaccggttgtccattcatggctgaactctgcttcctctgttgacatgacacacatcatctcaatatccgaatagggcccatcagtctgacgaccaagagagccataaacaccaatagccttaacatcatccccatatttatccaatattcgttccttaatttcatgaacaatcttcattctttcttctctagtcattattattggtccattcactattctcattcccttttcagataattttagatttgcttttctaaataagaatatttggagagcaccgttcttattcagctattaataactcgtcttcctaagcatccttcaatccttttaataacaattatagcatctaatcttcaacaaactggcccgggataacttcgtataatgtatgctatacgaacggtacatatgactttggatccaagagaatattttatatttttgttcatgtaatcactccttcttaattacaaatttttagcatctaatttaacttcaattcctattatacaaaattttaagatactgcactatcaacacactcttaagtttgcttctaagtcttatttccataacttcttttacgtttccgccattctttgctgtttcgatttttatgatatggtgcaagtcagcacgaacacgaaccgtcttatctcccattatatctttttttgcactgattggtgtatcatttcgtttttcttttgtgctagaggatcaattcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtgcggccgcccgcggctatttttctaataccgttccccgagctcacgcaaaataaaatcataaatcatcttcgtccgctcttctttcgggtacagcataaattcctgtcttttcggcacgcggtggtcgattctgtcttggaatttggttctgagccacgctgttcggtatacctggttctcgaacgaattataagagatcggcagctccatcgttttcccattggaaaacgtcacttccgtatcgtcgaattcagtcgctttgaattcttttacatgcacatgggaaatccagccgcattggggtcttgtcgaagaaagtgtagggaataaaaagatttggttcgaagggtccaccatgatcggcggcttgtgtgaaatttttgtcacttcataagttcctgcttttcttcccgcatagcttgatccaaaaaatcggcagcttctgtcgacaatttgcagcggcttcatgtttacataaaacacgcaatctttttcaataattttggaacagattttgccgtctatttcttctggcagcacggcaattgttgcgccgttcacttcatacgattctaaaggtgcgtctgttttctgactcatattatggcctcctttggatcccatttccccctttgatttttagatatcactagtttggaccatttgtcatttccccctttgatttaagtgaacaagtttatccatcaactatcttaattgagttagtttgtttatccaataaactaactttatctcatcatatacaaaataaatgtttatttcaatgttttttttagaaaatttagttataatattagatatgatacttttaaatatctaattcaagcttcaaaaaacaccaacttagttcggtggataaacaaaggagtggttattattcaaattgcagatcaagctttagtaaaaaaaatgaatcaaaaattaatattagatgaaattttgaagaactcccctgtctccagggcaactctctctgagattacaggattaaacaagtctactgtctcctctcaagtaaatacactgcttgaaaaagattttatttttgaaattggggcagggcaatctagaggcggcagaagacctgtaatgcttgtttttaataagaatgcaggctactcgattggtattgatataggagtcgactatcttaacggaattctaaccgacttagaaggaaatattattctcgagaagacttctgacttgtctagttcttccgctagtgaagtaaaagagattttatttgcacttattcatggttttgtaacccatatgcctgagtccccttatggtctagtcggaataggaatttgtgttccaggccttgtagatcgtcatcagcaaattattttcatgcctaacttaaattggaatatcaaagatttgcagtttttaattgagagtgagtttaatgttccggtttttgttgaaaatgaagctaatgcaggagcatacggtgaaaaagtatttggtatgacaaaaaactatgaaaacatcgtttacatcagtattaatatcggaattggaactggacttgttattaacaacgaattgtataaaggtgttcagggtttttctggggaaatgggtcatatgacgatagattttaatggacccaaatgcagctgtggaaatcgaggctgttgggaattatatgcttctgaaaaagcgttactggcttcgctctctaaagaagaaaagaatatttctcgaaaagagattgtggaacgcgcaaataaaaatgatgtagaaatgttaaatgcacttcaaaactttggcttttatatcggaattggattaaccaatatccttaatacatttgatatagaagctgttatcttgagaaatcatataattgaatctcatcccattgttttaaatacgattaaaaacgaagtttcttctagagtccattctcatttagacaataaatgtgaactattgccttcttcgttaggaaaaaatgcacctgctttaggagcggtttctatcgttattgattcttttttaagtgttacccctataagttaggagctccccgggacgttcttgccattgctgcataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaattaattaatcatcgcgacggtaccggattgtaatattaggaaaagcctgagatccctcaggcttttattgttacatatcttgatttctctctcagctgaaacgacgaaaagatgctgccatgagacagaaaaccgctcctgatttgcataaagagggatgcagccgcaagtgcgcattttataaaagctaatgattcagtccacataattgatagacgaattctgctacaggtcacgtggctatgtgaagga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其中的kan-lox-comk片段以质粒pMD19T-kan-comk-lacA(SEQ ID NO.4)为模板，以Ck-npr-KpnF(SEQ ID NO.9)为上游引物，以Ck-npr-NheR(SEQ ID NO.10)为下游引物PCR扩增得到。
pMD19T-kan-comk-lacA(SEQ ID NO.4)具体为：
gcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgacgatcaggtcgcctgacaatatgtctcctgtcattatgtccttcacactctgatcaaacgtgaccagctgtttttcttccgtgaaattcatgacaaaaatataatcattgtcctgatcctgcctcgcttgtacggagacgccttttccgtgccgaaccggaaaaactggagagagagacaggtctgtgatcagaccctcatagaaatcacgctgaaattgatcctccaaacgcgcgccgataaaatacgccttgccctgctgatactcatggcttgtgaccgctggcgtgcgcgcataaaaatcttcttgatacaccgcttccactgaagctgtctttacatcaatcacggttgcataatccttcatttcatatatttggctgcggtagctgacagcgtttcgatccttcggatacagggtgtccgtttcaagaggctcaactccaaatatagcttgaaatcgatatctctgcagtcgcgatgattaattaattcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatcaataacgatagaaaccgctcctaaagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaaatgagaatggactctagaagaaacttcgtttttaatcgtatttaaaacaatgggatgagattcaattatatgatttctcaagataacagcttctatatcaaatgtattaaggatattggttaatccaattccgatataaaagccaaagttttgaagtgcatttaacatttctacatcatttttatttgcgcgttccacaatctcttttcgagaaatattcttttcttctttagagagcgaagccagtaacgctttttcagaagcatataattcccaacagcctcgatttccacagctgcatttgggtccattaaaatctatcgtcatatgacccatttccccagaaaaaccctgaacacctttatacaattcgttgttaataacaagtccagttccaattccgatattaatactgatgtaaacgatgttttcatagttttttgtcataccaaatactttttcaccgtatgctcctgcattagcttcattttcaacaaaaaccggaacattaaactcactctcaattaaaaactgcaaatctttgatattccaatttaagttaggcatgaaaataatttgctgatgacgatctacaaggcctggaacacaaattcctattccgactagaccataaggggactcaggcatatgggttacaaaaccatgaataagtgcaaataaaatctcttttacttcactagcggaagaactagacaagtcagaagtcttctcgagaataatatttccttctaagtcggttagaattccgttaagatagtcgactcctatatcaataccaatcgagtagcctgcattcttattaaaaacaagcattacaggtcttctgccgcctctagattgccctgccccaatttcaaaaataaaatctttttcaagcagtgtatttacttgagaggagacagtagacttgtttaatcctgtaatctcagagagagttgccctggagacaggggagttcttcaaaatttcatctaatattaatttttgattcattttttttactaaagcttgatctgcaatttgaataataaccactcctttgtttatccaccgaactaagttggtgttttttgaagcttgaattagatatttaaaagtatcatatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattgaaataaacatttattttgtatatgatgagataaagttagtttattggataaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaagggggaaatgacaaatggtccaaactagtgatatctaaaaatcaaagggggaaatgggatccaaaggaggccataatatgagtcagaaaacagacgcacctttagaatcgtatgaagtgaacggcgcaacaattgccgtgctgccagaagaaatagacggcaaaatctgttccaaaattattgaaaaagattgcgtgttttatgtaaacatgaagccgctgcaaattgtcgacagaagctgccgattttttggatcaagctatgcgggaagaaaagcaggaacttatgaagtgacaaaaatttcacacaagccgccgatcatggtggacccttcgaaccaaatctttttattccctacactttcttcgacaagaccccaatgcggctggatttcccatgtgcatgtaaaagaattcaaagcgactgaattcgacgatacggaagtgacgttttccaatgggaaaacgatggagctgccgatctcttataattcgttcgagaaccaggtataccgaacagcgtggctcagaaccaaattccaagacagaatcgaccaccgcgtgccgaaaagacaggaatttatgctgtacccgaaagaagagcggacgaagatgatttatgattttattttgcgtgagctcggggaacggtattagaaaaatagccgcgggcggccgcactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaagaattgatcctctagcacaaaagaaaaacgaaatgatacaccaatcagtgcaaaaaaagatataatgggagataagacggttcgtgttcgtgctgacttgcaccatatcataaaaatcgaaacagcaaagaatggcggaaacgtaaaagaagttatggaaataagacttagaagcaaacttaagagtgtgttgatagtgcagtatcttaaaattttgtataataggaattgaagttaaattagatgctaaaaatttgtaattaagaaggagtgattacatgaacaaaaatataaaatattctcttggatccaaagtcatatgtaccgttcgtatagcatacattatacgaagttatcccgggccagtttgttgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagtattagtaattatcatggctgtcatcccgggataacttcgtatagcatacattatacgaacggtagagctagcaaattctcgagttgccgccgggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgttgctctagagcggccgcatcgattcacagtggcaatctcccccgtattcgtttgaaatgtgccacattaacagcgccgggtgatgtccgtatcgttctgctaataagcggttgatgtgccgtgttttttctcggtagactttagatgtgaggcagtggttgtgccttccgccgtgcagctgtttgacgcgggaggcattgacgcgcaaaacttccggataggtttgcgacagccaggccggacgggctccgctcggcgttgctaatatgacccggccgcctatactgtgaatccgctcaaaaatatcatccagccattcaaattgatatacgccctcctccggctcaagtgcgctccatgcaaaaatgccgacagaaaacgtattcgtatgagaaagcttcatcagtttgatatcgtcagctaaaatatcgggccgatccagccactgatcggggttgtagtctcccccatggagcataaattttgcttttgttacgtgcgttttttcaagctttgacatcacaccatctctagaggatccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaga。
Ck-npr-Kpn F(SEQ ID NO.9)具体为：cttttcctaatattacaatccggtaccgtcgcgatgattaattaattcagaacg。
Ck-npr-Nhe R(SEQ ID NO.10)具体为：Gggatttattgtgggtgctagctctaccgttcgtataatg。
PCR反应体系如下：
在Mastercycler普通PCR仪(Eppendorf)上运行以下程序：
(1)98℃，2min；(2)98℃，15sec；(3)55℃，15sec；(4)72℃，3min 30sec；(5)循环从(2)到(4)，30次；(6)72℃，10min；(7)4℃，保存。
PCR产物经Axygen PCR清洁试剂盒回收纯化。以限制性内切酶Nhe I和Kpn I双酶切质粒pGSNE-nprlR，酶切产物经Axygen PCR清洁试剂盒回收纯化。上述纯化产物经Infusion试剂盒(购自TaKaRa)进行连接，连接液转入大肠杆菌DH5α，从大肠杆菌中分离得到重组质粒pGSNE-nprlR-comk。所述重组质粒pGSNE-nprlR-comk的质粒图谱如图2所示。
实例2 枯草芽孢杆菌164S的构建
采用质粒pMK4-comk、pGSNE-nprlR-comk、pMK4-cre改造枯草芽孢杆菌A164(A164基因组序列的DDBJ/EMBL/GenBank获取号为no.CP011115)，最终得到一株易于操作的高转化效率的枯草芽孢杆菌164S，流程图见图4。
具体操作如下：
首先，把pMK4-comk转化进入枯草芽孢杆菌A164。转化采用高渗法电击转化的方法，
a)接种枯草芽孢杆菌A164于3mL LB培养基中，过夜培养；
b)取2.6mL过夜培养菌液转接到40mL(LB+0.5M山梨醇)中，37℃，200rpm培养至OD600＝0.8；
c)将菌液冰水浴10min，然后5000g，5min，4℃离心收集菌体；
d)用30mL预冷的电转培养基(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％葡萄糖)，重新吹悬菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗3次；
e)漂洗三次后，利用未完全除去的电转培养基将菌体吹悬后分装，每EP管分装60μL；
f)将60μL感受态细胞中加入50ng质粒pMK4-comk，冰上孵育2min，加入预冷的电转杯(1mm)中，设置电压2kV，电击一次；
g)电击完毕取出杯子并立即加入1mLRM(LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇)，37℃，200rpm，复苏3hr后，涂5μg/mL的氯霉素抗性板；37℃，过夜培养筛选得到含有pMK4-comk质粒的枯草芽孢杆菌A164C。
然后，通过限制性内切酶Nco I酶切线性化质粒pGSNE-nprlR-comk，通过诱导转化的方法将线性化质粒pGSNE-nprlR-comk转化进入A164C，具体方法如下：
a)把平板活化的单菌落接种到3mL LB试管中，37℃、200rpm培养10～12h；
b)b)然取300μL培养液转接到预热的3mL LB试管中，加入滤膜灭菌的的木糖溶液至木糖终浓度为1％，37℃、200rpm培养3h；
c)分装到2mL Eppendorf管中，按比例100ngDNA/100μL培养液加入线性化的质粒后孵育，37℃、200rpm培养1.5h；涂10μg/mL的卡那霉素抗性板；37℃，过夜培养筛选得到含有comk整合到基因组上的含有卡纳抗性片段的菌。
然后通过在无氯霉素添加的LB培养基中传代，筛选到消除质粒pMK4-comk的枯草芽孢杆菌A164K。
最后，采用诱导转化的方法把pMK4-cre转化进入枯草芽孢杆菌A164K，在cre酶的作用下使两个lox位重组，通过印章法利用10μg/mL的卡那霉素抗性板反向筛选，得到了丢失两个lox位点间的kan基因。通过在无抗生素添加的LB培养基中传代，最终筛选到消除质粒pMK4-cre的枯草芽孢杆菌164S。
亦即，本发明本质上是用comk cassette(即xylR-PxylA-comk片段，序列参考SEQNO.2)替换了A164的中性蛋白酶编码基因nprE的部分序列。具体的，本发明的是枯草芽孢杆菌164S将枯草芽孢杆菌A164中如SEQ NO.11所示的序列敲除，并替换为如SEQ NO.12所示的序列。
亦即，被敲除的序列如SEQ ID NO.11所示，具体如下：
ttaggtaagaaattgtctgttgctgtcgctgcttcgtttatgagtttatcaatcagcctgccaggtgttcaggctgctgaaggtcatcagcttaaagagaatcaaacaaatttcctctccaaaaacgcgattgcgcaatcagaactctctgcaccaaatgacaaggctgtcaagcagtttttgaaaaagaacagcaacatttttaaaggtgacccttccaaaaggctgaagcttgttgaaagcacgactgatgcccttggatacaagcactttcgatatgcgcctgtcgttaacggagtgccaattaaagattcgcaagtgatcgttcacgtcgataaatccgataatgtctatgcggtcaatggtgaattacacaatcaatctgctgcaaaaacagataacagccaaaaagtctcttctgaaaaagcgctggcactcgctttcaaagctatcggcaaatcaccagacgctgtttctaacggagcggccaaaaacagcaataaagccgaattaaaagcgatagaaacaaaagacggcagctatcgtcttgcttacgacgtgacgattcgctatgtcgagcctgaacctgcaaactgggaagtcttagttgacgccgaaacaggcagcattttaaaacagcaaaataaagtagaacatgccgccgccactggaagcggaacaacgctaaagggcgcaactgttcctttgaacatctcttatgaaggcggaaaatatgttctaagagatctttcaaaaccaacaggcacccaaatcatcacatatgatttgcaaaacagacaaagccgccttccgggcacgcttgtctcaagcacaacgaaaacatttacatcttcatcacagcgggcagccgttgacgcacactataacctcggtaaagtgtacgattatttttattcaaactttaaacgaaacagctatgataacaaaggcagtaaaatcgtttcttccgttcactacggcactcaatacaataacgctgcatggacaggagaccagatgatttacggtgatggcgacggttcattcttctctccgctttccggctcattagatgtgacagcgcatgaaatgacacatggcgtcacccaagaaacagccaacttgatttatgaaaatcagccaggtgcattaaacgagtctttctctgacgtattcgggtattttaacgatacagaagactgggacatcggtgaagacattacggtcagccagcctgctcttcgcagcctgtccaaccctacaaaatacaaccagcctgacaattacgccaattaccgaaaccttccaaacacagatgaaggcgattatggcggtgtacacacaaacagcggaattccaaacaaagccgcttacaacaccatcacaaaacttggtgtatctaaatcacagcaaatctattaccgtgcgttaacaacgtacctcacgccttcttccacgttcaaagatgccaaggcagctctcattcagtctgcccgtgacctctacggctcaactgatgccgctaaagttgaagcagcctggaatgctgtt。
替换为的新序列如SEQ ID NO.12所示，具体如下：
gctagctcatggcaagcatatcgtatgtaatatgcttgccatcatatgactttggatccaagagaatattttatatttttgttcatgtaatcactccttcttaattacaaatttttagcatctaatttaacttcaattcctattatacaaaattttaagatactgcactatcaacacactcttaagtttgcttctaagtcttatttccataacttcttttacgtttccgccattctttgctgtttcgatttttatgatatggtgcaagtcagcacgaacacgaaccgtcttatctcccattatatctttttttgcactgattggtgtatcatttcgtttttcttttgtgctagaggatcaattcttgaagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtgcggccgcccgcggctatttttctaataccgttccccgagctcacgcaaaataaaatcataaatcatcttcgtccgctcttctttcgggtacagcataaattcctgtcttttcggcacgcggtggtcgattctgtcttggaatttggttctgagccacgctgttcggtatacctggttctcgaacgaattataagagatcggcagctccatcgttttcccattggaaaacgtcacttccgtatcgtcgaattcagtcgctttgaattcttttacatgcacatgggaaatccagccgcattggggtcttgtcgaagaaagtgtagggaataaaaagatttggttcgaagggtccaccatgatcggcggcttgtgtgaaatttttgtcacttcataagttcctgcttttcttcccgcatagcttgatccaaaaaatcggcagcttctgtcgacaatttgcagcggcttcatgtttacataaaacacgcaatctttttcaataattttggaacagattttgccgtctatttcttctggcagcacggcaattgttgcgccgttcacttcatacgattctaaaggtgcgtctgttttctgactcatattatggcctcctttggatcccatttccccctttgatttttagatatcactagtttggaccatttgtcatttccccctttgatttaagtgaacaagtttatccatcaactatcttaattgagttagtttgtttatccaataaactaactttatctcatcatatacaaaataaatgtttatttcaatgttttttttagaaaatttagttataatattagatatgatacttttaaatatctaattcaagcttcaaaaaacaccaacttagttcggtggataaacaaaggagtggttattattcaaattgcagatcaagctttagtaaaaaaaatgaatcaaaaattaatattagatgaaattttgaagaactcccctgtctccagggcaactctctctgagattacaggattaaacaagtctactgtctcctctcaagtaaatacactgcttgaaaaagattttatttttgaaattggggcagggcaatctagaggcggcagaagacctgtaatgcttgtttttaataagaatgcaggctactcgattggtattgatataggagtcgactatcttaacggaattctaaccgacttagaaggaaatattattctcgagaagacttctgacttgtctagttcttccgctagtgaagtaaaagagattttatttgcacttattcatggttttgtaacccatatgcctgagtccccttatggtctagtcggaataggaatttgtgttccaggccttgtagatcgtcatcagcaaattattttcatgcctaacttaaattggaatatcaaagatttgcagtttttaattgagagtgagtttaatgttccggtttttgttgaaaatgaagctaatgcaggagcatacggtgaaaaagtatttggtatgacaaaaaactatgaaaacatcgtttacatcagtattaatatcggaattggaactggacttgttattaacaacgaattgtataaaggtgttcagggtttttctggggaaatgggtcatatgacgatagattttaatggacccaaatgcagctgtggaaatcgaggctgttgggaattatatgcttctgaaaaagcgttactggcttcgctctctaaagaagaaaagaatatttctcgaaaagagattgtggaacgcgcaaataaaaatgatgtagaaatgttaaatgcacttcaaaactttggcttttatatcggaattggattaaccaatatccttaatacatttgatatagaagctgttatcttgagaaatcatataattgaatctcatcccattgttttaaatacgattaaaaacgaagtttcttctagagtccattctcatttagacaataaatgtgaactattgccttcttcgttaggaaaaaatgcacctgctttaggagcggtttctatcgttattgattcttttttaagtgttacccctataagttaggagctccccgggacgttcttgccattgctgcataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaattaattaatcatcgcgacggtacc。
利用普通的质粒DNA(例如pMK4、pHT01等可在苦草芽孢杆菌中自助复制的穿梭质粒)对枯草芽孢杆菌164S进行转化，转化效率可以达到104～105CFU/μg DNA。
实例3 枯草芽孢杆菌164S淀粉酶基因的敲除
采用诱导转化的方式，可以方便地对枯草芽孢杆菌164S进行基因操作。利用限制性内切酶Kpn I切割淀粉酶敲除质粒pDG364后，不做产物的清洁，直接转化枯草芽孢杆菌164S：
a)把平板活化的枯草芽孢杆菌164S落接种到3mL LB试管中，37℃、200rpm培养10～12h；
b)然取300μL培养液转接到预热的3mL LB试管中，加入滤膜灭菌的的木糖溶液至木糖终浓度为1％，37℃、200rpm培养3h；
c)分装到2mL Eppendorf管中，按比例100ng DNA/100μL培养液加入线性化的质粒后孵育，37℃、200rpm培养1.5h。涂5μg/mL的氯霉素抗性板。37℃，过夜培养。
挑取单克隆转接筛选得到的菌于含2‰(质量分数)可溶性淀粉的LB平板上，37℃过夜培养，然后用碘液检测淀粉水解圈的方式鉴定淀粉酶敲除情况，检测结果见图5，淀粉酶基因敲除效率大于90％。由此可见，本发明所得到的新的苦草芽孢具有很强的操作性，具有广泛的应用前景。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (14)

1.一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌基因组中含有xylR-PxylA-comk表达单元，所述xylR-PxylA-comk表达单元的序列包括5’至3’方向依次排列的xylR基因序列、xylA启动子基因序列、comk基因序列。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述xylR-PxylA-comk表达单元的基因序列如SEQ ID NO.12所示。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌A164改造获得。
4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌是将枯草芽孢杆菌A164中的中性蛋白酶基因nprE敲除并替换为xylR-PxylA-comk表达单元构建获得。
5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，被敲除的中性蛋白酶基因nprE的基因序列如SEQ ID NO.11所示。
6.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌除了中性蛋白酶基因nprE被敲除和替换之外，还可经过其他基因改造。
7.一种制备如权利要求1～6任一权利要求所述枯草芽孢杆菌的方法，包括步骤：将枯草芽孢杆菌A164中的中性蛋白酶基因nprE敲除并替换为xylR-PxylA-comk表达单元。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用基因重组介导的基因操作敲除和替换中性蛋白酶基因nprE。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用Cre-LoxP重组酶系统介导的基因重组方法敲除和替换所述中性蛋白酶基因nprE。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括对所述枯草芽孢杆菌进行了单个或者多个感兴趣目标基因的改造。
11.如权利要求1～6任一权利要求所述枯草芽孢杆菌的用途，为将所述枯草芽孢杆菌作为表达宿主。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，将所述枯草芽孢杆菌作为表达宿主用于外源基因的高效表达。
13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，将所述枯草芽孢杆菌作为表达宿主用于工业多肽类产品、蛋白类产品、药剂和酶制剂的高效表达。
14.一种表达外源基因的方法，包括如下步骤：
1)构建含有外源基因的重组表达载体；
2)将步骤1)获得的重组表达载体转染如权利要求1～6任一权利要求所述枯草芽孢杆菌，并在合适表达所述外源基因的条件下培养所述宿主。
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