JP2003274958A - 多コピー型・ゲノム挿入型の選択両用ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 そのまま細胞に導入した場合には細胞内で多
コピー型として保持されるが、導入前に制限酵素で処理
することにより、染色体上の所定の遺伝子座に挿入され
るゲノム挿入型に変換することができる選択両用ベクタ
ーを提供すること。 【解決手段】 切り出し可能なＡＲＳ（自律複製配列）
に連結された第１選択マーカー遺伝子と、シゾサッカロ
ミセス・ポンベ等の宿主細胞のゲノムＤＮＡとの間で相
同組換え可能な分断された状態の第２選択マーカー遺伝
子とを備え、第１選択マーカー遺伝子が、制限酵素認識
部位を介して第２選択マーカー遺伝子を分断している、
ＡＲＳに連結された第１選択マーカー遺伝子の切出しの
有無により、多コピー型とゲノム挿入型とを選択するこ
とができる選択両用ベクターとする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、目的遺伝子の過剰
発現に適した多コピー型のベクターとして、あるいは、
目的遺伝子の細胞当たりの発現量を精確に把握するのに
適したゲノム挿入型のベクターとして使用することがで
きる選択両用ベクターに関する。

【０００２】

【従来の技術】安価な培地で生育が可能な酵母は、動物
細胞と比較して分裂速度が速く、また細菌と比較して翻
訳後修飾が動物細胞と類似していることから、組換えＤ
ＮＡ技術による蛋白質産生の宿主として注目を集め、従
来、種々の酵母を宿主とした発現系が報告されている
（Yeast, 8, 423-488, 1992）。分裂酵母であるシゾサ
ッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
は、出芽酵母であるサッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）と同様に、その遺伝的及び分子
的アプローチの容易さから真菌一般のモデル生物として
広く利用されている上に、特に細胞周期、染色体の構
造、ＲＮＡスプライシング、産生タンパク質のアセチル
化・リン酸化、翻訳後修飾などが動物細胞に類似し（Ce
ll, 45, 781-782, 1986; Nature, 318, 78-80, 1985; C
ell. Biol., 109, 2693-2702, 1989）、このため、動物
細胞由来のタンパク質を発現させる宿主として、すでに
実用化段階に達している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】分裂酵母では、研究対
象の遺伝子を細胞に導入し発現させるためのベクターと
して様々なものが作製されている。これらは主として染
色体外でプラスミドとして保持される多コピー型のもの
であり（Gene, 221, 59-68, 1998; Gene, 191, 191-19
5, 1997; Gene, 164, 173-177, 1995; Yeast, 18, 463-
468, 2001; Yeast,16, 861-872, 2000）、これら多コピ
ー型のベクターを用いて目的遺伝子を発現させることに
より、ある変異の抑圧や遺伝子の過剰発現による影響、
あるいは遺伝子産物の局在観察などが行われてきた。こ
れら多コピー型のベクターは目的遺伝子の過剰発現や遺
伝子産物の検出などが容易になるという利点を有するも
のの、場合によってはその発現量が正しい生理的現象を
反映せず、誤った実験結果を導くこともよく見うけられ
る。

【０００４】一方、最近、プラスミドを一カ所だけ制限
酵素で消化し、その直鎖状のＤＮＡ断片を酵母に導入す
ると、制限酵素で消化した部分の周辺のＤＮＡ配列と相
同なゲノム上のＤＮＡ部分との間で相同組換えが起こ
り、導入した断片がゲノムに挿入されることが明らかに
された（Gene, 123, 127-130, 1993）。このようにして
ゲノムに挿入された遺伝子断片は細胞内でのコピー数が
必ず１に限定されるため、遺伝子の過剰発現の目的には
適さないが、細胞ごとのばらつきがほとんどなくなり、
安定した実験結果が得られるという利点がある。

【０００５】最近、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポン
ベの全ゲノム構造解析が終了した（Nature 415, 871-88
0, 2002）。かかる構造解析により、塩基配列が決定さ
れても遺伝子発現産物のうちデータベースを利用した相
同タンパク質の検索などにより、機能が推定できる遺伝
子は極めて少なく、また、実際に細胞内において発現、
機能しているタンパク質の多くは細胞の状態によって、
その発現量の変化や翻訳後修飾によって様々に変動す
る。そこで、全遺伝子発現産物の機能や発現部位・時期
等について、得られた配列情報に基づいて予測されてい
るすべての遺伝子をクローニングし、得られたＤＮＡ
を、蛍光性タンパク質ＧＦＰ遺伝子に連結しうる多コピ
ー型のベクターを利用して解析を進めたところ、遺伝子
産物を容易に検出することができるが、発現量が正しい
生理的現象を反映しないことがしばしば観察され、他
方、ゲノム挿入型のベクターを用いると、細胞ごとのば
らつきがほとんどなくなり、安定した実験結果が得られ
ることがわかった。被検遺伝子の数が少ない場合は、多
コピー型のベクターとゲノム挿入型のベクターとの両ベ
クターに被検遺伝子をクローニングする作業負担は少な
いが、被検遺伝子の数が数千に及ぶと、多コピー型のベ
クターとゲノム挿入型のベクターとの両ベクターに被検
遺伝子をクローニングする作業負担がきわめて大きくな
る。そして、この両ベクターに被検遺伝子をクローニン
グする作業負担が遺伝子の機能解析上大きな問題となっ
ていた。

【０００６】本発明の課題は、目的遺伝子の過剰発現に
適した多コピー型と、目的遺伝子の細胞当たりの発現量
を精確に把握するのに適したゲノム挿入型とを容易に選
択することができる選択両用ベクター、例えば、そのま
ま細胞に導入した場合には細胞内で多コピー型として保
持されるが、導入前に制限酵素で処理することにより、
染色体上の所定の遺伝子座に挿入されるゲノム挿入型に
変換することができる選択両用ベクターを提供すること
にある。かかる選択両用ベクターを用いると、形質転換
体をそれぞれ異なる選択マーカーで選択することによ
り、例えば、制限酵素による消化の有無と形質転換後の
選択培地を組み合わせることによって、多コピー型とゲ
ノム挿入型の二つのタイプを容易に選択することがで
き、ひいては被検遺伝子をクローニングする作業負担を
大幅に軽減できる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究し、そのまま細胞に導入した
場合には細胞内で多コピー型として保持されるが、導入
前に制限酵素（Not I,Sac II又はApa I）で処理するこ
とにより、染色体上のleu1遺伝子座に挿入することがで
きるベクターを用いて、分裂酵母シゾサッカロミセス・
ポンベを形質転換すると、かかる形質転換体はそれぞれ
異なる栄養要求性マーカーで選択するため、制限酵素に
よる消化の有無と形質転換後の選択培地を組み合わせる
ことにより、多コピー型とゲノム挿入型の二つのタイプ
を容易に選択することができ、分裂酵母で汎用されるベ
クターの二つの利点を一つのベクターで利用できること
を見い出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち本発明は、切り出し可能なＡＲＳ
に連結された第１選択マーカー遺伝子と、宿主細胞のゲ
ノムＤＮＡとの間で相同組換え可能な分断された状態の
第２選択マーカー遺伝子とを備え、前記ＡＲＳに連結さ
れた第１選択マーカー遺伝子の切出しの有無により、多
コピー型とゲノム挿入型とを選択することができること
を特徴とする選択両用ベクター（請求項１）や、ＡＲＳ
に連結された第１選択マーカー遺伝子が、制限酵素認識
部位を介して第２選択マーカー遺伝子を分断しているこ
とを特徴とする請求項１記載の選択両用ベクター（請求
項２）や、宿主細胞が、第２選択マーカー遺伝子機能を
ゲノム上で欠失していることを特徴とする請求項１又は
２記載の選択両用ベクター（請求項３）や、宿主細胞
が、真核細胞であることを特徴とする請求項１〜３のい
ずれか記載の選択両用ベクター（請求項４）や、真核細
胞が、酵母であることを特徴とする請求項４記載の選択
両用ベクター（請求項５）や、酵母が、シゾサッカロミ
セス・ポンベであることを特徴とする請求項５記載の選
択両用ベクター（請求項６）や、分断された状態の第２
選択マーカー遺伝子が、その５'側ＤＮＡ断片にプロモ
ーター領域を含むことを特徴とする請求項１〜６のいず
れか記載の選択両用ベクター（請求項７）や、分断され
た状態の第２選択マーカー遺伝子が、その３'側ＤＮＡ
断片において、第２選択マーカー遺伝子機能欠失処理が
施されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか
記載の選択両用ベクター（請求項８）や、目的遺伝子の
クローニング部位を有することを特徴とする請求項１〜
８のいずれか記載の選択両用ベクター（請求項９）に関
する。

【０００９】また本発明は、配列番号１に示される塩基
配列からなるＤＮＡ、又はこれらの配列の一部若しくは
全部を含む配列からなり、かつ選択両用ベクター機能を
備えたＤＮＡ（請求項１０）に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の選択両用ベクターとして
は、切り出し可能なＡＲＳ（自律複製配列）に連結され
た第１選択マーカー遺伝子と、宿主細胞のゲノムＤＮＡ
との間で相同組換え可能な分断された状態の第２選択マ
ーカー遺伝子とを備え、前記ＡＲＳに連結された第１選
択マーカー遺伝子の切出しの有無により、多コピー型と
ゲノム挿入型とを選択することができるベクターであれ
ば特に制限されるものではなく、ＡＲＳに連結された第
１選択マーカー遺伝子の切出しをしない場合、ＡＲＳに
より宿主細胞内で自律的に増殖しうるタイプの多コピー
型ベクターとして選択・利用することができ、ＡＲＳに
連結された第１選択マーカー遺伝子の切出しをする場
合、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの間で相同組換え可能な
ゲノム挿入型ベクターとして選択・利用することができ
る。

【００１１】上記ベクターの種類としては、例えば、プ
ラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルス等を例示
することができる。また、上記ＡＲＳとしては、細胞中
で染色体に組み込まれず複製を自律的に続けることがで
きる複製開始点（ｏｒｉ領域）を含むＤＮＡ断片であれ
ばどのようなものでもよく、大腸菌ｏｒｉＣ、酵母ＡＲ
Ｓ、大腸菌ｏｒｉＣ、出芽酵母２μ、分裂酵母ａｒｓ
１、糸状菌ＡＭＡ１等を例示することができる。

【００１２】上記宿主細胞としては、ＡＲＳによりベク
ターを自律複製させることができ、かつ、ゲノムＤＮＡ
と相同のＤＮＡ配列との間で相同組換えを可能とする細
胞であれば特に制限されるものではなく、大腸菌、枯草
菌細菌等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の
真核細胞や、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞等の動物細胞や、
ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞
や、植物細胞などを例示することができるが、カビ、酵
母等の真核細胞が好ましく、中でもシゾサッカロミセス
属（Schizosaccharomyces）に属する分裂酵母が好まし
く、特にシゾサッカロミセス・ポンベ（S.pombe）が好
ましい。これら宿主細胞へのベクターの導入は、Davis
ら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及び
Sambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUA
L, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, C
old Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的
な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸
カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキスト
ラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(t
ransvection)、マイクロインジェクション、カチオン性
脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーショ
ン、形質導入、スクレープローディング (scrapeloadin
g)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により
行うことができる。

【００１３】本発明における第１選択マーカー遺伝子と
第２選択マーカー遺伝子は異なるマーカー遺伝子であ
り、かかるマーカー遺伝子としては、抗生物質等の薬剤
耐性遺伝子や、栄養要求マーカー遺伝子等のレシピエン
ト細胞における欠失産物をコードするＤＮＡを挙げるこ
とができ、上記薬剤耐性遺伝子としては、ネオマイシ
ン、カナマイシン、パロモマイシンの耐性遺伝子である
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、Ｇ４１８耐性
遺伝子であるアミノグリコシドホスフォトランスフェラ
ーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子であるハイ
グロマイシンＢホスフォトランスフェラーゼ遺伝子など
を例示することができる。特に、酵母選択マーカー遺伝
子としては、上記の抗生物質耐性遺伝子の他、ｌｅｕ
１、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ｕｒａ４等の栄養
要求マーカー遺伝子を例示することができる。これら選
択マーカー遺伝子と選択培地を組み合わせることによっ
て、選択マーカー遺伝子を発現する細胞を選択すること
ができる。

【００１４】本発明の選択両用ベクターは、ＡＲＳに連
結された第１選択マーカー遺伝子を切出しできるように
構築されている。かかる切出しには、各種制限酵素を使
用する方法や部位特異的な組換え方法を用いることがで
きる。部位特異的な組換えには、バクテリオファージＰ
１由来のリコンビナーゼＣｒｅ／ｌｏｘＰ配列、出芽酵
母サッカロミセス・セレビッシェ由来のリコンビナーゼ
ＦＬＰ／ＦＲＴ配列、醤油酵母チゴサッカロミセス・ル
キシー（Zygosaccharomyces rouxii）由来のリコンビナ
ーゼＲ／ＲＳ配列、バクテリオファージＭｕ由来のリコ
ンビナーゼＧｉｎ／ｇｉｘ配列等を用いることができ
る。

【００１５】本発明の選択両用ベクターの好適な態様と
して、ＡＲＳに連結された第１選択マーカー遺伝子が、
制限酵素認識部位を介して第２選択マーカー遺伝子を分
断しているベクターを挙げることができる。この場合、
分断された状態の第２選択マーカー遺伝子の５'側ＤＮ
Ａ断片にプロモーター領域を含むものが、相同組換え後
の第２選択マーカー遺伝子の高発現の点で好ましい。こ
のプロモーター領域の上流にターミネーター配列を連結
させ、第２選択マーカー遺伝子の高発現が影響されない
ようにしておくこともできる。また、分断された状態の
第２選択マーカー遺伝子の３'側ＤＮＡ断片としては、
相同組換えが生起しうる範囲で、３'側末端を削除した
り、読み枠をずらしたりして、第２選択マーカー遺伝子
機能を欠失させる処理を施こしておくことが、第１選択
マーカー遺伝子の切り出し前のベクター上で第２選択マ
ーカー遺伝子が機能する可能性を排除する点で、また、
相同組換え後の宿主細胞において、１つの第２選択マー
カー遺伝子を再構築させる点で好ましい。同様に、相同
組換え後の宿主細胞において、１つの第２選択マーカー
遺伝子を再構築させる目的で、宿主細胞として、点変異
など第２選択マーカー遺伝子機能がゲノム上で欠失して
いるものを用いることもできる。

【００１６】本発明の選択両用ベクターには、目的遺伝
子のクローニングサイトを設けておくことが好ましく、
このクローニングサイトをＧＦＰ遺伝子等の蛍光蛋白質
遺伝子の３'側末端に設けておくことにより、目的遺伝
子の発現産物の局在観察が可能となる。そして、分裂酵
母シゾサッカロミセス・ポンベに好適に用いることがで
きる本発明の選択両用ベクターとして、配列番号１に示
される塩基配列からなるpDUALを具体的に例示すること
ができるが、配列番号１の配列の一部又は全部を含む配
列からなり、かつ選択両用ベクター機能を備えたＤＮＡ
もpDUAL同様に好適に用いることができる。

【００１７】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
するが、本発明の技術的範囲はこの実施例によって何ら
制限されるものではない。 実施例Ａ（材料と方法） Ａ−１（使用した分裂酵母菌株等） 野生株としてシゾサッカロミセス・ポンベＪＹ３（h⁹⁰
wild-type）、ロイシン要求株としてシゾサッカロミセ
ス・ポンベＪＹ２６５（h^- leu1-32）、及びウラシル・
ロイシン・アデニン要求株としてシゾサッカロミセス・
ポンベＪＹ７４５（h⁺ ura4-D18 leu1-32 ade6-M216）
を用いた。これら分裂酵母菌株は、東京大学大学院理学
系研究科生物化学専攻山本正幸博士から供与されたもの
を用いた。また、これらの分裂酵母菌株に使用する培地
として、通常の分裂酵母の培養・増殖にはYE完全培地
［Yeast extract；０．５％（ｗ／ｖ）、グルコース；
２％（ｗ／ｖ）］を、アミノ酸類が含まれておらず、菌
株の栄養要求性のチェックや形質転換体の選択にはＳＤ
合成選択培地［Yeast nitrogen base w/o amino acid
s；０．６７％（ｗ／ｖ）、グルコース；２％（ｗ／
ｖ）］をそれぞれ使用した。なお、栄養要求性株の培養
の際にはアデニン、ロイシン又はウラシルをそれぞれ終
濃度50 μg/mlになるように添加して用いた。そしてま
た、市販品以外のベクターであるpFA6a-3HA-kanMX6とpR
EP2は東京大学大学院理学系研究科生物化学専攻山本正
幸博士から供与されたものを用いた。

【００１８】Ａ−２（分裂酵母の形質転換） 分裂酵母の形質転換は文献（Genetics, 155, 539-549,
2000）に記載されている方法によって実施した。すなわ
ち、分裂酵母菌株をＹＥ完全培地で培養した、対数増殖
期以降の細胞を使用した。遠心分離により細胞を回収
し、５０μＬの０．１Ｍの酢酸リチウム、ｐＨ５．０に
再懸濁した。直後にサンプルＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、
及び１５０μＬの５０％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ４０００）を細胞懸濁液に添加し、かかる
混合液を室温で少なくとも３０分間インキュベーション
した。２０μＬのジメチルスルフォキシドを添加した
後、細胞を４２℃にて１５分間加熱し、遠心沈殿し、Ｈ
₂Ｏに再懸濁して、適切な選択培地に蒔いた。得られた
形質転換体はＳＤ培地で選択した。

【００１９】Ａ−３（プラスミドの作製に用いたオリゴ
ＤＮＡ） ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅の際には、Pyrobest Ｄ
ＮＡ Polymerase（TaKaRa）を用いた。また、ＤＮＡ断
片の連結にはLigation High（TOYOBO）を用いた。ＰＣ
ＲによるＤＮＡ断片の増幅には、以下のプライマーを用
い、９５℃で３分間変性させた後、９５℃で１５秒間変
性させ、５０℃で１５秒間アニーリングし、７２℃で２
分３０秒間（leu1-32変異遺伝子を分裂酵母ゲノムＤＮ
Ａから増幅する場合のみ１分間）伸長反応させるという
サイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で３分間伸長
反応を行うという条件下に実施した。

【００２０】 （プライマー） SPBC1A4.02c.Fd；（配列番号２） 5'-AAAAAGCAGGCTCTCATATGTGTGCAAAGAAAATCGT-3' SPBC1A4.02c.Rv；（配列番号３） 5'-AGAAAGCTGGGTACAAAATTTTTTCAAGTTCT-3' BamHI-Tadh-F；（配列番号４） 5'-TTCCCGGGATCCGGCGCGCCACTTCTAAATAAGCG-3' SpeI-Tadh-R；（配列番号５） 5'- GGGTCGACTAGTATATTACCCTGTTATCCCTAGCGG-3' SpeI-P-leu1-F；（配列番号６） 5'-GGGTCGACTAGTAAGATGATTCTTTTATCGTCGATAACG-3' NotI-leu1(5')-R；（配列番号７） 5'-TTGCATGCGGCCGCCAAACGAGCAATACGAGAAACTTC-3' NotI-ApaI-ars1-F；（配列番号８） 5'-TGCATGCGGCCGCGGGCCCAACCTTCCAATTCATTAAATCG-3' NotI-ApaI-ura4-R；（配列番号９） 5'-TTGCATGCGGCCGCGGGCCCAACACCAATGTTTATAACC-3' NotI-leu1(3')-F；（配列番号１０） 5'-TTGCATGCGGCCGCTTAGCTGAAACTTCCAACCCTCC-3' SacI-leu1(delta3)-R；（配列番号１１） 5'-GGTCTAGAGCTCGGGAGCGCTACCGTGAATGGGCTC-3'

【００２１】実施例Ｂ（結果） Ｂ−１（leu1-32の変異点の解析） 宿主細胞（ＪＹ７４５）におけるleu1遺伝子（第２選択
マーカー遺伝子）の変異点、すなわちleu1-32変異遺伝
子の変異点を決定するために、leu1-32変異株（ＪＹ２
６５）のゲノムＤＮＡを鋳型、SPBC1A4.02c.Fd及びSPBC
1A4.02c.Rv をプライマーとしてＰＣＲをおこない、leu
1遺伝子全長を増幅して、大腸菌ベクターpDONR201（Inv
itrogen）にクローニングした。このleu1-32変異遺伝子
断片の塩基配列を確認したところ、137番目のグアニン
（G）がアデニン（A）に置換していた（図１）。

【００２２】Ｂ−２（選択両用ベクターpDUALの構築） 上記結果に基づき、ゲノム上のleu1遺伝子座位に相同組
換えで挿入される際に必要なプラスミド上の配列とゲノ
ム上のleu1遺伝子のオーバーラップする部分として、１
３８番目の塩基（Ａ）より下流の領域約７４０塩基対を
組換え用の配列とし、この断片のほぼ中央に当たる位置
（塩基５２０付近）に組換えを促進する制限酵素Not I
の認識配列を作製することとした。また、正しくleu1遺
伝子座位で組換えが生じ、ゲノムに挿入された際は、外
部から導入したＤＮＡに含まれている配列に依存してle
u1遺伝子の転写がおこなわれるようになるため、leu1遺
伝子の発現に必要なプロモーター配列としてleu1遺伝子
の開始コドンＡＴＧの上流約７１０ｂｐを含む配列をク
ローニングして用いることとした。さらに、本プロモー
ター配列はプラスミド上でも機能することが十分予想さ
れたので、このプロモーターによって発現するleu1が機
能してしまうことを防ぐため、leu1遺伝子内部に作製し
た制限酵素部位の配列でleu1の読み枠をずらし、正しい
leu1遺伝子産物が生じないようにした他、プラスミド上
のleu1遺伝子の3'末端を欠失させることで、さらにプラ
スミド上のleu1が機能する可能性を排除した（図１）。

【００２３】次に、分裂酵母の野生型株ＪＹ３より、le
u1遺伝子断片をそれぞれＰＣＲプライマーとしてSpeI-P
-leu1-F及びNotI-leu1(5')-R、又はNotI-leu1(3')-F及
びSacI-leu1(delta3)-Rを用いて二つの断片に分けてＰ
ＣＲで増幅した。これらのＰＣＲ断片をアガロースゲル
電気泳動した後、ゲルから切り出して精製し、それぞれ
を制限酵素Spe I及びNot I、又はNot I及びSac Iを用い
て末端を消化した後、一度に大腸菌ベクターpBluescrip
tII-SK(-)（STRATAGENE）のSpe I-Sac I部位にクローニ
ングした。これとは別にpFA6a-3HA-kanMX6プラスミド
（Yeast, 14, 943-951, 1998）を鋳型として、BamHI-Ta
dh-F及びSpeI-Tadh-RをＰＣＲプライマーとしてＡＤＨ
ターミネーターを増幅し、アガロースゲル電気泳動した
後に制限酵素Bam HI及びSpe Iで消化した。先にクロー
ニングしておいた内部にNot I部位を含むleu1遺伝子断
片をSpe I及びSac Iで消化して切り出し、上述のＡＤＨ
ターミネーターと共に大腸菌ベクターpUC119（TaKaRa）
のBam HI-Sac I部位にクローニングした。

【００２４】leu1遺伝子内部のNot I認識部位に挿入す
るura4-ars1断片（ＡＲＳに連結された第１選択マーカ
ー遺伝子）は以下のようにして作製した。まず、分裂酵
母ベクターpREP2（J. Bacteriol. 146, 746-754, 199
3）を制限酵素Sph I及びSac Iで消化した後、Klenow Fr
agmentを用いてＤＮＡの末端を平滑化し、再度連結する
ことにより、ura4とars1が連続的に存在するプラスミド
を作製した。このプラスミドを鋳型とし、NotI-ApaI-ar
s1-F及びNotI-ApaI-ura4-Rをプライマーとして用いたＰ
ＣＲによりura4-ars1断片を増幅した。このＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動した後、ゲルから切り出すこ
とにより精製し、制限酵素Not Iで消化した。このNot I
消化ＤＮＡ断片を上述のプラスミドのNot I部位に挿入
することにより、目的のプラスミドベクターpDUALを作
製した（図１）。

【００２５】Ｂ−３（選択両用ベクターpDUALによる分
裂酵母の形質転換） 宿主細胞として、ウラシル・ロイシン・アデニン要求株
であるシゾサッカロミセス・ポンベＪＹ７４５を用い
た。作製したプラスミド（pDUAL）を、そのまま（ＡＲ
Ｓに連結された第１選択マーカー遺伝子を切り出すこと
なく）宿主細胞に導入した場合はウラシル要求性を相補
してウラシル非要求性となり、あらかじめ制限酵素で消
化した場合はロイシン要求性を相補してロイシン非要求
性となるかどうかを確認した。pDUALベクターは、制限
酵素Not I、Apa I、Sac IIのいずれかで消化することに
よりura4-ars1断片が切り出され、相同組み換えを生起
するleu1遺伝子断片が分断された直鎖ＤＮＡ断片に変化
する（図２）。このＤＮＡ断片を宿主細胞に導入した場
合、leu1-32変異遺伝子の変異点（Ｇ１３７Ａ）よりも
３'末端側でゲノム上のleu1遺伝子座位と相同組換えを
起こした形質転換体がロイシン非要求性となることが期
待される。pDUALベクターのＤＮＡを上記の制限酵素で
消化し、プラスミド上のleu1断片に挿入されていたura4
-ars1が切り出されてくることをゲル電気泳動で確認し
た（図３）。

【００２６】上記制限酵素の未処理物（None）と処理物
（Not I又はApa I）を用いて宿主細胞を形質転換した。
それぞれの形質転換細胞を、ウラシルを含まない選択培
地（SD ade leu）又はロイシンを含まない選択培地（SD
ade ura）に蒔いて、３０℃で３日間培養した（図
４）。ロイシンを含まない選択培地においては、制限酵
素で消化しなかった場合は、ロイシン非要求性の形質転
換体は出現せず、制限酵素処理をおこなった場合のみ、
ロイシン非要求性形質転換体が出現した（図４左）。他
方、ウラシルを含まない培地においては、制限酵素処理
の有無に関わらずウラシル非要求性の形質転換体が出現
したが、これはおそらく切断によって生じたura4-ars1
断片がランダムにゲノムに挿入されたためと考えられ
る。このようなマーカー遺伝子断片は、ランダムなゲノ
ムへの挿入を利用して突然変異株（遺伝子破壊株）の単
離などに用いられているが（Nucleic Acids Research,
Vol. 28,No. 11, 2000）、得られたロイシン非要求性の
形質転換体にランダムにura4-ars1断片が挿入されてし
まうことは望ましくない。

【００２７】そこで、得られたロイシン非要求性形質転
換体のゲノムにura4遺伝子が挿入されているかどうかを
形質転換体のウラシル要求性によってチェックした。上
記形質転換体から、ロイシン非要求性又はウラシル非要
求性の少なくとも１００株以上をそれぞれ適当に選び、
ウラシルを含まない培地（SD ade leu）とロイシンを含
まない培地（SD ade ura）に蒔いて、３０℃で３日間培
養した（図５）。ロイシン非要求性株はウラシルを含ま
ない培地では生育が認められなかったが、ロイシンを含
まない培地では生育が認められた（図５下）。この結果
から、制限酵素処理後のpDUALベクターで形質転換した
宿主細胞のゲノムには、ura4(-ars1)断片が挿入されて
いないことが判明した。他方、ウラシル非要求性株はロ
イシンを含まない培地では生育が認められなかったが、
ウラシルを含まない培地では生育が認められた（図５
上）。この結果から、制限酵素処理後のpDUALベクター
で形質転換した宿主細胞では、leu1遺伝子座位への挿入
とura4断片のランダムな挿入が同一株中では起こってい
ないことが判明した。なお、Sac IIで切断したＤＮＡを
用いた場合でも同様の結果が得られた。これらの結果
は、pDUALベクターを制限酵素で消化した際に生じるura
4-ars1断片は、宿主細胞の形質転換前に除去する必要が
ないことを意味している。なお、ura4遺伝子配列内部に
のみ存在する制限酵素Stu Iの認識部位を予めStu Iによ
って消化することにより、あるいは、制限酵素処理物か
らura4-ars1断片をあらかじめ除去することにより、ura
4遺伝子がゲノムへ挿入して機能しないようにすること
ができる。

【００２８】

【発明の効果】本発明によると、目的遺伝子の過剰発現
に適した多コピー型と、目的遺伝子の細胞当たりの発現
量を精確に把握するのに適したゲノム挿入型とを容易に
選択することができる選択両用ベクター、例えば、その
まま細胞に導入した場合には細胞内で多コピー型として
保持されるが、導入前に制限酵素で処理することによ
り、染色体上の所定の遺伝子座に挿入されるゲノム挿入
型に変換することができる選択両用ベクターを得ること
ができる。かかる選択両用ベクターを用いると、形質転
換体をそれぞれ異なる選択マーカーで選択することによ
り、例えば、制限酵素による消化の有無と形質転換後の
選択培地を組み合わせることによって、多コピー型とゲ
ノム挿入型の二つのタイプを容易に選択することがで
き、例えば、被検遺伝子をクローニングする作業負担を
大幅に軽減できる。

【００２９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION <120> Dual vector having selective functions of multiple copying or genome insertion <130> A131P19 <140> <141> <160> 11 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 7921 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:pDUAL vector <400> 1 aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccggcg cgccacttct aaataagcga 60 atttcttatg atttatgatt tttattatta aataagttat aaaaaaaata agtgtataca 120 aattttaaag tgactcttag gttttaaaac gaaaattctt attcttgagt aactctttcc 180 tgtaggtcag gttgctttct caggtatagt atgaggtcgc tcttattgac cacacctcta 240 ccggcagatc cgctagggat aacagggtaa tatactagta agatgattct tttatcgtcg 300 ataacgatga ggatgtagac gattatgatg agagtgatta gcttctaaaa tttggtgttt 360 tcaaacgcta tttacagtac aatctgaaaa aattggatga acattgtaaa tggtaggata 420 cgagttccaa ttaatgtatt ttttaagtat tacacttagc ttattaattt tatatataca 480 ttctacctct gtgggtttaa agacaactcg tacacatact caaattattt atgaacatta 540 taatgcatat tcgtactgtc tattaaacat ttttttgaca ttaaaaattt cgtttactaa 600 cgtagaaagc gctgataatt gaggctacta ttttaatatc tagaaacaaa gattcattaa 660 ttaattaagt aagctccagg atacttgtat atttcgttaa aaaagcgcaa tttcaacaat 720 tcctatgaac atccatgatt tcatcacaaa atcaaacata tcaggattta acgtgaatta 780 tttgctttct tgtgattttc atctgatttc tggtcattta cgttactgta aacaagcttt 840 ttaaaaaaag gattttttac gcaatattat cgatatccca atctgtagta taaaaagtgc 900 aacagtgttg agtttcccga aaccaggcat ttttgcggta gggtctgaaa ctttcacgaa 960 accatttcac aacaaaactt cttcaacaac atgtgtgcaa agaaaatcgt cgtcttacca 1020 ggagaccata ttggccctga aattgttgct tctgccttgg aggttttgaa agtcgttgag 1080 aagaagcgac ctgagttaaa actcgagttt gaagaacaca agattggagg tgcctctatt 1140 gatgcctatg gaaccccttt gactgacgag actgtgaagg cttgtttgga agctgacggt 1200 gttcttttgg gtgccgttgg tggtcctgaa tggaccaacc ccaattgtcg tcctgagcaa 1260 ggtttattga agcttcgtaa gagtatgggt gtttgggcca accttcgacc ttgcaacttt 1320 gccagcaagt ctttagtcaa gtacagccct ttgaagcctg aaatcgttga aggtgtcgat 1380 ttttgtgttg tacgagaact tactggaggt tgttactttg gtgagcgcac tgaggacaac 1440 ggatcgggtt atgctatgga cacttggcct tacagtttgg aagaagtttc tcgtattgct 1500 cgtttggcgg ccgcgggccc aacaccaatg tttataacca agttttatct tgtttgtcta 1560 catggtattt tacattcatc tacatacatc tttcattggc tttgtacata gttatcatta 1620 caagtctaaa aaaattcact cttttcttat tcaatgtcaa tccaagagaa aagattgtgg 1680 taatgttgta ggagcatgtt taataaatta ctatagcaaa ttacttttta ttcccaaggt 1740 gtttatctat aatagttaat attttagtcg ctacataaaa ttttaccaaa gagtacttgt 1800 atactaattc taaatgcctt ctgacataaa acgcctagga aaacaaacgc aaacaaggca 1860 tcgacttttt caataaccaa ccaaaaaaat tttacattag tcttttttta atgctgagaa 1920 agtctttgct gatatgcctt ccaaccagct tctctatatc tcttggcttc gacaacagga 1980 ttacgaccag ctccatagac tccacgacca acaatgatga tgtcgctacc gcagtttaca 2040 atcacttctt caggagtacg atattgctgt cccagcccgt ctcctttaac atccaagccg 2100 ataccagggg acatagttat gtagtcgctt tgaaggttag gaaatcgacg accagctata 2160 aagccaaagc aaaaatcggt atgcttctca aaccattcta aggttttctc tgtgtaggaa 2220 ccagtagcca aagagccttt ggaagacatt tcagccaaaa gcaagagacc acgtcccaaa 2280 ggtaaaccaa cttctttgag gccttgtata ataccctcgc ctggcactgt atggcaattt 2340 gtgatatgag cccaagaagc aattttgtac acaccagatg catattgtag cttgacggta 2400 tttccaatgt ctgcgaattt gcgatcctca aagataagaa aacgatgctt tttacctaag 2460 gccaccagtt tttctaccat atcctggtcg aaatcctcga caacgtcaat atgtgtcttg 2520 ataacacaga catagggtcc aattttatct accaattcta agatttcgga tttcttcgtc 2580 aaatcgaccg cgactgacaa gttgctttgc ttttcttcca tcaaagccaa caattccttg 2640 gcaatgggat ttttcatccc ctcagctcta gctgaatagc tttgaaatac tctagcatcc 2700 ataactttgc ttttaaacct ttaatttcga tccaagcaaa aaagaggttc ttggtaggac 2760 aatacggtaa gaaaacacga catgtgcaga gatgccgacg aagcatagtt aaactgggat 2820 ggtaaaatca attaagaatt tataaagaca aaattgtata agtctctaaa acatcttaat 2880 tatacctcac agaactatct aaaatatatt cacaaagtgc aaacattatc atgaaaaaga 2940 accattttaa tttaaagcaa gggcattaag gcttatttac agaatttctt acttttgtaa 3000 agattataag gctgattatc tttttcacca tgccaaaaat tacacaagat agaatggatg 3060 tttgaaatta aacgtgagta tacaaacaaa tacactaggt aaatcgaaac atttttttct 3120 ccattaagta acaaattcct atttagagaa agaatgctga gtagattaaa taatctatac 3180 aaactttttt aacacaaatg catacatata gccagtggga tttgtagcta agcttccgaa 3240 ttcgagtcta actccttaac cactcggaca tagtgactta tctgacactc attgtaaatt 3300 aatatatata taggcatttt gtttagttaa aggtacttaa gtaattagta taaacgaacc 3360 aattttataa tcaggaagtt aagtgaatgg tagcacatgt cgtaaaaatt gtgaattttt 3420 attgaataat attttaaata caagcctttc tagactaggt atactcataa acatatatga 3480 gcaaaaggat agaggagatt acattgcatc ttctacaaat ttatttattg ccctttactg 3540 aaaaattaaa taatgagtac taaatgataa aaagcgctca gtacaagaaa gattgcaaaa 3600 atattgcatt cttcatgaat taaagttgca tataaggcat attgaaagta atagtactaa 3660 aacagcagtt agcgaaaatt aatagaatta tattcgcaag acaattgtga cattaaatta 3720 aaaaattgta gaatttttac tatcctcttt aacgccatga gcctttataa aaaggttaaa 3780 ttagttttaa cattcttttt ttgagtaaga gtttacaatt tatcaaaacc tgtgttatta 3840 tattcattag tttcaattta ttagcatcta gagaaaaatc aattggcagt tacattgttg 3900 gaatttatga agaaaaagaa tctacaacgg agaataagtt gctgatcgct ttccctaaaa 3960 ttgtatattt tgctgagctt attttgacat ttcgttgaag ttttctctaa ttcgcattca 4020 ttttaagtaa aacaatgaga aataaaatta caaaaaatac aaattaaaat acaattttta 4080 gctataatta tagacgatgc ccttgtatcc cattctgtct cgcttgcccc tactttttat 4140 cttttatata ccataatgaa cgctgccgct actaaccata ccccgatttt acatttcgga 4200 ctcccaagga cgtacaaaat agaaaactat agaaaaaaat aatcagaaaa tagcatgtca 4260 tctctttgta aaacgcgttt gcaagaagaa aggaaacaat ggagaagaga tcatccattt 4320 gtatgtaaat tttagtaaac ttgaagaaat cactaacaac ttctcttact tagggattct 4380 atgcaaaacc ttgtaaatca tctgatggag gactcgattt aatgaattgg aaggttgggc 4440 ccgcggccgc ttagctgaaa cttccaaccc tcctgctccc gtcacattac tcgacaaagc 4500 taatgttttg gcaacttctc gtctttggcg caagactgta gctaagattt ttaaggagga 4560 atatcctcac cttaccttaa aaaaccagct cattgactcc gcagccatgc ttttggtcaa 4620 gagccctcgt acacttaacg gtgttgtttt gactgacaac ttgtttggtg acattatttc 4680 agatgaggct tctgtcattc ctggtagctt gggccttttg ccttctgcct ccctttccgg 4740 tgtggtagga aaatcagaag aaaaggttca ttgtttggtt gagcccattc acggtagcgc 4800 tcccgagctc gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 4860 ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 4920 aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga 4980 tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatacgt caaagcaacc 5040 atagtacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt 5100 gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct 5160 cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg 5220 atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat ttgggtgatg gttcacgtag 5280 tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa 5340 tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcgggct attcttttga 5400 tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa 5460 atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt ttatggtgca ctctcagtac 5520 aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 5580 gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 5640 gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct 5700 cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt agacgtcagg 5760 tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc 5820 aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag 5880 gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg 5940 ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt 6000 gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 6060 tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 6120 attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 6180 tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 6240 agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 6300 aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac 6360 tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac 6420 cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac 6480 tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact 6540 tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg 6600 tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt 6660 tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat 6720 aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta 6780 gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 6840 tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 6900 aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 6960 aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 7020 tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc 7080 gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 7140 cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 7200 acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 7260 cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 7320 cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 7380 aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 7440 gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 7500 atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc 7560 tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 7620 gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 7680 agcggaagag cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg 7740 cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt 7800 gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 7860 gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc 7920 c 7921 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SPBC1A4.02c.Fd <400> 2 aaaaagcagg ctctcatatg tgtgcaaaga aaatcgt 37 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SPBC1A4.02c.Rv <400> 3 agaaagctgg gtacaaaatt ttttcaagtt ct 32 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:BamHI-Tadh-F <400> 4 ttcccgggat ccggcgcgcc acttctaaat aagcg 35 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SpeI-Tadh-R <400> 5 gggtcgacta gtatattacc ctgttatccc tagcgg 36 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SpeI-P-leu1-F <400> 6 gggtcgacta gtaagatgat tcttttatcg tcgataacg 39 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:NotI-leu1(5')-R <400> 7 ttgcatgcgg ccgccaaacg agcaatacga gaaacttc 38 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:NotI-ApaI-ars1-F <400> 8 tgcatgcggc cgcgggccca accttccaat tcattaaatc g 41 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:NotI-ApaI-ura4-R <400> 9 ttgcatgcgg ccgcgggccc aacaccaatg tttataacc 39 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:NotI-leu1(3')-F <400> 10 ttgcatgcgg ccgcttagct gaaacttcca accctcc 37 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SacI-leu1(delta3)-R <400> 11 ggtctagagc tcgggagcgc taccgtgaat gggctc 36

【図面の簡単な説明】

【図１】leu1遺伝子の塩基配列と遺伝子産物のアミノ酸
配列を示す図である。leu1-32変異株で置換しているグ
アニン残基（G137）を枠囲いで示した。本発明のpDUAL
ベクターに組み込んだleu1断片の５'及び３'末端部分を
二重下線で示した。また、leu1遺伝子内部に作製したNo
t I部位とその周辺の配列を枠囲いで示した。

【図２】本発明のpDUALベクターの構造とゲノムへの挿
入様式を示す図である。制限酵素処理によって生じたＤ
ＮＡの末端がゲノム上のleu1遺伝子座位に標的化され、
相同組み換えが誘発される。実際の相同組み換えはleu1
-32変異の変異点（G137）より上流でも起こり得るが、
ロイシン非要求性となるのはleu1-32の変異点よりも下
流（３'側）で相同組み換えが起こった形質転換体だけ
である。

【図３】制限酵素Not I、Apa I又はSac IIのいずれかの
処理により、本発明のpDUALベクター内のura4-ars1断片
が切り出されてくることの確認結果を示す図である。ur
a4-ars1断片挿入前のプラスミド１はNot Iでのみ切断さ
れる。

【図４】本発明のpDUALベクターを制限酵素Not I又はAp
a Iで切断後、分裂酵母株JY745(h⁺ ura4-D18 leu1-32 a
de6-M216)に導入し、それぞれウラシルを含まない培地
（SD ade leu）又はロイシンを含まない培地（SD ade u
ra）に蒔いて、３０℃で３日間培養した結果を示す図で
ある。

【図５】形質転換体から、それぞれロイシン非要求性又
はウラシル非要求性の株を適当に選び、ウラシルを含ま
ない培地（SD ade leu）とロイシンを含まない培地（SD
ade ura）で培養をおこなった結果を示す図である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 切り出し可能なＡＲＳに連結された第１
   選択マーカー遺伝子と、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの間
   で相同組換え可能な分断された状態の第２選択マーカー
   遺伝子とを備え、前記ＡＲＳに連結された第１選択マー
   カー遺伝子の切出しの有無により、多コピー型とゲノム
   挿入型とを選択することができることを特徴とする選択
   両用ベクター。
2. 【請求項２】 ＡＲＳに連結された第１選択マーカー遺
   伝子が、制限酵素認識部位を介して第２選択マーカー遺
   伝子を分断していることを特徴とする請求項１記載の選
   択両用ベクター。
3. 【請求項３】 宿主細胞が、第２選択マーカー遺伝子機
   能をゲノム上で欠失していることを特徴とする請求項１
   又は２記載の選択両用ベクター。
4. 【請求項４】 宿主細胞が、真核細胞であることを特徴
   とする請求項１〜３のいずれか記載の選択両用ベクタ
   ー。
5. 【請求項５】 真核細胞が、酵母であることを特徴とす
   る請求項４記載の選択両用ベクター。
6. 【請求項６】 酵母が、シゾサッカロミセス・ポンベで
   あることを特徴とする請求項５記載の選択両用ベクタ
   ー。
7. 【請求項７】 分断された状態の第２選択マーカー遺伝
   子が、その５'側ＤＮＡ断片にプロモーター領域を含む
   ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の選択両
   用ベクター。
8. 【請求項８】 分断された状態の第２選択マーカー遺伝
   子が、その３'側ＤＮＡ断片において、第２選択マーカ
   ー遺伝子機能欠失処理が施されていることを特徴とする
   請求項１〜７のいずれか記載の選択両用ベクター。
9. 【請求項９】 目的遺伝子のクローニング部位を有する
   ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の選択両
   用ベクター。
10. 【請求項１０】 配列番号１に示される塩基配列からな
    るＤＮＡ、又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む
    配列からなり、かつ選択両用ベクター機能を備えたＤＮ
    Ａ。