KR20130001121A

KR20130001121A - 젖산의 고효율 생산을 위한 변형 미생물

Info

Publication number: KR20130001121A
Application number: KR1020120061819A
Authority: KR
Inventors: 정순천; 구현민; 김재영; 김지은; 김진우; 박영경; 이소영; 조화영; 권대혁; 박재찬
Original assignee: 성균관대학교산학협력단; 삼성전자주식회사
Priority date: 2011-06-24
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2013-01-03
Also published as: KR20130001103A; KR101882740B1

Abstract

젖산의 고효율 생산을 위한 변형 미생물, 상기 변형 미생물을 제작하기 위한 발현 벡터, 및 상기 변형 미생물을 이용한 젖산의 생산 방법이 개시된다. 상기 변형 미생물은 산성 조건하에서도 고효율로 젖산을 생산할 수 있다.

Description

젖산의 고효율 생산을 위한 변형 미생물{MODIFIED MICROORGANISM FOR HIGH EFFICIENT PRODUCTION OF LACTIC ACID}

젖산의 고효율 생산을 위한 변형 미생물, 상기 변형 미생물을 제작하기 위한 발현 벡터, 및 상기 변형 미생물을 이용한 젖산의 생산 방법에 관한 것이다.

젖산은 일반적으로 식품 보존제, 향취제 또는 산미제 등의 식품 첨가제로 사용될 뿐만 아니라 화장품, 화학, 금속, 전자, 직물, 염색, 제약 등 산업적으로 광범위하게 이용되는 중요한 유기산이다. 또한, 젖산은 생분해성 플라스틱의 일종인 폴리락틱애시드(PLA)의 원료물질로도 사용되며, 근래에 들어서는 유가상승, 원유의 고갈, 석유유래 플라스틱 제품의 부패하지 않는 특성으로 인해 야기되는 환경오염 문제로 인한 난분해성 플라스틱의 환경친화적인 대체 고분자 물질에 대한 관심이 증가되고 있어서 이에 따른 젖산의 수요가 크게 증가하는 추세이다.

특히, 젖산은 수산기와 카르복실기를 가지고 있어 반응성이 큰 유기산으로서, 폴리락틱애시드 뿐만 아니라 아세트알데히드(acetaldehyde), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 아크릴산(acrylic acid), 2,3-펜타디온(2,3-pentathione) 등의 화학물을 생산하는 중요한 원료물질로도 사용된다. 젖산은 또한, 생분해성이며 무독성 용제인 에틸락테이트(ethyl lactate)의 제조에도 사용되며, 이는 전자 제조업, 페인트나 직물, 세제, 접착제나 인쇄물 등에 이용되고 있다.

최근, 사카로마이세스 균주에 대한 대안으로서 클루이베로마이세스 균주(Kluyveromyces)가 주목받고 있다. K. 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및 K. 락티스(Kluyveromyces Lactis)는 사카로마이세스와 마찬가지로, 미국 FDA로부터 인체에 대한 안정성이 인정된 GRAS (Generally Recognized As Save) 세포로 분류되어 있다.

K. marxianus는 47℃, 49℃, 및 심지어 52℃의 온도에서도 성장이 가능하며, 내산성이 뛰어나 유기산 및 플랫폼 화합물 생산 균주로서 최근 이목이 집중되고 있다.

일 측면에 따르면,

일본자라(Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리(Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래(Tursiops truncatus) 및 노르웨이산집쥐(Rattus norvegicus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 락테이트 데하이드로게나제(Lactate Dehydrogenase, LDH) 활성을 포함하는 젖산의 고효율 생산을 위한 변형 미생물이 개시된다.

다른 측면에 따르면,

복제개시점; 프로모터; 일본자라, 오리너구리, 병코돌고래 및 노르웨이산집쥐로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 LDH 활성을 코드화하는 폴리뉴클레오티드; 및 터미네이터를 포함하는 발현 벡터가 개시된다.

다른 측면에 따르면,

상기 발현 벡터가 도입된 변형 미생물을 글루코오스 함유 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양에 의해 생성된 젖산을 회수하는 단계를 포함하는 젖산의 생산 방법이 개시된다.

상기 변형 미생물은 젖산을 고수율로 생산할 수 있다. 또한, 산성 조건 하에서도 젖산을 고수율로 생산할 수 있다.

도 1은 실시예 1에 따른 발현 벡터 pJSKM316-GPD를 나타낸다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 비록 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어져서는 안된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 씌여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 씌여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 씌여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수지 범위를 포함할 것이다.

본 명세서에서 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

젖산의 고효율 생산을 위한 변형된 미생물을 제공하고자 한다.

젖산과 같은 유기산은 산업적 발효 방법을 통해 제조된다. 발효는 당을 소비하여 상기 당을 원하는 산으로 전환시키는 다양한 종류의 박테리아 종에 의해 수행된다.

당 재료로부터 유기산을 제조하기 위한 효모 또는 진균성 생체 촉매의 개발은 하기와 같은 이유에서 이루어지고 있다. 많은 박테리아들은 그들이 성장하고 당을 효율적으로 대사하기 위해 필요한 아미노산 또는 단백질의 일부를 합성할 수 없다. 그 결과, 박테리아는 종종 다소 복합적인 영양소들이 공급되어야만 한다. 이는 발효를 수행하는데 있어 요구되는 직접적인 비용의 증가를 야기한다. 배지의 복잡성 증가로 인해 발효 생성물을 합리적으로 순수한 상태로 회수하는 것이 더욱 어려워지므로, 생성물을 회수하기 위해서는 추가적인 작업 및 비용이 부과된다. 반면, 많은 효모 종은 그들이 필요로 하는 아미노산 또는 단백질을 무기 질소 화합물로부터 합성할 수 있다. 이들은 종종 소위 "규정된(defined)" 배지에서 잘 성장하고 발효하는데, 상기 배지는 대개 덜 비싸고 생성물 회수 작업에 어려움이 적다.

효모가 유기산 생성을 위한 생체 촉매로서 관심을 받는 또 다른 이유는 생성물 그 자체의 특성과 관련이 있다. 경제적으로 실행가능한 방법을 갖기 위해서는, 발효 배지 내에 고농도의 유기산 생성물이 축적되어야 한다. 발효 생성물은 고농도로 존재하는 경우 생체촉매에 독성이 될 수 있다는 우려 외에도, 발효 생성물이 산인 경우에 산성도에 대한 추가의 우려가 존재한다. 배지는 더 많은 유기산이 생성됨에 따라 점점 산성이 될 것이다. 이들 유기산을 생성하는 대부분의 박테리아는 강산 환경에서 잘 활동하지 못하며, 상기 조건하에서 생존하지 못하거나 경제적으로 실행 불가능할 정도로 느리게 생성물을 생성한다.

따라서, 상업적 산 발효 방법은 산이 형성될 때 산을 중화시키는 물질의 첨가로 완충된다. 이는 배지를 중성 pH로 유지시키며, 박테리아가 효율적으로 성장하고 유기산을 생성하게 해 준다. 그러나, 이는 산을 염으로 전환시키며, 이는 이후에 생성물을 원하는 산 형태로 수득하기 위해서 분리되어야만 한다.

통상적인 완충제는 유기산을 중화시켜 상응하는 칼슘염을 형성하는 칼슘 화합물이다. 칼슘 염을 발효 배지로부터 회수한 후, 이를 미네랄 산, 전형적으로는 황산의 첨가로 분리하여 유기산을 재생시키고 미네랄 산의 불용성 칼슘염을 형성한다. 그러므로, 상기 방법은 완충제 및 미네랄 산에 대한 직접적인 비용뿐만 아니라 원하지 않는 칼슘염 부산물을 처리하고 처분하는 비용도 발생시킨다. 생체촉매가 보다 낮은 pH 조건 하에서 효율적으로 성장하고 유기산을 생성할 수 있다면 상기 비용은 감소되거나 제거될 수 있을 것이다.

일 구현예에 따르면, 외래성 락테이트 데하이드로게나제(Lactate dehydrogenase, LDH) 활성을 포함하는 변형 미생물이 제공된다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "대사 조작된(metabolically engineered)" 또는 "대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 알코올과 같은 원하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 핵산 서열의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반한다. "대사 조작된"은 유전자 조작과 적절한 배양 조건을 이용한 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability)과 단백질 기능성(protein functionality)의 조절과 최적화에 의한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 더욱 포함할 수 있다. 생합성 유전자는 숙주에 외래성이거나, 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 또는 내인성 숙주 세포에서 이종 발현 제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주(예를 들면, 미생물)에 이종성일 수 있다. 적절한 배양 조건은 배양 배지 pH, 이온 강도, 영양 함량 등의 조건, 온도, 산소, 이산화탄소, 질소 함량, 습도, 및 상기 미생물의 물질대사 작용에 의한 화합물의 생산을 가능하게 하는 기타 배양 조건을 포함한다. 숙주 세포로서 기능할 수 있는 미생물에 적합한 배양 조건은 널리 알려져 있다.

따라서, 대사 "조작된(engineered)" 또는 "변형된(modified)" 미생물은 유전 물질을 선택된 숙주 또는 부모 미생물 내로 도입하여 미생물의 세포 생리와 생화학을 변형하거나 변경함으로써 생산된다. 유전 물질의 도입을 통하여, 부모 미생물은 새로운 성질, 예를 들면, 새로운 세포내 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포내 대사산물을 생산하는 능력을 획득한다.

예를 들면, 유전 물질의 부모 미생물 내로의 도입은 화학 물질을 생산하는 새롭거나 변형된 능력을 초래한다. 부모 미생물에 도입된 유전 물질은 화학 물질 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자 또는 유전자의 일부를 포함하고, 이들 유전자의 발현 또는 발현 조절을 위한 추가 구성요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "외인성(exogenous)"은 고려되는 유전 물질이 숙주 균주에 대해 천연이 아님을 의미한다. 상기 용어 "천연(native)"은 숙주 세포의 야생형 세포의 게놈 내에서 발견되는 유전 물질을 의미한다.

본 명세서에서 상호교환적으로 사용된, 용어 "활성(activity)", 효소활성(enzyme activity)"은 유리한 조건하에서 생산되는 경우에 선택된 폴리펩티드에 정상적으로 기인하는 임의의 기능적 활성을 의미한다. 전형적으로, 선택된 폴리펩티드의 활성은 생산된 폴리펩티드와 관련된 전체 효소적 활성을 포함한다. 숙주 세포에 의해 생산되고 효소적 활성을 지니는 폴리펩티드는 세포의 세포내 공간에 위치하거나, 세포와 결합되어 있거나, 세포외 환경으로 분비될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "락테이트 데하이드로게나제(Lactate dehydrogenase, LDH)"는 피루베이트로부터 락테이트로 전환시킬 수 있는 능력을 의미한다. 락테이트 데하이드로게나제 효소는 사이토크롬 c-의존성 D-락테이트 데하이드로게나제(EC 1.1.2.4) 또는 L-락테이트 데하이드로게나제(EC 1.1.2.3), 및 NAD(P)-의존성 D-락테이트 데하이드로게나제(EC 1.1.1.28) 또는 L-락테이트 데하이드로게나제(EC 1.1.1.27)으로 나뉘어지나, 상기 구현예는 NAD(P)-의존성 L-락테이트 데하이드로게나제에 대한 것이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "로부터 유래된(derived from)"은 지시된 공급원으로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유전 물질을 분리하거나 지시된 공급원으로부터 유전 물질을 정제하는 것을 의미한다.

상기 락테이트 데하이드로게나제의 반응식은 하기와 같다:

[반응식 1]

상기 구현예에서, LDH 활성은 박테리아, 진균, 효모, 포유동물 또는 파충류 공급원으로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 구현예에서는 데이타베이스 조사(database search)를 통해 고효율 LDH 활성을 발굴하였다. 예를 들면, 데이타베이스로부터 L-LDH 유전자를 나열한 후 효소 상동성(enzyme homology) 및 계통수 분석(phylogenetic analysis)에 의해 대표 유전자를 선정하였다.

일 실시예에서, 일본자라(Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리(Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래(Tursiops truncatus) 및 노르웨이산집쥐(Rattus norvegicus)로부터 유래한 LDH 활성을 사용하였다.

상기 LDH 활성을 미생물에 도입하는 것은 공지된 통상의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 상기 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제작하고, 이러한 발현 벡터로 미생물을 형질전환시키는 방법을 이용할 수 있다.

다른 구현예에 따르면, 상기 변형 미생물을 제작하기 위한 발현 벡터가 제공된다. 상기 발현 벡터는 복제개시점; 프로모터; 락테이트 데하이드로게나제(Lactate dehydrogenase, LDH) 활성을 코드화하는 폴리뉴클레오티드; 및 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "복제 개시점(replication origin)"은 숙주 세포내에서 플라스미드의 복제 또는 증폭을 지시하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 미생물 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 단순히 잠재성 게놈 삽입물일 수 있다. 적합한 숙주내로 형질전환되면, 상기 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제되어 기능을 하거나, 게놈 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터로서 통상적으로 사용되기 때문에, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "플라스미드(plasmid)"와 벡터(vector)"는 상호교환적으로 사용된다.

그러나, 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태도 포함한다. 예를 들면, 벡터는 복제 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 파지 또는 바이러스 입자, DNA 구축물, 및 카세트를 포함할 수 있다. 용어 "플라스미드"는 복제 벡터로서 사용되는 환형의 이중 가닥 DNA 구출물을 의미하며, 많은 박테리아 및 일부의 진핵생물 내의 염색체 외의 자가-복제 유전적 요소를 형성한다. 상기 플라스미드는 상동 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있는 복수의 카피 플라스미드를 포함할 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 도입된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 예를 들면, 발현 조절서열 및 해당 유전자는 선별 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 유전자의 전사에 영향을 미치는 경우, 폴리뉴클레오티드 프로모터 서열이 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사에 영향을 미치는 것을 의미한다. 상기 "작동가능하게 연결된"은 연결되는 폴리뉴클레오티드 서열이 인접함을 의미할 수 있다. 연결은 편리한 제한 위치에 묶어짐으로써 수행될 수 있다. 그러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 연결자(linker)가 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "프로모터(promoter)"는 하류 유전자의 전사를 가져오거나 효과를 주는 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 프로모터는 목적 단백질의 발현을 가져오는 임의의 프로모터일 수 있고, 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 보여주는 임의의 핵산 서열일 수 있고, 돌연변이, 절단된 및 혼성화 프로모터를 포함하고, 숙주 세포에 대하여 상동성 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 수득될 수 있다. 상기 프로모터는 숙주 세포에 대하여 고유의 또는 이질적일 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "유전자(gene)"는 선행하는 및 이어지는 암호화 영역, 예를 들면, 각 암호화 조각(엑손) 사이의 개입 서열(인트론) 뿐만 아니라, 5' 미번역(5' UTR) 또는 리더 서열 및 3' 미번역(3' UTR) 또는 트레일러 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본 명세서에서 상호교환적으로 사용된, 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 및 "핵산(nucleic acid)"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머성 형태를 의미한다. 이는 단일 나선 DNA, 이중 나선 DNA, 게놈 DNA, cDNA, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 자연적, 화학적, 생화학적으로 변형, 비-자연적 또는 유도화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예는 유전자, 유전자 단편, 염색체 단편, ESTs, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 유전자 암호의 퇴화의 결과로서, 주어진 단백질을 암호화하는 많은 뉴클레오티드 서열이 생성될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "터미네이터(terminator)"는 전사의 종료를 가져오거나 효과를 주는 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다.

상기 구현예에서, 복제 개시점은 효모 자가복제서열(autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있고, 상기 ARS는 효모 동원체 서열(centromeric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다.

일 실시예에서, 클루이베로마이세스 마르시아누스의 ARS/CEN가 사용되었다.

상기 ARS/CEN 복제 개시점은 서열번호 1, 상기 서열번호 1에 대하여 약 70& 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다.

서열번호 1:

gagctccttt catttctgat aaaagtaaga ttactccatt tatcttttca ccaacatat tcatagttga aagttatcct tctaagtacg tatacaatat taattaaacg taaaaacaaa actgactgta aaaatgtgta aaaaaaaaat atcaaattc atagcagttt caaggaatga aaactattat gatctggtca cgtgtatata aattattaat tttaaaccca tataatttat tattttttta ttctaaagt ttaaagtaat tttagtagt attttatatt ttgaataaat atactttaaa tttttatttt tatattttat tacttttaaa aataatgttt ttatttaaaa caaaattata agttaaaaag ttgttccgaa agtaaaatat attttatagt ttttacaaaa ataaattatt tttaacgtat tttttttaat tatatttttg tatgtgatta tatccacagg tattatgctg aatttagctg tttcagttta ccagtgtgat agtatgattt tttttgcctct caaaagctatt tttttagaag cttcgtctta gaaataggtg gtgtataaat tgcggttgac ttttaactat atatcatttt cgatttattt attacataga gaggtgcttt taatttttta atttttattt tcaataattt taaaagtggg tacttttaaa ttggaacaaa gtgaaaaata tctgttatac gtgcaactga attttactga ccttaaagga ctatctcaat cctggttcag aaatccttgaa atgattgata tgttggtgg attttctctg attttcaaac aagaggtat tttatttcat atttattata ttttttacat ttattttata tttttttatt gtttggaagg gaaagcgaca atcaaattca aaatatatta attaaactgt aatacttaat aagagacaaa taacagccaa gaatcaaat actgggtttt taatcaaaag atctctctac atgcacccaa attcattatt taaatttact atactacaga cagaatatac gaacccagat taagtagtca gacgcttttc cgctttattg agtatatagc cttacatatt ttctgcccat aatttctgga tttaaaataa acaaaaatgg ttactttgta gttatgaaaa aaggcttttc caaaatgcga aatacgtgtt atttaaggtt aatcaacaaa acgcatatcc atatgggtag ttggacaaaa cttcaatcga t

상기 구현예에서, 프로모터는 CYC(cytochrome-c oxidase), TEF(translation elongation factor 1α, GPD(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ADH(alcohol dehydrogenase), PHO5, TRP1, GAL1, GAL10, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, triose phosphate isomerase, phosphoglucose isomerase, glucokinase,α-mating factor pheromone, GUT2, nmt, fbp1, AOX1, AOX2, MOX1, FMD1 및 PGK1을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 상기 구현예에서, 프로모터는 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터 및 ADH 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

일 실시예에서, GPD 프로모터가 사용되었다.

상기 CYC 프로모터는 서열번호 2, 상기 서열번호 2에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다.

서열번호 2:

atttggcgag cgttggttgg tggatcaagc ccacgcgtag gcaatcctc gagcagatcc gccaggcgtg tatatatagc gtggatggcc aggcaacttt agtgctgaca catacaggca tatatatatg tgtgcgacga cacatgatc atatggcatg catgtgctc tgtatgtata taaaactctt gttttcttct tttctctaaa tattctttcc ttatacatta ggacctttg cagcataaat tactatactt ctatagacac gcaaacacaa atacacacac taa

상기 TEF 프로모터는 서열번호 3, 상기 서열번호 3에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다.

서열번호 3:

atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc tagggtgt cgttaattac ccgtactaaa ggtttggaaa agaaaaaaga gaccgcctcg tttctttttc ttcgtcgaaa aaggcaataa aaatttttat cacgtttctt tttcttgaaa attttttttt tgattttttt ctctttcgat gacctcccat tgatatttaa gttaataaac ggtcttcaat ttctcaagtt tcagtttcat ttttcttgtt ctattacaac tttttttact tcttgctcat tagaaagaaa gcatagcaat ctaatctaag ttt

상기 GPD 프로모터는 서열번호 4, 상기 서열번호 4에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다.

서열번호 4:

agtttatcattatcaatactcgccatttcaaagaatacgtaaataattaatagtagtgattttcctaactttatttagtcaaaaaattagccttttaattctgctgtaacccgtacatgcccaaaatagggggcgggttacacagaatatataacatcgtaggtgtctgggtgaacagtttattcctggcatccactaaatataatggagcccgctttttaagctggcatccagaaaaaaaaagaatcccagcaccaaaatattgttttcttcaccaaccatcagttcataggtccattctcttagcgcaactacagagaacaggggcacaaacaggcaaaaaacgggcacaacctcaatggagtgatgcaacctgcctggagtaaatgatgacacaaggcaattgacccacgcatgtatctatctcattttcttacaccttctattaccttctgctctctctgatttggaaaaagctgaaaaaaaaggttgaaaccagttccctgaaattattcccctacttgactaataagtatataaagacggtaggtattgattgtaattctgtaaatctatttcttaaacttcttaaattctacttttatagttagtcttttttttagttttaaaacaccagaacttagtttcgacggat

상기 ADH 프로모터는 서열번호 5, 상기 서열번호 5에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다.

서열번호 5:

gccgggatcg aagaaatgat ggtaaatgaa ataggaaatc aaggagcatg aaggcaaaa gacaaatata agggtcgaac gaaaaataaa gtgaaaagtg ttgatatgat gtatttggct ttgcggcgcc gaaaaaacga gtttacgcaa ttgcacaatc atgctgactc tgtggcggac ccgcgctctt gccggcccgg cgataacgct gggcgtgagg ctgtgcccgg cggagttttt tgcgcctgca ttttccaagg tttaccctgc gctaaggggc gagattggag aagcaataag aatgccggtt ggggttgcga tgatgacgac cacgacaact ggtgtcatta tttaagttgc cgaaagaacc tgagtgcatt tgcaacatga gtatactagaa gaatgagcca agacttgcga gacgcgagtt tgccggtggt gcgaacaata gagcgaccat gaccttgaag gtgagacgcg cataaccgct agagtacttt gaagaggaaa cagcaatagg gttgctacca gtataaatag acaggtacat acaacactgg aaatggttgt ctgtttgagt acgctttcaa ttcatttggg tgtgcacttt attatgttac aatatggaag ggaactttac acttctcctat gcacatatat taattaaagt ccaatgctag tagagaaggg gggtaacacc cctccgcgct cttttccgat ttttttctaa accgtggaat atttcggatat ccttttgttg tttccgggtg tacaatatgg acttcctctt ttctggcaac caaacccata catcgggatt cctataatac cttcgttggt ctccctaaca tgtaggtggc ggaggggaga tatacaatag aacagatacc agacaagaca taatgggcta aacaagacta caccaattac actgcctcat tgatggtggt acataacgaa ctaatactgt agccctaga cttgatagc catcatcat atcgaagttt cactaccctt tttccatttg ccatctattg aagtaataat aggcgcatgc aacttctttt cttttttttt cttttctctc tcccccgttg ttgtctcacca tatccgcaat gacaaaaaaa tgatggaagaca ctaaaggaaa aaattaacga caaagacagc accaacagat gtcgttgttc cagagctgat gaggggtatc tcgaagcaca cgaaactttt tccttccttc attcacgcaca ctactctcta atgagcaacg gtatacggcc ttccttccag ttacttgaat ttgaaataaa aaaaagtttg ctgtcttgct atcaagtataa atagacctgc aattattaat cttttgtttc ctcgtcattgt tctcgttccc tttcttcctt gtttcttttt ctgcacaata tttcaagcta taccaagcat acaatcaact ccaagctggc cgc

상기 LDH 활성을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 일본자라로부터 유래한 서열번호 6(Accession Number: Q98SL0), 또는 상기 서열번호 6에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다.

서열번호 6:

MSVKELLIQN VHKEEHSHAH NKITVVGVGA VGMACAISIL MKDLADELAL VDVIEDKLRG

EMLDLQHGSL FLRTPKIVSG KDYSVTAHSK LVIITAGARQ QEGESRLNLV QRNVNIFKFI

IPNVVKYSPD CMLLVVSNPV DILTYVAWKI SGFPKHRVIG SGCNLDSARF RYLMGEKLGI

HSLSCHGWII GEHGDSSVPV WSGVNVAGVS LKALYPDLGT DADKEHWKEV HKQVVDSAYE

VIKLKGYTSW AIGLSVADLA ETVMKNLRRV HPISTMVKGM YGVSSDVFLS VPCVLGYAGI

TDVVKMTLKS EEEEKLRKSA DTLWGIQKEL QF

상기 LDH 활성을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 오리너구리로부터 유래한 서열번호 7(Accession Number: Q7YQK6), 또는 상기 서열번호 7에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다.

서열번호 7:

MAGVKEQLIQ NLLKEEYAPQ NKITVVGVGA VGMACAISIL MKDLADELAL VDVIEDKLKG

EMMDLQHGSL FLRTPKIVSG KDYSVTANSK LVIITAGARQ QEGESRLNLV QRNVNIFKFI

IPNVVKYSPN CKLLVVSNPV DILTYVAWKI SGFPKNRVIG SGCNLDSARF RYLMGERLGI

HSTSCHGWVI GEHGDSSVPV WSGVNVAGVS LKNLHPDLGT DADKEQWKDV HKQVVDSAYE

VIKLKGYTSW AIGLSVADLA ESIVKNLRRV HPISTMIKGL YGIKDEVFLS VPCVLGQNGI

SDVVKITLKS EEEAHLKKSA DTLWGIQKEL QF

상기 LDH 활성을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 병코돌고래로부터 유래한 서열번호 8(Accession Number: C6L2F0) , 또는 상기 서열번호 8에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다.

서열번호 8:

MATVKDQLIQ NLLKEEHVPQ NKITVVGVGA VGMACAISIL MKDLADELAL VDVIEDKLKG

EMMDLQHGSL FLRTPKIVSG KDYSVTANSK LVIITAGARQ QEGESRLNLV QRNVNIFKFI

VPNIVKYSPH CKLLVVSNPV DILTYVAWKI SGFPKNRVIG SGCNLDSARF RYLMGERLGV

HPLSCHGWIL GEHGDSSVPV WSGVNVAGVS LKNLHPELGT DADKEHWKAI HKQVVDSAYE

VIKLKGYTSW AVGLSVADLA ESIMKNLRRV HPISTMIKGL YGIKEDVFLS VPCILGQNGI

SDVVKVTLTP EEQACLKKSA DTLWGIQKEL QF

상기 LDH 활성을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 노르웨이산집쥐로부터 유래한 서열번호 9(Accession Number: P04642), 또는 상기 서열번호 9에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다.

서열번호 9:

MAALKDQLIV NLLKEEQVPQ NKITVVGVGA VGMACAISIL MKDLADELAL VDVIEDKLKG

EMMDLQHGSL FLKTPKIVSS KDYSVTANSK LVIITAGARQ QEGESRLNLV QRNVNIFKFI

IPNVVKYSPQ CKLLIVSNPV DILTYVAWKI SGFPKNRVIG SGCNLDSARF RYLMGERLGV

HPLSCHGWVL GEHGDSSVPV WSGVNVAGVS LKSLNPQLGT DADKEQWKDV HKQVVDSAYE

VIKLKGYTSW AIGLSVADLA ESIMKNLRRV HPISTMIKGL YGIKEDVFLS VPCILGQNGI

SDVVKVTLTP DEEARLKKSA DTLWGIQKEL QF

상기 터미네이터는 PGK1(phosphoglycerate kinase 1), CYC1(Cytochrome c transcription), 및 GAL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 실시예에서, CYC1 터미네이터가 사용되었다.

상기 CYC1 터미네이터는 서열번호 10, 상기 서열번호 10에 대하여 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함할 수 있다.

서열번호 10:

tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaacc gaaaaggaag gagttagaca acctgaagtc taggtcccta tttatttttt tatagttatg ttagtattaa gaacgttatt tatatttca aatttttct tttttttctg tacagacgc gtgtacgca tgtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg acgctcgaag gctttaattt gcggcc

본 명세서에서 사용된, 용어 "상동성(homology)"은 서열 유사성 또는 서열 동일성을 의미한다. 상기 상동성은 당업계에 알려진 표준 기술(예를 들면, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482[1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, Wl)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램; 및 Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984])을 사용하여 측정될 수 있다.

상기 발현 벡터는 선별 마커를 더욱 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "선별 마커(selectable marker)"는 숙주 세포에서 발현가능한 뉴클레오티드 서열을 의미하고, 선별 마커의 발현은 발현된 유전자를 함유하는 세포에게 상응하는 선별제의 존재 또는 필수 영양소의 결핍시 성장하는 능력을 부여한다. 상기 선별 마커는 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kannamycin), 에리스로마이신(erythromycin), 액티노마이신(actinomycin), 클로람페니콜(chlorampjenicol) 및 테트라싸이클린(tetracyclin) 등과 같은 내항생제성 마커, 및 URA3(우라실 영양요구성), LEU2(루신 영양요구성), TRP1(트립토판 영양요구성) 및 HIS3(히스티딘 영양요구성)과 같은 영양요구성 마커를 포함할 수 있다. 즉, 선별 마커는 숙주 세포에서 내항생제성 및 영양요구성을 부여하여 외인성의 DNA를 함유하는 세포가, 형질 전환되는 동안 어떠한 외인성의 서열도 받지 않는 세포로부터 구별될 수 있도록 하는 유전자이다.

일 실시예에서, URA3 영양요구성 선별 마커가 사용되었다.

상기 발현 벡터는 미생물 숙주세포로 통상의 방법에 의해 도입될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "숙주 세포(host cell)"는 상기 발현 벡터를 위한 숙주로서 수행하는 세포로부터의 적합한 세포를 의미한다. 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포일 수 있고, 또는 변화된 숙주세포일 수 있다. "야생형 숙주 세포(wide-type host cell)"는 재조합 방법을 통하여 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "변화된 숙주 세포(altered host cell)"는 유전적으로 설계된 숙주 세포를 의미하며, 여기서 목적 단백질은 발현의 수준으로 생성되거나 발현의 수준보다 더 큰 수준으로 생성되거나 본질적으로 동일한 성장 조건 하에서 성장하는 미변화된 또는 야생형 숙주 세포내에서의 목적 단백질의 발현의 수준보다 큰 발현의 수준으로 발현된다. "변형 숙주 세포(modified host cell)"은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현되도록 유전적으로 설계되는 야생형 또는 변화된 숙주 세포를 의미한다. 변형 숙주 세포는 야생형 또는 변화된 모 숙주 세포보다 더 높은 수준으로 젖산을 발현할 수 있다.

상기 숙주세포는 효모(yeast) 또는 박테리아(bacteria)일 수 있으나 이에 제한 되는 것은 아니며, 상기 발현 벡터를 도입하기에 적합한 모든 세포를 포함한다. 상기 효모 또는 박테리아는 자이모모나스(Zymomonas ), 에스케리치아(Escherichia ), 슈도모나스(Pseudomonas ), 알칼리게네스(Alcaligenes ), 살모넬라(Salmonella ), 쉬겔라(Shigella ), 버크홀데리아(Burkholderia ), 올리고트로파(Oligotropha ), 클렙시엘라(Klebsiella ), 피치아(Pichia ), 칸디다(Candida ), 한세눌라(Hansenula ), 사카로미세스(Saccharomyces ), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces ), 코마모나스(Comamonas ), 코리네박테리움(Corynebacterium ), 브레비박테륨(Brevibacterium ), 로도코쿠스(Rhodococcus ), 아조토박터(Azotobacter ), 시트로박터(Citrobacter ), 엔테로박터(Enterobacter ), 클로스트리디움(Clostridium ), 락토바실러스(Lactobacillus ), 아스페르길루스(Aspergillus ), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces ), 두날리엘라(Dunaliella ), 데바리오미세스(Debaryomyces ), 무코르(Mucor ), 토룰롭시스(Torulopsis ), 메틸로박테리아(Methylobacteria ), 바실러스(Bacillus ), 리조비움(Rhizobium ), 스트렙토마이세스( Streptomyces)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 구현예에서, 숙주 세포는 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 또는 또는 에스케리치아(Escherichia)가 사용되었으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 클루이베로마이세스 속은 클루이베로마이세스 마르시아누스(K. marxianus), 클루이베로마이세스 프라길리스(K. fragilis), 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis), 클루이베로마이세스 불가리쿠스(K. bulgaricus), 및 클루이베로마이세스 써모토러란스(K. thermotolerans)를 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 실시예에서, 클루이베로마이세스 마르시아누스 및 에스케리치아 콜리가 사용되었다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "도입된(introduced)"은 핵산 서열을 상기 숙주 세포내로 옮기는 임의의 적절한 방법을 의미한다. 도입의 방법은 원형질 융합, 감염(transfection), 형질전환, 컨쥬게이션, 형질도입을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(예를 들면, Ferrari et al., "Genetics," in Hardwood et al,(eds.), (Bacillus), Plenum Publishing Corp., pages 57-72, [1989] 참조).

본 명세서에서 사용된, 용어 "형질전환된(tramsformed)" 및 "안정적으로 형질전환된(stably transformed)"은 게놈 내로 통합되는 비-고유의 이종적인 폴리뉴클레오티드 서열 또는 2 이상의 세대 동안 유지되는 에피솜 플라스미드에 존재하는 이종의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 의미한다.

상기 LDH 활성을 코드화하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 것은, 플라스미드를 대장균으로부터 단리하고, 이를 숙주 세포에 형질전환하는 것에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 대장균과 같은 중매 미생물을 필수적으로 사용하여야 하는 것은 아니고, 벡터가 숙주 세포로 직접적으로 도입될 수도 있다. 상기 형질전환 방법은 전기천공(electroporation), 극미 주입(microinjection), 유전자총(biolistics)(또는 입자 폭격 매개된 전달), 또는 아그로박테리움 매개된 형질전환 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 구현예에 따르면, 상기 변형 미생물을 이용한 젖산의 생산 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 변형 미생물을 글루코오스 함유 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양에 의해 생성된 젖산을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 방법은 회수된 젖산으로부터 락타이드를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 상기 락타이드를 중합하여 폴리락타이드 중합체를 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 변형 미생물을 배양하는 단계는 발효 조건 하에서 수행될 수 있다.

세포 배양에 사용되는 상기 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그).

상기 구현예에서, 상기 배지는 변형 미생물에 의해 발효될 수 있는 당을 포함하는 발효 배지일 수 있다. 당은 6탄당, 예를 들면, 글루코스, 글리칸 또는 글루코스의 다른 중합체, 글루코스 올리고머, 예를 들면, 말토스, 말토트리오스 및 이소말토트리오스, 파노스, 프럭토스 및 프럭토스 올리고머일 수 있다. 상기 발효 배지는 또한 암모니아, 황산 암모늄, 염화 암모늄, 질산 암모늄 및 우레아와 같은 질소원; 인산 수소 칼륨, 인산 이수소 칼륨, 황산 마그네슘과 같은 무기염; 및 필요에 따라, 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카사미노산, 비오틴, 티아민과 같은 각종의 비타민을 포함하는 영양분을 포함할 수 있다.

상기 변형 미생물은 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있다. 고전적인 배치 발효 방법은 폐쇄적인 시스템을 사용하며, 상기 배양 매질은 발효가 실행되기 전에 만들어지고, 상기 매질에 유기체를 접종하고, 상기 매질에 어떠한 성분의 첨가도 없이 발효가 일어난다. 특정한 경우에서, 성장 매질의 상기 탄소원 내용물이 아닌, 상기 pH 및 산소 함량은 배치 방법 동안 변화된다. 배치 시스템의 상기 대사물 및 세포 바이오매스는 끊임없이 발효가 정지될 때까지 변한다. 배치 시스템에서, 세포는 정지된 지체 상에서 고도성장 로그 상에 걸쳐 진척하고, 성장율이 감소되거나 멈춘 최종적으로 정지 상에 이른다. 처리되지 않으면, 정지상의 세포는 결국 죽는다. 일반적인 기간에서, 로그 상의 상기 세포는 대부분의 단백질을 만든다.

표준 배치 시스템의 변형은 "공급-배치 발효" 시스템이다. 상기 시스템에서, 영양(예를 들면, 탄소원, 질소원, O₂, 및 통상적으로, 다른 영양)은 이들의 배양물의 농도가 한계치 미만으로 떨어질 때 첨가된다. 공급-배치 시스템은 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 억제하고, 매질이 매질 내에서 영양소를 제한된 양으로 갖는 것이 바람직할 때 유용하다, 공급-배치 시스템에서의 실제 영양 농도의 측정은 pH, 용존 산소 및 CO₂와 같은 폐기가스의 부분압과 같은 측정가능한 인자의 변화에 기초하여 예측된다. 배치 및 공급-배치 발효가 일반적이고, 당업계에 알려져 있다.

계속적 발효는, 정의된 배양 매질이 계속해서 생반응기(bioreactor)에 첨가되고, 조건화된 매질의 동일한 양이 과정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 계속적 발효는 일반적으로 세포가 처음에는 로그 상 성장에 있는 일정한 고 밀도의 배양물을 유지한다. 계속적 발효는 세포 성장 또는 마지막 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조작을 허용한다. 예를 들어, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 속도로, 모든 다른 파라미터는 적당하게 유지된다. 다른 시스템에서, 많은 성장에 영향을 주는 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안, 계속해서 변한다. 계속적 시스템은 일정한 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 매질이 빠져나가는 것에 의한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대항하여 균형이 맞을 수 있다. 생성물 형성의 속도를 최대화하는 기술뿐만 아니라, 계속적 발효 과정 동안 영양소 및 성장인자를 유지하는 방법은 당업계에 알려져 있다.

상기 배양 동안 배지는 pH가 약 5.0 내지 약 9.0, 또는 약 5.5 내지 약 7.0의 범위에서 유지되도록 완충될 수 있다. 적합한 완충제는 젖산이 형성되었을 때 이를 중화시킬 수 있는 염기성 물질로, 예를 들면 수산화칼륨, 탄산칼슘, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산칼륨, 탄산나트륨, 탄산암모늄, 암모니아, 수산화암모늄을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 배양은 발효 종결시 배지의 pH가 젖산의 pKa 이하가 되도록 수행될 수 있다. 예를 들면, 최종 pH는 약 1.5 내지 약 4.5, 또는 약 2.0 내지 약 3.5, 또는 약 2.5 내지 3.0의 범위일 수 있다. 상기 구현예에 따른 미생물은 pH가 약 3.5 미만, 약 3.3 미만, 심지어 약 3.1 미만인 산성 발효 배지에서도 성장하여 젖산을 생산할 수 있다.

상기 배양에 의해 생성된 젖산을 회수하는 단계는 바이오프로세스에서 사용되는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 염석법, 재결정법, 유기 용매 추출법, 에스테르화 증류법, 크로마토그래피 및 전기투석법을 포함하며, 분리, 정제 또는 수집 방법이 사용될 수 있다.

상기 구현예에 따르면, 변형 미생물은 고수율로 젖산을 생산할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 변형 미생물은 34.50% 이상의 수율을 나타내었다. 심지어, 상기 변형 미생물은 약 pH 3.0의 조건하에서도 12.20% 이상의 수율을 나타내었다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

*균주 및 플라스미드

플라스미드의 증식 및 대량 추출을 위한 숙주로는 E.coli TOP10 F- mcrA △(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ△M15 △lacX74 nupG recA1 araD139 △ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 λ-XL1 Blue(endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq △(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)(Invitrogen, CA)를 사용하였다. 젖산을 생성하기 위한 효모 숙주 세포로는 Kluyveromyces marxianus 균주, 예를 들면 KM07(ATCC 36907)을 사용하였다. 유전자 재조합 플라스미드는 pRS306 (ATCC 77141)을 사용하였다.

배지 및 배양 방법

E. coli는 암피실린 또는 카나마이신을 포함하는 LB(1% 박토-트립톤, 0.5% 박토-효소 추출물, 1% NaCl) 배지에 접종한 후, 37℃에서 배양하여 사용하였다. 효모 숙주 세포와 재조합 효모는 YPD(1% 박토-효모추출물, 2% 박토-펩톤, 2% 덱스트로스) 배지에서, 37℃의 온도 하에 2틀 동안 배양하여 사용하였다. 최소배지는 0.17 % 효모 질소 염기, 0.5 % 황산암모늄, 2 % 글루코스 또는 글리세롤, 38.4 mg/l 아르기닌, 57.6 mg/l이소로이신, 48 mg/l 페닐알라닌, 57.6 % mg/l 발린, 6mg/l 트레오닌, 50 mg/l 이노시톨, 40 mg/l 트립토판, 15 mg/l 티롭신, 60 mg/l 로이신, 4 mg/l 히스티딘을 포함한다.

실시예 1: 젖산의 고효율 생산을 위한 발현 벡터의 제작

A. pKM316 의 제작

K. marxianus의 ARS/CEN 복제 개시점을 53.2℃의 TaOpt(optimal annealing temperature)하에 PCR을 수행하여 증폭하였다. 이때, 사용된 프라이머는 하기와 같다:

정방향 프라이머 5'-TTCAGACGTCGAGCTCCTTTCATTTCTGAT-3'

역방향 프라이머 5'-TTCAGACGTCATCGATTGAAGTTTTGTCCA-3'

그 다음, 상기 복제 개시점을 제한효소 AatII를 이용하여 절단한 후, 같은 방법으로 절단된 pRS306 (ATCC 77141) 플라스미드에 도입하여 K. marxianus　-　E. coli 셔틀 벡터를 제작하였다. 이를 pKM316이라 명명하였다.

B. pJSKM316 - GPD 의 제작

S. cerevisiae의 GPD 프로모터 및 K. marxianus의 CYC 터미네이터를 57.5℃의 TaOpt하에 PCR을 수행하여 증폭하였다. 이때, 사용된 프라이머는 각각 하기와 같다:

정방향 프라이머 5'-TTCAGGTACCGGCCGCAAATTAAAGCCTTC-3'

역방향 프라이머 5'-TTCAGCGGCCGCAGTTTATCATTATCAATACT-3'

정방향 프라이머 5'-TTCAGGTACCTCATGTAATTAGTTATGTCAC-3'

역방향 프라이머 5'-TTCAGCGGCCGCGGCCGCAAATTAAAGCCT-3'

그 다음, 상기 프로모터 및 터미네이터를 제한효소 NotI과 KpnI 를 이용하여 절단한 후, 같은 방법으로 절단된 pKM316에 도입하여 pJSKM316-GPD를 제작하였다.

C. pJSKM316 - GPD LDH CYC

일본자라(서열번호 6), 오리너구리(서열번호 7), 병코돌고래(서열번호 8) 및 노르웨이산집쥐(서열번호 9)로부터 유래한 LDH를 제한효소 BamHI과 EcoRI를 이용하여 절단한 후, 같은 방법으로 절단된 pJSKM316-GPD 에 각각 도입하여 4개의 pJSKM316-GPD LDH CYC 를 제작하였다.

대조로서, 개구리(Xenopus laevis)로부터 유래한 LDH를 상기와 동일한 방법으로 pJSKM316-GPD에 도입하여 pJSKM316-GPD LDH CYC를 제작하였다.

실시예 2: 변형 K. marxianus 의 젖산 생산 수율 평가

상기 실시예 1에서 제작된 5개의 발현 벡터를 K. marxianus 균주에 도입하였다. 상기 5개의 발현 벡터 pJSKM316-GPD LDH CYC 를 전기천공 방법으로 KM07 에 각각 형질전환한 후, pH 5.5에서의 젖산 생산 수율을 측정하였다. 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.

LDH 유전자의 기원	젖산의 생산성(g/L/h)	수율(%)
일본자라	1.02	35.70
오리너구리	0.99	34.77
병코돌고래	0.98	35.18
노르웨이산집쥐	0.97	36.07
개구리	0.76	26.28

상기의 표 1로부터 알 수 있듯이, 일본자라, 오리너구리, 병코돌고래 및 노르웨이산집쥐로부터 유래한 LDH를 포함하는 K. marxianus　의 젖산 생산성은 0.959g/L/h으로서 34.77% 이상의 수율을 나타났으나, 개구리로부터 유래한 LDH를 포함하는 K. marxianus　의 젖산 생산성은 0.76g/L/h 로서 26.28% 이하의 수율을 나타내었다.

또한, 산성 조건하에서의 상기 구현예에 따른 K. marxianus　의 젖산 생산성을 알아보기 위하여, pH 3에서 젖산 생산 수율을 측정하였다. 그 결과를 하기의 표 2에 나타내었다.

LDH 유전자의 기원	젖산의 생산성(g/L/h)	수율(%)
일본자라	0.34	19.20
오리너구리	0.30	17.10
병코돌고래	0.24	15.20
노르웨이산집쥐	0.22	12.20

상기의 표 2로부터 알 수 있듯이, 일본자라, 오리너구리, 병코돌고래 및 노르웨이산집쥐로부터 유래한 LDH를 포함하는 K. marxianus　의 젖산 생산성은 pH 3의 강산 조건하에서도 0.22g/L/h 이상으로, 12.20% 이상의 수율을 나타내었다.

따라서, 상기 실시예에 따라 제조된 일본자라, 오리너구리, 병코돌고래 및 노르웨이산집쥐로부터 유래한 LDH 유전자를 갖는 K. marxianus 균주들은 산성 조건하에서도 젖산을 고수율로 생산할 수 있으므로, 산업적으로 이용할 수 있을 것이다.

이상 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백한 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> MODIFIED MICROORGANISM FOR HIGH EFFICIENT PRODUCTION OF LACTIC ACID <130> RG-201109-516-1 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1267 <212> DNA <213> DNA <400> 1 gagctccttt catttctgat aaaagtaaga ttactccatt tatcttttca ccaacatatt 60 catagttgaa agttatcctt ctaagtacgt atacaatatt aattaaacgt aaaaacaaaa 120 ctgactgtaa aaatgtgtaa aaaaaaaata tcaaattcat agcagtttca aggaatgaaa 180 actattatga tctggtcacg tgtatataaa ttattaattt taaacccata taatttatta 240 tttttttatt ctaaagttta aagtaatttt agtagtattt tatattttga ataaatatac 300 tttaaatttt tatttttata ttttattact tttaaaaata atgtttttat ttaaaacaaa 360 attataagtt aaaaagttgt tccgaaagta aaatatattt tatagttttt acaaaaataa 420 attattttta acgtattttt tttaattata tttttgtatg tgattatatc cacaggtatt 480 atgctgaatt tagctgtttc agtttaccag tgtgatagta tgattttttt tgcctctcaa 540 aagctatttt tttagaagct tcgtcttaga aataggtggt gtataaattg cggttgactt 600 ttaactatat atcattttcg atttatttat tacatagaga ggtgctttta attttttaat 660 ttttattttc aataatttta aaagtgggta cttttaaatt ggaacaaagt gaaaaatatc 720 tgttatacgt gcaactgaat tttactgacc ttaaaggact atctcaatcc tggttcagaa 780 atccttgaaa tgattgatat gttggtggat tttctctgat tttcaaacaa gaggtatttt 840 atttcatatt tattatattt tttacattta ttttatattt ttttattgtt tggaagggaa 900 agcgacaatc aaattcaaaa tatattaatt aaactgtaat acttaataag agacaaataa 960 cagccaagaa tcaaatactg ggtttttaat caaaagatct ctctacatgc acccaaattc 1020 attatttaaa tttactatac tacagacaga atatacgaac ccagattaag tagtcagacg 1080 cttttccgct ttattgagta tatagcctta catattttct gcccataatt tctggattta 1140 aaataaacaa aaatggttac tttgtagtta tgaaaaaagg cttttccaaa atgcgaaata 1200 cgtgttattt aaggttaatc aacaaaacgc atatccatat gggtagttgg acaaaacttc 1260 aatcgat 1267 <210> 2 <211> 289 <212> DNA <213> DNA <400> 2 atttggcgag cgttggttgg tggatcaagc ccacgcgtag gcaatcctcg agcagatccg 60 ccaggcgtgt atatatagcg tggatggcca ggcaacttta gtgctgacac atacaggcat 120 atatatatgt gtgcgacgac acatgatcat atggcatgca tgtgctctgt atgtatataa 180 aactcttgtt ttcttctttt ctctaaatat tctttcctta tacattagga cctttgcagc 240 ataaattact atacttctat agacacgcaa acacaaatac acacactaa 289 <210> 3 <211> 401 <212> DNA <213> DNA <400> 3 atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca 60 tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc 120 tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt 180 tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat 240 tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg 300 tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc 360 ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt t 401 <210> 4 <211> 655 <212> DNA <213> DNA <400> 4 agtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat 60 tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc 120 ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 180 tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 240 aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 300 tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 360 ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 420 ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 480 aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 540 agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 600 tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccagaac ttagtttcga cggat 655 <210> 5 <211> 1468 <212> DNA <213> DNA <400> 5 gccgggatcg aagaaatgat ggtaaatgaa ataggaaatc aaggagcatg aaggcaaaag 60 acaaatataa gggtcgaacg aaaaataaag tgaaaagtgt tgatatgatg tatttggctt 120 tgcggcgccg aaaaaacgag tttacgcaat tgcacaatca tgctgactct gtggcggacc 180 cgcgctcttg ccggcccggc gataacgctg ggcgtgaggc tgtgcccggc ggagtttttt 240 gcgcctgcat tttccaaggt ttaccctgcg ctaaggggcg agattggaga agcaataaga 300 atgccggttg gggttgcgat gatgacgacc acgacaactg gtgtcattat ttaagttgcc 360 gaaagaacct gagtgcattt gcaacatgag tatactagaa gaatgagcca agacttgcga 420 gacgcgagtt tgccggtggt gcgaacaata gagcgaccat gaccttgaag gtgagacgcg 480 cataaccgct agagtacttt gaagaggaaa cagcaatagg gttgctacca gtataaatag 540 acaggtacat acaacactgg aaatggttgt ctgtttgagt acgctttcaa ttcatttggg 600 tgtgcacttt attatgttac aatatggaag ggaactttac acttctccta tgcacatata 660 ttaattaaag tccaatgcta gtagagaagg ggggtaacac ccctccgcgc tcttttccga 720 tttttttcta aaccgtggaa tatttcggat atccttttgt tgtttccggg tgtacaatat 780 ggacttcctc ttttctggca accaaaccca tacatcggga ttcctataat accttcgttg 840 gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga gatatacaat agaacagata ccagacaaga 900 cataatgggc taaacaagac tacaccaatt acactgcctc attgatggtg gtacataacg 960 aactaatact gtagccctag acttgatagc catcatcata tcgaagtttc actacccttt 1020 ttccatttgc catctattga agtaataata ggcgcatgca acttcttttc tttttttttc 1080 ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca tatccgcaat gacaaaaaaa tgatggaaga 1140 cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca gcaccaacag atgtcgttgt tccagagctg 1200 atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt tttccttcct tcattcacgc acactactct 1260 ctaatgagca acggtatacg gccttccttc cagttacttg aatttgaaat aaaaaaaagt 1320 ttgctgtctt gctatcaagt ataaatagac ctgcaattat taatcttttg tttcctcgtc 1380 attgttctcg ttccctttct tccttgtttc tttttctgca caatatttca agctatacca 1440 agcatacaat caactccaag ctggccgc 1468 <210> 6 <211> 332 <212> PRT <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 6 Met Ser Val Lys Glu Leu Leu Ile Gln Asn Val His Lys Glu Glu His 1 5 10 15 Ser His Ala His Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Arg Gly Glu Met Leu Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala His Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asp Cys Met Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys His Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Lys Leu Gly Ile His Ser Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Ile Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Pro Asp Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu His Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Thr Val Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Val Lys Gly Met Tyr Gly Val Ser Ser Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Val Leu Gly Tyr Ala Gly Ile Thr Asp Val Val 290 295 300 Lys Met Thr Leu Lys Ser Glu Glu Glu Glu Lys Leu Arg Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 7 <211> 332 <212> PRT <213> Ornithorhynchus anatinus <400> 7 Met Ala Gly Val Lys Glu Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Tyr Ala Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Ile His Ser Thr Ser Cys His Gly Trp Val Ile Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Asp Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Asp Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Val Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Asp Glu Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Val Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Ile Thr Leu Lys Ser Glu Glu Glu Ala His Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 8 <211> 332 <212> PRT <213> Tursiops truncatus <400> 8 Met Ala Thr Val Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Val Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro His Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu His Trp Lys Ala Ile His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Val Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr Pro Glu Glu Gln Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 9 <211> 332 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 9 Met Ala Ala Leu Lys Asp Gln Leu Ile Val Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Lys Thr Pro Lys Ile Val Ser Ser 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Gln Cys Lys Leu Leu Ile Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Val Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Ser Leu Asn Pro Gln Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Asp Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr Pro Asp Glu Glu Ala Arg Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 10 <211> 252 <212> DNA <213> DNA <400> 10 tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60 aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120 tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180 acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240 taatttgcgg cc 252

Claims

일본자라(Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리(Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래(Tursiops truncatus) 및 노르웨이산집쥐(Rattus norvegicus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 락테이트 데하이드로게나제(Lactate Dehydrogenase, LDH) 활성을 포함하는, 젖산의 고효율 생산을 위한 변형 미생물.
제1항에 있어서,
상기 변형 미생물은 효모(yeast) 또는 박테리아(bacteria)인 것인, 변형 미생물.
제2항에 있어서,
상기 변형 미생물은 자이모모나스(Zymomonas ), 에스케리치아(Escherichia ), 슈도모나스(Pseudomonas ), 알칼리게네스(Alcaligenes ), 살모넬라(Salmonella ), 쉬겔라(Shigella ), 버크홀데리아(Burkholderia ), 올리고트로파(Oligotropha ), 클렙시엘라(Klebsiella ), 피치아(Pichia ), 칸디다(Candida ), 한세눌라(Hansenula ), 사카로미세스(Saccharomyces ), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces ), 코마모나스(Comamonas ), 코리네박테리움(Corynebacterium ), 브레비박테륨(Brevibacterium ), 로도코쿠스(Rhodococcus ), 아조토박터(Azotobacter ), 시트로박터(Citrobacter ), 엔테로박터(Enterobacter ), 클로스트리디움(Clostridium ), 락토바실러스(Lactobacillus ), 아스페르길루스(Aspergillus ), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces ), 두날리엘라(Dunaliella ), 데바리오미세스(Debaryomyces ), 무코르(Mucor ), 토룰롭시스(Torulopsis ), 메틸로박테리아(Methylobacteria ), 바실러스(Bacillus ), 리조비움(Rhizobium ), 스트렙토마이세스(Streptomyces)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 변형 미생물
제3항에 있어서,
상기 변형 미생물은 에스케리치아 콜리(Escherichia coli, 대장균) 또는 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)인 것인, 변형 미생물.
제1항에 있어서,
상기 변형 미생물은 글루코오스로부터 34% 이상의 수율로 젖산을 생산하는 것인, 변형 미생물.
제1항에 있어서,
상기 변형 미생물은 pH 3의 조건하에서 글루코오스로부터 12.20% 이상의 수율로 젖산을 생산하는 것인, 변형 미생물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 변형 미생물을 제작하기 위한,
복제 개시점;
프로모터;
일본자라, 오리너구리, 병코돌고래 및 노르웨이산집쥐로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 LDH 활성을 코드화하는 폴리뉴클레오티드; 및
터미네이터를 포함하는, 발현 벡터.
제7항에 있어서,
상기 복제 개시점은 ARS/CEN 복제 개시점인 것인, 발현 벡터.
제8항에 있어서,
상기 ARS/CEN 복제 개시점은 서열번호 1, 또는 상기 서열번호에 대하여 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 발현 벡터.
제7항에 있어서,
상기 프로모터는 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 발현 벡터.
제10항에 있어서,
상기 CYC 프로모터는 서열번호 2 또는 상기 서열번호에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함하는 것인, 발현 벡터.
제10항에 있어서,
상기 TEF 프로모터는 서열번호 3 또는 상기 서열번호에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함하는 것인, 발현 벡터.
제10항에 있어서,
상기 GPD 프로모터는 서열번호 4 또는 상기 서열번호에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함하는 것인, 발현 벡터.
제10항에 있어서,
상기 ADH 프로모터는 서열번호 5 또는 상기 서열번호에 대하여 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 것을 포함하는 것인, 발현 벡터.
제7항에 있어서,
상기 일본자라로부터 유래한 LDH 활성은 서열번호 6, 또는 상기 서열번호에 대하여 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하고,
상기 오리너구리로부터 유래한 LDH 활성은 서열번호 7, 또는 상기 서열번호에 대하여 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하고,
상기 병코돌고래로부터 유래한 LDH 활성은 서열번호 8, 또는 상기 서열번호에 대하여 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하고,
상기 노르웨이산집쥐로부터 유래한 LDH 활성은 서열번호 9, 또는 상기 서열번호에 대하여 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 발현 벡터.
제7항에 있어서,
상기 터미네이터는 CYC1 터미네이터인 것인, 발현 벡터.
제7항에 있어서,
상기 CYC1 터미네이터는 서열번호 10, 또는 상기 서열번호에 대하여 70% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는 것인, 발현 벡터.
제1항 내지 제6항에 따른 변형 미생물을 글루코오스 함유 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 배양에 의해 생성된 젖산을 회수하는 단계를 포함하는, 젖산의 고효율 생산 방법.
제18항에 있어서,
상기 배양 중에 적어도 일부 동안 배지의 pH가 1.5 내지 4.5의 범위 내에 있는 것인, 방법.
제18항에 있어서,
상기 배양의 시작시에는 pH가 3.5 내지 6이고, 배양 동안에는 pH가 1.9 내지 3.5로 떨어지는 것인, 방법.
제18항에 있어서,
상기 회수된 젖산으로부터 락타이드를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제21항에 있어서,
락타이드를 중합하여 폴리락타이드 중합체를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.