KR20070038235A

KR20070038235A - Ｌｄｈ 유전자를 포함하는 락토바실러스용 벡터, ｌｄｈ유전자가 염색체에 삽입된 락토바실러스 속 균주, 상기균주를 선발하는 방법 및 상기 균주를 이용하여 ｌ형젖산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20070038235A
Application number: KR1020050093320A
Authority: KR
Inventors: 박영훈; 조광명; 진창현
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2005-10-05
Filing date: 2005-10-05
Publication date: 2007-04-10

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 프로모터 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3의 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 기능적으로 연결되어 있는 락토바실러스용 벡터, 상기 벡터를 이용하여 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 균주를 선발하는 방법 및 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 균주를 배양하는 단계를 포함하는, L-젖산을 생산하는 방법을 제공한다.

락테이트 디히드로게나제, 젖산

Description

ＬＤＨ 유전자를 포함하는 락토바실러스용 벡터, ＬＤＨ 유전자가 염색체에 삽입된 락토바실러스 속 균주, 상기 균주를 선발하는 방법 및 상기 균주를 이용하여 Ｌ형 젖산을 생산하는 방법{A vector for the lactobacillus genus microorgansim containing LDH gene, lactobacillus genus microorgansim having integrated LDH gene in its chromosome, method of selecting the microorgansim and a method of producing L-lactic acid using the microorgansim}

도 1은 pCJ100 벡터의 제한 효소 지도를 나타내는 도면이다.

도 2a 및 2b는 본 발명의 일 구체예에 따른 pCJ101 벡터의 제작과정을 나타내는 도면이다.

도 3은 pCJ101 벡터로 형질전환된 락토바실러스 파라카세이 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 한 PCR을 통하여 얻어진 PCR 산물을 전기 영동한 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명은 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 락토바실러스 속 균주의 염색체에 삽입하는데 유용한 벡터, 상기 폴리뉴클레오티드 가 염색체에 삽입된 락토바실러스 속 균주, 상기 균주를 선발하는 방법 및 상기 균주를 이용하여 L형 젖산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

락토바실러스 (Lactobacilli) 속 미생물은 인간의 위장에서 흔히 발견되는 프로바이오틱스 (probiotics)로서 인간의 건강을 증진시키는 기능이 있다. 최근에 효소나 백신의 전달체로서 락토바실러스를 이용하고자 하는 연구가 많이 진행되고 있지만 대장균과 같이 확실한 염색체 삽입 체계 (integration system)가 구축되어 있지 않다.

종래에 락토바실러스 속 미생물에서 외래 폴리뉴클레오티드를 염색체 삽입하고자 하는 연구가 있었다. Serror P, Appl Environ Microbiol, 2002 Jan;68:46-52에는 파지 삽입용 요소 (Phage integrative element)를 이용하는 방법이 개시되어 있다. 즉 박테리오파지의 인테그라제 (integrase) 유전자와 attP 부위를 지니고 있는 벡터를 이용하여 락토바실러스 속 미생물의 염색체에 외래 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 방법이 개시되어 있다. 또한 파지를 사용하지 않는 부위-특이적 염색체 삽입 방법이 알려져 있다. 예를 들면, Russell WM, Appl Environ Microbiol, 2001 Sep;67:4361-4에는 2개의 플라스미드를 이용하여 lacL 유전자를 불활성화시키는 방법이 개시되어 있다. 또한 최근에는 클로스트리디움 서모셀룸 (Clostridium thermocellum) 균주 유래의 세포 외부 엔도글루카나제 A (celA) 유전자를 선발 마커로 사용하여 외래 폴리뉴클레오티드를 락토바실러스 속 미생물의 염색체 내에서 삽입하는 방법이 개시되어 있다 (Jang SJ, FEMS Microbiol Lett. 2003 Jul 29;224:191-5).

또한, 미국특허공개 제2003/0228671호에는 효모 균주의 염색체상에 존재하는 피루베이트 디카르복실라제 (PDC) 유전자 위치에 락테이트 디히드로게나제 (LDH) 유전자를 삽입시켜 얻어진 효모 균주를 이용하여 젖산을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 이와 같은 종래 기술에 의하더라도, L-ldh 유전자를 파지나 세포 외부 엔도글루카나제 A 등을 이용하지 않고 용이하게 락토바실러스 속 미생물의 염색체에 삽입하는 방법은 여전히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 락토바실러스 속 균주의 16S rRNA를 이용함으로써 락토바실러스 속 균주에 외래 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내에 용이하게 삽입시킬 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 락토바실러스 속 균주의 염색체 삽입하는데 유용한 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 락토바실러스 속 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 벡터를 이용하여 염색체 중에 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 락토바실러스 속 균주를 선발하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 염색체 중에 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입되어 있는 락토바실러스 속 균주를 이용하여 L형 젖산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 프로모터 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3의 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 기능적으로 연결되어 있는 락토바실러스용 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드는 락토바실러스 속 균주인 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei)의 16S rRNA를 코딩한다.

본 발명에 있어서, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드는 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum)으로부터 유래된 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 유전자의 프로모터 서열이다. 또한, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드는 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei)로부터 유래된 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 일 구체예에서는, 본 발명의 벡터는 바람직하게는 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 pCJ101 벡터이다.

본 발명의 벡터의 일 구체예에서, 본 발명의 벡터는 락토바실러스 속 박테리아에 치사적인 항생제, 예를 들면 에리스로마이신에 대하여 내성을 부여하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 에리스로마이신에 대하여 내성을 부여하는 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것이다.

본 발명에 있어서, "벡터"란 당업계에 통상적으로 알려진 의미로 사용된다. "벡터"란 일반적으로 세포의 중심 대사의 일부분이 아닌 유전자를 포함하기도 하는 외래 염색체 요소로서, 보통 원형의 이중가닥 DNA이다. 상기 요소는 자가복제서열, 게놈삽입서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형 또는 원형, 단일 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 일반적으로, 상기 벡터는 적당한 유전자의 전사 및 번역을 지시하는 서열, 선택성 마커, 및 자가복제 또는 염색체 삽입을 허용하는 서열이 포함된다. 적절한 벡터는 전사 개시 조절을 포함하는 유전자의 5′영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3′을 포함한다. 본 발명에 있어서, "기능적으로 연결되어 있는"이란 표현의 의미는 각 폴리뉴클레오티드가 전사 및 번역되어 활성이 있는 유전자 산물을 발현하도록 연결되어 있는 것을 의미한다. 본 발명의 벡터는, 상기한 각 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 당업계에 알려진 통상적인 적당한 조절 서열을 포함할 수 있다. 상기 "적당한 조절 서열"이란 상기 폴리뉴클레오티드가 전사 및 번역될 수 있도록 조절기능을 하는 서열을 말한다. 상기 조절 서열에는 예를 들면, 리보좀 결합 서열 (RBS), 프로모터 및 터미네이터가 포함된다. 상기 프로모터는 본 발명의 유전자의 전사의 개시를 지시할 수 있는 서열이면, 어느 것이나 될 수 있으나, 예를 들면, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (사카로마이세스에서의 발현에 유용함), lac, trp, λP_L, λP_R, T7, tac 및 trc (E. coli에서의 발현에 유용함)가 사용될 수 있다. 또한, 상기 터미네이터 영역은 바람직한 숙주세포의 다양한 유전자로부터 유 래하는 것일 수 있으며, 또한 선택적으로 필요하지 않을 수도 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 벡터로 락토바실러스 균주를 형질전환시키고 선발 배지에서 배양함으로써, 형질전환된 락토바실러스 균주로부터 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 균주를 선발하는 단계를 포함하는, L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 균주를 선발하는 방법을 제공한다.

본 발명의 벡터는 락토바실러스 유래 16S rDNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있어, 락토바실러스 속 미생물에 도입되는 경우, 그 염색체 중에 삽입되는 특성이 있다. 따라서, 본 발명의 벡터는 벡터 그 자체 또는 그에 포함되어 있는 외래 유전자를 락토바실러스 속 미생물의 염색체에 안정하게 삽입하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, "선발 배지"란 본 발명의 벡터로 형질전환 균주가 배양물 중에서 다른 균주에 비하여 우선적으로 생육할 수 있도록 하는 배지를 말한다. 선발 배지에는 임의의 선택 마커, 예를 들면 에리스로마이신, 카나마이신 및 젠타마이신 등이 포함되어 있는 배지가 포함된다.

본 발명의 벡터를 락토바실러스 속 미생물에 도입하는 방법은 당업계에 알려진 임의의 벡터 도입 방법이 사용될 수 있다. 예를 들며, 전기천공 (electroporation) 및 입자 충돌법 (particle bombardment) 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 미생물은 락토바실러스 속 미생물이면 어느 것이나 포함되나, 바람직하게는 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei)이다.

본 발명은 또한, L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 균주를 제공한다. 바람직하게는, 상기 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 균주는 본 발명의 선발 방법에 의하여 선발되는 것이다. 더욱 바람직하게는, 상기 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 균주, 파라카세이 균주 (수탁번호 KCCM-10681P)이다.

본 발명에 있어서, "L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된"이란 표현은, 락토바실러스 속 균주 체내에 내재적으로 가지고 있는 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제외하고, 추가적으로 상기 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 것을 말한다.

본 발명은 또한, L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 균주를 배양하는 단계를 포함하는, L-젖산을 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 락토바실러스 균주는 락토바실러스 파라카세이다.

본 발명의 L-젖산을 생산하는 방법은 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 균주를 사용하는 것을 제외하고는 통상적으로 알려진 락토바실러스 균주의 배양 방법이 사용될 수 있다. 또한, 종래 알려진 임의의 젖산의 분리 방법이 배양물 중의 젖산을 분리하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 L-젖산을 생산하는 방법의 일 구체예에 있어서, 상기 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 균주는 상기한 바와 같은 본 발명에 따른 벡터로 락토바실러스 균주를 형질전환하고 배양함으로써 얻어지는 균주이다. 바람직하게는, 상기 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 파라카세이는 상기한 바와 같은 본 발명에 따른 벡터로 락토바실러스 파라카세이를 형질전환하고 배양함으로써 얻어지는 균주이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예1 : L-락테이트 디히드로게나제( L- ldh ) 프로모터 영역 클로닝

본 실시예에서는 미국 국립생물정보센터(NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov)의 뉴클레오티드 검색을 통하여 락토바실러스의 L-ldh 프로모터 (promoter) 유전자 서열을 얻을 수 있었고, 이를 클로닝하기 위하여 서열번호 6 및 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하였다. 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이를 주형으로 하고 서열번호 6 및 7의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR을 수행하여 L-ldh 프로모터를 증폭하였다. 서열번호 6과 7의 염기서열을 갖는 상기 프라이머에는 각각 제한효소 BamHI과 NheI의 인지 부위를 포함하고 있다.

증폭된 L-ldh 프로모터 유전자는 TOPO TA Cloning 키트 (Invitrogen 사, 미 국)를 이용하여 pCR2.1 벡터에 클로닝하여, pCR2.1-TOPO-PL - ldh를 제조하였다.

실시예2 : L- ldh 유전자 클로닝

본 실시예에서는 미국 국립생물정보센터(NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov)의 뉴클레오티드 검색을 통하여 락토바실러스 L- ldh 유전자 서열을 얻었고, 이를 통해 서열번호 8 및 9의 염기서열을 지니는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하였다. 락토바실러스 파라카세이 (Lactobacillus paracasei) 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이를 주형으로 하고 서열번호 8 및 9의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR을 수행하여 L- ldh 유전자를 증폭하였다. 서열번호 8과 9의 염기서열을 갖는 상기 프라이머에는 각각 제한효소 NheI과 SacI의 인지 부위를 포함하고 있다.

증폭된 L- ldh 유전자는 TOPO TA Cloning 키트 (Invitrogen 사, 미국)를 이용하여 pCR2.1 벡터에 클로닝하여, pCR2.1-TOPO-L- ldh를 제조하였다.

실시예3 : L- ldh 유전자 염색체 삽입용 벡터의 제조

실시예 2에서 제조한 pCR2.1-TOPO-L- ldh를 제한 효소 NheI과 SacI으로 처리하여 L-ldh 유전자를 분리 정제하였다. 실시예 1에서 제조한 pCR2.1-TOPO-PL - ldh를 제한 효소 NheI과 SacI으로 처리하여 분리 정제한 뒤 L- ldh 유전자 100ng 및 pCR2.1-TOPO-PL-ldh 10ng에 T4 DNA 라이게이즈 1㎕, 라이게이즈 버퍼 1㎕를 넣고 총 부피 10㎕가 되도록 조정한 다음, 16℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 대장균 DH5α에 형질전환시켜 L- ldh 유전자를 포함하는 pCR2.1-TOPO-PL - ldh -L-ldh을 분리정제하였다.

위에서 제조한 pCR-2.1-TOPO-PL - ldh-L- ldh를 주형으로 하고 서열번호 6 및 10의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR을 수행하여 PL-ldh-L-ldh 유전자를 증폭하였다. 서열번호 6 및 10의 염기서열을 갖는 상기 프라이머에는 제한효소 BamHI의 인지 부위를 포함하고 있다.

증폭된 PL - ldh-L- ldh 유전자는 TOPO TA Cloning 키트 (Invitrogen 사, 미국)를 이용하여 pCR2.1 벡터에 클로닝하여 pCR2.1-TOPO- PL - ldh-L- ldh를 제조하였다.

위에서 제조한 pCR2.1-TOPO- PL - ldh-L- ldh를 제한 효소 BamHI으로 처리하여 PL-ldh-L-ldh 유전자를 분리정제하였다. 다음으로, 서열번호 13의 pCJ100 벡터를 제한효소 BamHI으로 처리한 다음, 30㎕의 부피로 CIP (calf intestinal phosphatase) 처리를 하였다. 준비된 PL - ldh-L- ldh 유전자 100ng 및 pCJ100 10ng에 T4 DNA 라이게이즈 1㎕, 라이게이즈 버퍼 1㎕를 넣고 총 부피 10㎕가 되도록 조정한 다음, 16℃에서 6시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 얻어진 벡터를 대장균 DH5α에 형질전환시켜 PL - ldh-L- ldh 유전자를 포함하는 pCJ101 벡터 (서열번호 4)를 분리정제하였다. 도 2a 및 2b는 본 발명의 일 구체예에 따른 pCJ101 벡터의 제작과정을 나타내는 도면이다.

여기에서 사용된 pCJ100 벡터 (서열번호 13)는 TOPO TA Cloning 키트 (Invitrogen 사, 미국)에 포함되어 있는 pCR2.1-TOPO 벡터로부터 유래된 벡터로서, 상기 벡터 중의 amp^R를 불활성화시키고, 락토바실러스 파라카세이 16S rRNA 유전자, 스트렙토코커스 피오제네스 (Streptococcus pyogenes)의 게놈 DNA 유래의 에리스로 마이신 내성 유전자 (erm^R)를 포함하는, pCR2.1(△amp^R)-16S rDNA-erm^R 벡터이다. 도 1은 pCJ100의 제한 효소 지도를 나타내는 도면이다.

실시예4 : 염색체 삽입용 벡터의 락토바실러스로의 형질전환

락토바실러스 파라카세이 균주를 250 mL 플라스크 중의 25 mL MRS 배지 (Difco, cat # 288130)에 접종하여 37 ℃, 200 rpm 조건으로 12 시간 배양한 뒤, 250 mL 중의 1% 글리신 함유 100 mL MRS 배지에 OD₆₀₀=0.25가 되도록 접종한 뒤 OD₆₀₀=0.6이 될 때까지 배양했다. 이 후 1500g, 5분 조건으로 원심분리한 뒤 100 mL SM (326 g 자당, 0.71 g MgCl₂6H₂O를 1리터로 맞춤, 여과기 멸균됨) 버퍼로 두 번 세척하였다. 이 후 1 mL SM 버퍼에 재현탁한 뒤 100 ㎕씩 분주했다.

위와 같이 만들어진 콤페턴트 세포에 염색체 삽입용 벡터 (pCJ101) 1 ㎍을 첨가한 뒤 얼음에 보관 중인 2 mm 전기천공 큐벳에 넣고 1.5 kV, 25 μF, 800Ω으로 전기천공한 뒤 즉시 MRSSM (MRS, 0.5 M 자당, 0.1 M MgCl₂) 1mL을 첨가했다. 이후 46 ℃ 수조에서 6분간 반응시킨 뒤 37 ℃에서 3 시간 배양한 다음 에리스로마이신 5㎍/ml 함유 MRS 플레이트에 도말했다. 생성된 콜로니는 에리스로마이신 20㎍/ml 함유 MRS 플레이트에서 다시 한번 확인했다.

실시예5 : 락토바실러스에서의 벡터 염섹체 삽입 여부 확인

실시예4에서 얻은 형질전환 락토바실러스 파라카세이 균주와 형질 전환 이전의 락토바실러스 파라카세이 균주로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 상기 각각의 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 11 및 12의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR을 수행하여 염색체 삽입 여부를 최종 확인했다.

도 3은 pCJ101 벡터로 형질전환된 락토바실러스 파라카세이 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR하여 얻어진 PCR 산물을 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3에서, M: 1kb 플러스 래더, 레인 1: L. 파라카세이 게놈 DNA를 주형으로 사용, 레인 2 및 3: 삽입 후 1 내지 2 게놈 DNA, 레인 4: pCJ100 벡터

이상과 같이 확인된, 락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 핵산이 염색체 내에 삽입되어 있는 락토바실러스 파라카제이 균주를 2005년 8월 29일자로 한국미생물보존센터 (KCCM)에 수탁번호 KCCM-10681P로 기탁하였다.

실시예6 : 플라스크 수준에서 L형 젖산의 생산 역가 측정

실시예5에서 얻은 L- ldh 유전자가 염색체에 삽입된 락토바실러스 파라카세이 균주 수탁번호 KCCM-10681P를 이용하여 플라스크에서 L형 젖산의 생산 역가를 측정하였다. 역가 측정용 배지는 소듐 포스페이트 버퍼 (pH 6.0)에 GYP 배지 (50g/L, 포도당; 10g/L, 효모 추출물; 10g/L, 펩톤; 500 mg/L, 소듐 시트레이트; 200 mg/L, 마그네슘 설페이트; 10 mg/L, 망간 설페이트; 10 mg/L, 황산제일철 (ferrous sulfate); 10 mg/L, 소듐 클로라이드)를 녹여 사용하였다.　 살균 전 조제 배지의 pH는 6.5이다.

역가 측정 방법은 균주를 37 ℃ MRS 플레이트에서 12 시간 동안 배양한 다음 15 mL 펠콘 튜브에 4mL의 MRS 브로스를 담고 플레이트에서 1 백금이를 접종하여 37 ℃, 200rpm 조건으로 24 시간 배양하였다. 이 후 250 mL 플라스크에 역가 측정용 배지 16 mL를 담고 시드 (seed) 배양한 것을 4 mL 접종한 뒤 37 ℃, 200rpm으로 3일간 배양한 뒤 젖산 농도를 측정하였다. 젖산은 CHIRALPAK MA(+) ID 4.6 mm 길이 50 mm, 및 검출기 파장로서 UV 254 nm를 사용하고, 용리액으로서 100% 0.002M CuSO4, 유속 0.5 ml/분, 전개 시간 20 분, 칼럼 온도 35 ℃ 및 주입 부피 10㎕으로 하는 고속크로마토그래피에 의하여 측정하였다. 젖산 생산량의 측정 결과는 하기 표 1과 같다.

표 1. 플라스크에서 L형 젖산의 생산 역가 측정 결과

균주명		OD₆₀₀ nm	잔류 포도당 (g/l)	L형 젖산(g/l)	소모된 포도당량 (g/l)	L형 젖산 수율(%)
L.파라카세이	1	4.01	13.5	21.2	36.5	58.1
L.파라카세이	2	3.96	14.3	19.1	35.7	53.5
L-ldh 함유 L.파라카세이 1	1	4.23	10.5	25.2	39.5	63.8
L-ldh 함유 L.파라카세이 1	2	4.02	11.7	24.1	38.3	62.9
L-ldh 함유 L.파라카세이 2	1	3.86	11.4	23.8	38.6	61.7
L-ldh 함유 L.파라카세이 2	2	4.35	10.5	25.1	39.5	63.5

표 1에 나타낸 바와 같이, L-ldh 유전자가 염색체 삽입된 L. 파라카세이의 경우 모균주에 비하여 젖산 생산 수율이 현저하게 증가되었음을 알 수 있다.

본 발명의 벡터에 의하면, L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 락토바실러스 속 균주의 염색체에 용이하게 도입할 수 있다.

본 발명의 선발 방법에 의하면, L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 도입된 락토바실러스 속 균주를 용이하게 선발할 수 있다.

본 발명의 균주는, L형 젖산의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 L형 젖산 생산 방법에 의하면, L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 도입된 락토바실러스 속 균주로부터 L형 젖산을 고수율로 생산할 수 있다.

<110> CJ corporation <120> A vector useful for integrating a polynucleotide encoding L-lactate dehydrogenase activity into a chromosome of lactobacillus genus microorgansim, a method of selecting a lactobacillus genus microorganism having an integrated the polynucleotide in its chromosome and a method of producing L-lactic acid using the lactobacillus genus microorganism having an integrated the polynucleotide in its chromosome <130> PN063938 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 829 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei <220> <221> gene <222> (1)..(829) <223> gene encoding 16S rRNA of Lactobacillus paracasei <400> 1 tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg 60 cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tggtgaagaa ggatagaggt 120 agtaactggc ctttatttga cggtaatcaa ccagaaagtc acggctaact acgtgccagc 180 agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc 240 aggcggaaaa ataagtctaa tgtgaaagcc ctcggcttaa ccgaggaact gcatcggaaa 300 ctgtttttct tgagtgcaga agaggagagt ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta 360 gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctctctgg tctgcaactg acgctgaggc 420 tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga 480 gtgctaagtg ttgggaggtt tccgcctctc agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg 540 cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg 600 gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatctag 660 tgccatcttc agagatgaag agttcccttc ggggacgcta agacaggtgg tgcatggctg 720 tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgttat 780 tagttgccag cattaagttg ggcactctaa tgagactgcc ggtgacaaa 829 <210> 2 <211> 401 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <220> <221> promoter <222> (1)..(401) <223> promoter of L-lactate dehydrogenase gene of Lactobacillus plantarum <400> 2 ggatccatga cgtgtctggg catattgccg ccaatgttgc ctaacccaac gatcattttc 60 ataattttat cttctcctat tactttgcat accaaaacag gccgaaccgg taatcgaccc 120 gattcggcaa ctctgaagta acgataccac ctaagtcgta ttggcaccac tactcacacc 180 gtgaccgacg gcagcccgcc agtcaagtgt tcaaaagtta gcgtttatta agtgcgataa 240 gtataccaca aagggcttat tgacgcccgc caaagggttt tgcggacatt gttaataatt 300 gtattaaaag catgctcaat ctaacactta ttttgcacaa acatggtata ctttaaccgt 360 aaaaactaaa ttttcactac gagaggatga cttatgctag c 401 <210> 3 <211> 994 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei <220> <221> gene <222> (1)..(994) <223> L-Lactose dehydrogenase gene of Lactobacillus paracasei <400> 3 gctagccgtg gcaagtatta cggataagga tcaccaaaaa gttattctcg ttggtgacgg 60 cgccgttggt tcaagttatg cctatgcaat ggtattgcaa ggtattgcac aagaaatcgg 120 gatcgttgac atttttaagg acaagacgaa gggtgacgcg attgacttaa gcaacgcgct 180 gccattcacc agcccaaaga agatttattc agctgaatac agcgatgcca aggatgctga 240 tctggttgtt atcactgctg gtgctcctca gaagccaggc gaaacccgct tggatctggt 300 taacaagaac ttgaagatct tgaagtccat tgttgatccg attgtggatt ctggctttaa 360 cggtatcttc ttggttgctg ccaacccagt tgatatcttg acctatgcaa cttggaaact 420 ttccggcttc ccgaagaacc gggttgttgg ttcaggtact tcattggata ccgcacgttt 480 ccgtcagtcc attgctgaaa tggttaacgt tgatgcacgt tcggtccacg cttacatcat 540 gggtgaacat ggtgacactg aattccctgt atggtcacac gctaacatcg gtggcgttac 600 cattgccgaa tgggttaaag cacatccgga aatcaaggaa gacaagcttg ttaagatgtt 660 tgaagacgtt cgtgacgctg cttacgaaat catcaaactc aagggcgcaa ccttctatgg 720 tatcgcaact gctttggcac gtatctccaa ggctatcctg aacgatgaaa atgctgttct 780 gccactgtcc gtttacatgg atggtcaata tggcttgaac gacatctaca tcggtacccc 840 agctgtgatc aaccgcaatg gtatccagaa cattctggaa attccattga ccgaccacga 900 agaggaatcc atgcagaaat ctgcttcaca attgaagaag gttctgactg atgccttcgc 960 gaagaacgac atcgaaaccc gtcagtaaga gctc 994 <210> 4 <211> 6794 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCJ101 vector <400> 4 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240 caaacttaag agtgtgttga tagtgcatta aaaattttgt ataataggaa ttgaagttaa 300 attagatgct aaaaatttgt aattaagaag gagggattcg tcatgttggt attccaaatg 360 cgttatgtag ataaaacatc tactgttttg aaacagacta aaaacagtga ttacgcagat 420 aaataaatac gttagattaa ttcctaccag tgactaatct tatgactttt taaacagata 480 actaaaatta caaacaaatc gtttaacttc tgtatttgtt tatagatgta atcacttcag 540 gagtgattac atgaacaaaa atataaaata ttctcaaaac tttttaacga gtgaaaaagt 600 actcaaccaa ataataaaac aattgaattt aaaagaaacc gataccgttt acgaaattgg 660 aacaggtaaa gggcatttaa cgacgaaact ggctaaaata agtaaacagg taacgtctat 720 tgaattagac agtcatctat tcaacttatc gtcagaaaaa ttaaaactga acattcgtgt 780 cactttaatt caccaagata ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga ggtataaaat 840 tgttgggaat attccttacc atttaagcac acaaattatt aaaaaagtgg tttttgaaag 900 ccatgcgtct gacatctatc tgattgttga agaaggattc tacaagcgta ccttggatat 960 tcaccgaaca ctagggttgc tcttgcacac tcaagtctcg attcagcaat tgcttaagct 1020 gccagcggaa tgctttcatc ctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa aacttacccg 1080 ccataccaca gatgttccag ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg 1140 ggtcaatcga gaatatcgtc aactgtttac taaaaatcag tttcatcaag caatgaaaca 1200 cgccaaagta aacaatttaa gtaccgttac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag 1260 ttatctatta tttaacggga ggaaataatt ctatgagtcg cttttgtaaa tttggaaagt 1320 tacacgttac taaagggaat gtagataaat tattaggtat agggcacctc taataactac 1380 caattaattc acctcaaaat gaaattagaa aaaaacagcg aaatttttaa atctatttct 1440 tatcgataca aattcctcgt aggcgctcgg gaccccaaca tgaggaaatg tttttataaa 1500 aaaagagtag ttaccgtttt ttggtaacta ctcttttcct tttttaaggt ttaaatacct 1560 ggaagtttag gtgttttggg tattggtgga agcttggtac cgagctcgga tccgagctct 1620 tactgacggg tttcgatgtc gttcttcgcg aaggcatcag tcagaacctt cttcaattgt 1680 gaagcagatt tctgcatgga ttcctcttcg tggtcggtca atggaatttc cagaatgttc 1740 tggataccat tgcggttgat cacagctggg gtaccgatgt agatgtcgtt caagccatat 1800 tgaccatcca tgtaaacgga cagtggcaga acagcatttt catcgttcag gatagccttg 1860 gagatacgtg ccaaagcagt tgcgatacca tagaaggttg cgcccttgag tttgatgatt 1920 tcgtaagcag cgtcacgaac gtcttcaaac atcttaacaa gcttgtcttc cttgatttcc 1980 ggatgtgctt taacccattc ggcaatggta acgccaccga tgttagcgtg tgaccataca 2040 gggaattcag tgtcaccatg ttcacccatg atgtaagcgt ggaccgaacg tgcatcaacg 2100 ttaaccattt cagcaatgga ctgacggaaa cgtgcggtat ccaatgaagt acctgaacca 2160 acaacccggt tcttcgggaa gccggaaagt ttccaagttg cataggtcaa gatatcaact 2220 gggttggcag caaccaagaa gataccgtta aagccagaat ccacaatcgg atcaacaatg 2280 gacttcaaga tcttcaagtt cttgttaacc agatccaagc gggtttcgcc tggcttctga 2340 ggagcaccag cagtgataac aaccagatca gcatccttgg catcgctgta ttcagctgaa 2400 taaatcttct ttgggctggt gaatggcagc gcgttgctta agtcaatcgc gtcacccttc 2460 gtcttgtcct taaaaatgtc aacgatcccg atttcttgtg caataccttg caataccatt 2520 gcataggcat aacttgaacc aacggcgccg tcaccaacga gaataacttt ttggtgatcc 2580 ttatccgtaa tacttgccac ggctagcata agtcatcctc tcgtagtgaa aatttagttt 2640 ttacggttaa agtataccat gtttgtgcaa aataagtgtt agattgagca tgcttttaat 2700 acaattatta acaatgtccg caaaaccctt tggcgggcgt caataagccc tttgtggtat 2760 acttatcgca cttaataaac gctaactttt gaacacttga ctggcgggct gccgtcggtc 2820 acggtgtgag tagtggtgcc aatacgactt aggtggtatc gttacttcag agttgccgaa 2880 tcgggtcgat taccggttcg gcctgttttg gtatgcaaag taataggaga agataaaatt 2940 atgaaaatga tcgttgggtt aggcaacatt ggcggcaata tgcccagaca cgtcatggat 3000 ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttcgcccttt acgggaggca gcagtaggga 3060 atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg 3120 gatcgtaaag ctctgttgtt ggtgaagaag gatagaggta gtaactggcc tttatttgac 3180 ggtaatcaac cagaaagtca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 3240 gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggaaaaa taagtctaat 3300 gtgaaagccc tcggcttaac cgaggaactg catcggaaac tgtttttctt gagtgcagaa 3360 gaggagagtg gaactccatg tgtagcggtg gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 3420 ggcgaaggcg gctctctggt ctgcaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac 3480 aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tgggaggttt 3540 ccgcctctca gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag 3600 gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 3660 gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatctagt gccatcttca gagatgaaga 3720 gttcccttcg gggacgctaa gacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 3780 tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgttatt agttgccagc attaagttgg 3840 gcactctaat gagactgccg gtgacaaaaa gggcgaattc tgcagatatc catcacactg 3900 gcggccgctc gagcatgcat ctagagggcc caattcgccc tatagtgagt cgtattacaa 3960 ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa 4020 tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga 4080 tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg acgcgccctg tagcggcgca 4140 ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta 4200 gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt 4260 caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac 4320 cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt 4380 tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 4440 acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 4500 gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaatt 4560 cagggcgcaa gggctgctaa aggaagcgga acacgtagaa agccagtccg cagaaacggt 4620 gctgaccccg gatgaatgtc agctactggg ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa 4680 agagaaagca ggtagcttgc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat 4740 ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct 4800 gcaaagtaaa ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat 4860 ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag 4920 gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 4980 gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 5040 agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 5100 tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 5160 actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatcccac cttgctcctg 5220 ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 5280 cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 5340 ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 5400 tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg 5460 atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg 5520 gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg 5580 aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg 5640 attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaatt gaaaaaggaa 5700 gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 5760 tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg 5820 tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg 5880 ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaaagg atctaggtga agatcctttt 5940 tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 6000 cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 6060 gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 6120 tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt 6180 gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 6240 gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 6300 ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 6360 acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 6420 agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 6480 cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 6540 tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 6600 gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 6660 ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc 6720 ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag 6780 cgaggaagcg gaag 6794 <210> 5 <211> 1362 <212> DNA <213> Streptococcus pyogenes <220> <221> gene <222> (1)..(1362) <223> erythromycin resistant gene <400> 5 aagcttgcaa acttaagagt gtgttgatag tgcattaaaa attttgtata ataggaattg 60 aagttaaatt agatgctaaa aatttgtaat taagaaggag ggattcgtca tgttggtatt 120 ccaaatgcgt tatgtagata aaacatctac tgttttgaaa cagactaaaa acagtgatta 180 cgcagataaa taaatacgtt agattaattc ctaccagtga ctaatcttat gactttttaa 240 acagataact aaaattacaa acaaatcgtt taacttctgt atttgtttat agatgtaatc 300 acttcaggag tgattacatg aacaaaaata taaaatattc tcaaaacttt ttaacgagtg 360 aaaaagtact caaccaaata ataaaacaat tgaatttaaa agaaaccgat accgtttacg 420 aaattggaac aggtaaaggg catttaacga cgaaactggc taaaataagt aaacaggtaa 480 cgtctattga attagacagt catctattca acttatcgtc agaaaaatta aaactgaaca 540 ttcgtgtcac tttaattcac caagatattc tacagtttca attccctaac aaacagaggt 600 ataaaattgt tgggaatatt ccttaccatt taagcacaca aattattaaa aaagtggttt 660 ttgaaagcca tgcgtctgac atctatctga ttgttgaaga aggattctac aagcgtacct 720 tggatattca ccgaacacta gggttgctct tgcacactca agtctcgatt cagcaattgc 780 ttaagctgcc agcggaatgc tttcatccta aaccaaaagt aaacagtgtc ttaataaaac 840 ttacccgcca taccacagat gttccagata aatattggaa gctatatacg tactttgttt 900 caaaatgggt caatcgagaa tatcgtcaac tgtttactaa aaatcagttt catcaagcaa 960 tgaaacacgc caaagtaaac aatttaagta ccgttactta tgagcaagta ttgtctattt 1020 ttaatagtta tctattattt aacgggagga aataattcta tgagtcgctt ttgtaaattt 1080 ggaaagttac acgttactaa agggaatgta gataaattat taggtatagg gcacctctaa 1140 taactaccaa ttaattcacc tcaaaatgaa attagaaaaa aacagcgaaa tttttaaatc 1200 tatttcttat cgatacaaat tcctcgtagg cgctcgggac cccaacatga ggaaatgttt 1260 ttataaaaaa agagtagtta ccgttttttg gtaactactc ttttcctttt ttaaggttta 1320 aatacctgga agtttaggtg ttttgggtat tggtggaagc tt 1362 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Promoter of L-ldh amplification from Lactobacillus plantarum <400> 6 ggatccatga cgtgtctggg ca 22 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Promoter of L-ldh amplification from Lactobacillus plantarum <400> 7 gctagcataa gtcatcctct cgta 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for L-ldh amplification from Lactobacillus paracasei <400> 8 gctagccgtg gcaagtatta cgga 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for L-ldh amplification from Lactobacillus paracasei <400> 9 gagctcttac tgacgggttt cgat 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PL-ldh-L-ldh amplification <400> 10 ggatccgagc tcttactgac gggt 24 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for erythromycin resistant gene amplification <400> 11 aagcttgcaa acttaagagt gtgtt 25 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> revers primer for erythromycin resistant gene amplification <400> 12 aagcttccac caatacccaa aa 22 <210> 13 <211> 5405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide sequence of pCJ100 vector <400> 13 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60 acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240 caaacttaag agtgtgttga tagtgcatta aaaattttgt ataataggaa ttgaagttaa 300 attagatgct aaaaatttgt aattaagaag gagggattcg tcatgttggt attccaaatg 360 cgttatgtag ataaaacatc tactgttttg aaacagacta aaaacagtga ttacgcagat 420 aaataaatac gttagattaa ttcctaccag tgactaatct tatgactttt taaacagata 480 actaaaatta caaacaaatc gtttaacttc tgtatttgtt tatagatgta atcacttcag 540 gagtgattac atgaacaaaa atataaaata ttctcaaaac tttttaacga gtgaaaaagt 600 actcaaccaa ataataaaac aattgaattt aaaagaaacc gataccgttt acgaaattgg 660 aacaggtaaa gggcatttaa cgacgaaact ggctaaaata agtaaacagg taacgtctat 720 tgaattagac agtcatctat tcaacttatc gtcagaaaaa ttaaaactga acattcgtgt 780 cactttaatt caccaagata ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga ggtataaaat 840 tgttgggaat attccttacc atttaagcac acaaattatt aaaaaagtgg tttttgaaag 900 ccatgcgtct gacatctatc tgattgttga agaaggattc tacaagcgta ccttggatat 960 tcaccgaaca ctagggttgc tcttgcacac tcaagtctcg attcagcaat tgcttaagct 1020 gccagcggaa tgctttcatc ctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa aacttacccg 1080 ccataccaca gatgttccag ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg 1140 ggtcaatcga gaatatcgtc aactgtttac taaaaatcag tttcatcaag caatgaaaca 1200 cgccaaagta aacaatttaa gtaccgttac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag 1260 ttatctatta tttaacggga ggaaataatt ctatgagtcg cttttgtaaa tttggaaagt 1320 tacacgttac taaagggaat gtagataaat tattaggtat agggcacctc taataactac 1380 caattaattc acctcaaaat gaaattagaa aaaaacagcg aaatttttaa atctatttct 1440 tatcgataca aattcctcgt aggcgctcgg gaccccaaca tgaggaaatg tttttataaa 1500 aaaagagtag ttaccgtttt ttggtaacta ctcttttcct tttttaaggt ttaaatacct 1560 ggaagtttag gtgttttggg tattggtgga agcttggtac cgagctcgga tccactagta 1620 acggccgcca gtgtgctgga attcgccctt tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac 1680 aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa 1740 gctctgttgt tggtgaagaa ggatagaggt agtaactggc ctttatttga cggtaatcaa 1800 ccagaaagtc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 1860 gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggaaaa ataagtctaa tgtgaaagcc 1920 ctcggcttaa ccgaggaact gcatcggaaa ctgtttttct tgagtgcaga agaggagagt 1980 ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc 2040 ggctctctgg tctgcaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga 2100 taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaagtg ttgggaggtt tccgcctctc 2160 agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact 2220 caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 2280 cgaagaacct taccaggtct tgacatctag tgccatcttc agagatgaag agttcccttc 2340 ggggacgcta agacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 2400 aagtcccgca acgagcgcaa cccttgttat tagttgccag cattaagttg ggcactctaa 2460 tgagactgcc ggtgacaaaa agggcgaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct 2520 cgagcatgca tctagagggc ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca attcactggc 2580 cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 2640 agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc 2700 ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg 2760 gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 2820 cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta 2880 aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa 2940 cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct 3000 ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 3060 aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 3120 ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat tcagggcgca 3180 agggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc 3240 ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc 3300 aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta tggacagcaa 3360 gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa 3420 actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag 3480 agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg 3540 ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg 3600 atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc 3660 tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga 3720 cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc 3780 tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatccca ccttgctcct gccgagaaag 3840 tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat 3900 tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg 3960 tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca 4020 ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct 4080 tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg 4140 gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg 4200 gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc 4260 gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgaat tgaaaaagga agagtatgag 4320 tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt 4380 tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt 4440 gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga 4500 acgttttcca atgatgagca cttttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 4560 catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 4620 gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 4680 aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 4740 gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta 4800 gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 4860 gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 4920 atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 4980 cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 5040 cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 5100 agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 5160 tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 5220 gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 5280 catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 5340 agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 5400 ggaag 5405

Claims

서열번호 1의 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 프로모터 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 3의 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 기능적으로 연결되어 있는 락토바실러스용 벡터.
제1항에 있어서, 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 pCJ101 벡터인 벡터.
제1항 또는 제2항에 따른 벡터로 락토바실러스 균주를 형질전환시키고 선발배지에서 배양하여, 형질전환된 락토바실러스 균주로부터 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 균주를 선발하는 단계를 포함하는, L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 균주를 선발하는 방법.
L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 파라카세이 균주 (수탁번호 KCCM-10681P).
L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 균주를 배양하는 단계를 포함하는, L-젖산을 생산하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 락토바실러스 균주는 락토바실러스 파라카세이인 방법.
제6항에 있어서, 상기 락토바실러스 균주는 락토바실러스 파라카세이 (수탁번호 KCCM-10681P)인 방법.
제5항에 있어서, 상기 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 균주는 제1항 또는 제2항에 따른 벡터로 락토바실러스 균주를 형질전환하고 배양함으로써 얻어지는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 L-락테이트 디히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체에 삽입된 락토바실러스 파라카세이는 제1항 또는 제2항에 따른 벡터로 락토바실러스 파라카세이를 형질전환하고 배양함으로써 얻어지는 것인 방법.