CN115175992A - 用于制备生产高浓度的用于7-adca制备的脱乙氧基头孢菌素c的重组顶头孢霉菌株的方法以及通过该方法制备的菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备产高浓度脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的重组顶头孢霉菌株的方法，以及通过该方法制备的菌株，更具体地，涉及一种制备高产DAOC的顶头孢霉菌株的方法，通过该方法制备的重组顶头孢霉菌株，一种在能够产生DAOC的条件培养该菌株并回收DAOC的DAOC生产方法，一种用于在该生产方法中所用的顶头孢霉菌株中高DAOC表达的多核苷酸，一种用于在顶头孢霉菌株中高DAOC表达的表达载体，以及一种通过用CPC酰基转移酶处理产生的DAOC来生产7‑ADCA的方法。

Description

用于制备生产高浓度的用于7-ADCA制备的脱乙氧基头孢菌素 C的重组顶头孢霉菌株的方法以及通过该方法制备的菌株

技术领域

本申请要求于2019年9月18日提交的韩国专利申请号10-2019-0114945的优先权，其整个说明书通过引用整体并入本文。

本发明涉及一种制备产高浓度脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的重组顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)菌株的方法，以及通过该方法制备的菌株，更具体地，涉及一种制备高产DAOC的顶头孢霉菌株的方法，通过该方法制备的重组顶头孢霉菌株，一种在能够产生DAOC的条件下培养该菌株并回收DAOC的DAOC生产方法，一种用于在该生产方法中所用的顶头孢霉菌株中高DAOC表达的多核苷酸，一种用于在顶头孢霉菌株中高DAOC表达的表达载体，以及一种通过用CPC酰基转移酶处理产生的DAOC来生产7-ADCA的方法。

背景技术

头孢菌素C(以下简称为“CPC”)是一种β-内酰胺类抗生素，由某些微生物诸如顶头孢霉(Acremonium chrysogenum，一种丝状真菌)产生。CPC通过抑制细胞壁合成而表现出抗革兰氏阴性菌的抗生素活性，但其程度很弱，因此主要用于制备半合成头孢菌素抗生素(以下简称为“头孢菌素抗生素”)的原料。头孢菌素抗生素的原料可主要分为7-氨基头孢菌烷酸(以下简称为“7-ACA”)、脱乙酰戊二酰7-氨基头孢菌烷酸(以下简称为“D-7-ACA”)和7-氨基脱乙酰氧基头孢菌酸(以下简称为“7-ADCA”)。

在目前的工业生产方法的情况下，已知7-ADCA是通过将青霉烷环、青霉素β-内酰胺环扩环为头孢类的头孢烯环的化学转化方法制备的。特别是，在7-ADCA的生产中，由于涉及扩环到头孢烯环的化学转化方法中使用了诸如甲苯的有机溶剂，会产生大量有毒废物，其主要缺点在于环境污染和废水处理成本增加。

已知一些公司应用两步酶促方法来克服此问题，具体而言，已知可使用两种酶(扩展酶(extension enzyme)和酰基转移酶)通过改进从青霉烷环扩环到头孢烯环的扩环酶(expandase)以增加对青霉素G等的底物亲和力和活性，或通过修饰菌株以产生己二酰基-6-APA等或通过开发发酵方法来产生7-ADCA。为此，通过发酵产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)生产和纯化己二酰基-6-APA，并以两步用扩展酶和酰基转移酶处理该酶(Crawford L等,1995Production of cephalosporin intermediates by feeding adipicacid to recombinant Penicillium chrysogenum strains expressing ring expansionactivity,Biotechnology(NY).1995Jan；13(1):58-62，国际专利WO2010015624A1己二酰基-7-ADCA生产菌株)。尽管这在环境方面具有优势，但用于纯化和固定这两种酶的成本较高，因此在制造成本方面效率可能会降低。

因此，对能够以经济的方式生产7-ADCA而无环境污染的方法的需求日益增加。

在本说明书中引用了许多论文和专利文献，并指出了它们的引文。为了更清楚地描述本发明所属技术领域的水平和本发明的内容，通过引用将所引用的论文和专利文献的公开内容整体并入本文。

发明内容

技术问题

作为本发明人开发生态友好且高效的7-ADCA生产方法的不断研究的结果，当在顶头孢霉菌株中删除CefEF和CefG基因，然后用含有来自各种细菌的CefE基因的表达载体转化微生物时，发现能够以高生产率获得DAOC(7-ADCA的前体)，从而完成本发明。此外，发现通过将CPC酰基转移酶处理成如此获得的DAOC，可以以工业规模生产7-ADCA，从而完成本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种制备高产脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的顶头孢霉菌株的方法，其包含：(a)制备高产头孢菌素C(CPC)的顶头孢霉菌株；(b)删除该菌株的CefEF和CefG基因；以及(c)用包含微生物的CefE基因序列的表达载体转化步骤(b)的菌株，该微生物选自：内酰胺拟无枝菌酸(Amycolatopsis lactamdurans)、暗红戈登氏菌(Gordonia rubripertincta)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、氧化烃微杆菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans)、侵蚀侏囊菌(Nannocystis exedens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas synringae)、棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)和独岛鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas dokdonensis)。

本发明的另一个目的是提供一种制备高产脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的顶头孢霉菌株的方法，其包含：(a1)制备高产头孢菌素C(CPC)的顶头孢霉菌株；(b1)删除该菌株的CefEF和CefG基因；(c1)用包含两种或更多种微生物的CefE基因序列的各表达载体转化步骤(b1)的菌株，该微生物选自：内酰胺拟无枝菌酸、暗红戈登氏菌、脓肿分枝杆菌、氧化烃微杆菌、侵蚀侏囊菌、丁香假单胞菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌；以及(d1)对每种转化菌株进行原生质体融合。

本发明的另一个目的是提供根据上述方法制备的顶头孢霉菌株。

本发明的另一个目的是提供一种用于生产脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的方法，其包含：(i)在能够产生DAOC的条件下培养顶头孢霉菌株；以及(ii)从培养基中回收DAOC。

本发明的另一个目的是提供一种用于生产7-氨基脱乙酰氧基头孢菌酸(7-ADCA)的方法，其包含：(I)在能够产生脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的条件下培养顶头孢霉菌株；(II)从培养基中回收DAOC；以及(III)用头孢菌素C(CPC)酰基转移酶处理回收的DAOC。

技术方案

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种制备高产脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的顶头孢霉菌株的方法，其包含：(a)制备高产头孢菌素C(CPC)的顶头孢霉菌株；(b)删除该菌株的CefEF和CefG基因；以及(c)用包含微生物的CefE基因序列的表达载体转化步骤(b)的菌株，该微生物选自：内酰胺拟无枝菌酸、暗红戈登氏菌、脓肿分枝杆菌、氧化烃微杆菌、侵蚀侏囊菌、丁香假单胞菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种制备高产脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的顶头孢霉菌株的方法，其包含：(a1)制备高产头孢菌素C(CPC)的顶头孢霉菌株；(b1)删除该菌株的CefEF和CefG基因；(c1)用包含两种或更多种微生物的CefE基因序列的各表达载体转化步骤(b1)的菌株，该微生物选自：内酰胺拟无枝菌酸、暗红戈登氏菌、脓肿分枝杆菌、氧化烃微杆菌、侵蚀侏囊菌、丁香假单胞菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌；以及(d1)对每种转化菌株进行原生质体融合。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了根据上述方法制备的顶头孢霉菌株。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种用于生产脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的方法，其包含：(i)在能够产生DAOC的条件下培养顶头孢霉菌株；以及(ii)从培养基中回收DAOC。

为了实现本发明的另一个目的，本发明提供了一种用于生产7-氨基脱乙酰氧基头孢菌酸(7-ADCA)的方法，其包含：(I)在能够产生脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的条件下培养顶头孢霉菌株；(II)从培养基中回收DAOC；以及(III)用头孢菌素C(CPC)酰基转移酶处理回收的DAOC。

在下文中，将更详细地描述本发明。

本发明提供了一种制备高产脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的顶头孢霉菌株的方法，其包含：(a)制备高产头孢菌素C(CPC)的顶头孢霉菌株；(b)删除该菌株的CefEF和CefG基因；以及(c)用包含微生物的CefE基因序列的表达载体转化步骤(b)的菌株，该微生物选自：内酰胺拟无枝菌酸、暗红戈登氏菌、脓肿分枝杆菌、氧化烃微杆菌、侵蚀侏囊菌、丁香假单胞菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌。

顶头孢霉具有头孢菌素合成途径，且终产物为CPC。CPC从前体L-2-氨基己二酸盐、L-半胱氨酸、L-缬氨酸通过N-[(5S)-5-氨基-5-羧基戊酰基]-L-半胱氨酰-D-缬氨酸转化为异青霉素N和青霉素N，此后，在CefEF基因编码的扩环酶(扩环酶或DAOC合酶)的催化下，青霉烷环转化为头孢烯环，成为基于头孢菌素的DAOC前体。由CefEF基因编码的酶是一种双功能酶，其具有羟化酶活性，除环延伸外还除去DAOC的羟基，并催化转化为脱乙酰基头孢菌素C(DAC)。DAC被由CefG基因编码的DAC乙酰转移酶转化为最终产物CPC。

这些头孢菌素合成途径中的一些也存在于一些产头孢菌素的放线菌中。放线菌中CefEF编码的扩环酶和羟化酶的双重功能分为CefE编码扩环酶和CefF编码羟化酶，它们存在并共同作用。

因此，在本发明中，使用放线菌CefE基因的细菌来源的同源基因从顶头孢霉生产DAOC。更具体地，本发明提供了一种生产具有非常高DAOC生产率的顶头孢霉菌株的方法，其包含在删除顶头孢霉的CefEF和CefG后导入与放线菌CefE基因具有同源性的各种细菌的CefE基因的步骤。

通过本发明的方法生产的菌株具有高DAOC生产率的特征。通过本发明的生产方法生产的高产DAOC的顶头孢霉菌株的DAOC生产能力可以为25g/L或更多，26g/L或更多，27g/L或更多，28g/L或更多，29g/L或更多，30g/L或更多，31g/L或更多，32g/L或更多，33g/L或更多，34g/L或更多，35g/L或更多，优选30g/L或更多，最优选33g/L或更多。生产能力的上限可以通过重组顶头孢霉的生长条件、培养基中原料的量等来进行调节，并且本发明所属领域的普通技术人员可以很容易地设定。

在下文中，将针对每个步骤更详细地描述用于生产本发明的菌株的方法。是

步骤(a)是制备高产头孢菌素C(CPC)的顶头孢霉菌株。

在顶头孢霉所具有的头孢菌素合成途径中，DAOC通过CefEF基因编码的酶的羟化酶活性转化为DAC，DAC通过乙酰转移酶转化为CPC。因此，为了生产高DAOC生产率的顶头孢霉，需要制备具有高CPC生产率的菌株。

在本发明中，“CPC高生产率”是指在适当的培养条件下具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35g/L或更多，优选30、31、32、33、34或35g/L或更多，最优选35g/L或更多的CPC生产能力。“适当的培养条件”是指在特定的培养基组成、培养温度、培养时间和pH环境下培养高产CPC的顶头孢霉菌株，以表现出CPC生产能力。“适当的培养条件”可以由本领域技术人员根据以下描述适当地设定。

在本发明中，CPC高生产率顶头孢霉菌株可以是其中野生型菌株本身具有如上定义的CPC生产能力的菌株，或者可以通过突变而具有高CPC生产率。

通过以前的研究，本发明人通过N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理诱导顶头孢霉菌株的突变，其中，筛选并保藏了CPC生产率提高的细胞。在本发明中，CPC高生产率顶头孢霉菌株可优选为2016年8月18日保藏于韩国生命工学研究院生物资源中心(KoreaResearch Institute of Bioscience and Biotechnology Biological ResourcesCenter)的顶头孢霉，其保藏号为KCTC13079BP。

步骤(b)为删除菌株的CefEF和CefG基因。

在本发明中，“删除”可以定义为从菌株染色体序列中鉴定的CefEF和CefG基因序列的每个起始密码子到终止密码子的去除，或同时从每个起始密码子到终止密码子去除两个相邻的CefEF和CefG基因序列。

在本发明的一个实施方案中，在构建含有待删除的基因或与包含该基因的核苷酸序列的两端外侧同源的核苷酸序列且其中具有抗生素抗性标记的质粒载体后，通过将其转化到顶头孢霉中诱导CefEF和CefG基因的删除，在步骤(a)中保证了CPC生产率提高。

更具体地，在本发明的一个实施方案中，通过常规方法在遗传霉素抗性标记基因集的两侧连接与待删除基因两侧具有同源性的核苷酸序列，并通过体外培养筛选缺乏CPC生产能力的菌株，并通过PCR分析染色体序列来诱导通过同源重组的删除，完成CefEF和CefG缺陷型菌株的生产。确认缺陷的细胞命名为“顶头孢霉D”，并保藏在相关机构。

因此，优选地，通过完成本发明的步骤(b)制备的细胞可以是由于CefEF和CefG基因的删除而缺乏CPC生产能力的重组顶头孢霉D菌株，并且这可以是于2019年8月19日保藏在韩国生命工学研究院生物资源中心的顶头孢霉D(保藏号KCTC 13922BP)。

在本发明中，“转化”是将表达载体导入菌株，为此，可以通过任何常用的方法进行。例如，表达载体不限于此，但可以通过诸如氯化钙(CaCl₂)和热激、粒子枪轰击、碳化硅晶须、超声处理、电穿孔、PEG(聚乙二醇)沉淀等方法导入菌株中。

步骤(c)是用包含微生物的CefE基因序列的表达载体转化步骤(b)的菌株，该微生物选自：内酰胺拟无枝菌酸、暗红戈登氏菌、脓肿分枝杆菌、氧化烃微杆菌、侵蚀侏囊菌、丁香假单胞菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌。

这是通过将各种细菌的CefE基因导入其中CefEF和CefG基因在步骤(b)中删除的顶头孢霉菌株中诱导CefE编码的扩环酶将异青霉素N和青霉素N转化为DAOC的步骤。

在本发明的步骤(c)中，CefE基因可以是选自的菌株的CefE基因：内酰胺拟无枝菌酸、暗红戈登氏菌、脓肿分枝杆菌、氧化烃微杆菌、侵蚀侏囊菌、丁香假单胞菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌，优选地，其可以是选自的菌株的CefE基因：内酰胺拟无枝菌酸、脓肿分枝杆菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌，最优选地，其可以是脓肿分枝杆菌的CefE基因。

根据本发明的一个实施方案，内酰胺拟无枝菌酸可以是NCBI txid1913的菌株，暗红戈登氏菌可以是NCBI txid1077975的菌株，脓肿分枝杆菌可以是NCBI txid1185650的菌株，氧化烃微杆菌可以是NCBI txid1223527的菌株，侵蚀侏囊菌可以是NCBI txid1366054的菌株，丁香假单胞菌可以是NCBI txid1189623的菌株，棒状链霉菌可以是NCBItxid443255的菌株，独岛鞘氨醇单胞菌可以是NCBI txid344880的菌株。

在本发明中，CefE基因可以包括来自该菌株的CefE基因的核苷酸序列，但是只要保持编码扩环酶的基因的原始功能，它可以包括通过突变如核苷酸序列的取代、缺失或插入诱导的核苷酸序列。优选地，菌株的CefE基因可以包括密码子优化的核苷酸序列，其被转导至顶头孢霉以表达所需的蛋白质。

在本发明中，“密码子优化”是指通过突出蛋白质编码区的氨基酸密码子中偏向和使用的优选密码子并修饰稀有密码子来增强蛋白质生产的方法。当进行密码子优化过程时，仅改变基因的核苷酸序列，而不改变相应蛋白质的氨基酸序列。

这样的密码子优化方法是本领域所熟知的，本领域技术人员可以根据本领域已知的方法进行密码子优化，使得该菌株的CefE基因编码的蛋白质在顶头孢霉中得到良好的表达。

根据本发明的一个实施方案，对来源于内酰胺拟无枝菌酸的CefE基因genbankNID Z13974.1、来源于暗红戈登氏菌的CefE基因genbank NID CP022580.1、来源于脓肿分枝杆菌的CefE基因genbank NID FVPM01000026.1、来源于氧化烃微杆菌的CefE基因genbank NID JYJB01000010.1、来源于侵蚀侏囊菌的CefE基因genbank NIDFOMX01000018.1、来源于丁香假单胞菌的基因genbank NID AOJT01001469.1、来源于棒状链霉菌的基因的genbank NID DS570624.1和来源于独岛鞘氨醇单胞菌的CefE基因genbankNID NBBI01000005.1的核苷酸序列进行了密码子优化。

优选地，在本发明中，步骤(c)的CefE基因可以由选自SEQ ID NO：1至8的核苷酸序列组成，更优选地，其可以由选自SEQ ID NO：1、3、5、7和8的核苷酸序列组成，甚至更优选地，其可以由选自SEQ ID NO：1、3、7和8的核苷酸序列组成，最优选地，其可以由SEQ ID NO：3的核苷酸序列组成。

在本发明的一个实施方案中，基于通过氨基酸同源性检索发现的8种细菌的CefE蛋白序列，在根据顶头孢霉的密码子进行密码子优化后，通过基因合成获得8种CefE基因，通过将其与启动子可操作地连接，制备构建以便表达的表达载体，通过将其转化到步骤(b)的缺陷型菌株中制备高产DAOC的支顶孢属(Acremonium)。

在本发明中，“表达载体”是指编码扩环酶的多核苷酸克隆到其中的质粒、病毒或其它介质，优选质粒表达载体。本发明中克隆的多核苷酸序列可以与适当的表达控制序列可操作地连接，并且可操作地连接的基因序列和表达控制序列可以包括在一个表达载体中，该表达载体包括选择标记和复制起点。“可操作地连接”是指多核苷酸序列以能够使基因表达的方式与表达控制序列连接。“表达控制序列”是指控制可操作地连接的多核苷酸序列在特定宿主细胞中表达的DNA序列。这种调节序列可以包括一种或多种选自由用于实现转录的启动子、用于调节转录的任何操纵子序列、编码合适的mRNA脂质体结合位点的序列和用于调节转录和翻译终止的序列等组成的组的序列。

在本发明中，“启动子”是指控制可操作地连接的核酸序列在特定宿主细胞中表达的DNA序列，“与启动子可操作地连接”是指由后续核酸片段的表达盒编码的蛋白质的表达受启动子功能的影响。作为启动子，可以使用一直持续诱导靶基因表达的启动子(组成型启动子)或在特定位置和时间诱导靶基因表达的启动子(诱导型启动子)。

优选地，在本发明中，启动子是能够提高顶头孢霉中蛋白质表达的高蛋白表达启动子，并且可以是由SEQ ID NO：9至13的核苷酸序列组成的启动子，最优选地，其可以是由SEQ ID NO：11的核苷酸序列组成的启动子。

此外，本发明的表达载体中包括的表达控制序列中的终止子序列可以是trpC终止子，但不限于此。

用作表达载体的亲本载体的载体不受特别限制，并且可使用本发明所属领域中用作宿主细胞的微生物中常用于表达的所有质粒、病毒或其它介质。

例如，质粒包括但不限于大肠杆菌(E.coli)来源的质粒(pBR322、pBR325、pUC118和pUC119、pET-22b(+))、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的质粒(pUB110和pTP5)和酵母来源的质粒(YEp13、YEp24和YCp50)以及基于pBluescript的载体。

优选地，本发明的表达载体可以是由SEQ ID NO：14至21的序列表示的载体，其被克隆以使得CefE基因(其为编码扩环酶的多核苷酸)可操作地连接在启动子和终止子之间，并且可以通过用这些表达载体转化顶头孢霉缺陷型菌株来生产DAOC。

在本发明中，由CefE基因编码的“扩环酶”包括野生型或突变型，但优选可以是由SEQ ID NO：22至29的氨基酸序列表示的蛋白质，并且其可以由由上述SEQ ID NO：1至8的核苷酸序列组成的多核苷酸序列表达。

根据本发明的一个实施方案，根据本发明的方法制备的菌株DAOC生产能力为30g/L，具有这种规模的DAOC生产能力的菌株尚未公开，本发明人通过本发明首次公开。

另一方面，本发明的方法可进一步包括在步骤(c)之后，通过在选择性培养基中或体外培养转化细胞来筛选高产DAOC的菌株的过程。

本发明还提供了一种制备高产脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的顶头孢霉菌株的方法，其包含：(a1)制备高产头孢菌素C(CPC)的顶头孢霉菌株；(b1)删除该菌株的CefEF和CefG基因；(c1)用包含两种或更多种微生物的CefE基因序列的各表达载体转化步骤(b1)的菌株，该微生物选自：内酰胺拟无枝菌酸、暗红戈登氏菌、脓肿分枝杆菌、氧化烃微杆菌、侵蚀侏囊菌、丁香假单胞菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌；以及(d1)对每种转化菌株进行原生质体融合。

上述方法中的步骤(a1)至(c1)可参照前述方法的步骤(a)至(c)。

本发明的步骤(c1)是用包含两种或多种微生物的CefE基因碱基序列的各表达载体转化步骤(b1)的菌株，该微生物选自：内酰胺拟无枝菌酸、暗红戈登氏菌、脓肿分枝杆菌、氧化烃微杆菌、侵蚀侏囊菌、丁香假单胞菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌。

对于在步骤(c1)中产生CefE基因的8种类型的微生物的描述，可参考步骤(c)。

在步骤(c1)中，步骤(b1)的菌株可以用包含CefE基因碱基序列的各表达载体转化，所述CefE基因碱基序列优选为选自由内酰胺拟无枝菌酸、暗红戈登氏菌、脓肿分枝杆菌、氧化烃微杆菌、侵蚀侏囊菌、丁香假单胞菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌组成的组的两种或更多种类型的微生物，更优选为选自由脓肿分枝杆菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌组成的组的两种或更多种类型的微生物，最优选为脓肿分枝杆菌和独岛鞘氨醇单胞菌。

步骤(d1)是对步骤(c1)中用包含CefE基因碱基序列的各表达载体转化的各菌株进行原生质体融合。

原生质体融合是指在两个或更多个原生质体(其细胞壁已经通过酶处理除去的细胞)之间的诱导或自发缔合，诸如体细胞杂交，以产生单个双核或多核细胞。

本发明步骤(d1)中的原生质体融合方法可非限制性地应用于本发明，只要它是本领域已知的方法。

另一方面，本发明的方法可进一步包含在步骤(d1)之后在选择性培养基中培养原生质体融合的微生物以筛选高产DAOC的菌株的步骤。

在本发明的一个实施方案中，本发明人通过培养用包含内酰胺拟无枝菌酸、脓肿分枝杆菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌的CefE基因序列的各表达载体转化的微生物，初步筛选高产DAOC的菌株，并将所筛选的高产DAOC的菌株中的两种或更多种进行原生质体融合。结果证实，在原生质体融合的微生物中，DAOC生产率显著提高。

因此，根据本发明的包含步骤(a1)至(d1)的方法制备的高产DAOC的顶头孢霉菌株的DAOC生产能力可以是25g/L或更多，26g/L或更多，27g/L或更多，28g/L或更多，29g/L或更多，30g/L或更多，31g/L或更多，32g/L或更多，33g/L或更多，34g/L或更多，35g/L或更多，优选30g/L或更多，最优选35g/L或更多。生产能力的上限可以通过重组顶头孢霉的生长条件、培养基中原料的量等来进行调节，并且本发明所属领域的普通技术人员可以很容易地设定。

本发明还提供了根据上述方法制备的高产DAOC的顶头孢霉菌株。

本发明还提供一种生产脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的方法，其包含：(i)在能够产生DAOC的条件下培养高产DAOC的顶头孢霉菌株；以及(ii)从培养基回收DAOC。

DAOC生产方法的步骤(i)是在能够产生DAOC的条件下培养通过本发明的方法制备的菌株，并且能够产生DAOC的条件是指在特定的培养基组成、培养温度、培养时间和pH环境下培养高产DAOC的顶头孢霉菌株。这种培养条件是本领域所熟知的，并且可以由本领域技术人员根据已知技术适当地设定。

DAOC生产方法的步骤(ii)是从培养基中回收DAOC，并且是指从菌株或其培养基中分离、收获、纯化或收集由本发明的菌株生产的DAOC。具体而言，DAOC的回收方法不特别限于此，但是可以使用诸如离心、过滤、萃取、喷雾、干燥、膨胀、沉淀、结晶、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀)和层析(例如，离子交换、亲和、疏水性和尺寸排阻)的方法，并且这可以由本领域技术人员容易地配置。

特别是，在本发明的DAOC生产方法中，步骤(i)中的培养物可以是发酵培养物。

转化菌株的发酵培养可以通过已知的宿主细胞培养方法或其改良方法进行。发酵培养可分为1-5种子培养和主培养，但不限于此。对于培养基的组成，可以使用天然培养基或含有碳源、氮源、无机盐等的合成培养基，其可以被转化的重组宿主细胞有效利用。可以使用的碳源包括碳水化合物，诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、大豆粉、花生粉、小麦粉、玉米粉(corn flour)、糊精、玉蜀黍粉(cornmeal)、果糖糖浆；淀粉、淀粉的水解产物；有机酸，诸如乙酸和丙酸；醇，诸如乙醇、丙醇和甘油；油，诸如大豆油、橄榄油、菜籽油、花生油和鱼油等。氮源包括氨；无机或有机酸的铵盐，诸如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵；蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆提取物、大豆水解物；各种发酵细胞及其裂解物等。氨基酸包括谷氨酸钠、蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、缬氨酸等。无机盐包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。

发酵培养通常在有氧条件下进行，例如通过振荡培养或在旋转机器上旋转。培养温度优选为5-30℃，培养时间通常为1-20天，优选3-12天。在培养过程中，培养基的pH优选保持在3.0至9.0的范围内。可以用无机或有机酸、碱性溶液、尿素、碳酸钙、氨等调节介质的pH。如果需要，可在培养过程中加入抗生素诸如潮霉素B、遗传霉素、满霉素、苯菌灵、氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、卡那霉素和四环素，以筛选转化体并防止污染。

在本发明的一个实施方案中，通过评估导入了选自SEQ ID NO：14至21的一种表达载体的各产DAOC菌株的发酵生产率来完成该方法，在导入了SEQ ID NO：16的表达载体的菌株中，估计最大DAOC发酵生产率为约33.5g/L。通过HPLC和质谱分析，将生产的DAOC与通过要求从MedKoo(Morrisville,North Carolina,USA)合成获得的标准DAOC进行比较，证实其为相同的物质。

本发明还提供了一种用于在顶头孢霉菌株中高表达脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的多核苷酸，其由选自SEQ ID NO：1至8的核苷酸序列组成，本发明还提供了一种用于在顶头孢霉菌株中高表达DAOC的多核苷酸，其优选由选自SEQ ID NO：1、3、5、7和8的核苷酸序列组成，更优选由选自SEQ ID NO：1、3、7和8的核苷酸序列组成，最优选地，SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于在顶头孢霉菌株中高表达脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的表达载体，其由选自SEQ ID NO：14至21的核苷酸序列组成，本发明还提供了一种用于在顶头孢霉菌株中高表达DAOC的表达载体，其优选由选自SEQ ID NO：14、16、18、20和21的核苷酸序列组成，更优选由选自SEQ ID NO：14、16、18和20的核苷酸序列组成，最优选SEQ IDNO：16的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于生产7-氨基脱乙酰氧基头孢菌酸(7-ADCA)的方法，其包含：(I)在能够产生脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的条件下培养该菌株；(II)从培养基中回收DAOC；以及(III)用头孢菌素C(CPC)酰基转移酶处理回收的DAOC。

该方法中的步骤(I)和(II)与上述DAOC制备方法的(i)和(ii)所述的相同。

步骤(III)是通过用CPC酰基转移酶处理步骤(II)中获得的DAOC培养基来制备7-ADCA。

使用CPC酰基转移酶的转化反应通常在需氧条件下进行，例如通过振荡培养或在旋转机器上旋转。转化反应温度优选在5至30℃的范围内进行，反应时间通常为1分钟至300分钟，优选1分钟至120分钟。反应pH优选保持在3.0至9.0的范围内。反应pH可以用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等调节。

在本发明的一个实施方案中，大部分转化反应在用CPC酰基转移酶处理后60分钟内完成，当33.5g/L DAOC完全转化时，约18g/L生产20.08g/L 7-ADCA，表明约90％的高产率。所生产的7-ADCA通过质谱分析验证。通过与HPLC和质谱分析比较，证实标准7-ADCA(Sigma-Aldrich A8398,USA)是相同的物质。

本发明的7-ADCA生产方法可以包括在步骤(III)之后从反应溶液中回收7-ADCA的步骤，并且这意味着从反应溶液中分离、收获、纯化或收集通过本发明的酶促反应方法生产的7-ADCA。具体而言，7-ADCA的回收方法不特别限于此，但是可以使用诸如离心、过滤、萃取、喷雾、干燥、膨胀、沉淀、结晶、电泳、分级溶解(例如，硫酸铵沉淀)和层析(例如，离子交换、亲和、疏水性和尺寸排阻)的方法，并且这可以由本领域技术人员容易地配置。

根据本发明的方法，仅通过本发明提供的菌株的发酵培养和一步酶促转化方法，即可高效、环保地生产7-ADCA，且无有毒副产物。

有益效果

根据本发明，可以制备具有高DAOC性能的顶头孢霉菌株，通过用CPC酰基转移酶处理由这些菌株产生的DAOC，可以以环保且高效的方式生产7-ADCA而无有毒副产物。

附图说明

图1是表达载体的结构，其中导入了编码各种细菌的扩环酶的CefE基因。该载体含有抗生素抗性基因盒、Flp盒和细菌CefE盒。

图2是证实通过引入8种细菌的CefE基因而体外培养支顶孢属重组体生产DAOC的DAOC生产率的结果。

图3是根据所选支顶孢属菌株(菌株1-38、菌株3-7、菌株7-23、菌株7-53、菌株8-60)的5升发酵培养物评价DAOC生产率的结果。

图4是由重组支顶孢属菌株产生的DAOC的质谱分析结果。

图5是通过在由菌株1-38、菌株3-7、菌株7-23、菌株7-53、菌株8-60(其为5个菌株)产生的DAOC培养基中处理CPC酰基转移酶产生7-ADCA的酶促反应的结果。

图6是通过将产生DAOC的发酵液转化为CPC酰基转移酶而获得的反应溶液中所含的7-ADCA的质谱分析结果。

图7是根据选自根据原生质体融合方法制备的菌株的菌株的5升发酵培养物评价DAOC生产率的结果。

具体实施方式

在下文中，将参考实施例详细描述本发明。

然而，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的内容不限于以下实施例。

实验方法

1.酶和试剂盒

作为克隆方法，除非有特殊情况，按照购买DNA聚合酶的说明书进行PCR扩增基因。通常，使用Pfu-X聚合酶(Solgent,Korea)作为DNA聚合酶。限制性内切酶、T4 DNA连接酶和Klenow片段购自NEB(USA)并根据酶手册使用。QIAprep Spin Miniprep Kit、QIAquick PCRPurification Kit和QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen,Netherlands)用于一系列克隆方法，诸如质粒DNA的PCR和纯化以及从琼脂糖凝胶中提取。

2.转化

用于克隆的大肠杆菌DH5α的转化通过用氯化钙洗涤然后热激来进行，具体而言，将大肠杆菌接种至LB中并培养至OD0.6，通过离心(4℃，4000rpm)回收细胞，通过用冰冷却的0.1M氯化钙溶液洗涤4次以制备感受态细胞。将100-500ng制备的质粒DNA与100μL感受态细胞混合，置冰上30分钟，42℃热激30秒，置冰上2分钟，然后加入1mL LB，37℃孵育1小时后，将其铺板于含抗生素的LB平板培养基上。

通过利用PEG(聚乙二醇)的转化方法进行向真菌宿主的转化，具体而言，将宿主菌株铺展在LB平板培养基上，并且在通过在28℃培养6至8天获得菌落之后，将其放入100mLTB培养基(12g/L胰蛋白胨，24g/L酵母提取物，9.4g/L K₂HPO₄，2.2g/L KH₂PO₄，4g/L甘油)中，并从LB平板培养基中取出菌落并接种。对于菌落接种，用解剖刀将LB平板培养基上的菌落切成边长5-7mm的正方形，根据菌落大小取4-6片接种，28℃，150rpm条件下培养3-4天。生长完成后，将培养基在4℃和4000rpm离心，弃去上清液，并用0.6M MgSO₄溶液洗涤一次。

为了产生原生质体，将2％的裂解酶(Sigma-Aldrich,L1412,USA)处理约4倍重量的细胞，并在30℃，100rpm下反应3小时。之后，用相同量的分离缓冲液A(0.6M山梨醇，100mMTris-Cl，pH 7.0)覆盖反应溶液，并在1800g，4℃条件离心10分钟。将上清液和界面转移到新的离心管中，加入相同量的分离缓冲液B(1.2M山梨醇，100mM Tris-Cl，pH 7.5)，并在1800g，4℃条件离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀再次用MSC(1M山梨醇，10mM MOPS，pH6.5，10mM CaCl₂)洗涤。通过在显微镜下观察对形成的原生质体计数后，将1-5μg DNA和50μL 60％PEG溶液(使聚乙二醇6000在MSC中浓度为60％)与1×10⁷原生质体混合进行转化，然后置于冰上20分钟。再次加入500μL 60％PEG溶液，混合，并在室温下放置20分钟，然后铺板于含有适当抗生素的LB-蔗糖平板培养基(0.8M蔗糖，2％琼脂，潮霉素100mg/L，遗传霉素200mg/L)上。将平板培养基在28℃培养10至30天，直至形成菌落。

3.体外培养

在28℃的恒温培养箱(stationary incubator)中在LB，0.6M MgSO₄，2％琼脂培养基中生长14天的约100个菌落用火焰灭菌的手术刀切下，用镊子夹取，并置于1.5mL e管中。加入0.2mL NaCl，将菌落用杵碾碎，铺在孢子培养基(淀粉24g/L，甘氨酸1.2g/L，聚胨4g/L，酵母提取物0.3g/L，酪蛋白8g/L，硫酸铵6g/L，磷酸二钾1.2g/L，硫酸镁0.6g/L，琼脂20g/L，pH 7.0)上，在28℃恒温培养箱中培养10-14天。将形成的菌落用铂齿刮下，并置于含有2mL20％甘油的15mL帽管中，充分悬浮，取一定量置于1.5mL e管中并储存在-80℃冰箱中备用。

在种子培养和主培养阶段进行用于菌株筛选的体外培养。对于培养，使用直径为2cm，长度为20cm的褶皱试管(wrinkled test tube)，种子培养和主培养的培养基组成和培养条件相同。培养基成分为糖15g/L，大豆胨15g/L，硫酸铵5g/L，蛋氨酸10g/L，碳酸钙10g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖5g/L，硫酸镁2g/L，油酸甲酯50g/L。对于种子培养，将储存在-80℃冰箱中的0.3mL储备液接种到含有5mL培养基的试管中，然后在28℃和200rpm条件下在振荡培养箱中培养4天。对于主培养，将0.5mL种子培养液接种到含有5mL培养基的试管中，并在28℃和200rpm条件下在振荡培养箱中培养4天，然后收集0.5mL培养液并通过HPLC分析上清液。

4.DAOC和7-ADCA的分析

在生产菌株的DAOC生产率或酶转化后，使用HPLC分析7-ADCA，具体而言，在离心培养液或酶反应溶液后，将25μL上清液与975μL三重蒸馏水混合并稀释40倍。将稀释的培养液用0.2μm过滤器过滤，然后用Shimadzu LC10Avp分析。分析条件为ZORBAX Eclipse PlusC18柱(分析型4.6mm×250mm，5微米)，流动相20mM乙酸铵：乙腈(95：5)，pH 7.0，流速0.8mL/min，柱温40℃，UV检测器220nm。

将在实施例中详细描述除用于本发明的那些之外的实验方法。

实施例1：CefEF和CefG缺陷型菌株的制备

1-1.构建用于删除的质粒载体

CefEF和CefG具有双向启动子，其在CPC生物合成途径中在基因组上的相邻位置以相反方向表达，因此分别从CefEF和CefG的两个末端位置向外约2.5kb被指定为同源重组和扩增的结合位点。使用引物5'-GAGTAGTTTGGCCTTGATGGGACG-3'(SEQ ID NO：30)和引物5'-CCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCTATGGAGGTGTCAGCCTGCC-3'(SEQ ID NO：31)扩增左连接位点，并使用引物5'-GCCCTATAGTGAGTCGTATTACCGCCGATCGAGTAATAAATCTACG-3'(SEQ ID NO：32)和引物5'-GTGCTTCTCGGTTCAGTGAGTCGG-3'(SEQ ID NO：33)扩增右连接位点。使用遗传霉素抗性基因作为选择标记基因，其使用引物5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'(SEQ ID NO：34)和引物5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3'(SEQ ID NO：35)从韩国专利号10-1808192中指定的pB-GcastF扩增。由于将同源部分加入到扩增的左右连接位点和选择性标记基因盒中，因此将每个基因用作模板并通过缝合PCR连接。通过平端连接将含有连接位点和选择标记的基因片段插入pBluescript II SK+(Stratagene,USA)质粒载体的EcoRV限制性位点，构建用于CefEF和CefG删除的质粒载体。

1-2.缺陷型菌株的筛选

在本发明中，在本发明人的先前研究(韩国专利号10-1808192)中制备的具有提高的CPC生产能力的顶头孢霉菌株(保藏号KCTC13079BP)用于转化。通过上述实验方法中介绍的PEG转化方法将缺失质粒载体转化到菌株中，在通过上述实验方法中提到的体外培养发现缺乏CPC生产力的菌落，并提取相应菌落的基因组DNA后，通过PCR确认每个菌落中缺陷的存在与否。具体而言，使用位于删除位点外的引物5'-CGATGTAGGAGGTTGACGGTGC-3'(SEQ IDNO：36)和PgpdA中固有的引物5'-CGATAAGGGCCAGTTCCGCC-3'(SEQ ID NO：37)(标记基因启动子)，检查产物，另外，通过选择其中在删除位点外的引物和CefG中固有的引物5'-GGTACCAGGCCCAGAAGTTTGC-3'(SEQ ID NO：38)中未发生扩增的菌落来确认删除。

CefEF和CefG基因缺陷型高产CPC的顶头孢霉菌株于2019年8月19日保藏于韩国生命工学研究院生物资源中心(KCTC)(保藏号：KCTC 13922BP)。

实施例2：通过导入各种细菌的CefE筛选产DAOC的菌株

2-1.细菌CefE检测和克隆

在该步骤中，细菌CefE检索基于棒状链霉菌(一种众所周知的产头孢菌素抗生素的放线菌)的CefE基因编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)，通过NCBI(National Centerfor Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)进行氨基酸同源性检索获得具有高度同源性的细菌的氨基酸序列。具体而言，选择革兰氏阴性变形菌门中的γ-变形菌、δ-变形菌和α-变形菌各1种的3种和高GC革兰氏阳性放线菌的假诺卡氏菌属(Pseudonocardiales)、链霉菌(Streptomycetales)、棒状杆菌目(Corynebacteriales)和微球菌目(Micrococcales)各1-2种的5种，从而获得总共8种细菌细胞CefE的氨基酸序列。然后，基于每个氨基酸的序列，进行密码子优化以匹配支顶孢属的密码子，并请求基因合成(Cosmogene Tech,Korea)以获得8个细菌CefE基因。每个细菌CefE基因命名如下：E1(SEQ ID NO：1)为Amycoltopsis lactamdurans的CefE，E2(SEQ ID NO：2)为暗红戈登氏菌的CefE，E3(SEQ ID NO：3)为脓肿分枝杆菌的CefE，E4(SEQ ID NO：4)为氧化烃微杆菌的CefE，E5(SEQ ID NO：5)为侵蚀侏囊菌的CefE，E6(SEQ ID NO：6)为丁香假单胞菌的CefE，E7(SEQ ID NO：7)为棒状链霉菌的CefE，E8(SEQ ID NO：8)为独岛鞘氨醇单胞菌的CefE。

E1至E8的基因是从合成请求保护的每个模板中扩增出来的，

分别使用引物5'-CGCTTGAGCAGACATCACCATGACCGACGCCACCGTGCC-3'(SEQ ID NO：39)和5'-GCTAAGCTTTTATCAGCGGGCGGCGGC-3'(SEQ ID NO：40)扩增E1，使用引物5'-CGCTTGAGCAGACATCACCATGACCGACAGCCCGATCT-3'(SEQ ID NO：41)和5'-GCTAAGCTTTTATCAGCCGACGGTGATCG-3'(SEQ ID NO：42)扩增E2，使用引物5'-CGCTTGAGCAGACATCACCATGACGGACATCGGTGAAC-3'(SEQ ID NO：43)和5'-GCTAAGCTTTTATCAGCCGACGGTTATGGC-3'(SEQ ID NO：44)扩增E3，使用引物5'-CGCTTGAGCAGACATCACCATGGCCCTGCCGCCCGTCATGC-3'(SEQ ID NO：45)和5'-GCTAAGCTTTTATCACGCGCTCGCGCCT-3'(SEQ ID NO：46)扩增E4，使用引物5'-CGCTTGAGCAGACATCACCATGTCAAGCGCCATCATCGCC-3'(SEQ ID NO：47)和5'-GCTAAGCTTTTATCAGACGTTCAGGTTCTTCGCCTTG-3'(SEQ ID NO：48)扩增E5，使用引物5'-CGCTTGAGCAGACATCACCATGACCCTCCAGTACGTCCC-3'(SEQ ID NO：49)和5'-GCTAAGCTTTTATCAGGCGACCTTGGACC-3'(SEQ ID NO：50)扩增E6，使用引物5'-CGCTTGAGCAGACATCACCATGGACACCACCGTGCCGAC-3'(SEQ ID NO：51)和5'-GCTAAGCTTTTACTACGCCTTCGAGGTCCGCCG-3'(SEQ ID NO：52)扩增E7，使用引物5'-CGCTTGAGCAGACATCACCATGCATCGCGCGGGCGGC-3'(SEQ ID NO：53)和5'-GCTAAGCTTTTATCACTTCTTGATGAGAC-3'(SEQ ID NO：54)扩增E8。使用引物5'-GCAACTAGTGCGGCCGCCCTTGTATCTCTACACACAGGC-3'(SEQ ID NO：55)和5'-GGTGATGTCTGCTCAAGCG-3'(SEQID NO：56)从pB-HCXEP3(韩国专利号10-1808192的SEQ ID NO：15)扩增启动子PEP3。

由于上述扩增的E1至E8基因和启动子PEP3具有可彼此重叠的序列，因此通过进行缝合PCR将它们连接起来。使用上述扩增的PEP3片段和E1片段作为模板和引物SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：40进行PCR，以获得与启动子连接的E1基因片段。以相同的方式，使用PEP3片段和E2片段作为模板，以及引物SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：42，得到与启动子连接的E2基因片段，使用PEP3片段和E3片段作为模板，以及引物SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：44，得到与启动子连接的E3基因片段，使用PEP3片段和E4片段作为模板，以及引物SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：46，得到与启动子连接的E4基因片段，使用PEP3片段和E5片段作为模板，以及引物SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：48，得到与启动子连接的E5基因片段，使用PEP3片段和E6片段作为模板，以及引物SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：50，得到与启动子连接的E6基因片段，使用PEP3片段和E7片段作为模板，以及引物SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：52，得到与启动子连接的E7基因片段，使用PEP3片段和E8片段作为模板，以及引物SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：54，得到启动子连接的E8基因片段。

为了在具有启动子PEP3的E1至E8基因中具有终止子，首先构建导入有终止子的载体。由于终止子是trpC终止子，在使用引物5'-CGACTCGAGACTTAACGTTACTGAAATCATCAAACAGC-3'(SEQ ID NO：57)和5'-GCAGGTACCATCGAGTGGAGATGTGGAGTGGG-3'(SEQ ID NO：58)从pAN7-1(GenBank Z32698)扩增后，用XhoI和KpnI限制性内切酶切(restricted)，插入pBluescript II SK+的相同位点，然后制备pB-TtrpC(SEQ ID NO：59)。将具有启动子PEP3的E1至E8基因片段导入pB-TtrpC质粒载体以完成具有启动子和终止子的每个基因的盒。

具体而言，将与PEP3连接的E1基因片段用NotI和HindIII限制性内切酶切，并插入pB-TtrpC的相同位点以完成pB-E1cast(SEQ ID NO：60)，将与PEP3连接的E2基因片段用SpeI和HindIII限制性内切酶切，并插入pB-TtrpC的相同位点以完成pB-E2cast(SEQ IDNO：61)，将与PEP3连接的E3基因片段用NotI和HindIII限制性内切酶切，并插入pB-TtrpC的相同位点以完成pB-E3cast(SEQ ID NO：62)，将与PEP3连接的E4基因片段用NotI和HindIII限制性内切酶切，并插入pB-TtrpC的相同位点以完成pB-E4cast(SEQ ID NO：63)，将与PEP3连接的E5基因片段用NotI和HindIII限制性内切酶切，并插入pB-TtrpC的相同位点以完成pB-E5cast(SEQ ID NO：64)，将与PEP3连接的E6基因片段用NotI和HindIII限制性内切酶切，并插入pB-TtrpC的相同位点以完成pB-E6cast(SEQ ID NO：65)，将与PEP3连接的E7基因片段NotI和HindIII限制性内切酶切，并插入pB-TtrpC的相同位点以完成pB-E7cast(SEQID NO：66)，将与PEP3连接的E8基因片段NotI和HindIII限制性内切酶切，并插入pB-TtrpC的相同位点以完成pB-E8cast(SEQ ID NO：67)。

使用引物T3(SEQ ID NO：34)和T7(SEQ ID NO：35)从具有完成的8个细菌CefE基因盒的质粒载体扩增每个基因盒后，通过平端连接将其插入pB-HF的PmeI限制性位点，该位点是韩国专利号10-1808192中指定的SEQ ID NO：5。最终将每个完成的质粒命名为pB-HFE1(SEQ ID NO：14)、pB-HFE2(SEQ ID NO：15)、pB-HFE3(SEQ ID NO：16)、pB-HFE4(SEQ ID NO：17)、pB-HFE5(SEQ ID NO：18)、pB-HFE6(SEQ ID NO：19)、pB-HFE7(SEQ ID NO：20)、pB-HFE8(SEQ ID NO：21)。完成的表达载体的构建如图1所示。每个质粒载体具有潮霉素抗生素标记，并且其被配置成用flp-FRT系统去除标记(韩国专利号10-1808192)。

2-2.产DAOC的菌株的筛选

将实施例2-1中构建的8个载体转化并导入实施例1中制备的CefEF和CefG缺陷型D菌株后，通过体外培养大量获得的菌落，筛选出用于DAOC生产和发酵试验的高产菌株。

根据上述<实验方法>中所示的方法进行产物的转化、体外培养和HPLC分析。具体而言，用于以下HPLC分析和质谱分析的标准品是通过请求MedKoo Biosciences,Inc(Morrisville,North Carolina,USA)合成的。对于导入pB-HFE1至pB-HFE8表达载体的8种类型中的每一种，在体外培养了60个菌落，结果如图2所示。这表明，在导入了8个细菌CefE基因的菌株中，随导入的基因的不同，活性差异很大，即使导入了相同的基因，随菌落的不同，活性也有很大差异。特别是，在导入了CefE2和CefE4的转化体的情况下，几乎没有任何具有DAOC生产力的菌株，其中DAOC的生产力得到明显证实的组为Amycoratopsislactamdurans的CefE1、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium Abcessus)的CefE3、侵蚀侏囊菌的CefE5、丁香假单胞菌的CefE6、棒状链霉菌的CefE7和独岛鞘氨醇单胞菌的CefE8。在引入CefE3的情况下，菌株3-7的产量约为3.77g/L，是所有菌落中最高的，证实在导入棒状链霉菌的CefE7的7-53菌株中最大产量为3.35g/L，在导入独岛鞘氨醇单胞菌的CefE8的8-60菌株中最大产量约为3.5g/L，其证实相对较高。

实施例3：产DAOC菌株的发酵生产率评估

在实施例2的体外培养中DAOC生产率高的菌株中，主要从不同物种中选择5个菌株来评估发酵生产率。发酵生产率评估对象为导入CefE1的1-38菌株、导入CefE3的3-7菌株、导入CefE7的7-23菌株和7-53菌株、导入CefE8的8-60菌株。

DAOC生产菌株的发酵分初级种子培养、次级种子培养和主培养阶段进行。对于初级培养，将4至6个菌落接种到初级种子培养基(大豆粉28.5g/L，玉米浆25mL/L，蔗糖35g/L，葡萄糖5g/L，碳酸钙5g/L，消泡剂0.8mL/L)中，然后在30℃和200rpm下培养4至5天，具体取决于菌落大小。对于次级种子培养，将所有初级种子培养基接种到含有次级种子培养基(与初级种子培养基相同，但加入5mL/L大豆油)的发酵罐中，在30℃，35％DO，400rpm和1.0vvm空气的条件下开始，根据细胞的生长进料6％葡萄糖，并逐步提高搅拌速度，培养4至5天。对于主培养，将200mL次级种子培养基接种到含有主培养基(花生粉23g/L，玉米浆50mL/L，蛋氨酸1.5g/L，糊精70g/L，玉米小麦(corn wheat)35g/L，硫酸钙13g/L，大豆油60mL/L，硫酸铵13g/L，果糖浆9g/L，碳酸钙10g/L，消泡剂0.5mL/L)的发酵罐中，并在28℃，35％DO，400rpm，空气1.0vvm条件下开始培养，使用氨水将pH调节至5.4-5.7，根据细胞的生长情况，逐步提高搅拌速度并培养。培养2天后，将培养温度从28℃降至25℃，并在第5天至第8天完成发酵，同时根据细胞生长情况分阶段供给5％至10％的大豆油。

为了分析发酵液中的DAOC，将1mL发酵液稀释100倍，以14000rpm离心10分钟，并通过0.22μm注射器式滤器过滤上清液用于HPLC分析。

发酵结果如图3所示。

导入脓肿分枝杆菌来源的CefE(CefE3)的3-7菌株在140小时内产最高33.5g/L的DAOC，导入棒状链霉菌的CefE(CefE7)的7-23和7-53在140小时时分别显示出约27.0和28.1g/L的类似生产率。导入独岛鞘氨醇单胞菌CefE(CefE8)的菌株8-60由于生产延迟而发酵约183小时，160小时后增幅不大，最终产量为28.5g/L。

生产的DAOC通过质谱分析确认，且质谱分析通过委托外部公司EZ Mass(Jinju,Gyeongnam,Korea)进行，质谱结果如图4所示，证实其与标准DAOC一致。

实施例4：DAOC培养基向7-ADCA的转化反应

在DAOC生产和发酵之后，用CPC酰基转移酶处理发酵液以进行酶促反应。CPC酰基转移酶使用韩国专利申请公开号10-2014-0094150中公开的突变CPC酰基转移酶。

在DAOC发酵完成之后，使用15℃的温度、800rpm的搅拌速度和14％氨水将pH调节至8.0，并且然后将液体CPC酰基转移酶以30U/mL的终浓度添加至每个发酵罐。反应时间总共为2小时，分别在15分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟取样并进行分析。

结果如图5所示。

每个发酵罐均有一些差异，但大多数在60分钟内反应完成后达到最大值。DAOC与7-ADCA的摩尔比为约59.94％，其中大部分转化率为90％，从菌株3-7的发酵液中可获得最多约18g/L的7-ADCA。

生产的7-ADCA通过质谱分析确认，并且与DAOC分析一样，质谱分析通过委托外部公司EZ Mass(Jinju,Gyeongnam,Korea)进行，质谱结果如图6所示，证实其与标准7-ADCA(Sigma-Aldrich A8398,USA)一致。

结果，最终证实发酵的DAOC被CPC酰基转移酶高效地转化为7-ADCA。

实施例5：通过原生质体融合提高DAOC生产率

为了提高DAOC生产率，通过具有优异DAOC生产率的菌株之间的原生质体融合进行基因组改组。制备实施例3中筛选的发酵试验菌株1-38、3-7、7-23、7-53和8-60的原生质体，并随机融合，然后选择大量菌落以测试DAOC生产率。

原生质体融合是通过修改上述PEG(聚乙二醇)转化方法进行的。1-38、3-7、7-23、7-53和8-60这5种菌株中每一种的原生质体的生产与上述转化方法中的相同。对制备的原生质体进行计数后，将250μL 60％PEG溶液与5种菌株各1×10⁷个原生质体混合，然后置于冰上40分钟。之后，加入2.5mL60％PEG溶液，混合，并在室温下放置40分钟，然后铺板于含有抗生素的LB蔗糖平板培养基上。将平板培养基在28℃培养10至30天，直至形成菌落。

取约100个形成的菌落并通过上述方法体外培养，然后筛选出DAOC生产率最高的前5个菌株并提取基因组DNA，然后分别使用引物SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40确认CefE1的存在与否，使用SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44确认CefE3的存在与否，使用SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52确认CefE7的存在与否，使用SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54确认CefE8的存在与否，以及每种菌株是如何融合的。此外，同时进行发酵试验以确定生产率。

图7是通过原生质体融合筛选的菌株的发酵结果。在筛选出的高产菌株中，一株未发生融合，三株有两种菌株的融合：CefE1和CefE7(E1-E7)、CefE1和CefE8(E1-E8)、CefE3和CefE8(E3-E8)与导入的菌株融合，在一株中也观察到CefE3、CefE7和CefE8的三个菌株的融合(E3-E7-E8)。在发酵生产率的情况下，当导入CefE3的菌株和导入CefE8的菌株融合时，在149小时时最高为38.7g/L。当CefE3、CefE7和CefE8导入菌株融合时，在140小时时生产率显著高，为35.4g/L。

由于上面已经详细描述了本发明的具体部分，对于本领域普通技术人员来说，这些具体描述仅仅是优选实施方案，并且显然本发明的范围不限于此。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来限定。

工业实用性

根据本发明，可以制备具有高DAOC性能的顶头孢霉菌株，并通过用CPC酰基转移酶处理由这些菌株产生的DAOC，可以以环保且高效的方式生产7-ADCA而无有毒副产物，其具有非常高的工业实用性。

[保藏号]

保藏机构名称：韩国生命工学研究院

保藏号：KCTC13922BP

保藏日期：20190819

保藏地址：(56212)韩国生命工学研究院(KRIBB)，181,Ipsin-gil,Jeongeup-si,Jeollabuk-do,韩国

原始保藏的收据

致：Amicogen.Inc.

Amicogen.Inc.

14-10,Worasan-ro 950beon-gil,Munsan-euo,Jinju-si,Gyeongsangnam-do

韩国

<110> 艾美科健株式会社

<120> 用于制备生产高浓度的用于 7-ADCA 制备的脱乙氧基头孢菌素 C 的重组顶头孢霉菌株的方法以及通过该方法制备的菌株

<130> OP19-0152/PCT

<150> KR 10-2019-0114945

<151> 2019-09-18

<160> 67

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 948

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Codon optimized CefE of Amycolatopsis lactamdurans

(NCBI:txid1913)

<400> 1

atgaccgacg ccaccgtgcc caccttcgac ctggccgagc tccgggaggg tctgcaccag 60

gaggagttca ggcattgcct ccgcgaaaag ggtgtcttct acctgaaggg caccggcctg 120

cccgccgagg ccgaccacgc atccgggcgg gagatcgcgg tggacttctt cgaccacggc 180

accgaggccg agaagaaggc ggtgatgacg cccatcccta ccatccgccg gggctacgcg 240

ggcctggaga gcgagtccac cgcgcagatc acgaacaccg gcaagtacac cgactactcc 300

atgtcctatt cgatgggtac cgcggacaac ctcttcccca gcgccgagtt cgagaaggcc 360

tgggaggact atttcgcccg tatgtaccgc gcctcccagg acgtggcgcg gcaggtgctg 420

acgtcggtcg gggcggagcc ggaagtgggc atggacgcct tcctggactg tgagccgctt 480

ctgcgccttc ggtacttccc tgaggtcccc gaggaccgcg tggccgagga acagccgctc 540

cgcatggcgc cgcactacga cctgagcatc gtcacgctga tccaccagac cccgtgcgcc 600

aacggcttcg tgtccctgca ggtggaggtg gacggcagct acgtcgacat ccccgcccag 660

ccgggcgccg tgctggtctt ctgcggggcc gtcgcgacgc tggtggcgga cggggcgatc 720

aaggccccga agcaccacgt ggccgcgccc ggcgccgaca agcgcgtagg ctccagccgc 780

acgtccagcg tgttcttcct ccgtccgaac ggcgacttcc ggttcagcgt cccccgtgcg 840

cgcgaatgcg gcttcgacgt gtccatcccc gccgagaccg cgaccttcga cgactggatc 900

gggggcaact acatcaacat ccgcaagacg gccgccgccc gctgataa 948

<210> 2

<211> 975

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Codon optimized CefE of Gordonia rubripertincta CWB2 NBRC 101908

(NCBI:txid1077975)

<400> 2

atgaccgaca gcccgatctt gaccgtcgac ctgtcccgct ggcgggccgg tggcgcggac 60

gcggctgccg tgtgcgccgc cgtcgacgag tcgctccaga aggccggctt cctgctggtg 120

accggccacg ggatcgaccc ggtgctcccc gcggagctgc gggcggcagc ccgcgccttc 180

ttcgcgctgc cggccgaggt gaagcagaag tacgcggtcg gggtcggggg ccggggctgg 240

atcgggcccg gcatggaggc caacgcctac gccgagggta ccgagacccc cccggacctg 300

aaggagacct ataactcggg ggcgcaaacg ccggtcggcg taccggaggt ggacgactac 360

tggttcgcac ccgacgtctg gcccattgaa gcgccgcggc tcaaggagct cttcacggca 420

tggaccgcac agtgcaagac actcagcgac gacctcctgg cgctgatggc cgcctccctc 480

ggcttcgccg ccgcggacaa ccccttccgc gacctggctg gcaacgccac ctggacctcc 540

aacatcaacc actacccggc gatggccgtc gtgggcgagc ccgagccggg gcagtaccgg 600

atcggcccgc acaccgactt cggcacggtg accgtcctcg accgcgaacc cggttccggc 660

ggcctgcagg tctacagcga agacggggga tgggctgacg cgccgtacga ccccgcggcc 720

ctcacggtca acatcgggga cctcctcgag tactggtccg gtggtcggtg gccggccggg 780

cgccaccggg tgctgccgcc ccagccggac gcccccgagg aggacctgat gtccctgatc 840

ttcttctatg aactggacca tgacgccgtc gtcacgccga tcggtaagcc cctggggcgc 900

cgcgccggcc tggagcctgt ggtctccggc gagttcatcc gggagcgcct ggacgcgatc 960

accgtcggct gataa 975

<210> 3

<211> 414

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Codon optimized CefE of Mycobacteroides abscessus subsp.

abscessus (NCBI:txid1185650)

<400> 3

atgacggaca tcggtgaacc ggagcctggt cagtaccgga tcggcccgca cacggacttc 60

ggcaccgtca cgatcctgga ccgggagccg ggagccggag ggctgcaggt gtactccgag 120

cagggcggct gggccgacgc cccgtacgac ccgtcggccc tgacggtcaa catcggagac 180

ctgctcgagt actggtcggg gggcaggtgg ccggcgggcc gccaccgggt gctcccgcca 240

caggcggacg ctccggagga agacctggtg tctctcatct tcttctacga actcgaccac 300

gacgccgtcg tgaccccgct cgaccccccg gtcggaaaga tcgccggccg gccgccggtc 360

atcggcggcg atttcatccg ggagaggctg gacgccataa ccgtcggctg ataa 414

<210> 4

<211> 1077

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Codon optimized CefE of Microbacterium hydrocarbonoxydans NBRC

103074 (NCBI:txid1223527)

<400> 4

atggccctgc cgcccgtcat gctgaggaac acgcgggtct ccccccggat gcgcatctac 60

tcccgggtga tgtcggagct gtcgctgcct atcctggacc tctcgcagct ggacgccggc 120

ccggaagccg ccgcccggtt ccgggacgac ctgagggcgg ccacccacga cgtcgggttc 180

ttctacctca ccggcacggg cgtcagtccc gagctcgaag cgcgcctgca ccgcgccgct 240

ctcgacttct tcgcgctgcc ggaggcggag aagctggcga tcgagaacat caactcgccg 300

cacttccggg gctacactcg ggtgggtggg gagcgcaccc agggcgaggt cgactggcgg 360

gagcagatcg acatcggccc cgagcgcgac gccgtagatg gtggcccggc ctacaatcgg 420

ctgatcgggc cgaacctgtg gcccgcggcc cagccggagc tgaaggaagt ggtggcggag 480

tggcattcca cgctcagcga ggtcagccgg cgcctcctcc gcgcgtgggc ggagaccctg 540

ggggcggagc ctagctactt cgacgagcac ttcggagagc cctccaccct catcaagatc 600

gtccggtacc ccggcaccca cgagcccgag ccgcagcagg gtgtcggggc gcataaagac 660

tcaggtgtgc tcacgctcct gtgggtggaa cccggcaagg gtggcctgca ggtggagcgg 720

gacggaacgt gggttgacgc cccctccgtg cccggtgcgt tcgtcgtcaa catcggcgaa 780

ctcctggagt acgccaccgg gggctacctg aaggcgacca accaccgggt ggtctccccg 840

aaggcccccg acgagaggat ctccatcccc ttcttcttca atccggccct cgataagcgg 900

ctgccgctga tcgagctgcc cgcgcccctc gcggccgagg cgaccggggt gaccgacgac 960

ccgcgtaacc cgatccacgc cctgtacggc gagaacgccc tgaagtcacg gctgcgtgcc 1020

caccccgacg tggccgccat ccaccacgcg gacctggtag gcgcgagcgc gtgataa 1077

<210> 5

<211> 1005

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Codon optimized CefE of Nannocystis exedens subsp. cinnabaria

(NCBI:txid1366054)

<400> 5

atgtcaagcg ccatcatcgc cgaaatcccg gtgatcgacc tgggcccatt cggagacggg 60

gacgcgccgg gggcggcgga agtggccgcg gcattcgacc gggcctgcag ggacctgggg 120

ttcgtggtcg tcgtggggca cggcgtgccc caggccgtca tcgacgccgc gcaccggagt 180

gcccgcgcgt tctttgacct ggacctcgct acccgcgagc ggtacgcggc cccgcccggc 240

gggttcgtcg ggtaccgcgg gctcggagcc gaggggctgt cttacagtct ggaccaggag 300

gctgcgccgg acttcaagga gacatatacc gtcggacgca tcgatcgcgg agacgagcct 360

tacttcacgt cccagctggg gcggatgtac atgccggacc ctacgtggcc ggcggaggtc 420

cccgagttcg cagcgtcgtg ggccgagttc tatcgccaga tggaccgggt cgcctggcgc 480

ctgatgcgcg cgttcgccac cgcgctggcc ctcccccgcg agttcttcga cgacaagatt 540

gatcggaaca tctcgtgcct gcgcgcgctg aactaccccc acccgtccac acccccccag 600

cccggccagc tgcgcgcggg cgcccacacg gactacggct ccctcacgct gctcagcatg 660

gccgacgcgc ccgggggcct cgaggtgcag cgggacgacg ggtcgtgggc gccggtccgg 720

gtcccggcag acgccttcgt gatgaacgtg ggcgacctta tggcgcagtg gaccaacgac 780

cgttggcgct cgtcgatgca ccgcgtgacg aatccccccc cggacgcgat cggcgacacg 840

cggcggcaga gcctggcgtt cttccaccag cccaactatg acgccgaggt catcccgctc 900

gcgtcctgct gcggcccggc caaccccccg aagtacgccc gcaccacgag cggcgagcac 960

ctgttcatga agatgaccaa ggcgaagaac ctgaacgtct gataa 1005

<210> 6

<211> 1017

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Codon optimized CefE of Pseudomonas syringae pv. actinidiae ICMP

18886 (NCBI:txid1189623)

<400> 6

atgaccctcc agtacgtccc catcatcaac ctggcgccct atttctcggg cgagccggac 60

ggcaaggcgg cggtcgccca ggcggtgaac caggcgtgca aggacatcgg cttcctcgtc 120

atcaccgagc accagatccc aaccgagctg atcgaccgcg tctcgcgcct cacgcggcaa 180

ttcttcgatc tgccgctcgc cgaaaagagg aaggtcgacc gcccttcgcc ggagatggtc 240

cgggggtatt ccgccgtggc ggaggagtcg ctgtcctact cgctcgagga gtcggcgccg 300

ggggacctga aggagtcctt ctccatcggc ccgagcgacg tcccgaacga ggactactac 360

cacaacgccg aagcggggcc ccacttcgcg ccgaacgtgt ggccggccaa cgaacgggtc 420

cctggcttcc aggaggccta tcaggcctac ttcggggcaa tgtcccagct cgcgcagtcc 480

ctcatgcgct tgttcgccct ggccctcgag ctcgacgaat gcttcttcga cgaccgcatt 540

gaccgccaca tctccatgtt ccggtcgctc tcctacccgg acatcaagac cgaggtcgag 600

gccggccagc tgcgcgcgtc cgcccacacc gactacggct ccctgacgat cgtacgcccc 660

gacaacgccc tgggaggcct ccaggttcgg aaccagcagg gcgagtgggt ggacgttccg 720

tacgtggaga acggcttcgt cgtgaacatc ggtgatctga tgatgcagtg gaccaacgac 780

cagtggatca gcaccctgca cagggtcgtg aatccgccca tgacgagcga gcaggacaat 840

cggcggcagt ccctggtctt cttccaccag ccgaactatg acaccctgat cgagtgcctc 900

cccggctgcc tgctgccggg taccacgccc cgccacgccc ccgtcaccag cggcgaccac 960

ctcctcgcca agtttgtcaa gcagacgacg ttcggagggt ccaaggtcgc ctgataa 1017

<210> 7

<211> 939

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Codon optimized CefE of Streptomyces clavuligerus ATCC 27064

(NCBI:txid443255)

<400> 7

atggacacca ccgtgccgac cttctccctc gccgagctcc agcagggtct gcaccaggac 60

gagttccggc ggtgtctgcg cgacaagggg ctgttctacc tgaccgactg cggcctaaca 120

gacacggagc tcaagtccgc caaggatatc gtcatcgact ttttcgagca cgggagcgag 180

gccgagaagc gggcggtcac cagccccgtc ccgacgatgc gccgcggctt caccggtctg 240

gagtccgagt cgaccgccca aatcaccaac accggatcct actccgacta cagcatgtgt 300

tactccatgg ggacggccga caacctcttc ccctccgggg atttcgagcg catctggacc 360

cagtacttcg accgccagta caccgccagc agggccgtgg ccagggaggt cctgcgcgcc 420

accgggacgg aaccggacgg cggggtggag gccttcctgg actgcgaacc gcttctgcgg 480

ttccggtact tcccccaggt ccccgagcat cggtccgccg aggagcagcc gctccggatg 540

gccccccact acgacctgtc catggtgacc ctcatccagc agaccccgtg cgcaaacggg 600

ttcgtgtcgc tccaggccga ggtgggcggc gcgttcacag acctccctta ccgacccgac 660

gcggtgttgg tcttctgcgg cgccatcgcc accctcgtga cgggcggcca ggtcaaggcc 720

ccccggcacc acgtggccgc cccgcggcgt gaccagatcg ccggaagcag ccgcacgtcg 780

tccgtgttct tcctgcgccc gaacgcggac ttcacattct ccgtccccct cgcgcgggag 840

tgcggcttcg acgtctccct ggacggggag accgccacgt tccaggactg gatcggcggc 900

aactacgtca acatccggcg gacctcgaag gcgtgataa 939

<210> 8

<211> 1077

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Codon optimized CefE of Sphingomonas dokdonensis

(NCBI:txid344880)

<400> 8

atgcatcgcg cgggcggcag cgggctcgtc cccagtggcc gcatcgccgg ctattggcga 60

tgcgagcggc cctggcgcat gcagcgccga tcccgctgct cgaccaaggc cctggtgatg 120

ctggacaccc ccctggcgaa ggtgccgacc ctcagtctcg cagaccaggc agtcgatccc 180

gaccgcttcg ccgccgacct gggcggttcg ttcaggcggt tcggcttcgc catcgtcgcg 240

gaccatggca tcccggacga cctcatcgcc cgggcctggg cgcagaccga ggccctgttc 300

gcccagccgg acgccgacaa gcggggctac tacgtggaag gcgcgggcgg ggcccgcggc 360

tacaccccgt tcaagaccga gatcgcgaag gacgccaagc acgtcgacct gaaggagttc 420

tggcacgtgg ggcgagagct gcccacgggc caccggtacg cgggtgagat ggccccgaac 480

atctggcccg cccagcccga tggcttcaag gagaccttcg tcgagctgtt ccgcgctttc 540

gacacggcgg gcgacaagct cctgagcgcc atcgcccggg acctcgggct ggcgccggac 600

tggttcgacc tggcggtcaa ggacggcaac tccgtcctcc gcctgctgca ctaccccccg 660

atcccgatgg acgcggaggg cgtccgcgcg ggagcccatg aggacatcaa cctgatcacc 720

cttctcctgg gtgccgagga ggctggactg gagctgctcg accgcgacag cgggaattgg 780

ctggccatca agcccccgga gggcgcgatg gtagtgaacg tcggggacat gctgcagcgg 840

ttgaccaacc acgtcctgcc gtccaccacc caccgcgtcg tcaatccgcc cccggagcgc 900

cgggcccact cccgctacag catgcccttc tttctgcacc cggcccccga cttcctgatc 960

aagaccctgc cccagaccgt cacctcctcc aacccgaacc ggtaccccac cccgatcacg 1020

gcgcacgact acctccatga gcggcttgtg gagatcggtc tcatcaagaa gtgataa 1077

<210> 9

<211> 284

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Promoter EP1

<400> 9

tccaaatatc gtgcctctcc tgctttgcca ggtgtatgaa accggaaagg ccgctcagga 60

gctggccagc ggcgcagacc gggaacacaa gctggcagtc gacccatccg gtgctctgca 120

ctcgacctgc tgaggtccct cagtccctgg taggcagctt tgccccgtct gtccgcccgg 180

tgtgtcggcg gggttgacaa ggtcgttgcg tcagtccaac atttgttgcc atattttcct 240

gctctcctca ccagctgctc ttttcttttc tctttctttt ccca 284

<210> 10

<211> 284

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Promoter EP2

<400> 10

tccaaatatc gtgcctctcc tgctttgctc ggtgtatgaa accggatagg ccgctcagga 60

gctggccagc ggcgcagacc gggaacacaa gctggcagtc gacccatccg gtgctctgca 120

ctcgacctgc tgaggtccct cagtccctgg taggcagctt taccccgtct gtccgcccgg 180

tgtgtcggcg gggttgacaa ggtcgttgcg tcagtccaac atttgttgcc atattttcct 240

gctctcccca ccagctgctc ttttcttttc tctttctttt ccca 284

<210> 11

<211> 284

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Promoter EP3

<400> 11

tccaaatatc gtgcctctcc tgctttgcca ggtgtatgaa accggaaagg ccgctcagga 60

gctggccagc ggcgcagacc gggaacacaa gctggcagtc gacccatccg gtgctctgca 120

ctcgacctgc tgaggtccct cagtccctgg taggcagctt tgccccgtct gtccgcccgg 180

tgtgtcggcg gggttgacaa ggtcgttgcg tcagtccaac atttgttgcc atattttcct 240

gctttcccca ccagctgctc ttttcttttc tctttctttt ccca 284

<210> 12

<211> 284

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Promoter EP4

<400> 12

tccaaatatc gttcctctcc tgctttgccc ggtgtatgaa accggaaagg ccgctcagga 60

gctggccagc ggcgcagacc gggaacacaa gctggcagtc gacccatccg gtgctctgca 120

ctcgacctgc tgaggtccct cagtccctgg taggcagctt tgccccgtct gtccgcccgg 180

tgtgtcggcg gggttgacaa ggtcgttgcg tctgtccaac atttgttgcc atattttcct 240

cctctcccta ccagctgctc ttttcttttc tctttctttt ccca 284

<210> 13

<211> 284

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Promoter EP5

<400> 13

tccaaatatc gtgcctctcc tgctttgccc ggtgtatgaa accggaaagg ccgctcagga 60

gctggccagc ggcgcagacc gggaacacaa gctggcagtc gacccatccg gtgctctgca 120

ctcgacctgc tgaggtccct cattccctgg taggcagctt tgccccgtct gtccgcccgg 180

tgtgtcggcg gggttgacaa ggtcgttgcg tcagtccaac atttgttgcc atattttcct 240

gctctcccca ccagctgctc ttttcgtttc tctttctttt ccca 284

<210> 14

<211> 8192

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pB-HFE1 vector

<400> 14

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 180

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 240

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 300

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 360

tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 420

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 480

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 540

caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 600

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 660

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 720

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 780

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 840

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 900

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 960

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1020

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 1080

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 1140

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 1200

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 1260

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 1320

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 1380

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 1440

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 1500

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 1560

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 1620

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1680

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pB-HFE2 vector

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<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pB-HFE8 vector

<400> 21

cgcgactata tatttgtctc taattgtact ttgacatgct cctcttcttt actctgatag 60

cttgactatg aaaattccgt caccagcncc tgggttcgca aagataattg catgtttctt 120

ccttgaactc tcaagcctac aggacacaca ttcatcgtag gtataaacct cgaaatcant 180

tcctactaag atggtataca atagtaacca tgcatggttg cctagtgaat gctccgtaac 240

acccaatacg ccggccgaaa cttttttaca actctcctat gagtcgttta cccagaatgc 300

acaggtacac ttgtttagag gtaatccttc tttctagaag tcctcgtgta ctgtgtaagc 360

gcccactcca catctccact cgacctgcag ttcgaagttc ctattctcta gaaagtatag 420

gaacttcaga gcgctttcca attcgcccta tagtgagtcg tattacgcgc gctcactggc 480

cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 540

agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc 600

ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 660

ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 720

tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct 780

aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa 840

acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc 900

tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact 960

caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg 1020

gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct 1080

tacaatttag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 1140

taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 1200

tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 1260

gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 1320

gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 1380

cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 1440

tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 1500

tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 1560

atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 1620

ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 1680

gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 1740

gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 1800

gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 1860

gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 1920

gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 1980

cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 2040

atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 2100

tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 2160

ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 2220

gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 2280

tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 2340

ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt 2400

ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 2460

gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 2520

ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 2580

tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 2640

ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 2700

agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 2760

agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 2820

gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 2880

tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt 2940

accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca 3000

gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 3060

attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 3120

gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 3180

gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 3240

catgattacg ccaagcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct gggcaaagct 3300

gtttaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct ccaccgcggt ggcggccgcc 3360

cttgtatctc tacacacagg ctcaaatcaa taagaagaac ggttcgtctt tttcgtttat 3420

atcttgcatc gtcccaaagc tattggcggg atattctgtt tgcagttggc tgacttgaag 3480

taatctctgc agatctttcg acactgaaat acgtcgagcc tgctccgctt ggaagcggcg 3540

aggagcctcg tcctgtcaca actaccaaca tggagtacga taagggccag ttccgccagc 3600

tcattaagag ccagttcatg ggcgttggca tgatggccgt catgcatctg tacttcaagt 3660

acaccaacgc tcttctgatc cagtcgatca tccgctgaag gcgctttcga atctggttaa 3720

gatccacgtc ttcgggaagc cagcgactgg tgacctccag cgtcccttta aggctgccaa 3780

cagctttctc agccagggcc agcccaagac cgacaaggcc tccctccaga acgccgagaa 3840

gaactggagg ggtggtgtca aggaggagta agctccttat tgaagtcgga ggacggagcg 3900

gtgtcaagag gatattcttc gactctgtat tatagataag atgatgagga attggaggta 3960

gcatagcttc atttggattt gctttccagg ctgagactct agcttggagc atagagggtc 4020

ctttggcttt caatattctc aagtatctcg agtttgaact tattccctgt gaacctttta 4080

ttcaccaatg agcattggaa tgaacatgaa tctgaggact gcaatcgcca tgaggttttc 4140

gaaatacatc cggatgtcga aggcttgggg cacctgcgtt ggttgaattt agaacgtggc 4200

actattgatc atccgatagc tctgcaaagg gcgttgcaca atgcaagtca aacgttgcta 4260

gcagttccag gtggaatgtt atgatgagca ttgtattaaa tcaggagata tagcatgatc 4320

tctagttagc tcaccacaaa agtcagacgg cgtaaccaaa agtcacacaa cacaagctgt 4380

aaggatttcg gcacggctac ggaagacgga gaagccacct tcagtggact cgagtaccat 4440

ttaattctat ttgtgtttga tcgagaccta atacagcccc tacaacgacc atcaaagtcg 4500

tatagctacc agtgaggaag tggactcaaa tcgacttcag caacatctcc tggataaact 4560

ttaagcctaa actatacaga ataagatagg tggagagctt ataccgagct cccaaatctg 4620

tccagatcat ggttgaccgg tgcctggatc ttcctataga atcatcctta ttcgttgacc 4680

tagctgattc tggagtgacc cagagggtca tgacttgagc ctaaaatccg ccgcctccac 4740

catttgtaga aaaatgtgac gaactcgtga gctctgtaca gtgaccggtg actctttctg 4800

gcatgcggag agacggacgg acgcagagag aagggctgag taataagcca ctggccagac 4860

agctctggcg gctctgaggt gcagtggatg attattaatc cgggaccggc cgcccctccg 4920

ccccgaagtg gaaaggctgg tgtgcccctc gttgaccaag aatctattgc atcatcggag 4980

aatatggagc ttcatcgaat caccggcagt aagcgaagga gaatgtgaag ccaggggtgt 5040

atagccgtcg gcgaaatagc atgccattaa cctaggtaca gaagtccaat tgcttccgat 5100

ctggtaaaag attcacgaga tagtaccttc tccgaagtag gtagagcgag tacccggcgc 5160

gtaagctccc taattggcga attcccatcc ggcatctgta gggcgtccaa atatcgtgcc 5220

tctcctgctt tgccaggtgt atgaaaccgg aaaggccgct caggagctgg ccagcggcgc 5280

agaccgggaa cacaagctgg cagtcgaccc atccggtgct ctgcactcga cctgctgagg 5340

tccctcagtc cctggtaggc agctttgccc cgtctgtccg cccggtgtgt cggcggggtt 5400

gacaaggtcg ttgcgtcagt ccaacatttg ttgccatatt ttcctgcttt ccccaccagc 5460

tgctcttttc ttttctcttt cttttcccat cttcagtata ttcatcttcc catatgcatc 5520

caagaacctt tatttcccct aagtaagtac tttgctacat ccatactcca tccttcccat 5580

cccttattcc tttgaacctt tcagttcgag ctttcccact tcatcgcagc ttgactaaca 5640

gctaccccgc ttgagcagac atcaccatgc atcgcgcggg cggcagcggg ctcgtcccca 5700

gtggccgcat cgccggctat tggcgatgcg agcggccctg gcgcatgcag cgccgatccc 5760

gctgctcgac caaggccctg gtgatgctgg acacccccct ggcgaaggtg ccgaccctca 5820

gtctcgcaga ccaggcagtc gatcccgacc gcttcgccgc cgacctgggc ggttcgttca 5880

ggcggttcgg cttcgccatc gtcgcggacc atggcatccc ggacgacctc atcgcccggg 5940

cctgggcgca gaccgaggcc ctgttcgccc agccggacgc cgacaagcgg ggctactacg 6000

tggaaggcgc gggcggggcc cgcggctaca ccccgttcaa gaccgagatc gcgaaggacg 6060

ccaagcacgt cgacctgaag gagttctggc acgtggggcg agagctgccc acgggccacc 6120

ggtacgcggg tgagatggcc ccgaacatct ggcccgccca gcccgatggc ttcaaggaga 6180

ccttcgtcga gctgttccgc gctttcgaca cggcgggcga caagctcctg agcgccatcg 6240

cccgggacct cgggctggcg ccggactggt tcgacctggc ggtcaaggac ggcaactccg 6300

tcctccgcct gctgcactac cccccgatcc cgatggacgc ggagggcgtc cgcgcgggag 6360

cccatgagga catcaacctg atcacccttc tcctgggtgc cgaggaggct ggactggagc 6420

tgctcgaccg cgacagcggg aattggctgg ccatcaagcc cccggagggc gcgatggtag 6480

tgaacgtcgg ggacatgctg cagcggttga ccaaccacgt cctgccgtcc accacccacc 6540

gcgtcgtcaa tccgcccccg gagcgccggg cccactcccg ctacagcatg cccttctttc 6600

tgcacccggc ccccgacttc ctgatcaaga ccctgcccca gaccgtcacc tcctccaacc 6660

cgaaccggta ccccaccccg atcacggcgc acgactacct ccatgagcgg cttgtggaga 6720

tcggtctcat caagaagtga taaaagctta tcgataccgt cgacctcgag acttaacgtt 6780

actgaaatca tcaaacagct tgacgaatct ggatataaga tcgttggtgt cgatgtcagc 6840

tccggagttg agacaaatgg tgttcaggat ctcgataaga tacgttcatt tgtccaagca 6900

gcaaagagtg ccttctagtg atttaatagc tccatgtcaa caagaataaa acgcgttttc 6960

gggtttacct cttccagata cagctcatct gcaatgcatt aatgcattga ctgcaaccta 7020

gtaacgcctt tcaggctccg gcgaagagaa gaatagctta gcagagctat tttcattttc 7080

gggagacgag atcaagcaga tcaacggtcg tcaagagacc tacgagactg aggaatccgc 7140

tcttggctcc acgcgactat atatttgtct ctaattgtac tttgacatgc tcctcttctt 7200

tactctgata gcttgactat gaaaattccg tcaccagccc ctgggttcgc aaagataatt 7260

gcatgtttct tccttgaact ctcaagccta caggacacac attcatcgta ggtataaacc 7320

tcgaaatcag ttcctactaa gatggtatac aatagtaacc atgcatggtt gcctagtgaa 7380

tgctccgtaa cacccaatac gccggccgaa acttttttac aactctccta tgagtcgttt 7440

acccagaatg cacaggtaca cttgtttaga ggtaatcctt ctttctagaa gtcctcgtgt 7500

actgtgtaag cgcccactcc acatctccac tcgatggtac ccaattcgcc ctatagtgag 7560

tcgtattaaa accccgggta cgtaaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctgggcaa 7620

agcttgaggc cggacaaatt cagcctgcag gctaaagttt ctattacatg atatttgtcg 7680

tggacaaggg cgtctggggt aaaaaggaat gtgggcagag agctctcggc ttaaagaccg 7740

gcttcggagt tccagaccca ctcgaactga aaacgatgat tagagataag tagatctatt 7800

tggacagtat aagaatccta gtcggctagt atttctccac ttttacttta aaattcccca 7860

gagtaagggg gcaggttcgt cgtcacgggt agcctcgtct cgaggcatcg cggatagcat 7920

tatcttgggg tatcacgagt aacttcatcg tggcattatc gataggtact gtaagtactg 7980

taggaactta tccgggcatg gatatgtata ggtacatacg atgcactaaa agtggagaaa 8040

tactagccga gtagagatct tataccatcc gaatagattt actccttata atcaaggggc 8100

aacaatcagt tgtgacgatg tcggctgtgg gagtgcagtt taggggtcat caaagcacag 8160

gaaaacgtgt tgtatggatg cctatcgtct tg 8192

<210> 22

<211> 314

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CefE of Amycolatopsis lactamdurans (genbank PID CAA78376.1)

<400> 22

Met Thr Asp Ala Thr Val Pro Thr Phe Asp Leu Ala Glu Leu Arg Glu

1 5 10 15

Gly Leu His Gln Glu Glu Phe Arg His Cys Leu Arg Glu Lys Gly Val

20 25 30

Phe Tyr Leu Lys Gly Thr Gly Leu Pro Ala Glu Ala Asp His Ala Ser

35 40 45

Gly Arg Glu Ile Ala Val Asp Phe Phe Asp His Gly Thr Glu Ala Glu

50 55 60

Lys Lys Ala Val Met Thr Pro Ile Pro Thr Ile Arg Arg Gly Tyr Ala

65 70 75 80

Gly Leu Glu Ser Glu Ser Thr Ala Gln Ile Thr Asn Thr Gly Lys Tyr

85 90 95

Thr Asp Tyr Ser Met Ser Tyr Ser Met Gly Thr Ala Asp Asn Leu Phe

100 105 110

Pro Ser Ala Glu Phe Glu Lys Ala Trp Glu Asp Tyr Phe Ala Arg Met

115 120 125

Tyr Arg Ala Ser Gln Asp Val Ala Arg Gln Val Leu Thr Ser Val Gly

130 135 140

Ala Glu Pro Glu Val Gly Met Asp Ala Phe Leu Asp Cys Glu Pro Leu

145 150 155 160

Leu Arg Leu Arg Tyr Phe Pro Glu Val Pro Glu Asp Arg Val Ala Glu

165 170 175

Glu Gln Pro Leu Arg Met Ala Pro His Tyr Asp Leu Ser Ile Val Thr

180 185 190

Leu Ile His Gln Thr Pro Cys Ala Asn Gly Phe Val Ser Leu Gln Val

195 200 205

Glu Val Asp Gly Ser Tyr Val Asp Ile Pro Ala Gln Pro Gly Ala Val

210 215 220

Leu Val Phe Cys Gly Ala Val Ala Thr Leu Val Ala Asp Gly Ala Ile

225 230 235 240

Lys Ala Pro Lys His His Val Ala Ala Pro Gly Ala Asp Lys Arg Val

245 250 255

Gly Ser Ser Arg Thr Ser Ser Val Phe Phe Leu Arg Pro Asn Gly Asp

260 265 270

Phe Arg Phe Ser Val Pro Arg Ala Arg Glu Cys Gly Phe Asp Val Ser

275 280 285

Ile Pro Ala Glu Thr Ala Thr Phe Asp Asp Trp Ile Gly Gly Asn Tyr

290 295 300

Ile Asn Ile Arg Lys Thr Ala Ala Ala Arg

305 310

<210> 23

<211> 323

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CefE of Gordonia rubripertincta (genbank PID ASR04298.1)

<400> 23

Met Thr Asp Ser Pro Ile Leu Thr Val Asp Leu Ser Arg Trp Arg Ala

1 5 10 15

Gly Gly Ala Asp Ala Ala Ala Val Cys Ala Ala Val Asp Glu Ser Leu

20 25 30

Gln Lys Ala Gly Phe Leu Leu Val Thr Gly His Gly Ile Asp Pro Val

35 40 45

Leu Pro Ala Glu Leu Arg Ala Ala Ala Arg Ala Phe Phe Ala Leu Pro

50 55 60

Ala Glu Val Lys Gln Lys Tyr Ala Val Gly Val Gly Gly Arg Gly Trp

65 70 75 80

Ile Gly Pro Gly Met Glu Ala Asn Ala Tyr Ala Glu Gly Thr Glu Thr

85 90 95

Pro Pro Asp Leu Lys Glu Thr Tyr Asn Ser Gly Ala Gln Thr Pro Val

100 105 110

Gly Val Pro Glu Val Asp Asp Tyr Trp Phe Ala Pro Asp Val Trp Pro

115 120 125

Ile Glu Ala Pro Arg Leu Lys Glu Leu Phe Thr Ala Trp Thr Ala Gln

130 135 140

Cys Lys Thr Leu Ser Asp Asp Leu Leu Ala Leu Met Ala Ala Ser Leu

145 150 155 160

Gly Phe Ala Ala Ala Asp Asn Pro Phe Arg Asp Leu Ala Gly Asn Ala

165 170 175

Thr Trp Thr Ser Asn Ile Asn His Tyr Pro Ala Met Ala Val Val Gly

180 185 190

Glu Pro Glu Pro Gly Gln Tyr Arg Ile Gly Pro His Thr Asp Phe Gly

195 200 205

Thr Val Thr Val Leu Asp Arg Glu Pro Gly Ser Gly Gly Leu Gln Val

210 215 220

Tyr Ser Glu Asp Gly Gly Trp Ala Asp Ala Pro Tyr Asp Pro Ala Ala

225 230 235 240

Leu Thr Val Asn Ile Gly Asp Leu Leu Glu Tyr Trp Ser Gly Gly Arg

245 250 255

Trp Pro Ala Gly Arg His Arg Val Leu Pro Pro Gln Pro Asp Ala Pro

260 265 270

Glu Glu Asp Leu Met Ser Leu Ile Phe Phe Tyr Glu Leu Asp His Asp

275 280 285

Ala Val Val Thr Pro Ile Gly Lys Pro Leu Gly Arg Arg Ala Gly Leu

290 295 300

Glu Pro Val Val Ser Gly Glu Phe Ile Arg Glu Arg Leu Asp Ala Ile

305 310 315 320

Thr Val Gly

<210> 24

<211> 136

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CefE of Mycobacterium abscessus (genbank PID SKX81615.1)

<400> 24

Met Thr Asp Ile Gly Glu Pro Glu Pro Gly Gln Tyr Arg Ile Gly Pro

1 5 10 15

His Thr Asp Phe Gly Thr Val Thr Ile Leu Asp Arg Glu Pro Gly Ala

20 25 30

Gly Gly Leu Gln Val Tyr Ser Glu Gln Gly Gly Trp Ala Asp Ala Pro

35 40 45

Tyr Asp Pro Ser Ala Leu Thr Val Asn Ile Gly Asp Leu Leu Glu Tyr

50 55 60

Trp Ser Gly Gly Arg Trp Pro Ala Gly Arg His Arg Val Leu Pro Pro

65 70 75 80

Gln Ala Asp Ala Pro Glu Glu Asp Leu Val Ser Leu Ile Phe Phe Tyr

85 90 95

Glu Leu Asp His Asp Ala Val Val Thr Pro Leu Asp Pro Pro Val Gly

100 105 110

Lys Ile Ala Gly Arg Pro Pro Val Ile Gly Gly Asp Phe Ile Arg Glu

115 120 125

Arg Leu Asp Ala Ile Thr Val Gly

130 135

<210> 25

<211> 357

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CefE of Microbacterium hydrocarbonoxydans (genbank PID

KJL46674.1)

<400> 25

Met Ala Leu Pro Pro Val Met Leu Arg Asn Thr Arg Val Ser Pro Arg

1 5 10 15

Met Arg Ile Tyr Ser Arg Val Met Ser Glu Leu Ser Leu Pro Ile Leu

20 25 30

Asp Leu Ser Gln Leu Asp Ala Gly Pro Glu Ala Ala Ala Arg Phe Arg

35 40 45

Asp Asp Leu Arg Ala Ala Thr His Asp Val Gly Phe Phe Tyr Leu Thr

50 55 60

Gly Thr Gly Val Ser Pro Glu Leu Glu Ala Arg Leu His Arg Ala Ala

65 70 75 80

Leu Asp Phe Phe Ala Leu Pro Glu Ala Glu Lys Leu Ala Ile Glu Asn

85 90 95

Ile Asn Ser Pro His Phe Arg Gly Tyr Thr Arg Val Gly Gly Glu Arg

100 105 110

Thr Gln Gly Glu Val Asp Trp Arg Glu Gln Ile Asp Ile Gly Pro Glu

115 120 125

Arg Asp Ala Val Asp Gly Gly Pro Ala Tyr Asn Arg Leu Ile Gly Pro

130 135 140

Asn Leu Trp Pro Ala Ala Gln Pro Glu Leu Lys Glu Val Val Ala Glu

145 150 155 160

Trp His Ser Thr Leu Ser Glu Val Ser Arg Arg Leu Leu Arg Ala Trp

165 170 175

Ala Glu Thr Leu Gly Ala Glu Pro Ser Tyr Phe Asp Glu His Phe Gly

180 185 190

Glu Pro Ser Thr Leu Ile Lys Ile Val Arg Tyr Pro Gly Thr His Glu

195 200 205

Pro Glu Pro Gln Gln Gly Val Gly Ala His Lys Asp Ser Gly Val Leu

210 215 220

Thr Leu Leu Trp Val Glu Pro Gly Lys Gly Gly Leu Gln Val Glu Arg

225 230 235 240

Asp Gly Thr Trp Val Asp Ala Pro Ser Val Pro Gly Ala Phe Val Val

245 250 255

Asn Ile Gly Glu Leu Leu Glu Tyr Ala Thr Gly Gly Tyr Leu Lys Ala

260 265 270

Thr Asn His Arg Val Val Ser Pro Lys Ala Pro Asp Glu Arg Ile Ser

275 280 285

Ile Pro Phe Phe Phe Asn Pro Ala Leu Asp Lys Arg Leu Pro Leu Ile

290 295 300

Glu Leu Pro Ala Pro Leu Ala Ala Glu Ala Thr Gly Val Thr Asp Asp

305 310 315 320

Pro Arg Asn Pro Ile His Ala Leu Tyr Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ser

325 330 335

Arg Leu Arg Ala His Pro Asp Val Ala Ala Ile His His Ala Asp Leu

340 345 350

Val Gly Ala Ser Ala

355

<210> 26

<211> 333

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CefE of Nannocystis exedens (genbank PID SFE71965.1)

<400> 26

Met Ser Ser Ala Ile Ile Ala Glu Ile Pro Val Ile Asp Leu Gly Pro

1 5 10 15

Phe Gly Asp Gly Asp Ala Pro Gly Ala Ala Glu Val Ala Ala Ala Phe

20 25 30

Asp Arg Ala Cys Arg Asp Leu Gly Phe Val Val Val Val Gly His Gly

35 40 45

Val Pro Gln Ala Val Ile Asp Ala Ala His Arg Ser Ala Arg Ala Phe

50 55 60

Phe Asp Leu Asp Leu Ala Thr Arg Glu Arg Tyr Ala Ala Pro Pro Gly

65 70 75 80

Gly Phe Val Gly Tyr Arg Gly Leu Gly Ala Glu Gly Leu Ser Tyr Ser

85 90 95

Leu Asp Gln Glu Ala Ala Pro Asp Phe Lys Glu Thr Tyr Thr Val Gly

100 105 110

Arg Ile Asp Arg Gly Asp Glu Pro Tyr Phe Thr Ser Gln Leu Gly Arg

115 120 125

Met Tyr Met Pro Asp Pro Thr Trp Pro Ala Glu Val Pro Glu Phe Ala

130 135 140

Ala Ser Trp Ala Glu Phe Tyr Arg Gln Met Asp Arg Val Ala Trp Arg

145 150 155 160

Leu Met Arg Ala Phe Ala Thr Ala Leu Ala Leu Pro Arg Glu Phe Phe

165 170 175

Asp Asp Lys Ile Asp Arg Asn Ile Ser Cys Leu Arg Ala Leu Asn Tyr

180 185 190

Pro His Pro Ser Thr Pro Pro Gln Pro Gly Gln Leu Arg Ala Gly Ala

195 200 205

His Thr Asp Tyr Gly Ser Leu Thr Leu Leu Ser Met Ala Asp Ala Pro

210 215 220

Gly Gly Leu Glu Val Gln Arg Asp Asp Gly Ser Trp Ala Pro Val Arg

225 230 235 240

Val Pro Ala Asp Ala Phe Val Met Asn Val Gly Asp Leu Met Ala Gln

245 250 255

Trp Thr Asn Asp Arg Trp Arg Ser Ser Met His Arg Val Thr Asn Pro

260 265 270

Pro Pro Asp Ala Ile Gly Asp Thr Arg Arg Gln Ser Leu Ala Phe Phe

275 280 285

His Gln Pro Asn Tyr Asp Ala Glu Val Ile Pro Leu Ala Ser Cys Cys

290 295 300

Gly Pro Ala Asn Pro Pro Lys Tyr Ala Arg Thr Thr Ser Gly Glu His

305 310 315 320

Leu Phe Met Lys Met Thr Lys Ala Lys Asn Leu Asn Val

325 330

<210> 27

<211> 337

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CefE of Pseudomonas syringae (genbank PID EPM68633.1)

<400> 27

Met Thr Leu Gln Tyr Val Pro Ile Ile Asn Leu Ala Pro Tyr Phe Ser

1 5 10 15

Gly Glu Pro Asp Gly Lys Ala Ala Val Ala Gln Ala Val Asn Gln Ala

20 25 30

Cys Lys Asp Ile Gly Phe Leu Val Ile Thr Glu His Gln Ile Pro Thr

35 40 45

Glu Leu Ile Asp Arg Val Ser Arg Leu Thr Arg Gln Phe Phe Asp Leu

50 55 60

Pro Leu Ala Glu Lys Arg Lys Val Asp Arg Pro Ser Pro Glu Met Val

65 70 75 80

Arg Gly Tyr Ser Ala Val Ala Glu Glu Ser Leu Ser Tyr Ser Leu Glu

85 90 95

Glu Ser Ala Pro Gly Asp Leu Lys Glu Ser Phe Ser Ile Gly Pro Ser

100 105 110

Asp Val Pro Asn Glu Asp Tyr Tyr His Asn Ala Glu Ala Gly Pro His

115 120 125

Phe Ala Pro Asn Val Trp Pro Ala Asn Glu Arg Val Pro Gly Phe Gln

130 135 140

Glu Ala Tyr Gln Ala Tyr Phe Gly Ala Met Ser Gln Leu Ala Gln Ser

145 150 155 160

Leu Met Arg Leu Phe Ala Leu Ala Leu Glu Leu Asp Glu Cys Phe Phe

165 170 175

Asp Asp Arg Ile Asp Arg His Ile Ser Met Phe Arg Ser Leu Ser Tyr

180 185 190

Pro Asp Ile Lys Thr Glu Val Glu Ala Gly Gln Leu Arg Ala Ser Ala

195 200 205

His Thr Asp Tyr Gly Ser Leu Thr Ile Val Arg Pro Asp Asn Ala Leu

210 215 220

Gly Gly Leu Gln Val Arg Asn Gln Gln Gly Glu Trp Val Asp Val Pro

225 230 235 240

Tyr Val Glu Asn Gly Phe Val Val Asn Ile Gly Asp Leu Met Met Gln

245 250 255

Trp Thr Asn Asp Gln Trp Ile Ser Thr Leu His Arg Val Val Asn Pro

260 265 270

Pro Met Thr Ser Glu Gln Asp Asn Arg Arg Gln Ser Leu Val Phe Phe

275 280 285

His Gln Pro Asn Tyr Asp Thr Leu Ile Glu Cys Leu Pro Gly Cys Leu

290 295 300

Leu Pro Gly Thr Thr Pro Arg His Ala Pro Val Thr Ser Gly Asp His

305 310 315 320

Leu Leu Ala Lys Phe Val Lys Gln Thr Thr Phe Gly Gly Ser Lys Val

325 330 335

Ala

<210> 28

<211> 311

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CefE of S. clavuligerus (genbank PID EDY47106.1)

<400> 28

Met Asp Thr Thr Val Pro Thr Phe Ser Leu Ala Glu Leu Gln Gln Gly

1 5 10 15

Leu His Gln Asp Glu Phe Arg Arg Cys Leu Arg Asp Lys Gly Leu Phe

20 25 30

Tyr Leu Thr Asp Cys Gly Leu Thr Asp Thr Glu Leu Lys Ser Ala Lys

35 40 45

Asp Ile Val Ile Asp Phe Phe Glu His Gly Ser Glu Ala Glu Lys Arg

50 55 60

Ala Val Thr Ser Pro Val Pro Thr Met Arg Arg Gly Phe Thr Gly Leu

65 70 75 80

Glu Ser Glu Ser Thr Ala Gln Ile Thr Asn Thr Gly Ser Tyr Ser Asp

85 90 95

Tyr Ser Met Cys Tyr Ser Met Gly Thr Ala Asp Asn Leu Phe Pro Ser

100 105 110

Gly Asp Phe Glu Arg Ile Trp Thr Gln Tyr Phe Asp Arg Gln Tyr Thr

115 120 125

Ala Ser Arg Ala Val Ala Arg Glu Val Leu Arg Ala Thr Gly Thr Glu

130 135 140

Pro Asp Gly Gly Val Glu Ala Phe Leu Asp Cys Glu Pro Leu Leu Arg

145 150 155 160

Phe Arg Tyr Phe Pro Gln Val Pro Glu His Arg Ser Ala Glu Glu Gln

165 170 175

Pro Leu Arg Met Ala Pro His Tyr Asp Leu Ser Met Val Thr Leu Ile

180 185 190

Gln Gln Thr Pro Cys Ala Asn Gly Phe Val Ser Leu Gln Ala Glu Val

195 200 205

Gly Gly Ala Phe Thr Asp Leu Pro Tyr Arg Pro Asp Ala Val Leu Val

210 215 220

Phe Cys Gly Ala Ile Ala Thr Leu Val Thr Gly Gly Gln Val Lys Ala

225 230 235 240

Pro Arg His His Val Ala Ala Pro Arg Arg Asp Gln Ile Ala Gly Ser

245 250 255

Ser Arg Thr Ser Ser Val Phe Phe Leu Arg Pro Asn Ala Asp Phe Thr

260 265 270

Phe Ser Val Pro Leu Ala Arg Glu Cys Gly Phe Asp Val Ser Leu Asp

275 280 285

Gly Glu Thr Ala Thr Phe Gln Asp Trp Ile Gly Gly Asn Tyr Val Asn

290 295 300

Ile Arg Arg Thr Ser Lys Ala

305 310

<210> 29

<211> 357

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CefE of Sphingomonas dokdonensis (genbank PID OWK28829.1)

<400> 29

Met His Arg Ala Gly Gly Ser Gly Leu Val Pro Ser Gly Arg Ile Ala

1 5 10 15

Gly Tyr Trp Arg Cys Glu Arg Pro Trp Arg Met Gln Arg Arg Ser Arg

20 25 30

Cys Ser Thr Lys Ala Leu Val Met Leu Asp Thr Pro Leu Ala Lys Val

35 40 45

Pro Thr Leu Ser Leu Ala Asp Gln Ala Val Asp Pro Asp Arg Phe Ala

50 55 60

Ala Asp Leu Gly Gly Ser Phe Arg Arg Phe Gly Phe Ala Ile Val Ala

65 70 75 80

Asp His Gly Ile Pro Asp Asp Leu Ile Ala Arg Ala Trp Ala Gln Thr

85 90 95

Glu Ala Leu Phe Ala Gln Pro Asp Ala Asp Lys Arg Gly Tyr Tyr Val

100 105 110

Glu Gly Ala Gly Gly Ala Arg Gly Tyr Thr Pro Phe Lys Thr Glu Ile

115 120 125

Ala Lys Asp Ala Lys His Val Asp Leu Lys Glu Phe Trp His Val Gly

130 135 140

Arg Glu Leu Pro Thr Gly His Arg Tyr Ala Gly Glu Met Ala Pro Asn

145 150 155 160

Ile Trp Pro Ala Gln Pro Asp Gly Phe Lys Glu Thr Phe Val Glu Leu

165 170 175

Phe Arg Ala Phe Asp Thr Ala Gly Asp Lys Leu Leu Ser Ala Ile Ala

180 185 190

Arg Asp Leu Gly Leu Ala Pro Asp Trp Phe Asp Leu Ala Val Lys Asp

195 200 205

Gly Asn Ser Val Leu Arg Leu Leu His Tyr Pro Pro Ile Pro Met Asp

210 215 220

Ala Glu Gly Val Arg Ala Gly Ala His Glu Asp Ile Asn Leu Ile Thr

225 230 235 240

Leu Leu Leu Gly Ala Glu Glu Ala Gly Leu Glu Leu Leu Asp Arg Asp

245 250 255

Ser Gly Asn Trp Leu Ala Ile Lys Pro Pro Glu Gly Ala Met Val Val

260 265 270

Asn Val Gly Asp Met Leu Gln Arg Leu Thr Asn His Val Leu Pro Ser

275 280 285

Thr Thr His Arg Val Val Asn Pro Pro Pro Glu Arg Arg Ala His Ser

290 295 300

Arg Tyr Ser Met Pro Phe Phe Leu His Pro Ala Pro Asp Phe Leu Ile

305 310 315 320

Lys Thr Leu Pro Gln Thr Val Thr Ser Ser Asn Pro Asn Arg Tyr Pro

325 330 335

Thr Pro Ile Thr Ala His Asp Tyr Leu His Glu Arg Leu Val Glu Ile

340 345 350

Gly Leu Ile Lys Lys

355

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EFGLB-F

<400> 30

gagtagtttg gccttgatgg gacg 24

<210> 31

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EFGLB-R

<400> 31

ccctttagtg agggttaatt gctatggagg tgtcagcctg cc 42

<210> 32

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EFGRB-F

<400> 32

gccctatagt gagtcgtatt accgccgatc gagtaataaa tctacg 46

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EFGRB-R

<400> 33

gtgcttctcg gttcagtgag tcgg 24

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> T3

<400> 34

aattaaccct cactaaaggg 20

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> T7

<400> 35

taatacgact cactataggg c 21

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Gout (patent)

<400> 36

cgatgtagga ggttgacggt gc 22

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pgpdup (patent)

<400> 37

cgataagggc cagttccgcc 20

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Gdown (patent)

<400> 38

ggtaccaggc ccagaagttt gc 22

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E1-F

<400> 39

cgcttgagca gacatcacca tgaccgacgc caccgtgcc 39

<210> 40

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E1-R

<400> 40

gctaagcttt tatcagcggg cggcggc 27

<210> 41

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E2-F

<400> 41

cgcttgagca gacatcacca tgaccgacag cccgatct 38

<210> 42

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E2-R

<400> 42

gctaagcttt tatcagccga cggtgatcg 29

<210> 43

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E3-F

<400> 43

cgcttgagca gacatcacca tgacggacat cggtgaac 38

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E3-R

<400> 44

gctaagcttt tatcagccga cggttatggc 30

<210> 45

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E4-F

<400> 45

cgcttgagca gacatcacca tggccctgcc gcccgtcatg c 41

<210> 46

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E4-R

<400> 46

gctaagcttt tatcacgcgc tcgcgcct 28

<210> 47

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E5-F

<400> 47

cgcttgagca gacatcacca tgtcaagcgc catcatcgcc 40

<210> 48

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E5-R

<400> 48

gctaagcttt tatcagacgt tcaggttctt cgccttg 37

<210> 49

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E6-F

<400> 49

cgcttgagca gacatcacca tgaccctcca gtacgtccc 39

<210> 50

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E6-R

<400> 50

gctaagcttt tatcaggcga ccttggacc 29

<210> 51

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E7-F

<400> 51

cgcttgagca gacatcacca tggacaccac cgtgccgac 39

<210> 52

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E7-R

<400> 52

gctaagcttt tactacgcct tcgaggtccg ccg 33

<210> 53

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E8-F

<400> 53

cgcttgagca gacatcacca tgcatcgcgc gggcggc 37

<210> 54

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> E8-R

<400> 54

gctaagcttt tatcacttct tgatgagac 29

<210> 55

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PEP3-F

<400> 55

gcaactagtg cggccgccct tgtatctcta cacacaggc 39

<210> 56

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PEP3-R

<400> 56

ggtgatgtct gctcaagcg 19

<210> 57

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TtC-F

<400> 57

cgactcgaga cttaacgtta ctgaaatcat caaacagc 38

<210> 58

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TtC-R

<400> 58

gcaggtacca tcgagtggag atgtggagtg gg 32

<210> 59

<211> 3717

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pB-TtrpC

<400> 59

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 180

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 240

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 300

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 360

tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 420

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 480

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 540

caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 600

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 660

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 720

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 780

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 840

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 900

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 960

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1020

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 1080

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 1140

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 1200

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 1260

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 1320

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 1380

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 1440

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 1500

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 1560

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 1620

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1680

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 1740

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 1800

ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 1860

agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 1920

aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 1980

gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg 2040

tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt 2100

tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg 2160

ccaagcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg 2220

gccgctctag aactagtgga tcccccgggc tgcaggaatt cgatatcaag cttatcgata 2280

ccgtcgacct cgagacttaa cgttactgaa atcatcaaac agcttgacga atctggatat 2340

aagatcgttg gtgtcgatgt cagctccgga gttgagacaa atggtgttca ggatctcgat 2400

aagatacgtt catttgtcca agcagcaaag agtgccttct agtgatttaa tagctccatg 2460

tcaacaagaa taaaacgcgt tttcgggttt acctcttcca gatacagctc atctgcaatg 2520

cattaatgca ttgactgcaa cctagtaacg cctttcaggc tccggcgaag agaagaatag 2580

cttagcagag ctattttcat tttcgggaga cgagatcaag cagatcaacg gtcgtcaaga 2640

gacctacgag actgaggaat ccgctcttgg ctccacgcga ctatatattt gtctctaatt 2700

gtactttgac atgctcctct tctttactct gatagcttga ctatgaaaat tccgtcacca 2760

gcccctgggt tcgcaaagat aattgcatgt ttcttccttg aactctcaag cctacaggac 2820

acacattcat cgtaggtata aacctcgaaa tcagttccta ctaagatggt atacaatagt 2880

aaccatgcat ggttgcctag tgaatgctcc gtaacaccca atacgccggc cgaaactttt 2940

ttacaactct cctatgagtc gtttacccag aatgcacagg tacacttgtt tagaggtaat 3000

ccttctttct agaagtcctc gtgtactgtg taagcgccca ctccacatct ccactcgatg 3060

gtacccaatt cgccctatag tgagtcgtat tacgcgcgct cactggccgt cgttttacaa 3120

cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct 3180

ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc 3240

agcctgaatg gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg 3300

gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc 3360

ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc 3420

cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt 3480

gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag 3540

tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg 3600

gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag 3660

ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgcttac aatttag 3717

<210> 60

<211> 6930

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pB-E1cast

<400> 60

attcttcgac tctgtattat agataagatg atgaggaatt ggaggtagca tagcttcatt 60

tggatttgct ttccaggctg agactctagc ttggagcata gagggtcctt tggctttcaa 120

tattctcaag tatctcgagt ttgaacttat tccctgtgaa ccttttattc accaatgagc 180

attggaatga acatgaatct gaggactgca atcgccatga ggttttcgaa atacatccgg 240

atgtcgaagg cttggggcac ctgcgttggt tgaatttaga acgtggcact attgatcatc 300

cgatagctct gcaaagggcg ttgcacaatg caagtcaaac gttgctagca gttccaggtg 360

gaatgttatg atgagcattg tattaaatca ggagatatag catgatctct agttagctca 420

ccacaaaagt cagacggcgt aaccaaaagt cacacaacac aagctgtaag gatttcggca 480

cggctacgga agacggagaa gccaccttca gtggactcga gtaccattta attctatttg 540

tgtttgatcg agacctaata cagcccctac aacgaccatc aaagtcgtat agctaccagt 600

gaggaagtgg actcaaatcg acttcagcaa catctcctgg ataaacttta agcctaaact 660

atacagaata agataggtgg agagcttata ccgagctccc aaatctgtcc agatcatggt 720

tgaccggtgc ctggatcttc ctatagaatc atccttattc gttgacctag ctgattctgg 780

agtgacccag agggtcatga cttgagccta aaatccgccg cctccaccat ttgtagaaaa 840

atgtgacgaa ctcgtgagct ctgtacagtg accggtgact ctttctggca tgcggagaga 900

cggacggacg cagagagaag ggctgagtaa taagccactg gccagacagc tctggcggct 960

ctgaggtgca gtggatgatt attaatccgg gaccggccgc ccctccgccc cgaagtggaa 1020

aggctggtgt gcccctcgtt gaccaagaat ctattgcatc atcggagaat atggagcttc 1080

atcgaatcac cggcagtaag cgaaggagaa tgtgaagcca ggggtgtata gccgtcggcg 1140

aaatagcatg ccattaacct aggtacagaa gtccaattgc ttccgatctg gtaaaagatt 1200

cacgagatag taccttctcc gaagtaggta gagcgagtac ccggcgcgta agctccctaa 1260

ttggcgaatt cccatccggc atctgtaggg cgtccaaata tcgtgcctct cctgctttgc 1320

caggtgtatg aaaccggaaa ggccgctcag gagctggcca gcggcgcaga ccgggaacac 1380

aagctggcag tcgacccatc cggtgctctg cactcgacct gctgaggtcc ctcagtccct 1440

ggtaggcagc tttgccccgt ctgtccgccc ggtgtgtcgg cggggttgac aaggtcgttg 1500

cgtcagtcca acatttgttg ccatattttc ctgctttccc caccagctgc tcttttcttt 1560

tctctttctt ttcccatctt cagtatattc atcttcccat atgcatccaa gaacctttat 1620

ttcccctaag taagtacttt gctacatcca tactccatcc ttcccatccc ttattccttt 1680

gaacctttca gttcgagctt tcccacttca tcgcagcttg actaacagct accccgcttg 1740

agcagacatc accatgaccg acgccaccgt gcccaccttc gacctggccg agctccggga 1800

gggtctgcac caggaggagt tcaggcattg cctccgcgaa aagggtgtct tctacctgaa 1860

gggcaccggc ctgcccgccg aggccgacca cgcatccggg cgggagatcg cggtggactt 1920

cttcgaccac ggcaccgagg ccgagaagaa ggcggtgatg acgcccatcc ctaccatccg 1980

ccggggctac gcgggcctgg agagcgagtc caccgcgcag atcacgaaca ccggcaagta 2040

caccgactac tccatgtcct attcgatggg taccgcggac aacctcttcc ccagcgccga 2100

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<220>

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gccgcccttg tatctctaca cacaggctca aatcaataag aagaacggtt cgtctttttc 2280

gtttatatct tgcatcgtcc caaagctatt ggcgggatat tctgtttgca gttggctgac 2340

ttgaagtaat ctctgcagat ctttcgacac tgaaatacgt cgagcctgct ccgcttggaa 2400

gcggcgagga gcctcgtcct gtcacaacta ccaacatgga gtacgataag ggccagttcc 2460

gccagctcat taagagccag ttcatgggcg ttggcatgat ggccgtcatg catctgtact 2520

tcaagtacac caacgctctt ctgatccagt cgatcatccg ctgaaggcgc tttcgaatct 2580

ggttaagatc cacgtcttcg ggaagccagc gactggtgac ctccagcgtc cctttaaggc 2640

tgccaacagc tttctcagcc agggccagcc caagaccgac aaggcctccc tccagaacgc 2700

cgagaagaac tggaggggtg gtgtcaagga ggagtaagct ccttattgaa gtcggaggac 2760

ggagcggtgt caagaggata ttcttcgact ctgtattata gataagatga tgaggaattg 2820

gaggtagcat agcttcattt ggatttgctt tccaggctga gactctagct tggagcatag 2880

agggtccttt ggctttcaat attctcaagt atctcgagtt tgaacttatt ccctgtgaac 2940

cttttattca ccaatgagca ttggaatgaa catgaatctg aggactgcaa tcgccatgag 3000

gttttcgaaa tacatccgga tgtcgaaggc ttggggcacc tgcgttggtt gaatttagaa 3060

cgtggcacta ttgatcatcc gatagctctg caaagggcgt tgcacaatgc aagtcaaacg 3120

ttgctagcag ttccaggtgg aatgttatga tgagcattgt attaaatcag gagatatagc 3180

atgatctcta gttagctcac cacaaaagtc agacggcgta accaaaagtc acacaacaca 3240

agctgtaagg atttcggcac ggctacggaa gacggagaag ccaccttcag tggactcgag 3300

taccatttaa ttctatttgt gtttgatcga gacctaatac agcccctaca acgaccatca 3360

aagtcgtata gctaccagtg aggaagtgga ctcaaatcga cttcagcaac atctcctgga 3420

taaactttaa gcctaaacta tacagaataa gataggtgga gagcttatac cgagctccca 3480

aatctgtcca gatcatggtt gaccggtgcc tggatcttcc tatagaatca tccttattcg 3540

ttgacctagc tgattctgga gtgacccaga gggtcatgac ttgagcctaa aatccgccgc 3600

ctccaccatt tgtagaaaaa tgtgacgaac tcgtgagctc tgtacagtga ccggtgactc 3660

tttctggcat gcggagagac ggacggacgc agagagaagg gctgagtaat aagccactgg 3720

ccagacagct ctggcggctc tgaggtgcag tggatgatta ttaatccggg accggccgcc 3780

cctccgcccc gaagtggaaa ggctggtgtg cccctcgttg accaagaatc tattgcatca 3840

tcggagaata tggagcttca tcgaatcacc ggcagtaagc gaaggagaat gtgaagccag 3900

gggtgtatag ccgtcggcga aatagcatgc cattaaccta ggtacagaag tccaattgct 3960

tccgatctgg taaaagattc acgagatagt accttctccg aagtaggtag agcgagtacc 4020

cggcgcgtaa gctccctaat tggcgaattc ccatccggca tctgtagggc gtccaaatat 4080

cgtgcctctc ctgctttgcc aggtgtatga aaccggaaag gccgctcagg agctggccag 4140

cggcgcagac cgggaacaca agctggcagt cgacccatcc ggtgctctgc actcgacctg 4200

ctgaggtccc tcagtccctg gtaggcagct ttgccccgtc tgtccgcccg gtgtgtcggc 4260

ggggttgaca aggtcgttgc gtcagtccaa catttgttgc catattttcc tgctttcccc 4320

accagctgct cttttctttt ctctttcttt tcccatcttc agtatattca tcttcccata 4380

tgcatccaag aacctttatt tcccctaagt aagtactttg ctacatccat actccatcct 4440

tcccatccct tattcctttg aacctttcag ttcgagcttt cccacttcat cgcagcttga 4500

ctaacagcta ccccgcttga gcagacatca ccatggacac caccgtgccg accttctccc 4560

tcgccgagct ccagcagggt ctgcaccagg acgagttccg gcggtgtctg cgcgacaagg 4620

ggctgttcta cctgaccgac tgcggcctaa cagacacgga gctcaagtcc gccaaggata 4680

tcgtcatcga ctttttcgag cacgggagcg aggccgagaa gcgggcggtc accagccccg 4740

tcccgacgat gcgccgcggc ttcaccggtc tggagtccga gtcgaccgcc caaatcacca 4800

acaccggatc ctactccgac tacagcatgt gttactccat ggggacggcc gacaacctct 4860

tcccctccgg ggatttcgag cgcatctgga cccagtactt cgaccgccag tacaccgcca 4920

gcagggccgt ggccagggag gtcctgcgcg ccaccgggac ggaaccggac ggcggggtgg 4980

aggccttcct ggactgcgaa ccgcttctgc ggttccggta cttcccccag gtccccgagc 5040

atcggtccgc cgaggagcag ccgctccgga tggcccccca ctacgacctg tccatggtga 5100

ccctcatcca gcagaccccg tgcgcaaacg ggttcgtgtc gctccaggcc gaggtgggcg 5160

gcgcgttcac agacctccct taccgacccg acgcggtgtt ggtcttctgc ggcgccatcg 5220

ccaccctcgt gacgggcggc caggtcaagg ccccccggca ccacgtggcc gccccgcggc 5280

gtgaccagat cgccggaagc agccgcacgt cgtccgtgtt cttcctgcgc ccgaacgcgg 5340

acttcacatt ctccgtcccc ctcgcgcggg agtgcggctt cgacgtctcc ctggacgggg 5400

agaccgccac gttccaggac tggatcggcg gcaactacgt caacatccgg cggacctcga 5460

aggcgtagta aaagcttatc gataccgtcg acctcgagac ttaacgttac tgaaatcatc 5520

aaacagcttg acgaatctgg atataagatc gttggtgtcg atgtcagctc cggagttgag 5580

acaaatggtg ttcaggatct cgataagata cgttcatttg tccaagcagc aaagagtgcc 5640

ttctagtgat ttaatagctc catgtcaaca agaataaaac gcgttttcgg gtttacctct 5700

tccagataca gctcatctgc aatgcattaa tgcattgact gcaacctagt aacgcctttc 5760

aggctccggc gaagagaaga atagcttagc agagctattt tcattttcgg gagacgagat 5820

caagcagatc aacggtcgtc aagagaccta cgagactgag gaatccgctc ttggctccac 5880

gcgactatat atttgtctct aattgtactt tgacatgctc ctcttcttta ctctgatagc 5940

ttgactatga aaattccgtc accagcccct gggttcgcaa agataattgc atgtttcttc 6000

cttgaactct caagcctaca ggacacacat tcatcgtagg tataaacctc gaaatcagtt 6060

cctactaaga tggtatacaa tagtaaccat gcatggttgc ctagtgaatg ctccgtaaca 6120

cccaatacgc cggccgaaac ttttttacaa ctctcctatg agtcgtttac ccagaatgca 6180

caggtacact tgtttagagg taatccttct ttctagaagt cctcgtgtac tgtgtaagcg 6240

cccactccac atctccactc gatggtaccc aattcgccct atagtgagtc gtattacgcg 6300

cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt 6360

aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc 6420

gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc 6480

gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc 6540

ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc 6600

cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc 6660

gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg 6720

gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact 6780

ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt 6840

tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa 6900

atattaacgc ttacaattta g 6921

<210> 67

<211> 7059

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pB-E8cast

<400> 67

gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 60

caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 120

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 180

gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 240

tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 300

ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 360

tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 420

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 480

gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 540

caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 600

ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 660

ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 720

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 780

ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 840

gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 900

ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 960

taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1020

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 1080

atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 1140

aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 1200

caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 1260

ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 1320

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa 1380

tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa 1440

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 1500

ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa 1560

gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 1620

caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 1680

ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 1740

tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 1800

ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg 1860

agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 1920

aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 1980

gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg 2040

tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt 2100

tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg 2160

ccaagcgcgc aattaaccct cactaaaggg aacaaaagct ggagctccac cgcggtggcg 2220

gccgcccttg tatctctaca cacaggctca aatcaataag aagaacggtt cgtctttttc 2280

gtttatatct tgcatcgtcc caaagctatt ggcgggatat tctgtttgca gttggctgac 2340

ttgaagtaat ctctgcagat ctttcgacac tgaaatacgt cgagcctgct ccgcttggaa 2400

gcggcgagga gcctcgtcct gtcacaacta ccaacatgga gtacgataag ggccagttcc 2460

gccagctcat taagagccag ttcatgggcg ttggcatgat ggccgtcatg catctgtact 2520

tcaagtacac caacgctctt ctgatccagt cgatcatccg ctgaaggcgc tttcgaatct 2580

ggttaagatc cacgtcttcg ggaagccagc gactggtgac ctccagcgtc cctttaaggc 2640

tgccaacagc tttctcagcc agggccagcc caagaccgac aaggcctccc tccagaacgc 2700

cgagaagaac tggaggggtg gtgtcaagga ggagtaagct ccttattgaa gtcggaggac 2760

ggagcggtgt caagaggata ttcttcgact ctgtattata gataagatga tgaggaattg 2820

gaggtagcat agcttcattt ggatttgctt tccaggctga gactctagct tggagcatag 2880

agggtccttt ggctttcaat attctcaagt atctcgagtt tgaacttatt ccctgtgaac 2940

cttttattca ccaatgagca ttggaatgaa catgaatctg aggactgcaa tcgccatgag 3000

gttttcgaaa tacatccgga tgtcgaaggc ttggggcacc tgcgttggtt gaatttagaa 3060

cgtggcacta ttgatcatcc gatagctctg caaagggcgt tgcacaatgc aagtcaaacg 3120

ttgctagcag ttccaggtgg aatgttatga tgagcattgt attaaatcag gagatatagc 3180

atgatctcta gttagctcac cacaaaagtc agacggcgta accaaaagtc acacaacaca 3240

agctgtaagg atttcggcac ggctacggaa gacggagaag ccaccttcag tggactcgag 3300

taccatttaa ttctatttgt gtttgatcga gacctaatac agcccctaca acgaccatca 3360

aagtcgtata gctaccagtg aggaagtgga ctcaaatcga cttcagcaac atctcctgga 3420

taaactttaa gcctaaacta tacagaataa gataggtgga gagcttatac cgagctccca 3480

aatctgtcca gatcatggtt gaccggtgcc tggatcttcc tatagaatca tccttattcg 3540

ttgacctagc tgattctgga gtgacccaga gggtcatgac ttgagcctaa aatccgccgc 3600

ctccaccatt tgtagaaaaa tgtgacgaac tcgtgagctc tgtacagtga ccggtgactc 3660

tttctggcat gcggagagac ggacggacgc agagagaagg gctgagtaat aagccactgg 3720

ccagacagct ctggcggctc tgaggtgcag tggatgatta ttaatccggg accggccgcc 3780

cctccgcccc gaagtggaaa ggctggtgtg cccctcgttg accaagaatc tattgcatca 3840

tcggagaata tggagcttca tcgaatcacc ggcagtaagc gaaggagaat gtgaagccag 3900

gggtgtatag ccgtcggcga aatagcatgc cattaaccta ggtacagaag tccaattgct 3960

tccgatctgg taaaagattc acgagatagt accttctccg aagtaggtag agcgagtacc 4020

cggcgcgtaa gctccctaat tggcgaattc ccatccggca tctgtagggc gtccaaatat 4080

cgtgcctctc ctgctttgcc aggtgtatga aaccggaaag gccgctcagg agctggccag 4140

cggcgcagac cgggaacaca agctggcagt cgacccatcc ggtgctctgc actcgacctg 4200

ctgaggtccc tcagtccctg gtaggcagct ttgccccgtc tgtccgcccg gtgtgtcggc 4260

ggggttgaca aggtcgttgc gtcagtccaa catttgttgc catattttcc tgctttcccc 4320

accagctgct cttttctttt ctctttcttt tcccatcttc agtatattca tcttcccata 4380

tgcatccaag aacctttatt tcccctaagt aagtactttg ctacatccat actccatcct 4440

tcccatccct tattcctttg aacctttcag ttcgagcttt cccacttcat cgcagcttga 4500

ctaacagcta ccccgcttga gcagacatca ccatgcatcg cgcgggcggc agcgggctcg 4560

tccccagtgg ccgcatcgcc ggctattggc gatgcgagcg gccctggcgc atgcagcgcc 4620

gatcccgctg ctcgaccaag gccctggtga tgctggacac ccccctggcg aaggtgccga 4680

ccctcagtct cgcagaccag gcagtcgatc ccgaccgctt cgccgccgac ctgggcggtt 4740

cgttcaggcg gttcggcttc gccatcgtcg cggaccatgg catcccggac gacctcatcg 4800

cccgggcctg ggcgcagacc gaggccctgt tcgcccagcc ggacgccgac aagcggggct 4860

actacgtgga aggcgcgggc ggggcccgcg gctacacccc gttcaagacc gagatcgcga 4920

aggacgccaa gcacgtcgac ctgaaggagt tctggcacgt ggggcgagag ctgcccacgg 4980

gccaccggta cgcgggtgag atggccccga acatctggcc cgcccagccc gatggcttca 5040

aggagacctt cgtcgagctg ttccgcgctt tcgacacggc gggcgacaag ctcctgagcg 5100

ccatcgcccg ggacctcggg ctggcgccgg actggttcga cctggcggtc aaggacggca 5160

actccgtcct ccgcctgctg cactaccccc cgatcccgat ggacgcggag ggcgtccgcg 5220

cgggagccca tgaggacatc aacctgatca cccttctcct gggtgccgag gaggctggac 5280

tggagctgct cgaccgcgac agcgggaatt ggctggccat caagcccccg gagggcgcga 5340

tggtagtgaa cgtcggggac atgctgcagc ggttgaccaa ccacgtcctg ccgtccacca 5400

cccaccgcgt cgtcaatccg cccccggagc gccgggccca ctcccgctac agcatgccct 5460

tctttctgca cccggccccc gacttcctga tcaagaccct gccccagacc gtcacctcct 5520

ccaacccgaa ccggtacccc accccgatca cggcgcacga ctacctccat gagcggcttg 5580

tggagatcgg tctcatcaag aagtgataaa agcttatcga taccgtcgac ctcgagactt 5640

aacgttactg aaatcatcaa acagcttgac gaatctggat ataagatcgt tggtgtcgat 5700

gtcagctccg gagttgagac aaatggtgtt caggatctcg ataagatacg ttcatttgtc 5760

caagcagcaa agagtgcctt ctagtgattt aatagctcca tgtcaacaag aataaaacgc 5820

gttttcgggt ttacctcttc cagatacagc tcatctgcaa tgcattaatg cattgactgc 5880

aacctagtaa cgcctttcag gctccggcga agagaagaat agcttagcag agctattttc 5940

attttcggga gacgagatca agcagatcaa cggtcgtcaa gagacctacg agactgagga 6000

atccgctctt ggctccacgc gactatatat ttgtctctaa ttgtactttg acatgctcct 6060

cttctttact ctgatagctt gactatgaaa attccgtcac cagcccctgg gttcgcaaag 6120

ataattgcat gtttcttcct tgaactctca agcctacagg acacacattc atcgtaggta 6180

taaacctcga aatcagttcc tactaagatg gtatacaata gtaaccatgc atggttgcct 6240

agtgaatgct ccgtaacacc caatacgccg gccgaaactt ttttacaact ctcctatgag 6300

tcgtttaccc agaatgcaca ggtacacttg tttagaggta atccttcttt ctagaagtcc 6360

tcgtgtactg tgtaagcgcc cactccacat ctccactcga tggtacccaa ttcgccctat 6420

agtgagtcgt attacgcgcg ctcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac 6480

cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 6540

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 6600

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 6660

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 6720

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 6780

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 6840

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 6900

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 6960

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 7020

aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttag 7059

Claims (15)

1.一种制备高产脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)菌株的方法，其包含：

(a)制备高产头孢菌素C(CPC)的顶头孢霉菌株；

(b)删除所述菌株的CefEF和CefG基因；以及

(c)用包含微生物的CefE基因序列的表达载体转化步骤(b)的所述菌株，所述微生物选自：内酰胺拟无枝菌酸(Amycolatopsis lactamdurans)、暗红戈登氏菌(Gordoniarubripertincta)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、氧化烃微杆菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans)、侵蚀侏囊菌(Nannocystis exedens)、丁香假单胞菌(Pseudomonas synringae)、棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)和独岛鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas dokdonensis)。

2.一种制备高产脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的顶头孢霉菌株的方法，其包含：

(a1)制备高产头孢菌素C(CPC)的顶头孢霉菌株；

(b1)删除所述菌株的CefEF和CefG基因；

(c1)用包含两种或更多种微生物的CefE基因序列的各表达载体转化步骤(b1)的所述菌株，所述微生物选自：内酰胺拟无枝菌酸、暗红戈登氏菌、脓肿分枝杆菌、氧化烃微杆菌、侵蚀侏囊菌、丁香假单胞菌、棒状链霉菌和独岛鞘氨醇单胞菌；以及

(d1)对每种转化菌株进行原生质体融合。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述CefE基因由选自SEQ ID NO：1至8的核苷酸序列组成。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(a)或步骤(a1)的所述高产CPC的顶头孢霉菌株是保藏号为KCTC13079BP的菌株。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(b)或步骤(b1)中所述CefEF和CefG基因缺陷型高产CPC的顶头孢霉菌株是保藏号为KCTC 13922BP的菌株。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(c)或步骤(c1)中所述CefE与由选自SEQID NO：9至13的核苷酸序列组成的启动子可操作地连接。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述表达载体由选自SEQ ID NO：14至21的核苷酸序列组成。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述高产DAOC的顶头孢霉菌株的DAOC生产能力为30g/L或更多。

9.根据权利要求1或2所述的方法制备的顶头孢霉菌株。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述菌株的DAOC生产能力为30g/L或更多。

11.一种生产脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的方法，其包含：

(i)在能够产生DAOC的条件培养权利要求9所述的菌株；以及

(ii)从所述培养基中回收DAOC。

12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤(i)中的所述培养为发酵培养。

13.一种用于在顶头孢霉菌株中高表达脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的多核苷酸，其由选自SEQ ID NO：1至8的核苷酸序列组成。

14.一种用于在顶头孢霉菌株中高表达脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的表达载体，其由选自SEQ ID NO：14至21的核苷酸序列组成。

15.一种生产7-氨基脱乙酰氧基头孢菌酸(7-ADCA)的方法，其包含：

(I)在能够产生脱乙氧基头孢菌素C(DAOC)的条件培养权利要求9所述的菌株；

(II)从培养基中回收DAOC；以及

(III)用头孢菌素C(CPC)酰基转移酶处理所述回收的DAOC。

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