KR20160004642A - 산물 생산능이 향상된 효모 및 그를 이용한 산물을 생산하는 방법 - Google Patents

산물 생산능이 향상된 효모 및 그를 이용한 산물을 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

증가된 속도로 포도당을 소비할 수 있는 효모 세포 및 상기 효모 세포를 이용하여 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물을 효율적으로 생산하는 하는 방법을 제공한다.

Description

산물 생산능이 향상된 효모 및 그를 이용한 산물을 생산하는 방법{Yeast having a improved product productivity and method of producint the product}
증가된 속도로 포도당을 소비할 수 있는 효모 세포 및 상기 효모 세포를 이용하여 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물을 효율적으로 생산하는 하는 방법에 관한 것이다.
유기산 및 알콜과 같은 산물은 식품 및 의약품 및 화학 산업에서 빌딩 블록 물질 (building block material)로서 널리 사용되고 있다. 이들 물질은 석유로부터 생산하는 것이 알려져 있으나, 환경친화적인 미생물을 사용하여 생산하는 방법이 연구되고 있다.
미생물을 사용하여 산물을 생산하는 방법은 발효 기간이 길고 산물을 분리하는데 많은 비용이 소요될 수 있다. 따라서, 상기 미생물은 효모를 포함할 수 있다. 미새물을 사용한 산물을 생산하는 방법에 있어서, 미생물의 산물 생산성을 향상시키는 것이 요구되고 있다.
실제로, 생산성 (productivity)을 증가시키기 위한 많은 접근법은 산 스트레스와 같은 생산 환경이 생산성을 한정한다는 가정에 의존한다. 균주 개발의 다른 중점 사항은, 산물 형성에 관련된 효소 활성이 증진된다는 의미에서, 산물 형성 자체 (product formation itself)에 관한 것이다. 일반적으로 증진된 효소 활성의 예는, 산물의 생산을 위하여 필요한 중간체 (intermediates)를 제공하는 해당과정과 같은 중심 대사경로를 포함할 수 있다.
따라서, 산물 생산능이 증가된 효모 및 그를 이용한 산물 생산 방법이 여전히 요구되고 있다.
일 양상은 증가된 속도로 포도당을 소비할 수 있는 효모 세포를 제공한다.
다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물을 효율적으로 생산하는 하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 효소 또는 폴리펩티드 또는 단백질의 "활성 증가" 또는 "증가된 활성"은 효소 또는 폴리펩티드 또는 단백질이 활성을 나타낼 수 있도록 충분한 정도로 증가된 것일 수 있으며, 세포 또는 단리된 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 폴리펩티드에서 측정된 활성 수준과 비교하여 높은 활성 수준을 나타냄을 의미한다. 즉 해당 폴리펩티드의 활성이 본래 조작되지 않은 폴리펩티드에 의한 동일한 생화학적 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 증가된 활성을 갖는 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
폴리펩티드의 활성 증가는 폴리펩티드의 발현증가 또는 비활성 (specific activity)의 증가에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 발현 증가는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 세포 내 카피 수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 숙주 세포 게놈으로 도입 (integration)되는 등의 숙주 세포 내로 유전자가 도입되는 것을 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다.
용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
용어 "유전자 (gene)"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열 (5'-non coding 서열)과 3'-비코딩 서열 (3'-non coding 서열) 등의 조절 (regulatory) 서열을 포함할 수 있다. 상기 조절 영역은 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터, 리보좀 결합 부위, polyA 결합 서열, 터미네이터 영역 등을 포함할 수 있다.
"이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미한다.
"분비 (secretion)"는 물질이 세포 내부에서 주변세포질공간 (periplasmic space)이나 세포 외 환경으로 이동되는 것을 의미한다.
본 명세서에 언급된 "유기산 (organic acid)"은, 중성 형태의 유기산뿐만 아니라, 음전하 형태의 유기산, 및 그 염을 포함하며 이들 서로 교환가능하게 사용될 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 피루브산, TCA 회로의 중간 산물, 예를 들면, 시트르산, 이탄콘산, 이소시트르산, 옥살로숙신산, 알파-케토글루타르산, 숙신산, 숙신일-CoA, 푸마르산, 말레산, 또는 옥살로아세트산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 아세트산은 아세테이트 또는 그의 염과 교환가능하게 사용된다.
효소 또는 폴리펩티드의 "활성의 감소" 또는 "감소된 활성"은 세포 또는 단리된 효소 또는 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 폴리펩티드에서 측정된 활성 수준과 비교하여 낮은 활성 수준을 나타내거나 활성을 나타내지 않는 것을 의미한다. 즉 해당 폴리펩티드의 활성이 본래 조작되지 않은 폴리펩티드에 의한 동일한 생화학적 활성보다 약 10%이상, 약 20%이상, 약 30%이상, 약 40%이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 감소된 효소 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 활성의 감소는 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우 또는 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다.
상기 효소의 활성이 감소되는 것은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴에 의한 것일 수 있다. 유전자의 "제거 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 유전자가 발현되지 않거나 발현량이 감소되거나 발현되어도 효소 활성을 나타내지 않거나 활성이 감소되도록, 유전자의 일부 또는 전부가, 또는 그 프로모터, 그 터미네이터 영역 등의 조절 인자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것을 말한다. 상기 유전자의 제거 또는 파괴는 상동 재조합과 같은 유전자 조작, 돌연변이 유발, 분자 진화를 통해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 같은 유전자를 포함하거나 2개 이상의 다른 폴리펩티드 동종상동유전자 (paralog)를 포함하는 경우, 하나 또는 그 이상의 유전자가 제거 또는 파괴될 수 있다.
본 명세서에서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
일 양상은 유전적으로 조작되지 않은 세포에 비하여 GCR1 및 GCR2 중 하나 이상의 활성이 증가되어 있는 효모 세포를 제공한다.
상기 효모 세포는 유전적으로 조작되지 않은 세포에 비하여 증가된 포도당 소비 속도로 포도당을 소비할 수 있는 능력을 갖는 것일 수 있다.
. 상기 포도당 소모는 해당과정을 통해 한 분자의 포도당이 두 분자의 피루브산을 형성하는 과정일 수 있다. 상기 효모 세포는 유전적으로 조작되지 않은 세포에 비하여 증가된 해당과정(glycolysis) 중간 산물 또는 해당과정 중간 산물 유래 물질의 생산능을 갖는 것일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 상기 생산은 세포 내에서 생산하는 것 또는 세포에서 생산된 후 분비되는 것일 수 있다. "유전적으로 조작되지 않은 세포"는 GCR1 또는 GCR2 또는 GCR1 및 GCR2의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작되지 않은 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서 "유래 물질"이란 특정 물질로부터 생합성 과정에 의하여 형성되는 물질일 수 있다. "해당과정 중간 산물 유래 물질"이란 해당과정 중간 산물, 예를 들면 피루베이트로부터 생합성 과정에 의하여 형성되는 물질일 수 있다. "생합성 과정"은 세포 내에 자연적으로 존재하는 것뿐만 아니라 외부로부터 유전자의 도입에 의하여 새롭게 형성된 생합성 경로를 포함한다. 구체적으로, 상기 해당과정 중간 산물은 글루코스-6-포스페이트 (G6P), 프럭스토스-6-포스페이트(F6P), 프럭스토스-1,6-비스포스페이트(FBP), 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP), 글리세르알데히드-3-포스페이트(GAP), 1,3-비스포스포글리세레이트, 3-포스포글리세레이트, 2-포스포글리세레이트, 포스포에놀피루베이트(PEP), 또는 피루베이트일 수 있다. 상기 해당과정 중간 산물 유래 물질은 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP) 유래 물질, 글리세르알데히드-3-포스페이트(GAP) 유래 물질, 또는 피루베이트 유래 물질인 것일 수 있다. 상기 "DHAP 유래 물질"은 글리세롤-3-포스페이트 (G3P), 글리세롤, 글리세롤 유래 산물 또는 그 조합일 수 있다. 상기 "피루베이트 유래 물질"은 알콜, 유기산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 "피루베이트 유래 물질"은 에탄올, 아세트산, 아세틸-CoA, 락테이트, TCA 회로의 중간 산물, 이들 유래 산물, 또는 그 조합인 것일 수 있다. TCA 회로의 중간 산물은 시트르산, 이타콘산, 이소시트레이트, 옥살로숙신네이트, 알파-케토글루타레이트, 숙신산, 숙신일-CoA, 푸마르산, 말레이트, 옥살로아세테이트, 또는 그 조합인 것일 수 있다. 상기 TCA 회로의 중간 산물 유래 물질은 숙신산 유래 산물일 수 있다. TCA 회로의 중간 산물 유래 물질은 숙신닐-CoA, 숙신산 세미알데히드(succinic semialdehye: SSA), 4-히드록시부티레이트, 4-히드록시부티릴-CoA, 4-히드록시부티르알데히드, 1,3-부탄디올(1,3-BDO), 1,4-부탄디올(1,4-BDO), 부탄올, 또는 이소부탄올일 수 있다. 상기 효모 세포는 숙신산으로부터 1,4-BDO로 전환하는데 작용하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 효소는 예를 들면, CoA-의존성 succinate semialdehyde dehydrogenase, 4- hydroxybutyrate (4-HB) dehydrogenase, 4-hydroxybutyryl-CoA (4HB-CoA) transferase, aldehyde/alcohol dehydrogenase,및 Clostridium acetobutylicum AdhE2일 수 있다.
GCR1은 해당과정에 관여하는 유전자의 전사 활성자 (transcription activator)일 수 있다. GCR1은 전사 활성자 GCR2와 상호작용하고 기능하는 DNA-결합 단백질일 수 있다. GCR1은 콘센서스 서열 (consensus sequence) CTTCC에 결합하는 것일 수 있다. GCR1은 서열번호 1의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. GCR1 유전자는 서열번호 1의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 GCR1 유전자는 서열번호 2 또는 59의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
GCR2는 해당과정에 관여하는 유전자의 전사 활성자 (transcription activator)일 수 있다. GCR2는 전사 활성자 GCR1과 상호작용하고 기능하는 단백질일 수 있다. GCR2는 서열번호 3의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. GCR2 유전자는 서열번호 3의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 GCR2 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. GCR1 및 GCR2 유전자는 효모, 예를 들면, S. cerevisiae 유래의 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 GCR1 및 GCR2 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 GCR1 및 GCR2 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입되는 것, 내재적 유전자의 카피 수가 증폭된 것, GCR1 및 GCR2 중 하나 이상의 비활성이 증가된 것 또는 그 조합일 수 있다.
상기 효모 세포는 Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Shizosaccharomyces, Issachenkia, 또는 Hansenula에 속하는 균주인 것일 수 있다. Saccharomyces에 속하는 균주는 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다.
상기 효모 세포는, 피루베이트로부터 피루베이트 유래 물질을 합성하는 경로의 효소, DHAP로부터 글리세롤을 합성하는 경로, 또는 글리세롤로부터 글리세롤 유래 물질을 합성하는 경로의 효소의 활성이 증가된 것일 수 있다. DHAP로부터 글리세롤을 합성하는 경로는 DHAP와 NADH를 G3P와 NAD+로 전환하는 반응을 촉매하는 G3P 데히드로게나제(G3P dehydrogenase: GPDH) 및 G3P를 글리세롤과 Pi로 전환시키는 반응을 촉매하는 G3Pase를 포함할 수 있다.
"피루베이트 유래 물질"에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 증가는 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 효모 세포는, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소의 활성, 또는 피루베이트를 에탄올로 전환하는 경로의 효소의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 증가는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현, 또는 피루베이트를 에탄올로 전환하는 경로의 효소의 발현이 증가된 것에 의한 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 EC 1.1.1.27, 또는 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소를 코딩하는 것일 수 있다. 피루베이트를 에탄올로 전환하는 경로의 효소는 피루베이트 데카르복실라제 및 알콜 데히드로게나제 중 하나 이상일 수 있다. 피루베이트 데카르복실라제는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 알콜 데히드로게나제(ADH)는 EC. 1.1.1.2로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 효모 세포는, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 방해하는 경로의 활성이 불활성화 또는 감소된 것일 수 있다. 또한, 상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 촉진하거나 도와주는 경로의 활성이 증가된 것일 수 있다.
상기 효모 세포가 락테이트 생산용인 경우, 상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC)를 코딩하는 pdc1일 수 있다. 상기 효모 세포는 아세트알데히드를 에탄올로의 전환을 촉매하는 알콜 데히드로게나제 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 알콜 데히드로게나제는 NADH 의존성일 수 있다. 상기 pdc1 유전자는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제 (CYB2)일 수 있다. 상기 락테이트 시트크롬 c-옥시도리덕타제는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 6의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 cyb2 유전자는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase: GPD)는 NADH의 NAD+로의 산화를 이용하여 디히록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 GPD는 EC 1.1.1.8에 속하는 것일 수 있다. 상기 GPD는 서열번호 7의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 GPD를 코딩하는 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 GPD 유전자는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성은 락테이트를 생산하는데 충분한 정도로 증가된 것일 수 있다.
상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 상기 효모 세포에 도입 및 발현의 증가에 의하여 증가된 것일 수 있다. 상기 발현의 증가는 유전자의 카피 수가 증가되거나 상기 유전자의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자의 증가는 내인성 유전자의 증폭 또는 외인성 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자의 조절 영역의 변이는 내인성 유전자의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 동종성 (homogenous) 또는 이종성 (heterogenous) 유전자일 수 있다.
피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 데히드로게나제 (ldh)일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 피루베이트를 락테이트로의 전환을 촉매할 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있으며, 또한 L-락테이트 또는 D-락테이트에 각각 작용할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.28 로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 일본자라 (Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리 (Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래 (Tursiops truncatus), 노르웨이산집쥐 (Rattus norvegicus), 또는 개구리(Xenopus laevis)로부터 선택되는 1종 이상의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일본자라로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 오리너구리로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 병코돌고래로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 및 노르웨이산집쥐로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 11, 12, 13, 및 14의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 11, 12, 13, 및 14의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 11, 12, 13, 및 14의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 LDH를 포함하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 복제 개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터는 각각 서열번호 16, 17, 18, 및 19의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c transcription), 및 GAL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.
LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포의 게놈에 포함될 수 있다. LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다. LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 L-LDH 또는 D-LDH의 생산에 특이적이어서, 상기 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 효모 세포는 L-락테이트 거울상 이성질체 또는 D-락테이트 거울상 이성질체, 또는 그의 염을 생산할 수 있다.
상기 효모 세포는 단일 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 1 내지 10 카피수의 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리뉴클레오티드의 카피이거나 둘 이상의 상이한 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피를 포함할 수 있다. 외인성 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌(locus), 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있다.
또한 상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트(G3P)로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있고, 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것인 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다. 상기 효모 세포는 또한, G3P를 글리세롤로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 에탄올로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화 또는 감소된 것일 수 있다. 상기 사카로마이에스 세레비지애는 KCTC 12415BP 균주에 gcr1, gcr2 또는 두 유전자가 도입된 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것이고, 락테이트를 다른 산물로 전환하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트를 다른 산물로 전환하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 더 포함하고, 상기 폴리펩티드는 상기 유전자에 의하여 발현된 것일 수 있다. 락테이트를 다른 산물로 전환하는 활성을 갖는 폴리펩티드는 예를 들면, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 효소 및 락틸-CoA를 락틸-CoA 또는 다른 모노머와 축합하여 호모폴리락테이트 (homopolylactate) 또는 락테이트 함유 공중합체를 형성하는 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 효소 및 락틸-CoA를 락틸-CoA는 각각 CoA-transferase, 예를 들면, 조작된 Clostridium propionicum propionate CoA transferase (PctCp), 및 Pseudomonas sp. MBEL 6-19 polyhydroxyalkanoate (PHA synthase 1 (PhaC1Ps6 -19)일 수 있다 (Teak Ho Yang 등, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 105, No. 1, January 1, 2010).
상기 효모 세포는 Saccharomyces로서, GCR1을 코딩하는 유전자 및 GCR2를 코딩하는 유전자 중 하나 이상이 도입되어 있는 것일 수 있다. 상기 Saccharomyces는 Saccharomyces cerevisiae, 예를 들면, Saccharomyces cerevisiae CEN. PK2-1C일 수 있다.
다른 양상은 상기한 바와 같은 효모 세포를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 해당과정 중간 산물 또는 해당과정 중간 산물 유래 산물을 회수하는 단계;를 포함하는, 중간 산물 또는 해당과정 중간 산물 유래 산물을 생산하는 하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 효모 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 "효모 세포"에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 포도당을 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물, 예를 들면, 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양할 수 있다. 상기 호기 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 20 v/v% 이상, 예를 들면, 20 내지 100v/v%, 20 내지 80v/v%, 20 내지 60v/v%, 20 내지 40v/v%,또는 20 내지 30v/v%일 수 있다. 그 후 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물, 예를 들면, 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 미세호기 조건, 예를 들면, DO 2v/v% 이하, 예를 들면, 0.001 내지 2v/v%, 0.005 내지 2v/v%, 0.01 내지 2v/v%, 0.05 내지 2v/v%, 0.1 내지 2v/v%, 0.5 내지 2v/v%, 1 내지 2v/v%, 또는 1.5 내지 2v/v%에서 배양할 수 있다.
용어, "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 상기 탄소원은 자화가능한 당 (assimilable sugars)일 수 있다. 상기 자화가능한 당은 6탄당 또는 5 탄당일 수 있다. 상기 탄소원은 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈가 이용될 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 효모 세포를 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%, 예를 들면, 0.1% 내지 8%, 0.1% 내지 6%, 0.1% 내지 4%, 0.1% 내지 2%, 0.1% 내지 1%, 1% 내지 10%, 1% 내지 8%, 1% 내지 6%, 2% 내지 10%, 4% 내지 10%, 6% 내지 10%, 8% 내지 10%, 2% 내지 8%, 또는 2% 내지 6%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 효모 세포가 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.
상기 방법은 배양물로부터 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물을 회수하는 단계를 포함한다. 상기 배양물 (culture)은 세포와 배양매질 (culture medium)을 포함할 수 있다. "피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물"에 대하여는 상기한 바와 같다.
배양물로부터 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물 예를 들면, 락테이트의 회수는 당해 기술분야에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 회수 또는 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화 등의 방법일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
상기 회수는 세포, 배양 매질 또는 둘 모두로부터 회수하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 증가된 속도로 포도당을 소비할 수 있다.
다른 양상에 따른 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물을 생산하는 하는 방법에 의하면, 피루베이트 또는 피루베이트 유래 산물을 효율적으로 생산할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 효모 세포에서 GCR1 또는 GCR2 유전자의 과발현의 효과
본 실시예에서는 효모 세포에 GCR1 또는 GCR2 유전자를 도입하여 과발현시키고, 그 과발현이 효모 세포의 성장, 포도당 소모 및 에탄올 생산에 미치는 영향을 확인하였다.
(1) GCR1 의 과발현을 위한 벡터의 제작
GCR1 유전자의 과발현을 위해서 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae CEN.PK2-1D(MATα ura3 -52; trp1 -289; leu2 -3,112; his3 △ 1; MAL2 -8 C ; SUC2 ) EUROSCARF accession number: 30000B: 이라 "CEN.PK2-1D 균주"라고도 함) 게놈 DNA로부터 GCR1의 코딩 부위 함유 서열 (서열번호 2)을 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하고, 증폭 산물을 BamHI과 XhoI로 소화시킨 후, BamHI과 XhoI로 소화된 pRS416 vector (ATCC87521)에 연결하여 pRS416-GCR1 벡터를 제조하였다. 상기 벡터에서 GCR1 유전자는 GPD 프로모터 하에서 전사된다.
(2) GCR2 의 과발현을 위한 벡터의 제작
GCR2 유전자의 과발현을 위해서 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D 게놈 DNA로부터 GCR2의 코딩 부위 (서열번호 4)를 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여, 증폭 산물을 BamHI과 XhoI로 소화시킨 후, BamHI과 XhoI로 소화된 pRS416 vector (ATCC87521)에 연결하여 pRS416-GCR2 벡터를 제조하였다. 상기 벡터에서 GCR2 유전자는 GPD 프로모터 하에서 전사된다.
(3) GCR1 또는 GCR2 의 과발현 균주의 제작
GCR1 또는 GCR2 유전자를 과발현하기 위하여 상기에서 제작한 pRS416-GCR1 또는 pRS416-GCR2 벡터를 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D에 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation) 방법을 이용하여 도입하였다. 형질도입 후 uracil drop out 배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. No. Y0626) 6.7g/L 및 Yeast synthetic drop-out without uracil (Sigma-Aldrich: Cat. No. Y1501) 1.9g/L, 및 포도당 2 (w/v)%)에서 세포를 배양하여 세포 내에 GCR1 또는 GCR2 유전자가 도입되었는지를 확인하였다. 각 벡터의 도입 여부는, 얻어진 세포의 게놈을 주형으로 하고, 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 확인하였다.
(4) 형질전환된 효모 세포의 성장, 포도당 소모량 및 에탄올 생산량 확인
상기에서 제조된 형질전환 효모 세포를 5% 포도당을 함유한 최소 배지 (minimal Ura drop-out media) (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626) 6.7 g/L, 및 Yeast synthetic drop-out without uracil(Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501) 1.9 g/L 50ml에 OD600 값이 1이 되도록 접종하고, 30℃에서 240 rpm으로 교반하면서 10 시간 동안 호기 조건에서 배양하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 잔류 포도당 및 에탄올 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다.
(5) 배양 결과
배양 결과, 세포 성장 즉, 배양물의 OD600 값, 및 배지 중 잔류 포도당 및 에탄올 농도는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
균주 세포성장(OD600) 포도당 소비(g/L) 에탄올 생산(g/L)
대조군 12.0 19.8 8.8
GCR1 유전자 도입 12.8 38.0 13.2
GCR2 유전자 도입 10.6 25.6 12.7
표 1에서, 대조군은 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D에 pRS416 vector가 도입된 균주인 것을 제외하고 동일 조건에서 배양한 것이다. Gcr1 유전자 도입 균주 및 Gcr2 유전자 도입 균주는 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D에 각각 pRS416-GCR1 벡터 또는 pRS416-GCR2 벡터를 도입한 것이다. 표 1에 나타낸 바와 같이,
표 1에 나타낸 바와 같이, GCR1 유전자 도입 균주는 대조군에 비하여 세포 성장, 포도당 소비 및 에탄올 생산이 각각, 6.7%, 91.9% 및 50.0% 증가하였다. 또한, GCR2 유전자 도입 균주는 대조군에 비하여 세포 성장이 -11.7%이었으나, 포도당 소비 및 젖산 생산이 각각, 29.3% 및 44.3% 증가하였다.
실시예 2: 락테이트 생산능이 향상된 효모 세포에서 GCR1 또는 GCR2 유전자의 과발현의 효과
본 실시예에서는 락테이트 생산능이 향상된 효모 세포에 GCR1 또는 GCR2 유전자를 도입하여 과발현시키고, 그 과발현이 효모 세포의 성장, 포도당 소모, 에탄올 및 락테이트 생산에 미치는 영향을 확인하였다.
1. 락테이트 생산능이 향상된 효모 세포의 제조
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D에서 락테이트 생산능을 향상시키기 위하여, 대사 산물의 흐름을 락테이트 이외의 경로로 흐르게 하는 경로, 즉, 피루베이트로부터 에탄올로의 경로에 관여하는 효소인 피루베이트 데카르복실라제 1(pyruvate decarboxylase 1: PDC1) 및 알콜 데히드로게나제 1 (alcohol dehydrogease 1: ADH1) 유전자를 결실시켰다. PDC1은 피루베이트를 아세트알데히드와 CO2로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다. ADH1은 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다.
이때 pdc1 유전자 및 adh1 유전자의 결실과 동시에 각각 락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: ldh) 유전자를 도입하였다. LDH는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 반응을 촉매하는 효소이다.
또한, 락테이트로부터 피루베이트로 전환하는 반응을 촉매하는 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제 (L-lactate cytochrome-c oxidoreductase: cyb2) 유전자를 결실시켰다. 이때 cyb2 유전자의 결실과 동시에 락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: ldh) 유전자를 도입하였다.
또한, 해당과정에서 피루베이트로의 대사 흐름을 강화하기 위하여, 디히드록시아세톤 포스페이트 (dihydroxy acetone phosphate: DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트 (glycerol-3-phosphate: G3P)로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 갖는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 1 (glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1: gpd1) 유전자를 결실시켰다. GPD1은 상기 반응과 동시에 NADH를 NAD+로 전환시킨다. 이때 gpd1 유전자의 결실과 동시에 락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: ldh) 유전자를 도입하였다.
또한, 대장균 유래의 MhpF (acetaldehyde dehydrogenase(acylating))를 코딩하는 유전자를 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D에 도입하였다. MhpF는 EC.1.2.1.10에 속하는 것일 수 있다. MhpF는 아세트알데히드를 acetyl-CoA로 전환하는 것을 촉매하는 것일 수 있다. MhpF는 NAD+ 및 조효소 A를 사용하는 것일 수 있다. MhpF는 3-HPP의 분해를 위한 메타-절단 결로 (meta-cleavage pathway)의 마지막 효소일 수 있다. MhpF 유전자는 자체의 알데히드 데히드로게나제 6 (aldehyde dehydrogenase 6: ALD6)를 코딩하는 유전자인 ald6 유전자 부위에 도입되어 ald6 유전자를 결실시키는 것일 수 있다. ALD6는 알데히드 데히드로게나제의 구성적 세포질 형태 (constitutive cytosolic form)를 코딩하는 것일 수 있다. ALD6는 Mg2 +에 의하여 활성화되고, NADP에 특이적인 것일 수 있다. 이 효소는 acetate의 생성에 관여하는 것일 수 있다. 생성된 acetate로부터 세포질 acetyl-CoA가 합성될 수 있다.
(1) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh )의 제작
(1.1) pdc1 를 결실시키며 ldh 를 도입하기 위한 벡터의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D에서 피루베이트로부터 아세트알데히드를 거쳐 에탄올로 가는 경로를 차단하기 위하여 피루베이트 데카르복실라제 1 (pyruvate decarboxylase1: pdc1)을 코딩하는 유전자를 제거하였다. pdc1 유전자를 제거하는 동시에 일본 자라 유래 Ldh를 발현시키기 위하여 pdc1 유전자를 'ldh 카세트'로 치환하여 pdc1 유전자를 결손시켰다. "카세트"란 달리 언급이 없으면, 프로모터, 코딩 서열, 및 터미네이터가 작동가능하게 연결된 단백질이 발현될 수 있는 단위 서열을 나타낸다.
구체적으로, 'ldh 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 27 및 28의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 얻어진 CCW12 프로모터 서열 (서열번호 29)과 'ldh 유전자 (서열번호 15)'를 각각 SacI/XbaI과 BamHI/SalI로 소화하고, 동일 효소로 소화된 pRS416 vector (ATCC87521)에 연결하였다. pRS416 vector는 T7 프로모터, 박테리아에서 암피실린 저항성, 효모에서 URA3 카세트 (선택마커), 및 제한효소 클로닝 부위를 갖는 효모 센트로미어 셔틀 플라스미드 (yeast centromere shuttle plasmid)이다. 다음으로, 얻어진 벡터에 pCEP4 plasmid (invitrogen, Cat. no. V044-50)를 주형으로 하고 서열번호 30 및 31의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한PCR하여 얻어진 증폭 산물 즉, 'HPH 카세트' 서열 (서열번호 32)을 SacI로 소화시키고, 동일한 효소로 소화된 상기 얻어진 벡터에 연결하여 'ldh 카세트'를 포함하는 벡터 p416-ldh-HPH를 제조하였다. pCEP4 plasmid는 다중클로닝 부위 (multiple cloning site)에 삽입된 재조합 유전자의 높은 수준의 전사를 위한 cytomegalovirus (CMV) immediate early enhance/promoter를 사용하는 에피좀성 포유동물 발현 벡터 (episomal mammalian expression vector)이다. pCEP4는 트란스펙션된 세포 (transfected cell)에서 안정된 선택을 위한 히그로마이신 B 저항성 유전자 (hygromycin B resistance gene)을 갖는다. 여기서 'ldh 카세트'는 ldh 유전자 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, ldh 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다. 상기 ldh 유전자는 CCW12 프로모터 하에서 전사되도록 하였다. 또한, 'HPH (hygromycin B phosphotransferase) 카세트'는 히그로마이신 B 저항성 유전자 (hygromycin B resistance gene) 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, 히그로마이신 B 저항성 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다.
pdc1의 결실 용 벡터는 p416-ldh-HPH를 주형으로 하고 서열번호 33 및 34의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR에 의하여 ldh 유전자 절편과 pUC57-Ura3HA 벡터 (DNA2.0 Inc.; 서열번호 35)를 각각 SacI로 소화시킨 후 서로 연결하여 pUC-uraHA-ldh를 제조하였다. 이 벡터로부터 pdc1의 결실용 카세트는 pdc1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 36 및 37의 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하였다. 상기 서열번호 36의 1 내지 41 및 서열번호 37의 1 내지 44는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체의 상동 서열과 상동 재조합되어 pdc1 유전자와 치환될 부분을 의미한다.
(1.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ) 제조
(1.1)에서 제작한 pdc1 deletion용 카세트를 사카로마이세스 세레비지애 (CEN.PK2-1D, EUROSCARF accession number: 30000B)에 도입하였다. 상기 pdc1 deletion용 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 pdc1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, pdc1의 결실을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 38 및 39의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 pdc1 유전자 결실 및 ldh 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh)를 제조하였다.
(2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh )의 제작
(2.1) cyb2 를 결실시키기 위한 벡터의 제작
(1)에서 얻어진 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh)에서, 락테이트에서 피루베이트로 가는 경로를 차단하기 위하여 cyb2 유전자를 제거하였다.
구체적으로, (1.1)에서 제조된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고, 서열번호 40 및 41의 cyb2 상동 재조합 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 cyb2 deletion 용 카세트를 얻었다. 서열번호 40의 프라이머 중 1 내지 45 및 서열번호 41의 프라이머 중 1 내지 45는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체에 상동 재조합되어 cyb2와 치환될 부분을 의미한다.
(2.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh )의 제조
(2.1)에서 제작한 cyb2 deletion용 카세트를 상기한 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 cyb2 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 cyb2의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 42 및 43의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 cyb2 유전자 결실된 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh)를 제조하였다.
(3) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 , ㅿ gpd1 :: ldh )의 제조
(3.1) gpd1 를 결실시키기 위한 벡터의 제작
(2)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2)에서 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)에서 글리세롤-3-포스페이트로 가는 경로를 차단하기 위하여 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1, gpd1)을 코딩하는 유전자를 제거하였다.
구체적으로, (1.1)에서 제조된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고, 서열번호 44 및 45의 gpd1 상동 재조합 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 deletion 용 카세트를 얻었다. 서열번호 44의 프라이머 중 1 내지 50 및 서열번호 45의 프라이머 중 1 내지 50는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체에 상동 재조합되어 gpd1과 치환될 부분을 의미한다.
(3.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh )의 제조
(3.1)에서 제작한 gpd1 deletion용 카세트를 (2)에서 제조한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 gdp1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 gpd1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 46 및 47의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh)를 제조하였다.
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh)는 2013.5.30일자로 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 수탁번호 KCTC12415BP로 기탁하였다.
(4) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh ,ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿ adh1 :: ldh )
(4.1) adh1 을 결실하기 위한 벡터의 제작
(3)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh)에서 아세트알데히드에서 에탄올로 가는 경로를 차단하기 위하여 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase, adh1)를 코딩하는 유전자를 제거하였다. adh1 유전자를 제거하는 동시에 Ldh를 발현시키기 위하여 adh1 유전자를 ldh-HPH 카세트로 치환시켜 결손시켰다.
구체적으로, (1.1)에서 제조된 p416-ldh-HPH 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 48 및 49의 adh1 상동 재조합 서열 및 프로모터가 결합된 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 adh1 deletion 용 카세트를 얻었다. 서열번호 48의 프라이머 중 1 내지 51 및 서열번호 49의 프라이머 중 1 내지 51은 사카로마이세스 세레비지애의 염색체에 상동 재조합되어 adh1 유전자와 치환될 부분을 의미한다.
(4.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿadh1::ldh)의 제조
(4.1)에서 제작한 adh1 deletion용 카세트를 (3)에서 제조한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh)에 도입하였다.
도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 선택 마커인 히그로마이신 B의 존재하에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 adh1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 adh1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 50 및 51의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 adh1 유전자 결실 및 ldh 유전자 도입을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh)를 제조하였다.
(5) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿadh1::ldh, ㅿ ald6 :: mhpF )의 제조
(5.1) mhpF 를 도입하기 위한 벡터의 제작 및 도입
(4)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh)에서 acetaldehyde로부터 acetyl-CoA로 전환하는 경로를 강화하기 위하여, MhpF 유전자를 ald6 유전자 부위에 도입하였다.
구체적으로, MhpF 유전자는 대장균에서 유래한 MhpF 유전자를 기초로 S.cerevisiae 코돈-최적화된 (codon-optimized) 뉴클레오티드 서열을 구하고, 이 서열을 합성하였다 (DNA2.0 Inc; 서열번호 52). 얻어진 MhpF 유전자와 'HIS3 카세트'를 각각 SalI 제한 효소를 사용하여, 'pUC19 벡터'(NEB, N3041)에 연결하여, pUC19-His-MhpF 벡터 (서열번호 53)를 제조하였다. 상기 HIS3 카세트는 pRS413 (ATCC8758)을 주형으로 하고 서열번호 60 및 61의 프라이머를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하여 얻은 증폭 산물이다. pUC19-His-MhpF 벡터에서 mhpF는 GPD 프로모터 (서열번호 54) 하에서 발현된다.
제조된 pUC19-His-MhpF 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 55 및 56의 ald6 상동 재조합 및 프로모터가 결합된 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 mhpF 삽입용 카세트를 얻었다. 서열번호 55의 프라이머 중 1 내지 44 및 서열번호 56의 프라이머 중 1 내지 45는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체에 상동 재조합되어 ald6 유전자와 치환될 부분을 의미한다.
(5.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿadh1::ldh, ㅿ ald6 :: mhpF )의 제조
(5.1)에서 제작한 mhpF 삽입용 카세트를 (4)에서 제조한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh)에 도입하였다.
도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 histidine drop out 배지 (Yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: cat. no. Y0626) 6.7 g/L, Yeast synthetic drop-out without histidine (Sigma-Aldrich: cat. no. Y1751) 1.9 g/L, 및 포도당 2 (w/v)%)에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 ald6 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 ald6 유전자의 결실 및 mhpF 유전자의 도입을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 62 및 63의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 유전자 결실 및 유전자 도입 여부를 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF)를 제조하였다.
2. S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh ,ㅿadh1::ldh, ㅿ ald6 :: mhpF )에 GCR1 및/또는 GCR2 유전자의 도입
제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2, ㅿgpd1,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF)에 GCR1 및/또는 GCR2 유전자를 도입하여, GCR1 및/또는 GCR2 유전자가 과발현되는 효모 세포를 제조하였다.
GCR1 및/또는 GCR2 유전자의 도입은 실시예 1의 (3)에서 pRS416-GCR1 또는 pRS416-GCR2 벡터를 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D 대신 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF)를 사용한 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 수행되었다.
그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, gcr1+, and/or gcr2+)를 제조하였다.
3. 형질전환된 효모 세포의 성장, 포도당 소모량, 에탄올 및 락테이트 생산량 확인
상기에서 제조된 형질전환 효모 세포를 5% 포도당을 함유한 최소 배지 (minimal Ura drop-out media) 50ml에 OD600 값 1이 되도록 접종하고, 30℃에서90rpm으로 교반하면서 48 시간 동안 미세호기 조건에서 배양하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 잔류 포도당 및 에탄올 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다.
4. 배양 결과
배양 결과, 세포 성장 즉, 배양물의 OD600 값, 및 배지 중 잔류 포도당 및 에탄올 농도는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
균주 세포성장(OD600) 포도당 소비(g/L) 젖산 생산(g/L)
대조군 3.1 23.6 19.8
GCR1 강화 균주 3.3 33.6 24.9
표 2에서, 대조군은 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, 및 ㅿald6::mhpF)를 나타내고, Gcr1 강화 균주는 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿadh1::ldh, ㅿald6::mhpF, gcr1+)를 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 실험 균주는 대조군에 비하여 세포 성장, 포도당 소비 및 젖산 생산이 각각, 6.5%, 42.4% 및 25.8% 증가하였다.
한국생명공학연구원 KCTC12415BP 20130530
<110> Samsung Electronics. Co., Ltd. <120> Yeast having a improved product productivity and method of producint the product <130> PN105393KR <160> 63 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 785 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Val Cys Thr Ser Thr Ser Ser Asn Phe Tyr Ser Ile Ala Gln Tyr 1 5 10 15 Ile Leu Gln Ser Tyr Phe Lys Val Asn Val Asp Ser Leu Asn Ser Leu 20 25 30 Lys Leu Val Asp Leu Ile Val Asp Gln Thr Tyr Pro Asp Ser Leu Thr 35 40 45 Leu Arg Lys Leu Asn Glu Gly Ala Thr Gly Gln Pro Tyr Asp Tyr Phe 50 55 60 Asn Thr Val Ser Arg Asp Ala Asp Ile Ser Lys Cys Pro Ile Phe Ala 65 70 75 80 Leu Thr Ile Phe Phe Val Ile Arg Trp Ser His Pro Asn Pro Pro Ile 85 90 95 Ser Ile Glu Asn Phe Thr Thr Val Pro Leu Leu Asp Ser Asn Phe Ile 100 105 110 Ser Leu Asn Ser Asn Pro Leu Leu Tyr Ile Gln Asn Gln Asn Pro Asn 115 120 125 Ser Asn Ser Ser Val Lys Val Ser Arg Ser Gln Thr Phe Glu Pro Ser 130 135 140 Lys Glu Leu Ile Asp Leu Val Phe Pro Trp Leu Ser Tyr Leu Lys Gln 145 150 155 160 Asp Met Leu Leu Ile Asp Arg Thr Asn Tyr 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S.cerevisiae <400> 2 atggtatggt atgatcataa cacgcattct gaaaatgtta tctgggaggt tttcgatggg 60 tatggagttt tccttgattc tcacttatta tcccttgtat tgtaattgat ccttcagtaa 120 tatttgcagc ctttcacaac tatccttttt ttcattgctt attactattg aacctttttt 180 aggagttgcc tgcttatgca atataatttg ctgacaagta gtaaattacc agcacaatat 240 taagattaaa aaagaaatta gccaagagct tgatatatta tcttatacac aaacctttcc 300 gacctacttg ataaagccac atacctctac ctcttctatt agaaatagaa aagtacaaaa 360 atagcaaaag gaaataattt ctttaaaata acattgtgtg aggttccaac tatggattat 420 taatagagta acgcaaactt aaggaaagga agtgctttac aattaagtat ttataagaac 480 gaatttatcc cccaaaaaaa agcacctata cttaataaaa ggaggggaat agctatcaat 540 tgagtgttgt ctgcgtctgt ctgcgtacaa gaggatgaat tttctgactc aggctatgtc 600 agaaactttt caagggacaa ataacaggat aaaacgtaat gtcaggacac aaagtgtgcc 660 atcaacttcc tataataatg gcaaagaatc atatggacca aatactaacc aattaaatgc 720 cctactttct caattggaac agcaaacaag tgttgatagt accagcacga gctcaaactt 780 ttattccatt gcacaatata ttttacaatc atacttcaag gtcaatgtag attctctaaa 840 ctctctgaaa ttggtggatt tgatagtgga ccaaacttac cctgattctt tgacgctgcg 900 aaagctgaat gaaggagcaa cgggacaacc atacgattat ttcaatacag tttctcgtga 960 tgctgatatc tccaagtgtc caatttttgc gttgaccata ttttttgtta tacgatggag 1020 ccacccaaac cctccaattt caattgagaa ttttactaca gtaccgttgc tagattcaaa 1080 ctttatttct ctaaattcca atcctttact atatattcaa aatcaaaacc caaacagcaa 1140 ttcaagtgtt aaagtttcaa ggtcacaaac gtttgaacct tctaaagagt tgatcgattt 1200 ggtatttcca tggctgtctt atttgaagca ggatatgctt cttattgata ggacgaatta 1260 caagctttat tctctctgtg aactatttga atttatgggc agggttgcca ttcaggatct 1320 ccgatatctg agtcaacatc ccttattact acccaatatc gtaacattca tttcaaaatt 1380 tattcctgag ttattccaaa acgaagagtt taaaggaatc ggttcaatta aaaattcaaa 1440 caataatgcc ctgaacaatg ttacaggaat agaaacccaa tttttaaatc catctaccga 1500 ggaagtgagt caaaaagttg attcttactt tatggaatta tcaaaaaaat taactacaga 1560 aaatatcagg ttaagtcaag aaataacaca actaaaagca gatatgaact ccgtaggcaa 1620 tgtttgtaac caaattttgc tgttgcagag acaattgctt tcaggaaatc aggcgatcgg 1680 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ttctaatatt cataattcta ctgaggctgc aaattcaagt ggtacagtga caaagacagc 2580 tccatcattt ccgcagagtt cttctaagtt tgaaattata aataaaaagg atacgaaggc 2640 ggggccaaac gaggcaatca aatacaagct gtccagagaa aataaaacaa tatgggacct 2700 atatgcggag tggtatattg gtctgaacgg taaatcttca ataaaaaaat tgattgaaaa 2760 ttatggctgg cgaaggtgga aggttagcga agattcacat ttttttccta ctagaagaat 2820 tattatggat tatattgaaa cggaatgtga tcgtggcata aaactcggca ggtttactaa 2880 tcctcaacaa ccgagggagg atatacggaa gattttagta ggggacctag aaaagttcag 2940 gataaataac ggtctgactc tgaattctct atcattgtac tttagaaatt taacgaaaaa 3000 taacaaggaa atttgtattt ttgaaaactt taaaaattgg aacgttagat caatgacaga 3060 agaagagaaa ttaaagtatt gcaaaaggcg acataataca ccatcttaa 3109 <210> 3 <211> 534 <212> PRT <213> S.cerevisiae <400> 3 Met His His Gln Thr Lys Leu Asp Val Phe Ile Ile Arg Ala Tyr Asn 1 5 10 15 Leu Leu Ser Asn Glu Ser Val Ile Ser Gly Ala Ser Leu Gln Ser Val 20 25 30 Thr Asn Ser Pro Gln Thr Thr Thr Asn Thr Pro Ser Gly Met Val Asn 35 40 45 Gly Ala Val Gly Thr Gly Ile 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tggacaagat ctacgaagtt 120 gaaggtatga gatgggctgg taacgccaac gaattgaacg ctgcttacgc cgctgatggt 180 tacgctcgta tcaagggtat gtcttgtatc atcaccacct tcggtgtcgg tgaattgtct 240 gctttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgtcg gtgttttgca cgttgttggt 300 gtcccatcca tctctgctca agctaagcaa ttgttgttgc accacacctt gggtaacggt 360 gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc tatgatcact 420 gacattgcta ccgccccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccactta cgtcacccaa 480 agaccagtct acttaggttt gccagctaac ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540 ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600 attgacacca tcttggcttt ggtcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660 tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720 ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagatacggt 780 ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840 ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900 tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960 ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccactat tgctgacgcc 1020 gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080 gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140 ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200 ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260 gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320 ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440 cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500 actttcggtg ctaaggacta tgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560 ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga aatcatgttg 1620 ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680 gctaagcaat aa 1692 <210> 9 <211> 1776 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 9 atgctaaaat acaaaccttt actaaaaatc tcgaagaact gtgaggctgc tatcctcaga 60 gcgtctaaga ctagattgaa cacaatccgc gcgtacggtt ctaccgttcc aaaatccaag 120 tcgttcgaac aagactcaag aaaacgcaca cagtcatgga ctgccttgag agtcggtgca 180 attctagccg ctactagttc cgtggcgtat ctaaactggc ataatggcca aatagacaac 240 gagccgaaac tggatatgaa taaacaaaag atttcgcccg ctgaagttgc caagcataac 300 aagcccgatg attgttgggt tgtgatcaat ggttacgtat acgacttaac gcgattccta 360 ccaaatcatc caggtgggca ggatgttatc aagtttaacg ccgggaaaga tgtcactgct 420 atttttgaac cactacatgc tcctaatgtc atcgataagt atatagctcc cgagaaaaaa 480 ttgggtcccc ttcaaggatc catgcctcct gaacttgtct gtcctcctta tgctcctggt 540 gaaactaagg aagatatcgc tagaaaagaa caactaaaat cgctgctacc tcctctagat 600 aatattatta acctttacga ctttgaatac ttggcctctc aaactttgac taaacaagcg 660 tgggcctact attcctccgg tgctaacgac gaagttactc acagagaaaa ccataatgct 720 tatcatagga tttttttcaa accaaagatc cttgtagatg tacgcaaagt agacatttca 780 actgacatgt tgggttctca tgtggatgtt cccttctacg tgtctgctac agctttgtgt 840 aaactgggaa accccttaga aggtgaaaaa gatgtcgcca gaggttgtgg ccaaggtgtg 900 acaaaagtcc cacaaatgat atctactttg gcttcatgtt cccctgagga aattattgaa 960 gcagcaccct ctgataaaca aattcaatgg taccaactat atgttaactc tgatagaaag 1020 atcactgatg atttggttaa aaatgtagaa aagctgggtg taaaggcatt atttgtcact 1080 gtggatgctc caagtttagg tcaaagagaa aaagatatga agctgaaatt ttccaataca 1140 aaggctggtc caaaagcgat gaagaaaact aatgtagaag aatctcaagg tgcttcgaga 1200 gcgttatcaa agtttattga cccctctttg acttggaaag atatagaaga gttgaagaaa 1260 aagacaaaac tacctattgt tatcaaaggt gttcaacgta ccgaagatgt tatcaaagca 1320 gcagaaatcg gtgtaagtgg ggtggttcta tccaatcatg gtggtagaca attagatttt 1380 tcaagggctc ccattgaagt cctggctgaa accatgccaa tcctggaaca acgtaacttg 1440 aaggataagt tggaagtttt cgtggacggt ggtgttcgtc gtggtacaga tgtcttgaaa 1500 gcgttatgtc taggtgctaa aggtgttggt ttgggtagac cattcttgta tgcgaactca 1560 tgctatggtc gtaatggtgt tgaaaaagcc attgaaattt taagagatga aattgaaatg 1620 tctatgagac tattaggtgt tactagcatt gcggaattga agcctgatct tttagatcta 1680 tcaacactaa aggcaagaac agttggagta ccaaacgacg tgctgtataa tgaagtttat 1740 gagggaccta ctttaacaga atttgaggat gcatga 1776 <210> 10 <211> 1176 <212> DNA <213> S. cerevisiae <400> 10 atgtctgctg ctgctgatag attaaactta acttccggcc acttgaatgc tggtagaaag 60 agaagttcct cttctgtttc tttgaaggct gccgaaaagc ctttcaaggt tactgtgatt 120 ggatctggta actggggtac tactattgcc aaggtggttg ccgaaaattg taagggatac 180 ccagaagttt tcgctccaat agtacaaatg tgggtgttcg aagaagagat caatggtgaa 240 aaattgactg aaatcataaa tactagacat caaaacgtga aatacttgcc tggcatcact 300 ctacccgaca atttggttgc taatccagac ttgattgatt cagtcaagga tgtcgacatc 360 atcgttttca acattccaca tcaatttttg ccccgtatct gtagccaatt gaaaggtcat 420 gttgattcac acgtcagagc tatctcctgt ctaaagggtt ttgaagttgg tgctaaaggt 480 gtccaattgc tatcctctta catcactgag gaactaggta ttcaatgtgg tgctctatct 540 ggtgctaaca ttgccaccga agtcgctcaa gaacactggt ctgaaacaac agttgcttac 600 cacattccaa aggatttcag aggcgagggc aaggacgtcg accataaggt tctaaaggcc 660 ttgttccaca gaccttactt ccacgttagt gtcatcgaag atgttgctgg tatctccatc 720 tgtggtgctt tgaagaacgt tgttgcctta ggttgtggtt tcgtcgaagg 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tcagggttat 2100 tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 2160 cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 2220 acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt 2280 gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc 2340 gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt 2400 aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg 2460 cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac 2520 tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga 2580 tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa 2640 acgacggcca gtgaattcga gctcagttta tcattatcaa tactcgccat ttcaaagaat 2700 acgtaaataa ttaatagtag tgattttcct aactttattt agtcaaaaaa ttagcctttt 2760 aattctgctg taacccgtac atgcccaaaa tagggggcgg gttacacaga atatataaca 2820 tcgtaggtgt ctgggtgaac agtttattcc tggcatccac taaatataat ggagcccgct 2880 ttttaagctg gcatccagaa aaaaaaagaa tcccagcacc aaaatattgt 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gcgaggcaag 5460 aatgatcatc accgtagtga gagtgcgttc aaggctcttg cggttgccat aagagaagcc 5520 acctcgccca atggtaccaa cgatgttccc tccaccaaag gtgttcttat gtagtgacac 5580 cgattattta aagctgcagc atacgatata tatacatgtg tatatatgta tacctatgaa 5640 tgtcagtaag tatgtatacg aacagtatga tactgaagat gacaaggtaa tgcatcattc 5700 tatacgtgtc attctgaacg aggcgcgctt tccttttttc tttttgcttt ttcttttttt 5760 ttctcttgaa ctcgacggg 5779 <210> 54 <211> 655 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD promoter <400> 54 agtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat 60 tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc 120 ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 180 tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 240 aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 300 tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 360 ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 420 ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 480 aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 540 agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 600 tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccagaac ttagtttcga cggat 655 <210> 55 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 caagaaacat ctttaacata cacaaacaca tactatcaga atacccagtc acgacgttgt 60 aaaa 64 <210> 56 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gtattttgtg tatatgacgg aaagaaatgc aggttggtac attacaggtt tcccgactgg 60 aaagc 65 <210> 57 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 gacagtctag caaacagtag tagtcc 26 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 tgacgtaaga ccaagtaag 19 <210> 59 <211> 2358 <212> DNA <213> S. cerevisiae <400> 59 atggtatgta ccagcacgag ctcaaacttt tattccattg cacaatatat tttacaatca 60 tacttcaagg tcaatgtaga ttctctaaac tctctgaaat tggtggattt gatagtggac 120 caaacttacc ctgattcttt gacgctgcga aagctgaatg aaggagcaac gggacaacca 180 tacgattatt tcaatacagt ttctcgtgat gctgatatct ccaagtgtcc aatttttgcg 240 ttgaccatat tttttgttat acgatggagc cacccaaacc ctccaatttc aattgagaat 300 tttactacag taccgttgct agattcaaac tttatttctc taaattccaa tcctttacta 360 tatattcaaa atcaaaaccc aaacagcaat tcaagtgtta aagtttcaag gtcacaaacg 420 tttgaacctt ctaaagagtt gatcgatttg gtatttccat ggctgtctta tttgaagcag 480 gatatgcttc ttattgatag gacgaattac aagctttatt ctctctgtga actatttgaa 540 tttatgggca gggttgccat tcaggatctc cgatatctga gtcaacatcc cttattacta 600 cccaatatcg taacattcat ttcaaaattt attcctgagt tattccaaaa cgaagagttt 660 aaaggaatcg gttcaattaa aaattcaaac aataatgccc tgaacaatgt tacaggaata 720 gaaacccaat ttttaaatcc atctaccgag gaagtgagtc aaaaagttga ttcttacttt 780 atggaattat caaaaaaatt aactacagaa aatatcaggt taagtcaaga aataacacaa 840 ctaaaagcag atatgaactc cgtaggcaat gtttgtaacc aaattttgct gttgcagaga 900 caattgcttt caggaaatca ggcgatcgga tcaaagtccg aaaatattgt gtcttccaca 960 ggtgggggga tattaatact 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<210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer R <400> 63 tgacgtaaga ccaagtaag 19

Claims (21)

  1. 유전적으로 조작되지 않은 세포에 비하여 GCR1 및 GCR2 중 하나 이상의 활성이 증가되어 있는 효모 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 유전적으로 조작되지 않은 세포에 비하여 증가된 포도당 소비 속도로 포도당을 소비할 수 있는 능력을 갖는 것인 효모 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 유전적으로 조작되지 않은 세포에 비하여 증가된 해당과정(glycolysis) 중간 산물 또는 해당과정 중간 산물 유래 물질의 생산능을 갖는 것인 효모 세포.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 해당과정 중간 산물 은 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP), 글리세르알데히드-3-포스페이트(GAP), 또는 피루베이트인 것인 효모 세포.
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 해당과정 중간 산물 유래 물질은 DHAP로부터 유래된 물질, 또는 피루베이트로부터 유래된 물질이고, 상기 DHAP로부터 유래된 물질은 글리세롤-3-포스페이트 (G3P), 또는 글리세롤이고, 상기 피루베이트 유래 물질은 아세틸-CoA, 에탄올, 아세트산, 락테이트, TCA 회로의 중간 산물, 이들 유래 산물, 또는 그 조합인 것인 효모 세포.
  6. 청구항 5에 있어서, TCA 회로의 중간 산물은 시트르산, 이타콘산, 이소시트레이트, 옥살로숙신네이트, 알파-케토글루타레이트, 숙신산, 숙신일-CoA, 푸마르산, 말레이트, 옥살로아세테이트, 또는 그 조합이고, TCA 회로의 중간 산물 유래 물질은 1,3-부탄디올(1,3-BDO), 1,4-부탄디올(1,4-BDO), 부탄올, 또는 이소부탄올인 것인 효모 세포.
  7. 청구항 1에 있어서, GCR1 및 GCR2는 각각 서열번호 1 및 3의 아미노산 서열과 75% 이상의 서열 상동성을 갖는 것인 효모 세포.
  8. 청구항 1에 있어서, GCR1 및 GCR2 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가되어 있는 것인 효모 세포.
  9. 청구항 1에 있어서, GCR1 및 GCR2 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입되어 있는 것인 효모 세포.
  10. 청구항 8에 있어서, GCR1 및 GCR2 중 하나 이상을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 2 및 4와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  11. 청구항 1에 있어서, 효모 세포는 Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Shizosaccharomyces, Issachenkia, 또는 Hansenula에 속하는 균주인 것인 효모 세포.
  12. 청구항 5에 있어서, 피루베이트로부터 피루베이트 유래 물질을 합성하는 경로, DHAP로부터 글리세롤을 합성하는 경로, 또는 글리세롤로부터 글리세롤 유래 물질을 합성하는 경로의 효소의 활성이 증가된 것인 효모 세포.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가되어 있는 것인 효모 세포.
  14. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소의 활성, 또는 피루베이트를 에탄올로 전환하는 경로의 효소의 활성이 증가되어 있는 것인 효모 세포.
  15. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현, 또는 피루베이트를 에탄올로 전환하는 경로의 효소의 발현이 증가되어 있는 것인 효모 세포.
  16. 청구항 15에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 EC 1.1.1.27, 또는 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소를 코딩하는 것이고, 피루베이트를 에탄올로 전환하는 경로의 효소는 EC.4.1.1.1로 분류되는 피루베이트 데카르복실라제 및 EC.1.1.1.2로 분류되는 알콜 데히드로게나제 (ADH)를 포함하는 갖는 것인 효모 세포.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 효모 세포는 Saccharomyces로서, GCR1을 코딩하는 유전자 및 GCR2를 코딩하는 유전자 중 하나 이상이 도입되어 있는 것인 효모 세포.
  18. 청구항 1의 효모 세포를 배양하는 단계; 및
    배양물로부터 해당과정 중간 산물 또는 해당과정 중간 산물 유래 산물을 회수하는 단계;를 포함하는, 해당과정 중간 산물 또는 해당과정 중간 산물 유래 산물을 생산하는 하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 해당과정 중간 산물 유래 산물은 해당과정 중간 산물로부터 생합성 과정에 의하여 형성되는 산물인 것인 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 해당과정 중간 산물은 DHAP, GAP, 또는 피루베이트이고, 상기 해당과정 중간 산물 유래 산물은 DHAP 유래 산물, 또는 피루베이트 유래 산물을 포함하고, DHAP 유래 산물은 G3P 또는 글리세롤을 포함하고, 상기 피루베이트 유래 산물은 에탄올, 락테이트, 아세트산, 아세틸-CoA, 또는 TCA 회로의 중간 산물, 이들 유래 산물, 또는 그 조합을 포함하고, 상기 TCA 회로의 중간 산물은 시트르산, 이타콘산, 이소시트레이트, 옥살로숙신네이트, 알파-케토글루타레이트, 숙신산, 숙신일-CoA, 푸마르산, 말레이트, 옥살로아세테이트, 또는 그 조합이고, TCA 회로의 중간 산물 유래 산물은 1,3-부탄디올(1,3-BDO), 1,4-부탄디올(1,4-BDO), 부탄올, 또는 이소부탄올을 포함하는 것인 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 상기 효모 세포는 Saccharomyces로서, GCR1을 코딩하는 유전자 및 GCR2를 코딩하는 유전자 중 하나 이상이 도입되어 있는 것인 방법.
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