CN105432667A - 一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物农药与微生物肥料领域，具体公开的是一种含有芽孢萌发剂的枯草芽孢杆菌的可湿性粉剂及其制备方法，该可湿性粉剂的原料由下列重量组份组成：枯草芽孢杆菌发酵液40-70份，填料：硅藻土20-30份；润湿剂：Morwet？EFW？1-4份；分散剂：CMC-Na？0.2-1份；芽孢萌发剂：L-丙氨酸0.1-0.5份，肌苷0.1-0.5份，果糖0.5-1.5份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，卵磷脂0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甲基纤维素0.2-1份；增效剂：氨基寡糖素1-2份；本发明制备的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂施入大田后芽孢萌发速度快，萌发率高，可明显提高其肥效与对植物病害防治效果，减少芽孢的用量，降低成本。

Description

一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法
技术领域
本发明涉及生物农药与微生物肥料技术领域，具体涉及一种含芽孢萌发剂的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法。
背景技术
我国每年使用大量的化学农药制剂与化肥，极易造成农药残留超标，生物富集，不仅污染生态环境，还影响人类的健康。而生物农药副作用小，对人无害，是一种具有广阔前景的绿色农药，日益成为全球农药发展的一种趋势。
芽胞杆菌是目前生物农药与微生物肥料中研究最多的一种微生物，它具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，其营养细胞能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，因此，在控制病害发生、促进植株生长，提高作物产量等方面显示出了广阔的应用前景。
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种嗜温、好氧、产芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，分布广泛，极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常见内生细菌，尤其是在植物的根、茎部。目前该菌已经在水稻、大豆、棉花、小麦、辣椒、番茄、玉米等农作物上显示出很好的病害防治效果。枯草芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，与病原菌竞争植物周围的营养，分泌抗菌物质以抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。其主要防治对象为丝状真菌所引起的植物病害，如水稻纹枯病(Stagonosporacurtisii)、小麦纹枯病(Rhizoctoniacerealis)、番茄叶霉病(Cladosporiumfulvum)、豆类根腐病(Fusariurngraminerarum)(Rhizoctoniaspp.)、苹果霉心病(Alternariaalternata)、棉花立枯病(Rhizoctoniasolani)、棉花枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)等。
国外最早有关枯草芽孢杆菌有防治植物病害作用的报道见于1945年Johnson等人的研究，此后有关枯草芽孢杆菌的生物防治研究成为了热点，不断有人研究报道枯草芽孢杆菌的生物防治作用，并且已经有产品推向市场。到目前为止,枯草芽孢杆菌的生物防治研究依然是一个热点。
目前，各国都已经有有关枯草芽孢杆菌菌剂的报道。如澳大利亚报道的BacillussubtilisA-B对小麦和胡萝卜的立枯病和其他土传病害有防治作用。日本东京技术研究所的BacillussubtilisRB14对引起番前病害的立枯丝核菌和尖孢镰刀菌有生防作用，另外一种BaciUussubtilisNB22对靑枯假单胞菌引起的番游病害有很好的防效作用。
到目前为止，不断有新的研究报道枯草芽孢杆菌对新的农作物的生防作用。A.Holzinger等人筛选出一株Bacillussubtilis3A25，对芥菜叶绿素的含量、幼苗的高度、根的长度和叶片面积都有显著的促生作用。该菌种的菌剂不管是在叶片施喷还是土壤施喷都显著减少了大棚内臭氧反应的副作用。TesfagiorgisDemoz等人发现枯草芽孢杆菌能够防治轉梨的蒂腐病，在鍔梨开花的时候施喷液体剂型，枯草芽孢杆菌能够有效地吸附和存活在花朵上，分泌的拮抗物质能够造成病原菌的分生孢子和菌丝的降解，从而达到防治鍔梨蒂腐病的目的。K.C.ICuppera等研究发现BacillussubtilisACB-69能够防治由炭疽病菌造成的柑橘花后落果病，当每周喷洒用药(活菌数为5×108cfu/mL)—次能够将花朵患病的概率降低47%，而对照组的化学试剂只降低了18%，在整个开花阶段都喷洒施用能够使甜橙结出更多的果实。M.R.Swain从牛粪中分离得到一株枯草芽孢杆菌，对于尖孢镰刀菌的抑制率为25-34%，对于黑腐病菌的抑制率为100%，此外，该枯草芽孢杆菌还能够将硫氧化为硫酸盐,具有溶磷作用。
枯草芽孢杆菌的菌剂不仅可以直接通过喷洒、埋植等传统方式来实施，而且也可以通过寻找动物等载体来起到生物防治的作用。蓝莓作为美国第二大水果，花朵的传粉好坏直接影响到蓝莓产量，所以农户必须得人工饲养蜜蜂来帮助蓝萄传递花粉，但是在蜜蜂传递花粉的过程中会把链核盘菌这种病原菌也带到花朵上，从而使花朵枯萎，产量减少。SelimDedej等人发现一株枯草芽孢杆菌对链核盘菌有高度的拮抗作用，在蜂箱出入口放入枯草芽孢杆菌菌剂，使每个蜜蜂可以携带5.1-6.4×105cfu枯草芽孢杆菌，传递到每个花朵上的菌数<103cfu个，从而使得花朵的枯萎病得到了很好的抑制。
国内有关枯草芽孢杆菌生防菌的研究虽然起步较国外晚，但是发展非常快，在枯草芽孢杆菌生物防治方面已经取得了很大的成就，无论是生防菌种资源还是能够抑制的病原微生物种类都达到了国际水平。目前，己经有多种枯草芽孢杆菌菌剂上市，上市产品如南京农业大学的麦丰灵，云南星耀制品厂的百抗，光华化工股份公司的台湾宝，香港经纶全汛有限公司的亚宝，江苏农业科学院的纹曲宁等，对水稻纹枯病，稻瘟病，烟草，花卉，小麦，白菜等的土传病害与叶部病害能进行有效的防治。
除上述已经上市的枯草芽孢杆菌产品以外，不断有人报道新的枯草芽孢杆菌菌种对不同植物病原菌的生防作用。LiHui等从小麦根部分离到的内生BacillussubtilisElR-j对小麦柄诱病、葡萄白腐病和菌核病有较好的生防作用，在大田实验中，ElR-j的发酵液对小麦柄锈病的防效达到51%，而且较对照组有增产作用，ElR-j发酵液的10倍稀释液对孢子萌发的抑制率为84.1%。ZhongWei等从番痴根际土壤中分离到的BacillussubtilisQL-5和QL-8对细菌性枯萎病有生防作用，混合使用效果会更好。连玲丽等人用植物盆栽法研究发现，BacillusPumilusEN16能诱导番節对青枯病的防病效果达到49.45%-68.89%，采用菌液灌根处理有较好的抗病效果。庄敬华等人通过室内拮抗试验和温室盆栽试验发现，BacillussubtilisB6的代谢物对甜瓜枯萎病原菌孢子萌发和菌丝生长都有抑制作用，B6代谢物处理后病情指数由37.65降至11.29。刘勇等人的研究表明，枯草芽孢杆菌菌剂BS2004可以显著降低因姜痕导致的生姜死亡率，并增产51.2%；对大白菜根肿病的防病效果达到52.3%，增产14.7%，对莴苣霜霉病的防效达到69.0%。张晓云等人采用叶面喷雾法试验发现，BacillussubtilisCAB-1的抑菌蛋白粗提物对黄瓜白粉病保护和治疗的效果分别达到73.33%和76.85%，且能降低白粉病原菌分生孢子的萌发率和减少萌发的芽管个数，造成菌丝顶端呈球状畸形膨大，从而减少新生分生孢子的个数。曹春霞等人的研究显示1.0×l010cfu/g的枯草芽孢杆菌WP2.25kg/hm2对草莓白粉病的防治效果达到77.12%，与对照药剂25%三唑酮WP0.675kg/hm2处理的防治效果差异不显著。钟啸萍研究发现Bacillussubtilisal的代谢产物对油菜菌核病菌和灰霉病菌都有很好的抑制作用。叶云峰等人提取和纯化了B47的抗菌物质,发现该抗菌物质对14种病原真菌都有拮抗作用,其中对玉米大小斑病菌和各种香蕉叶斑病菌的拮抗作用较强，0.3g/L浓度下在田间试验中对玉米小斑病防治效果为53.05%。黄现青以Bacillussubtilisfmbj产生的抗菌物质脂肽进行桃防腐试验，防腐效果可以达到76.5%。陈莉发现枯草芽孢杆菌的培养液对葡萄灰霉病菌、草莓灰霉病菌、辣椒灰霉病菌和番庙灰霉病菌有强烈的抑制作用，在菌液浓度达到105cfu/mL时，对4种灰霉病菌的抑制率均达到了100%。曹春娜用枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对黄瓜灰霉病进行田间试验，0.08g/m2施药后的防效为70.81%，而对照药剂40%啼霉胺0.11g/m2的防效为77.40%。田云静用枯草芽孢杆菌菌剂对五味子的白粉病防治效果进行了研究，喷施加灌施处理五味子后，白粉病的发病率为13.0%，清水对照发病率为37.5%，对二年生、三年生、四年生五味子的防治效果分别为78.9%、77.8%、75.0%。
虽然以芽孢杆菌为主制备的微生物农药产品不少，但目前芽孢杆菌的剂型还是以可湿性粉剂为主，这种剂型虽然便于储存和运输，但在生产应用中存在很多制约因子。如施用的可湿性粉剂中大部份以芽孢作为衡量产品中有效成分的惟一标准，若芽孢不能及时萌发，施用效果则不佳，如王倩利用枯草芽孢杆菌TR21防治巴西蕉枯萎病时，前期试验利用TR21菌株NB发酵液灌根和叶腋接种都能有效防治枯萎病，但是利用芽孢制备可湿性粉剂的灌根与叶腋效果却不理想，验证了去掉发酵液后的纯芽孢可能因为萌发困难而使防效下降。
芽孢杆菌在自然界中分布广泛，当外部条件适合生长时，芽胞会由休眠状态经过一系列复杂生理生化反应成长为营养体并恢复新陈代谢作用，这个过程称为萌发(germination)。自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为“萌发剂”，通常营养诱导芽孢萌发包括氨基酸、糖类和嘌吟核苷的单一作用，也包括它们的协同作用(例如：AGFK；A：L一天冬酞胺；G：葡萄糖；F：果糖；K：钾离子)。当营养物质接触到芽孢时，芽孢内部会发生一系列变化，（1）、芽孢核内部H十和Zn2+释放出来，致使芽孢核内部pH由弱酸性上升至弱碱性；(2)、芽孢核内部Ca2+--DPA的大量释放；(3)、芽孢核水合，内部Ca2+--DPA被水所替代，芽孢的耐热性下降；(4)、芽孢皮层的芽孢肤聚糖层水解，芽孢核膨胀；(5)、芽孢核进一步水合，芽孢核内部蛋白质流动性增强，酶活性加强，合成ATP；(6)、降解SASP蛋白，以释放芽孢DNA，进而引导芽孢生长过程中RNA、蛋白质、DNA的合成。
芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态，接着启动一连串萌发事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。
近30年来，随着现代生物技术的广泛应用，以枯草芽孢杆菌为模式菌株对芽孢的萌发机制开展了大量和深入的研究，有关芽孢萌发的研究也成为了热点，主要研究了芽孢萌发信号的传导、营养萌发受体、萌发中的离子通道、皮层溶解酶以及非营养性萌发。如用葡萄糖、果糖、天门冬氨酸和氯化钾配成的混合剂(AGFK)可以用来作为枯草杆菌芽孢萌发的萌发剂，但还没有有关利用枯草芽孢杆菌的芽孢萌发剂应用到可湿性粉剂中技术方案公开过。
另外，由于不同的芽孢杆菌与湿润剂，分散剂等助剂的相容性，载体对各类芽孢杆菌吸附性各不相同，将现有的芽孢杆菌可湿性粉剂的配方或制备工艺无法用于制备含芽孢萌发剂的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，可湿性粉剂中有效菌的吸附量，存活率，对有害菌的防治效果及可湿性粉剂量的稳定性差异较大，其整个可湿性粉剂的制备方法必须全盘考虑各载体吸附能力，对枯草芽孢杆菌的干燥过程中保护作用，湿润剂，分散剂对可湿性粉剂的悬浮率，湿润时间的影响，并且对芽孢萌发剂进行全面的筛选才能够得到湿润时间短，悬浮率高，芽孢保存时间久，使用后芽孢能快速萌发的，防效好的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。
发明内容
针对上述现有技术的不足，提供一种含有芽孢萌发剂，能使枯草芽孢杆菌可湿性粉剂融入水后，枯草芽孢能快速萌发，大大提高枯草芽孢的萌发率的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法，其制备的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂芽孢含量为不低于100亿CFU/克，悬浮率不低于85%，润湿时间不高于75S，细度粉碎过400目筛，水份含量不高于5%，制备方法稳定。
为了达到上述目的，一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，由下列重量份组成：枯草芽孢杆菌发酵液40-70份，填料：硅藻土20-30份；润湿剂：MorwetEFW1-4份；分散剂：CMC-Na0.2-1份；芽孢萌发剂：L-丙氨酸0.1-0.5份，肌苷0.1-0.5份，果糖0.5-1.5份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，卵磷脂0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甲基纤维素0.2-1份；增效剂：氨基寡糖素1-2份。
其中，所述的一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，由以下几步骤组成：
一、枯草芽孢杆菌发酵液的制备
取出菌种保藏管，用NA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至茄子瓶中NA固体培养基上，涂满整个茄子瓶，在培养箱中30℃培养48小时，将1L无菌水将茄子瓶中的菌苔洗下，将洗下的枯草芽孢杆菌接种于装有120L枯草芽孢杆菌液体培养基的200L种子发酵罐，初始pH值为7.2，温度为30℃，通风1:0.8，开搅拌，转速为200r/min，从菌种接种后18h时，菌体生长处于指数生长期，转入2000L的发酵罐的发酵培养基中，以70%的罐装量，pH值为7.2，温度为30℃，开搅拌，转速为160r/min，通气量为前16小时为每分钟液气比为1：1，其后通气量为1：1.2；培养32-42小时，检测其芽孢含量超过100亿CFU/ml，即可结束发酵，作为枯草芽孢杆菌发酵液；
其中，所述NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述枯草芽孢杆菌液体培养基：玉米粉20g/L，豆粕粉30g/L，鱼粉2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾1g/L，碳酸钙2g/L，pH7.2；
其中，所述的发酵培养基：玉米粉32g/L，豆粕粉68g/L，鱼粉5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.6g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
二、将枯草芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：硅藻土20-30份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，卵磷脂0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甲基纤维素0.2-1份；混匀后喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌粉剂；
三、将润湿剂：MorwetEFW1-4份；分散剂：CMC-Na0.2-1份；芽孢萌发剂：L-丙氨酸0.1-0.5份，肌苷0.1-0.5份，果糖0.5-1.5份；增效剂：氨基寡糖素1-2份；混匀得到枯草芽孢杆菌的助剂；
四、将步骤二与步骤三所得到的枯草芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其芽孢含量不低于100亿cfu/g，悬浮率不低于85%，润湿时间不高于75s，水分含量低于5%，真空包装，即为枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。
其中，所述枯草芽孢杆菌可湿性粉剂最佳重量份组成为：枯草芽孢杆菌发酵液60份，填料：硅藻土28份；润湿剂：MorwetEFW3份；分散剂：CMC-Na0.8份；芽孢萌发剂：L-丙氨酸0.4份，肌苷0.5份，果糖1.2份；紫外保护剂：抗坏血酸1份，卵磷脂0.8份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甲基纤维素0.8份；增效剂：氨基寡糖素1.5份。
自然界中芽孢萌发受外源营养物质的影响，这类营养物质被称之为“萌发剂”，通常情况下，芽孢和促进萌发的芽孢萌发剂混合后数秒钟之内，萌发剂快速跨过芽孢衣和皮层到达芽孢内膜的表面，与位于芽孢内膜上的受体蛋白相互作用，激发芽孢进入萌发状态，接着启动一连串萌发事件，之后的萌发过程不会因移走萌发剂而停止。本发明可湿性粉剂中含有芽孢萌发剂：L-丙氨酸，肌苷，果糖是从苷氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，蛋氨酸，胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，组氨酸，脯氨酸，肌苷，2，6吡啶二羧钙，果糖中进行单因素试验，及组合性试验得到的具有明显诱导枯草芽孢萌发的萌发剂。经过试验，本发明的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂与水按1：1000的比例进行润湿混合均匀，此时的芽孢萌发剂能充分与芽孢接触后，从而促使其快萌发，经过试验，30分钟后，芽孢萌发率已经达到80%以上，而未加芽孢萌发剂的枯草芽孢在4小时后，其芽孢萌发率只达到了50%左右。
本发明人通过对载体（如膨润土，滑石粉，高岭土，硅藻土，白炭黑，磷矿粉，轻质碳酸钙）、助剂（润湿剂和分散剂）（聚乙烯醇，聚乙二醇，CMC-Na,吐温-60，十二烷基苯磺酸钠，T型木质素，十二烷基硫酸钠，茶皂素，MorwetEFW，MorwetD425，My100，D110，阿拉伯权胶，2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐，辛基酚聚氧乙烯醚，二异辛基琥珀酸酯磺酸钠，甲基纤维素，木质素磺酸钠）填料（硅藻土，高岭土，膨润土，白炭黑，轻质碳酸钙，滑石粉）、紫外线保护剂（抗坏血酸，糊精，十二烷基苯磺酸钠，刚果红，羧甲基纤维素，卵磷脂），干燥保护剂（脱脂奶粉，蔗糖，谷氨酸钠，麦芽糖，甘露糖，甲基纤维素等）进行筛选，其每种助剂配合芽孢萌发剂对枯草芽孢杆菌的芽孢存活，悬浮性，湿润性进行试验，最后通过多轮单因素与正交试验确定枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的配方。通过验证，本发明的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂在20-25℃下保存一年，其芽孢存活率还可达到85亿CFU/克。
本发明的可湿性粉剂采有真空包装，减少芽孢与空气的接触，降低了其萌发的机率。
本发明的可湿性粉剂的水分含量低于5%，低水份含量的可湿性粉剂中即使含有芽孢萌发剂（L-丙氨酸，肌苷与果糖），对其贮存过程中的芽孢活性也没有明显的影响，没有减少其在贮存过程中的芽孢。
本发明中的可湿性粉剂含有氨基寡糖素，氨基寡糖素能对一些植物病原菌的生长产生抑制作用，影响真菌孢子萌发，诱发菌丝形态发生变异、孢内生化发生改变等。能激发植物体内基因，产生具有抗病作用的几丁酶、葡聚糖酶、保素及PR蛋白等，并具有细胞活化作用，有助于受害植株的恢复，促根壮苗，增强作物的抗逆性，促进植物生长发育，与枯草芽孢杆菌相结合，增强其防病，提质的效果。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
这是国内首次将枯草芽孢杆菌的芽孢萌发剂加入枯草芽孢杆菌可湿剂进行工业化生产，大大提升了芽孢萌发速率与萌发率，解决了因为芽孢萌发慢，萌发率低而导致的防治效果差，效果不稳定的问题，减少了枯草芽孢杆菌的用量，降低了生产成本。
具体实施方式
实施例1
一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，由下列重量分组成：枯草芽孢杆菌发酵液60份，填料：硅藻土28份；润湿剂：MorwetEFW3份；分散剂：CMC-Na0.8份；芽孢萌发剂：L-丙氨酸0.4份，肌苷0.5份，果糖1.2份；紫外保护剂：抗坏血酸1份，卵磷脂0.8份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甲基纤维素0.8份；增效剂：氨基寡糖素1.5份。
其中，所述的一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，由以下几步骤组成：
一、枯草芽孢杆菌发酵液的制备
取出菌种保藏管，用NA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至茄子瓶中NA固体培养基上，涂满整个茄子瓶，在培养箱中30℃培养48小时，将1L无菌水将茄子瓶中的菌苔洗下，将洗下的枯草芽孢杆菌接种于装有120L枯草芽孢杆菌液体培养基的200L种子发酵罐，初始pH值为7.2，温度为30℃，通风1:0.8，开搅拌，转速为2000r/min；从菌种接种后18h时，菌体生长处于指数生长期，转入2000L的发酵罐的发酵培养基中，以70%的罐装量，pH值为7.2，温度为30℃，开搅拌，转速为160r/min，通气量为前16小时为每分钟液气比为1：1，其后通气量为1：1.2；培养38小时，检测其芽孢含量为115亿CFU/ml，结束发酵，作为枯草芽孢杆菌发酵液；
其中，所述NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述枯草芽孢杆菌液体培养基：玉米粉20g/L，豆粕粉30g/L，鱼粉2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾1g/L，碳酸钙2g/L，pH7.2；
其中，所述的发酵培养基：玉米粉32g/L，豆粕粉68g/L，鱼粉5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.6g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
二、将枯草芽孢杆菌发酵液60份；填料：硅藻土28份；紫外保护剂：抗坏血酸1份，卵磷脂0.8份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甲基纤维素0.8份；混匀后喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌粉剂；
三、将润湿剂：MorwetEFW3份；分散剂：CMC-Na0.8份；芽孢萌发剂：L-丙氨酸0.4份，肌苷0.5份，果糖1.2份；增效剂：氨基寡糖素1.5份；混匀得到枯草芽孢杆菌的助剂；
四、将步骤二与步骤三所得到的枯草芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其芽孢含量为125亿cfu/g，悬浮率为92%，润湿时间为65s，水分含量为3.5%，真空包装，即为枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。
实施例2
含芽孢萌发剂的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂在水稻大田中的试验效果
试验选择在水稻高产区中稻中进行。试验地址选择在湖南省隆回县滩头镇龙竹村一农户责任田中；
药剂用法与用量：试验组：将含有芽孢萌发剂的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂稀释1000倍在水稻秧苗两叶一心到四叶一心期、移栽后5-7天水稻返青期和破口抽穗期，选择晴天施药；
对照组一（未加芽孢萌发剂的枯草芽孢杆菌组）：将同量的枯草芽孢杆菌的未加芽孢萌发剂的枯草芽孢杆菌稀释1000倍与试验组同时使用；
对照组二（空白组）：将等量的清水进行喷施；
每组使用面积为2亩。施肥水平为纯氮20kg/667m2，P2O510kg/667m2，K2O20kg/667m2，基∶蘖∶穗=5∶2∶3。喷施器械选用农民通用手动背负式喷雾器，病虫害防治及田间管理略同大田生产。对照组一与对照组二（空白组）由于在生长过程中有纹枯病，利用常规药物进行防治了两次。其它管理措施相同。
试验结果：
由于本枯草芽孢杆菌是从市场上购买的，具有防治水稻纹枯病，等多种植物病害的样品中分离得到的，从表1可以看出使用有芽孢萌发剂的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（试验组）的水稻田中就没有发生纹枯病与稻瘟病，而使用未加芽孢萌发剂的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（对照组一）的有轻微的稻瘟病，而清水组（对照组二）的田有较严重的纹枯病与稻瘟病的发生，是用常规药物进行防治。使用含芽孢萌发剂的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的田增产最多，增产量达到24.86%，而使用未加芽孢萌发剂的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的田也有12.7%的增产，说明加入芽孢萌发剂明确显提高了枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的对病害的防治作用，同时也增加了其增产与肥效的作用。
表1各试验组的水稻产量
平均亩产（kg） 是否有病害 增产率(%)
试验组 688 24.86
对照组一 621 有稻瘟病 12.7
对照组二 551 有纹枯病，稻瘟病

Claims (3)

1.一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份组成：枯草芽孢杆菌发酵液40-70份，填料：硅藻土20-30份；润湿剂：MorwetEFW1-4份；分散剂：CMC-Na0.2-1份；芽孢萌发剂：L-丙氨酸0.1-0.5份，肌苷0.1-0.5份，果糖0.5-1.5份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，卵磷脂0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甲基纤维素0.2-1份；增效剂：氨基寡糖素1-2份。
2.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，由以下几步骤组成：
一、枯草芽孢杆菌发酵液的制备
取出菌种保藏管，用NA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至茄子瓶中NA固体培养基上，涂满整个茄子瓶，在培养箱中30℃培养48小时，将1L无菌水将茄子瓶中的菌苔洗下，将洗下的枯草芽孢杆菌接种于装有120L枯草芽孢杆菌液体培养基的200L种子发酵罐，初始pH值为7.2，温度为30℃，通风1:0.8，开搅拌，转速为200r/min；从菌种接种后18h时，菌体生长处于指数生长期，转入2000L的发酵罐的发酵培养基中，以70%的罐装量，pH值为7.2，温度为30℃，开搅拌，转速为160r/min，通气量为前16小时为每分钟液气比为1：1，其后通气量为1：1.2；培养32-42小时，检测其芽孢含量超过100亿CFU/ml，即可结束发酵，作为枯草芽孢杆菌发酵液；
其中，所述NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；
其中，所述枯草芽孢杆菌液体培养基：玉米粉20g/L，豆粕粉30g/L，鱼粉2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾1g/L，碳酸钙2g/L，pH7.2；
其中，所述的发酵培养基：玉米粉32g/L，豆粕粉68g/L，鱼粉5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.6g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.2；
各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
二、将枯草芽孢杆菌发酵液40-70份；填料：硅藻土20-30份；紫外保护剂：抗坏血酸0.5-2份，卵磷脂0.2-1份；干燥保护剂：麦芽糖1-4份，甲基纤维素0.2-1份；混匀后喷雾干燥，得到枯草芽孢杆菌粉剂；
三、将润湿剂：MorwetEFW1-4份；分散剂：CMC-Na0.2-1份；芽孢萌发剂：L-丙氨酸0.1-0.5份，肌苷0.1-0.5份，果糖0.5-1.5份；增效剂：氨基寡糖素1-2份；混匀得到枯草芽孢杆菌的助剂；
四、将步骤二与步骤三所得到的枯草芽孢杆菌粉剂与助剂混匀并过通过气流粉碎机粉碎过400目筛，检测其芽孢含量不低于100亿cfu/g，悬浮率不低于85%，润湿时间不高于75s，水分含量低于5%，真空包装，即为枯草芽孢杆菌可湿性粉剂。
3.根据权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，其特征，在于所述枯草芽孢杆菌可湿性粉剂由下列重量份组成：枯草芽孢杆菌发酵液60份，填料：硅藻土28份；润湿剂：MorwetEFW3份；分散剂：CMC-Na0.8份；芽孢萌发剂：L-丙氨酸0.4份，肌苷0.5份，果糖1.2份；紫外保护剂：抗坏血酸1份，卵磷脂0.8份；干燥保护剂：麦芽糖3份，甲基纤维素0.8份；增效剂：氨基寡糖素1.5份。
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